CN105838646B - 普鲁兰杆菌新菌种及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种普鲁兰杆菌（Pullulanibacillussp.7578‑24）新菌种及其培养方法和应用。发明所提供的普鲁兰杆菌（Pullullanibacillus sp.）分离自陈熟普洱茶，保藏号为CGMCC No.11827。依据多相分类学方法，该菌株是普鲁兰杆菌属的一个新种，其分类地位是Pullulanibacillus sp.，依据国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该种命名为Pullulanibacillus camelliae sp.nov.。本发明所提供的普鲁兰杆菌新菌种中温生长（30‑37℃），易培养。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的普鲁兰杆菌新菌种具有β‑半乳糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶活性，为β‑半乳糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶在工业、食品、医药和农业等行业应用提供菌种资源。

Description

普鲁兰杆菌新菌种及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰杆菌（Pullulanibacillus sp.7578-24）新菌种及其培养方法和应用。

背景技术

以形态学为分类基础，早期研究将普鲁兰杆菌归入芽孢杆菌属。2006 年，Hatayama 等人将其另立类普鲁兰杆菌属之后，至今仅有3种 (http://www.bacterio.cict.fr/p/pullulanibacillus.html)。模式种为长野解普鲁兰杆菌Pullulanibacillus naganoensis DSM 10191^T。2013年，由Pereira等对普鲁兰杆菌属的相关特性做了修正。好氧生长，产芽孢，细胞呈杆状，革兰氏阳性细胞壁，中温，主要的脂肪酸为异式和反异式饱和脂肪酸。

多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。1987年，国际系统细菌学委员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB）规定，DNA同源性≥70%为细菌种的界限。

普鲁兰杆菌属中的微生物可产生多种酶，具有广泛的应用前景。例如模式种长野解普鲁兰杆菌具有普鲁兰酶活性，普鲁兰酶作为淀粉酶的一种，主要应用在淀粉加工工业中，还应用在饲料、纺织等行业，有着巨大的市场和应用前景。从食品安全和原位酶活激发的角度出发，分离自普洱茶的普洱普鲁兰菌为普洱茶的加工及蛋白酶的其他工业化应用提供菌种资源，具有较好的应用前景。本发明涉及到的一种普鲁兰杆菌（Pullulanibacillus sp.7578-24）新菌种具有β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，为β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在工业、食品、医药和农业等行业应用提供菌种资源。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种普鲁兰杆菌属的新菌种。

本发明的目的之二在于提供该新菌种的培养方法。

为实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种类芽孢杆菌，该菌株的保藏号为CGMCC No.11827。

一种培养上述的普鲁兰杆菌的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将类普鲁兰杆菌接种于培养基中，在20-50℃，pH 6.0-8.0的条件下进行培养。

上述的最适培养温度为30-37℃。

上述的最适pH为6.5-7.5。

上述的培养基中还有质量百分比不超过5%的NaCl。

上述的培养在需氧条件下进行。

上述的普鲁兰杆菌在液体发酵法生产β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶中的应用

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了普鲁兰杆菌属的一个新种，该菌株的分类地位是Pullulanibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Pullulanibacillus camelliae sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用普鲁兰杆菌做出了一定的贡献。本发明的普鲁兰杆菌7578-24，可提取β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。

生物材料保藏信息

本发明的类芽孢菌7578-24，已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.11827。该菌株的分类命名是类芽孢菌Pullulanibacillus sp.，名称为7578-24。

附图说明

图1 显示本发明普鲁兰杆菌新种菌株7578-24的16S rRNA系统发育进化树。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

Paenibacilluspueri YN3^T 分离自本实验室。

实施例1、本发明新菌株7578-24的分离纯化

取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，37℃培养2-3天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。

将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC No.11827。

实施例2、本发明新菌株7578-24的表观特征

1. 菌落特征

取菌株7578-24的单菌落，转接到LB固体培养基（琼脂）上，于37℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株7578-24在LB固体培养基上形成边缘整齐，光滑，湿润，半透明，淡黄色的菌落，直径约1mm。

2. 细胞形态学特征

菌株7578-24细胞为革兰氏阳性杆菌，顶端圆钝，无鞭毛；细胞菌体大小为0.7-0.9μm×2.5-4.4 μm，单生或簇生。

实施例3、本发明新菌株7578-24的生长特性

挑取在LB固体培养基（琼脂）上培养24 h的新鲜培养物，接种到LB液体培养基，37℃摇床培养20~24 h，作为种子。

液体LB培养基的组成（/L）：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5g，蒸馏水定容至1000ml。

1.生长温度：

将所培养的7578-24种子按1%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种LB（液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24 h和48 h时测定其生长情况。得到菌株7578-24生长温度范围为20~50℃，最适温度30-37℃。

2. 生长NaCl 耐受性

所培养的7578-24种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0%、2.0%、5.0%和7.0%的LB培养基，37℃培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。结果显示菌株7578-24的NaCl耐受性为5%。

3. 生长pH 范围

用无菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH将灭好菌的TYB培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0，将所培养的7578-24种子按1%接种量接入，37℃培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。得到菌株7578-24生长的pH范围为6.0~8.0，最适pH为6.5~7.5。

实施例4、本发明新菌株7578-24的生理生化特性

利用API ZYM和API20E鉴定系统（生产厂商：bioMérieux）及常规的生理生化测定方法（东秀珠，蔡妙英等，2001）对菌株7578-24及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。

其中API ZYM 是一个半定量的微量方法系统，专为研究酶活所设计的。该技术对各种标本(组织、细胞、生物体液、洗涤水、土、油，等) 都适用。它可系统和快速地研究 19种酶的活性。用样量极少。实验步骤如下：

1）样品准备：在最小体积稀释标本：可用2 ml无菌蒸馏水或其它如普通的生理盐水不需要缓冲液。制备一个菌悬液，其混浊度在McFarland No 5和No 6之间。从斜面或离心肉汤培养物的纯菌种都能用来制备菌悬液。

2）试验条的准备：准备一个培养盘和盖子。记标本号于盘的侧面。可使用一个塑料洗瓶，分装约5ml蒸馏水于培养盘内，为了培养时能保持一定的湿度。从密封的包装中取出API ZYM试验条，置培养盘内。

3）试验条的接种：用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65µl)。

4）试验条培养：接种后，托盘上放塑料盖子，37℃培养4 小时。所有的测定条件(时间、温度、培养基、悬液浓度)要保持一致。接种的试验条避光保存。

5）试验条的结果观察：培养后，加1滴ZYM A试剂和1滴ZYM B试剂。5分钟后生色，如果是阳性，将试验条置于一个强光源(1000 瓦灯泡)下10秒，把灯泡放在杯上4秒。这是为消除杯中多余坚牢兰的黄色。暴光后阴性反应变为无色。再置试验条于日光下几分钟后，就可产生比较的结果。

6）记录反应：0-5标记相应的颜色深度。0相当于阴性反应，5为最强反应。2-4 是二者之间的强度。从颜色深度可知近似的微毫克分子浓度(nM) ：1相当释放5微毫克分子浓度(5 nM)，2相当于10 nM，3为20nM，4为30nM，5为40nM或更高。

菌株7578-24的主要生理生化特征：好氧生长；接触酶阳性；β-半乳糖苷酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，脲酶阳性，酯酶（C4）阳性，类脂酯酶（C8）阳性，胰凝乳蛋白酶阴性，不产生吲哚，VP反应阳性，不水解Tween 60，水解七叶灵；液化明胶；不水解酪蛋白；不水解淀粉；还原硝酸盐；能利用葡萄糖、甘露糖、甘油、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等作为碳源；不利用麦芽糖、纤维二糖、糖原、乳酸、甲酸、延胡索酸、柠檬酸盐、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸与组氨酸等底物。

菌株7578-24在胰凝乳蛋白酶活性，α-岩藻糖苷酶活性及α-甘露糖苷酶活性等方面与同源性接近的菌株Pullulanibacillus pueri YN3^T具有明显差异。

实施例5、本发明新菌株7578-24（CGMCC No.11827）的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定及16S rRNA系统发育特征。

1.提取基因组DNA

将普鲁兰杆菌Pullulanibacillus sp.7578-24（CGMCC No.11827）接种于LB液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心1分钟，去除上清液；用TES (50 mMTris，50 mM EDTA-Na₂，50mM NaCl，pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.4 mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温1小时；加入0.04 mL20%SDS，60℃保温30分钟；加入0.18 mL5M NaClO₄，混匀；加入等体积氯仿-异戊醇(24: 1)，轻轻摇匀1分钟左右，离心（12000转/分钟，10分钟），吸取上清液；上清液加入20 μl 0.2 % RNA酶37℃保温30 分钟，氯仿-异戊醇（24: 1，v/v）处理一遍；上清液加入20 μl蛋白酶K (50-70 μg/mL)，37℃保温1小时，氯仿-异戊醇（24: 1，v/v）处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟，12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。

2.16S rRNA基因的PCR扩增及测序

用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因的8-27和1541-1557碱基。PCR反应体系（20 μl）为：10×buffer 2μl、25 mmol/L MgCl₂2μl、10mmol/L dNTPs 1.5μl、30 pmol/L 引物各1μl、ddH₂O 13.4μl、Taq DNA酶 1μl、模板1μl。PCR反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min30s，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。

PCR 产物的测序采用 ABI BigDye3.1测序试剂盒 (Applied Biosystems) 和DNA自动测序仪 (model ABI3730; Applied Biosystems)。

测序结果表明，菌株7578-24（CGMCC No.11827）16S rRNA基因序列长度为1512bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

如上所述的16S rRNA 序列使用软件MEGA version6.0.software package绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-likelihood 和maximum-parsimony进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1 所示。同源性分析表明，菌株7578-24属于普鲁兰杆菌属，与普洱普鲁兰菌Pullulanibacillus pueri、P. naganoensis和P.uraniitolerans聚在一个分支，16S rRNA的同源性最高，分别为为97.6%、94.0和93.4%。通常两个菌株的16S rRNA同源性小于97%时可界定为不同的种，但多相分类学研究认为一个种的确定不应只依据一个单一的标准，有待其他生理生化指标、化学特征分析及DNA-DNA同源性等指标的分析，才能确定菌株7578-24的分类地位。

实施例6 本发明新微生物的脂肪酸含量特征

菌株7578-24的总脂肪酸含量的测定。

配置如下溶液：I，45g 氢氧化钠溶于150ml 甲醇及150ml 蒸馏水；II，190ml 浓盐酸，275ml 甲醇溶于135ml 蒸馏水；III，200ml 正己烷与200ml 乙醚混合均匀；IV，10.8 克氢氧化钠溶于900ml 蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。

1）取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液 ，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；

2）待样品管冷却后，加入2ml溶液，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；

3）在冷却的样品管中加入1.25ml溶液，快速振荡10min左右，弃去下层水相；

4）在剩余有机相中加入3ml溶液及几滴溶液，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.01）；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33mm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每min5℃升至260℃，随后以40℃/ min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃， 载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ml；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气（氮气）流速30ml/min。

结果显示，菌株7578-24的主要细胞脂肪酸为反异式饱和脂肪酸anteiso-C_17:0和不饱和脂肪酸C_18:1 ω7c，百分含量分别为30.6%和45.4%。符合普鲁兰杆菌属主要的脂肪酸类型。而且同相似菌株脂肪酸种类与含量上，均有差异，以此判断同相似菌株属于不同种类。

实施例 7 本发明新微生物的G + C mol%含量特征

菌株7578-24基因组DNA的G+C mol%含量测定。

使用熔解温度(Tm)法，以大肠埃希氏(E.coli K12，AS1.365)为参比对照，所用仪器为Agilent Technologies公司Cary Series UV-Vis Spectrophotometer，用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下:

1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD₂₆₀nm 值于0.3 ~ 0.4之间；

2） 在波长260nm首先记录25°C的OD值，然后设定升温程序，从30℃开始到95°C,其间每分钟升高1℃；

3）OD值上升表示变性开始,记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；

4）根据热变性曲线，得出熔链温度(Tm)，计算G+C mol%含量。

在0.1×SSC溶液中计算公式为:

G+C mol%=G+Cmol% （AS1.365）+ 2.08 (Tm_未知- Tm _AS1.365)

试验测定的E.coli K12 _AS1.365的Tm为79.07 °C和51.2 mol%，待测菌株7578-24的Tm值和G+Cmol%分别为76.02 °C和45 mol%。

实施例8 本发明新微生物的DNA-DNA杂交试验

菌株7578-24同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。

参考16S rRNA的结果，对7578-24与遗传亲缘关系最相似的种Pullulanibacilus Pueri YN3^T\进行DNA-DNA杂交试验。

采用液相复性率方法，所用仪器为Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。温度控制用Peltier temperature-controlling programmer数字控温程序。步骤如下：

1）DNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm 2.0，将DNA样品剪切2~5×10⁵道尔顿的片段。

2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC 精确配制成为OD260nm1.8~ 2.0，且两者OD260nm 值一致；

3）进入Kinetics程序，出现其方法窗口，在方法窗口中设置合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×（G+C）mol%+47 计算。

4）取两株菌种DNA样品各720 μl分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA 样品各360 μl 装在同一个离心管中为混合样品；

5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过空气浴（Themomixer, Eppendorf生产）100℃变性10min，然后迅速转移到预热的比色皿中，降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；

6）以时间为横坐标，OD260nm为纵坐标，绘制复性曲线，该线的斜率即为DNA 的复性速率（VM；VA；VB）。

DNA同源性计算：依据De Ley等的公式计算

H% = (4VM-VA-VB) / 2(VA× VB) 1/2 ×100%

DNA-DNA杂交的结果如下：

菌株7578-24与Pullulanibacillus pueri YN3^T的DNA相关性为35.0%，远低于国际系统细菌学委员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB）在1987年关于DNA相关性70%为细菌种的界限规定。结合实例2，3，4，5，6，7，8的数据，由此判定，菌株7578-24为Pullulanibacillus属的一个新菌种，该菌株的分类地位是Pullulanibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus camelliaesp.nov.，并选菌株7578-24为该种的模式菌株。

实施例9 本发明新微生物的用途

经API ZYM鉴定系统（生产厂商：bioMérieux）测定，菌株7578-24具有β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖苷酶。

β-半乳糖苷酶，俗称乳糖酶，能催化β-半乳糖苷键发生水解。目前，乳糖酶的应用领域很广。在乳品工业中，乳糖酶可用于生产低乳糖制品和低聚半乳糖。在乳品加工中，采用乳糖酶水解乳糖，可以避免冷冻浓缩乳制品中乳糖的结晶、乳清析出等问题。在酸奶的生产中，可加速酸化反应和提高发酵效率，使酸奶具有特有的乳香风味。在干酪生产中，可以加速干酪的成熟。在分析方面，将葡萄糖氧化酶和乳糖酶联合使用制备生物传感器，直接测定牛乳等乳制品中乳糖的含量，该法简便快捷，费用低廉。在环境保护方面，乳糖酶可以分解乳清中的乳糖，减缓乳清排放后较高的生物需氧量对水造成的污染。随着人们对乳糖酶的进一步研究，乳糖酶的应用范围越来越广，微生物来源的乳糖酶备受人们关注。不同来源的乳糖酶的特性不同，其应用范围也存在差异，获得更多的产乳糖酶的微生物资源可以提高酶的适应性。

β-葡萄糖苷酶，亦称纤维二糖酶，能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，是将纤维素转化为葡萄糖的关键酶。除了在降解纤维素方面有着重要作用外，β-葡萄糖苷酶在其他领域的应用也越来越广泛，包括食品、酿酒、医药和化学工业等。据研究报道，经β-葡萄糖苷酶处理的果酒，香气更加浓郁协调，风味显著提高；经β-葡萄糖苷酶处理桔子、苹果、葡萄等多种水果汁后，风味成分大大提高；香气形成机理研究结果表明，β-葡萄糖苷酶活性与茶叶中醇系香气如芳香醇及其氧化物，香叶醇、橙花醇和苯乙醇等的形成有着密切关系；据报道，豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物，都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元。

经API ZYM鉴定系统（生产厂商：bioMérieux）测定，菌株7578-24具有较高活性的β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶（具体鉴定过程见实施例4）。作为微生物来源的β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在工业、食品、医药和农业等行业具有有广泛应用。

<110> 上海大学

<120> 普鲁兰杆菌新菌种及其培养方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> Pullulanibacillussp.

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

gcgggaagca gaaagaactc ttcggagtga tttttgtgga acgagcggcg gacgggtgag 120

taacacgtgg gcaacctgcc cgtaagacgg ggataacttc gggaaaccgg agctaatacc 180

ggataatctt tagcaccgca tggtgcgaga gtgaaagatg gttctgccat cacttacgga 240

tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatgcgta 300

gccaacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 360

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 420

cgaggaaggt cttcggatcg taaagctctg ttgttagaga agaacaagtg ccataggaaa 480

tgatggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccccggct aactacgtgc cagcagccgc 540

ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 600

cttcttaagt ctgatgtgaa agcccgtggc tcaaccacgg agggtcattg gaaactgggg 660

agcttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 720

tggaggaaca ccagtggcga aagcggctct ctggtctgtc actgacgctg aggcgcgaaa 780

gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 840

ggtgttaggg ggtccaaccc ttagtgctga agttaacaca ttaagcactc cgcctgggga 900

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tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgagaccc 1020

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gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1140

ccagcattaa gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcggta 1260

caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcg aatcccataa aaccgttctc agttcggatt 1320

gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aattgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1380

cggtgaatcc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgagg gtttgtaaca 1440

cccgaagtcg gtgaggtaac cttcgggaac cagccgccga aggtgggaca aatgattggg 1500

gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggatcacctc ctt 1560

Claims (7)

1.一种普鲁兰杆菌(Pullulanibacillus camelliae)，该菌株的保藏号为CGMCCNo.11827。

2.一种培养根据权利要求1所述的普鲁兰杆菌的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将普鲁兰杆菌接种于培养基中，在20-50℃，pH6.0-8.0的条件下进行培养。

3.根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述的培养温度为30-37℃。

4.根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述的pH为6.5-7.5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养基中还有质量百分比不超过5％的NaCl。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养在需氧条件下进行。

7.根据权利要求1所述的普鲁兰杆菌在液体发酵法生产β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶中的应用。