CN109055251A - 一种芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109055251A CN109055251A CN201711037796.8A CN201711037796A CN109055251A CN 109055251 A CN109055251 A CN 109055251A CN 201711037796 A CN201711037796 A CN 201711037796A CN 109055251 A CN109055251 A CN 109055251A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- bacterial strain
- galactosidase
- present
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 13
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- 241001205439 Bacillus camelliae Species 0.000 claims description 2
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 claims 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 17
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 5
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract 1
- 235000019224 Camellia sinensis var Qingmao Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000020339 pu-erh tea Nutrition 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 7
- 241001322378 Bacillus paralicheniformis Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000040345 Bacillus shackletonii Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241001260372 Bacillus acidicola Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001429219 Bacillus ginsengihumi Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKLJLHAPJBUBNL-UHFFFAOYSA-N 12-methyltetradecanoic acid Chemical compound CCC(C)CCCCCCCCCCC(O)=O XKLJLHAPJBUBNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000345369 Edwardsiella hoshinae Species 0.000 description 1
- 101100379080 Emericella variicolor andB gene Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 101100522284 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus PTP-1 gene Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N bis(4-fluorophenyl)-methyl-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)silane;methyl n-(1h-benzimidazol-2-yl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1.C=1C=C(F)C=CC=1[Si](C=1C=CC(F)=CC=1)(C)CN1C=NC=N1 VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- -1 galactolipin Chemical compound 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- ZOCYQVNGROEVLU-UHFFFAOYSA-N isopentadecanoic acid Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCC(O)=O ZOCYQVNGROEVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的芽孢杆菌（Bacillus sp.）分离自陈熟普洱茶，保藏号为CGMCC No.1.15374。依据多相分类学方法，该菌株是芽孢杆菌属的一个新种，其分类地位是Bacillus sp.，依据国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该种命名为Bacillus camelliae sp.nov.。本发明所提供的芽孢杆菌新菌种易培养。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的芽孢杆菌新菌种具有α‑半乳糖苷酶、β‑半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶，为α‑半乳糖苷酶、β‑半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶在在食品、医药和化工等行业应用提供菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌及其应用。
背景技术
国内外关于芽孢杆菌属的研究已有100多年的历史。早在1835年，Ehrenberg就发现并命名了枯草芽孢杆菌Vibrio subtilis。1872年，德国植物学家Cohn建立了第一个细菌分类系统，根据细菌的形态特征命名了芽孢杆菌属（Bacillus）,并将芽孢杆菌重新命名为Bacillus subtilis。随着研究方法技术的改进发展，越来越多的芽孢杆菌种被发现。至今已有341个种，7个亚种(http://www.bacterio.net/bacillus.html)被发现和鉴定。芽孢杆菌属广泛存在于土壤、水、空气和动物肠道等环境。芽孢杆菌由于产生内生孢子，具有较强的抗逆性，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量大，能够产生多种多样的生理活性物质，具有广泛的研究前景。
多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。1987年，国际系统细菌学委员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB）规定，DNA同源性≥70%为细菌种的界限。
芽孢杆菌包含很多有特殊功能的菌株，在工业、农业和医学等领域中成为人们极为关注的一个微生物类群。采用现代分类手段对芽孢杆菌进行分类研究并对其生理生化特性进行探索，可获得一些生产应用或者潜在应用价值的菌株。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种芽孢杆菌，该芽孢杆菌为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
本发明的目的之二在于提供该芽孢杆菌在液体发酵生产α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种芽孢杆菌，该菌株的保藏号为CGMCC No.1.15374。
一种上述的芽孢杆菌的培养方法，其特征在于该方法是将芽孢杆菌7578-1 CGMCCNo.1.15374 接种于培养基中，在20~55℃，pH 4.8~7.7的条件下进行培养。
上述最适培养温度为30-45℃。
上述最适pH为4.8~7.7。
上述的培养的培养基中还包括质量百分比浓度不超过10%的NaCl。
上述的培养在需氧条件下进行。
一种根据上述的芽孢杆菌在液体发酵生产α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶中的应用。
本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。
本发明所述的培养的接种量为常规，所述百分比为体积百分比。
本发明所述的培养基为芽孢杆菌常规培养基，优选是TSB培养基。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了芽孢杆菌属的一个新种，该菌株的分类地位是Bacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Bacillus camelliae sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用芽孢杆菌做出了一定的贡献。本发明的芽孢杆菌7578-1，可提取α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶，在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。
生物材料保藏信息：
本发明的芽孢杆菌7578-1，已于2017年7月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.1.15374。该菌株的分类命名是芽孢杆菌Bacillus sp.，名称为7578-1。
附图说明
图1 显示本发明芽孢杆菌新种菌株7578-1的16S rRNA系统发育进化树。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25 ℃。
Bacillus shackletonii BCRC 17468T、Bacillus acidicola BCRC 80608T和购自台湾地区生物资源研究及保存中心，Bacillus ginsengihumi KCTC 13944T购自韩国典型菌种保藏中心，Bacillus paralicheniformis KACC 18426T由韩国农业微生物菌种保藏中心馈赠。
实施例1、本发明新菌株7578-1的分离制备
取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30℃培养2天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。
将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC No.1.15374。
实施例2、本发明新菌株7578-1的表观特征
1. 菌落特征
取菌株7578-1的单菌落，转接到TSA固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株7578-1在TSA固体培养基上形成边缘粗糙，表面光滑湿润，不透明，中间凸起，淡黄色的圆形菌落，直径约2mm。
2. 细胞形态学特征
细胞为短杆状；革兰氏染色阳性；周生鞭毛，产芽孢，细胞菌体大小为0.3-0.5 μm×2.5-4.0μm，单生。
实施例3、本发明新菌株7578-1的生长特性
挑取在TSA固体培养基上培养12 h的新鲜培养物，接种到LB液体培养基，37℃摇床培养12 h，作为种子。
液体TSB培养基的组成（/L）：胰蛋白胨15g，NaCl 5g，大豆蛋白胨5g，蒸馏水定容至1000ml。
1. 生长温度：
将所培养的7578-1种子按2.5 %(v/v)接种量转接新鲜的TSB液体培养基中，混匀。分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，每12 h测定其生长情况。得知菌株7578-1生长温度范围为20~55℃，最适温度30~45℃。
2. 生长NaCl 耐受性
所培养的7578-1种子按2.5 %(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9%、10%、11%和12.0%的TYB培养基，37℃培养，分别于24h和48 h的生长状态做记录。结果显示菌株7578-1的NaCl耐受性为10.0%。
3. 生长pH 范围
在最适生长盐浓度条件下，使用缓冲液分别将灭好菌的培养基调至pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，其中pH3.5-6.0使用的是0.2mol/L的Na2HPO4和0.1mol/L的柠檬酸；pH6.5-8.0使用的是1/15mol/L的Na2HPO4和1/15mol／L的KH2PO4；pH8.5-10.0使用的是0.1mol/L的Na2CO3和0.1mol／L的NaHCO3。每个pH梯度的培养基为：20mL的pH缓冲液、0.1g胰蛋白胨、0.1g大豆蛋白胨、0.1g酵母粉；分装于5支试管，每支4mL。灭菌后分别接种2.0%的新鲜菌液于37℃摇床培养24小时观察其生长状态，确定菌株7578-1的生长pH范围为4.8~7.7，最适生长pH为5.7~7.7。
实施例4、本发明新菌株7578-1的生理生化特性
利用API ZYM和API20E鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）及常规的生理生化测定方法（东秀珠，蔡妙英等，2001）对菌株7578-1及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。
其中API ZYM 是一个半定量的微量方法系统，专为研究酶活所设计的。该技术对各种标本(组织、细胞、生物体液、洗涤水、土、油，等) 都适用。它可系统和快速地研究 19种酶的活性。用样量极少。实验步骤如下：
1）样品准备：在最小体积稀释标本：可用2 ml无菌蒸馏水或其它如普通的生理盐水不需要缓冲液。制备一个菌悬液，其混浊度在McFarland No 5和No 6之间。从斜面或离心肉汤培养物的纯菌种都能用来制备菌悬液。
2）试验条的准备：准备一个培养盘和盖子。记标本号于盘的侧面。可使用一个塑料洗瓶，分装约5ml蒸馏水于培养盘内，为了培养时能保持一定的湿度。从密封的包装中取出API ZYM试验条，置培养盘内。
3）试验条的接种：用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65µl)。
4）试验条培养：接种后，托盘上放塑料盖子，37℃培养4 小时。所有的测定条件(时间、温度、培养基、悬液浓度)要保持一致。接种的试验条避光保存。
5）试验条的结果观察：培养后，加1滴ZYM A试剂和1滴ZYM B试剂。5分钟后生色，如果是阳性，将试验条置于一个强光源(1000 瓦灯泡)下10秒，把灯泡放在杯上4秒。这是为消除杯中多余坚牢兰的黄色。暴光后阴性反应变为无色。再置试验条于日光下几分钟后，就可产生比较的结果。
6）记录反应：0-5标记相应的颜色深度。0相当于阴性反应，5为最强反应。2-4 是二者之间的强度。从颜色深度可知近似的微毫克分子浓度(nM) ：1相当
释放5微毫克分子浓度(5 nM)，2相当于10 nM，3为20 nM，4为30 nM，5为40 nM或更高。
菌株7578-1的主要生理生化特征：好氧生长；接触酶和氧化酶阳性；核酸酶阴性；β-葡糖醛酸糖苷酶阴性，精氨酸芳香氨基酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，脲酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阳性，酯酶（C4）阳性，类脂酯酶（C8）阳性，胰凝乳蛋白酶阳性，α-半乳糖苷酶阳性、β-半乳糖苷酶阳性，不产生吲哚，VP反应阴性，水解七叶灵；液化明胶；不水解酪蛋白；不水解淀粉；不还原硝酸盐；能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、半乳糖、果糖等作为碳源；不利用木糖、甲酸、山梨醇、糖原、L-甘氨酸、L-丙氨酸等底物。
且菌株7578-1在液化明胶特性与同源性接近的菌株Bacillus shackletoniiBCRC 17468T、Bacillus acidicola BCRC 80608T、Bacillus ginsengihumi KCTC 13944T和Bacillus paralicheniformis KACC 18426T具有明显差异。菌株7578-1不能水解淀粉，而B. acidicola BCRC 80608T和B. paralicheniformis KACC 18426T能水解淀粉。
实施例5、本发明新菌株7578-1（CGMCC No.1.15374）的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定及16S rRNA系统发育特征。
1.提取基因组DNA
将芽孢杆菌Bacillus sp.7578-1（CGMCC No.1.15374）接种于TSB液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心1分钟，去除上清液；用TES (50 mM Tris，50 mMEDTA-Na2，50mM NaCl，pH 8.0~8.2)溶液洗3遍；用0.4 mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温1 h；加入0.04 mL 20% SDS，60℃保温30 min；加入0.18 mL 5M NaClO4，混匀；加入等体积氯仿-异戊醇(24: 1，v/v)，轻轻摇匀，离心（12000转/分钟，10分钟），吸取上清液；上清液加入20 μl 0.2 % RNA酶37℃保温30 分钟，氯仿-异戊醇（24: 1，v/v）处理一遍；上清液加入20 μl蛋白酶K (50-70 μg/mL)，37 ℃保温1h，氯仿-异戊醇（24: 1，v/v）处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟，12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。
2. 16S rRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因的8-27和1541-1557碱基。PCR反应体系（20 μL）为：10×buffer 2μL、25 mmol/L MgCl2 2μL、10 mmol/L dNTPs 1.5μL、30 pmol/L 引物各1 μL、ddH2O 13.4 μL、Taq DNA酶 1 μL、模板1 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 10 min，95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10min，4℃保存。
PCR 产物的测序采用 ABI BigDye3.1测序试剂盒 (Applied Biosystems) 和DNA自动测序仪 (model ABI3730; Applied Biosystems)。
测序结果表明，菌株7578-1（CGMCC No.1.15374）16S rRNA基因序列长度为1549bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表1所示。
如上所述的使用软件MEGA version6.0.software package绘制进化关系树。采用neighbor-joining 计算，并以maximum-parsimony 和maximum-likelihood 进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1 所示。从图1可见，通过对16S rRNA 基因的系统发育树分析，菌株7578-1属于芽孢杆菌属，与B. shackletonii BCRC 17468T和B. ginsengihumi KCTC 13944T聚在一个分支，并与B. acidicola BCRC 80608T和B. paralicheniformis KACC 18426T亲缘关系也较近。将菌株7578-1的16S rRNA基因序列在EzTaxon数据库中进行同源比对分析，其序列与B. shackletonii BCRC 17468T、B. acidicola BCRC 80608T、B. paralicheniformis KACC 18426T和B. ginsengihumi KCTC13944T的16S rRNA基因序列最接近，相似性分别为98.37%、97.63%、97.17和96.68%。通常两个菌株的16S rRNA同源性小于97%时可界定为不同的种，如果其相似性等于或高于97%情况就较为复杂。据统计，相似性为97%~98%时可能有90%的是新分类单元；相似性为98.5%~99%时可能有50%的是新分类单元；即使相似性大于99%时可能还有20%~30%是新分类单元。但多相分类学研究认为一个种的确定不应只依据一个单一的标准，有待其他生理生化指标、化学特征分析及DNA-DNA同源性等指标的分析，才能确定菌株7578-1的分类地位。
实施例6：本发明新微生物的脂肪酸含量特征
菌株7578-1的总脂肪酸含量的测定。
配置如下溶液：I，45g 氢氧化钠溶于150ml 甲醇及150ml 蒸馏水；II，190ml 浓盐酸，275ml 甲醇溶于135ml 蒸馏水；III，200ml 正己烷与200ml 乙醚混合均匀；IV，10.8克氢氧化钠溶于900ml 蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。
1）取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；
2）待样品管冷却后，加入2ml溶液，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；
3）在冷却的样品管中加入1.25ml溶液，快速振荡10min左右，弃去下层水相；
4）在剩余有机相中加入3ml溶液及几滴溶液，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。
HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.01）；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33mm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每min5℃升至260℃，随后以40℃/ min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ml；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气（氮气）流速30ml/min。
结果显示，菌株7578-1 的主要细胞脂肪酸为支链脂肪酸iso-C15:0、anteiso-C15:0和anteiso-C17:0，百分含量分别为46.3%、20.5%和21.6%。符合芽孢杆菌属主要的脂肪酸类型。而且同相似菌株脂肪酸含量上有差异，以此判断同相似菌株属于不同种。
实施例 7：本发明新微生物的G + C mol%含量特征
菌株7578-1基因组DNA的G+C mol%含量测定。
使用熔解温度(Tm)法，以大肠埃希氏(E.coli K12，AS1.365)为参比对照，所用仪器为Agilent Technologies公司Cary Series UV-Vis Spectrophotometer，用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下:
1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260nm 值于0.3 ~ 0.4之间；
2）在波长260nm首先记录25°C的OD值，然后设定升温程序，从30℃开始到95°C,其间每分钟升高1℃；
3）OD值上升表示变性开始,记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；
4）根据热变性曲线，得出熔链温度(Tm)，计算G+C mol%含量。
在0.1×SSC溶液中计算公式为:
G+C mol%=G+Cmol% （AS1.365）+ 2.08(Tm未知- Tm AS1.365)
试验测定的E. coli K12 AS1.365的Tm为79.1°C，待测菌株7578-1和对照菌株B. acidicola BCRC 80608T，B. shackletonii BCRC 17468T，B. paralicheniformis KACC18426T和B. ginsengihumi KCTC 13944T的Tm值分别是73.0 °C、70.0 °C、71.0 °C和70.0°C，已知标准菌株E. coli K12 AS1.365的GC含量为51.6 mol%，通过上述公式可推算出测菌株7578-1和对照菌株B. acidicola BCRC 80608T，B. shackletonii BCRC 17468T，B. paralicheniformis KACC 18426T和B. ginsengihumi KCTC 13944T的G+C含量分别是39.0mol%，32.8 mol%，34.9 mol%，45.9 mol%和32.8 mol%。由此可看出，菌株7578-1与上述四种对照菌株在DNA的G+C含量上有明显差异，可能代表一个新菌种，且符合Bacillus（芽孢杆菌属）的G+C含量为32mol%～62mol%的特征。
实施例8：本发明新微生物的DNA-DNA杂交试验
菌株7578-1同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。
参考16S rRNA的结果，对7578-1与遗传亲缘关系最相似的种B. acidicola BCRC80608T，B. shackletonii BCRC 17468T，B. paralicheniformis KACC 18426T和B. ginsengihumi KCTC 13944T进行DNA-DNA杂交试验。
采用液相复性率方法，所用仪器为Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。温度控制用Peltier temperature-controlling programmer数字控温程序。步骤如下：
1）DNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24 min（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm 2.0，将DNA样品剪切2~5×105道尔顿的片段。
2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC 精确配制成为OD260nm1.8~ 2.0，且两者OD260nm 值一致；
3）进入Kinetics程序，出现其方法窗口，在方法窗口中设置合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimalrenaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×（G+C）mol% + 47 °C计算。
4）取两株菌种DNA样品各720 μL分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA 样品各360 μL装在同一个离心管中为混合样品；
5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过空气浴（Themomixer, Eppendorf 生产）100℃变性10min，然后迅速转移到预热的比色皿中，降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；
5）以时间为横坐标，OD260nm为纵坐标，绘制复性曲线，该线的斜率即为DNA 的复性速率（VM；VA；VB）。
DNA同源性计算：依据De Ley等的公式计算
H% = (4VM-VA-VB) / 2(VA× VB) 1/2 ×100%
DNA-DNA杂交的结果如下：
菌株7578-1与B. acidicola BCRC 80608T，B. shackletonii BCRC 17468T，B. paralicheniformis KACC 18426T和B. ginsengihumi KCTC 13944T的DNA-DNA相关性分别为39%，30%，24%和17%，均大大低于国际系统细菌学委员会（International Committee onSystematic Bacteriology, ICSB）在1987年关于DNA相关性70%为细菌种的界限规定。结合实例2，3，4，5，6的数据，由此判定，菌株7578-1为Bacillus属的一个新菌种，该菌株的分类地位是Bacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Bacillus camelliae sp.nov.，并选菌株7578-1为该种的模式菌株。
实施例9：本发明新微生物的用途
经API ZYM鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）测定，菌株7578-1具有α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶活性。
作为微生物来源的α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。
序列表
<110> 上海大学
<120> 一种芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1549
<212> DNA
<213> Bacillus camelliae
<400> 1
agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggaccaaaat gaaagtttac tttcattttg gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 120
gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggataacttc 180
tttcctcgca tgaggaaaga ttgaaagatg gcttttgcta tcacttacag atggacccgc 240
ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg 300
agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360
tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtaa gtgatgaagg 420
tcttcggatc gtaaaactct gttgttagag aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta 480
ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540
gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa 600
gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag 660
tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 720
caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 780
agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 840
agggtttccg ccctttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 900
ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 960
ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgct aaccctagag 1020
atagggcgtt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1080
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgacctta gttgccagca 1140
ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1200
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg 1260
gctgcgagac cgcgaggtta agccaatccc ataaaaccat tctcagttcg gattgcaggc 1320
tgcaactcgc ctgcatgaag ccggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1380
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1440
gtcggtgagg taacgcagac gcgagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga 1500
agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat cacctcctt 1549
Claims (4)
1.一株普洱熟茶来源的菌株，其特征在于名称为普洱芽孢杆菌（Bacillus camelliae）7578-1，于2017年7月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.15374。
2.根据权利要求1所述的普洱熟茶来源的菌株，其特征在于：所述的普洱普鲁蓝菌7578-1的形态为：圆形菌落，边缘粗糙，表面光滑湿润，不透明，中间凸起，淡黄色，属革兰氏阳性菌，该菌体的形态为短杆。
3.根据权利要求1所述的普洱熟茶来源的菌株，其特征在于：所述的普洱普鲁蓝菌YN3的16S rDNA 如SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1~3任一项所述的普洱熟茶来源的菌株在液体发酵生产α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及胰凝乳蛋白酶中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711037796.8A CN109055251B (zh) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 一种芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711037796.8A CN109055251B (zh) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 一种芽孢杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109055251A true CN109055251A (zh) | 2018-12-21 |
| CN109055251B CN109055251B (zh) | 2021-08-10 |
Family
ID=64676005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711037796.8A Expired - Fee Related CN109055251B (zh) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 一种芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109055251B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728368B (zh) * | 2018-06-22 | 2021-07-16 | 李晓 | 一种纯白色黑木耳菌株及其用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080040827A1 (en) * | 2003-12-16 | 2008-02-14 | Judith Donovan | Secreted Insecticidal Protein and Gene Compositions from Bacillus Thuringiensis and Uses Therefor |
| CN103497907A (zh) * | 2013-08-02 | 2014-01-08 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用 |
| CN104877942A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-02 | 上海大学 | 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 |
-
2017
- 2017-10-31 CN CN201711037796.8A patent/CN109055251B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080040827A1 (en) * | 2003-12-16 | 2008-02-14 | Judith Donovan | Secreted Insecticidal Protein and Gene Compositions from Bacillus Thuringiensis and Uses Therefor |
| CN103497907A (zh) * | 2013-08-02 | 2014-01-08 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用 |
| CN104877942A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-02 | 上海大学 | 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LILI NIU 等: "Aeromicrobium camelliae sp. nov., isolated from Pu"er tea", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728368B (zh) * | 2018-06-22 | 2021-07-16 | 李晓 | 一种纯白色黑木耳菌株及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109055251B (zh) | 2021-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103740618B (zh) | 一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 | |
| CN106011005B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌t600及其菌剂制备方法和应用 | |
| JP6467521B2 (ja) | ストレプトマイセスおよびそれを用いてミルベマイシンａ４を製造する方法 | |
| CN104830708B (zh) | 一株原油降解菌株及其应用 | |
| CN104877936A (zh) | 一株从传统豆豉中分离得到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌菌株 | |
| WO2016155568A1 (zh) | 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素a3的方法 | |
| CN104877942B (zh) | 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 | |
| CN104450571B (zh) | 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株 | |
| CN109706092A (zh) | 一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌及纤溶酶和活菌片剂的制法 | |
| CN109055251A (zh) | 一种芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103114053B (zh) | 产高光学纯度d-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种及其应用 | |
| CN105838646B (zh) | 普鲁兰杆菌新菌种及其培养方法和应用 | |
| CN104805042B (zh) | 一种气微菌及其应用 | |
| CN114292796A (zh) | 一种可降解餐厨废弃物油脂的地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| Jung et al. | Bacillus acidiproducens sp. nov., vineyard soil isolates that produce lactic acid | |
| CN109666598A (zh) | 一种茶杆菌及其应用 | |
| CN106011010B (zh) | 一种产生物乳化剂的斯氏假单胞菌 | |
| CN106167771B (zh) | 一种巨大芽孢杆菌d122及其菌剂和菌剂制备方法 | |
| CN116286557B (zh) | 一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法 | |
| CN116121134B (zh) | 一种毛竹林土地芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115322939B (zh) | 一株产脂肪酶的耐盐德巴克葡萄球菌及其应用 | |
| Chen et al. | Isolation and identification of Halomonas sp. ZSCW-10: a moderately halophilic bacteria strain with cellulase activity | |
| CN106834171A (zh) | 一株高效降解2‑羟基吡啶的球形节杆菌菌株hch‑1及其菌剂制备方法与应用 | |
| CN109868232A (zh) | 一种茶类芽孢杆菌及其应用 | |
| Hidayat | Analysis of 16S rRNA gene lactic acid bacteria (LAB) isolate from Markisa fruit (Passiflora sp.) as a producer of protease enzyme and probiotics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210810 |