CN103114053B - 产高光学纯度d-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)以及该亚种所涉及的4个菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-5)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)和棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)。本发明还涉及采用本发明的棒状乳杆菌陕西亚种或所述菌株发酵产生的D-乳酸单体以及由D-乳酸单体聚合成的聚乳酸制品，还涉及本发明的棒状乳杆菌陕西亚种或所述菌株在制备D-乳酸单体以及在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物新亚种及其应用，具体地，涉及产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)以及该亚种的四个菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)和棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-10)，和它们的应用。
背景技术
乳酸是一种重要的可降解、无污染的化工原料，其在医药、食品、石油化工等领域有着广泛的用途，具有重要的经济价值。因此便捷、高效的乳酸合成或制备方法成为当前的重要研究方向，同时技术上的突破也具有较广阔的实用价值和前景。
乳酸学名2-羟丙酸，因分子中含有一个不对称碳原子，形成右旋、左旋两种旋光异构体，将右旋乳酸简称D-乳酸、左旋乳酸简称L-乳酸。
利用乳酸生产出的聚乳酸(PLA)，这种聚合物有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解的最终产物是二氧化碳和水，对人体及环境无害。聚乳酸具有十分广阔的用途，如应用于医药方面的手术缝合线、药物控释制剂和骨折内固定材料等。同时聚乳酸作为生物塑料原料近年受到广泛关注。研究表明用纯L-乳酸制成的聚乳酸(PLLA)具有“质地脆硬、强度差、不易加工”等缺点，且成本较高，应用受到较大的限制。如果将L-乳酸与D-乳酸按一定比例聚合后，可制成“具耐热性”的聚乳酸立构复合物(stereo complex，SC-PLA)，SC-PLA的强度及耐热性均可得到大幅度改善，应用领域大大拓宽。
目前工业上生产或制备L-乳酸的技术相对较为成熟，而D-乳酸的制备较为复杂、且成本较高，D-乳酸的制备技术或方法成为影响乳酸相关产业发展的瓶颈，因此研究或发展一种低成本、高效、便捷的D-乳酸生产或制备技术成为该领域的重大课题，探寻高产率、高光学纯度的产D-乳酸的菌株成为极有意义及价值的研究方向。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，现有技术中缺乏产高光学纯度D-乳酸的菌株。为了解决该技术问题，本发明提供一种能够产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)。
本发明提供了能够产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)。
该陕西亚种分离自陕西西安地区的民间传统酸菜。
本发明筛选的该棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)具体涉及4个菌株，分别是产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)，保藏编号为CGMCC No.6891；产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformissubsp.shaanxiensis SZD-5)，保藏编号为CGMCC No.6892；产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)，保藏编号为CGMCC No.6893；产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)，保藏编号为CGMCC No.6894。
本发明提供了一种D-乳酸单体，采用本发明的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株通过发酵而获得。
本发明还提供了一种聚乳酸制品，采用本发明的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株发酵产生的D-乳酸单体聚合制成。
本发明还涉及本发明的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株在制备D-乳酸单体中的应用。
本发明还涉及本发明的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
所述聚乳酸制品是手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。
所述聚乳酸制品还可以是生物塑料制品。
本发明的陕西亚种或菌株具体通过如下方法分离得到：取陕西西安地区民间传统酸菜原液；用灭菌接种环取原液，在血平板上三区划线接种，35℃培养48小时后观察菌落生长状况；用灭菌接种环从平板上选取菌落形态不同的菌落，分别采用三区划线法接种于不同的血平板，35℃培养48小时，观察每个平板菌落形态是否一致，重复以上操作直至每个平板上菌落形态一致，最终分离到4株产高光学纯度D-乳酸的菌株，即SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10。
分离筛选得到的4株菌均为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，兼性厌氧，在pH4.5生长，接触酶及氧化酶阴性，产乳酸，不产吲哚和硫化氢，不液化明胶，根据《伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey′smanual of systematic bacteriology.2009，2nd ed.Vol.3.Springer.p.)，可鉴定其属于乳杆菌属(Lactobacillus)。
根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(1999年，中国轻工业出版社)、《伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey′s manual ofsystematic bacteriology.2009，2nd ed.Vol.3.Springer.p.)，分离筛选得到的4株菌对碳水化合物发酵的性质符合乳杆菌属棒状乳杆菌。另外，这4株菌的16S rDNA基因序列与乳杆菌属棒状乳杆菌已知的两个亚种(棒状乳杆菌棒状亚种和棒状乳杆菌扭曲亚种)相应序列的相似率均达99％以上。因此，可将其确定为乳杆菌属棒状乳杆菌种(Lactobacillus coryniformis)。
目前棒状乳杆菌分为棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)和扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)，从生化特性区分二者主要依据所产乳酸旋光性、部分碳水化合物的发酵试验及石蕊牛奶试验等。综合分离筛选得到的4株菌的产乳酸旋光性、对碳水化合物的发酵及石蕊牛奶试验结果，该4株菌与两个已知亚种均不完全相符。另外，该4株菌的4个种内基因序列差异较大的蛋白编码基因序列和棒状乳杆菌的两个已知亚种均不完全相符。
综合分离筛选得到的4株菌的形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果以及4种蛋白编码基因同源性鉴定结果，将该4株菌鉴定为乳杆菌属棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的新亚种，即陕西亚种。
本发明提供的乳杆菌属棒状乳杆菌陕西亚种的各个菌株所产D-乳酸的光学纯度均高达100％，用其可以制备各种需要D-乳酸作为原料的聚乳酸制品，例如应用于医药方面的手术缝合线，药物控释制剂和骨折内固定材料或者生物塑料原料或具有耐热性的高强度SC-PLA制品。
本发明菌株的保藏信息
棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2，本文中简称为“SZD-2”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏日期：2012年11月28日；保藏编号CGMCC No.6891。
棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5，本文中简称为“SZD-5”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏日期：2012年11月28日；保藏编号CGMCC No.6892。
棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9，本文中简称为“SZD-9”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏日期：2012年11月28日；保藏编号CGMCC No.6893。
棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10，本文中简称为“SZD-10”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏日期：2012年11月28日；保藏编号CGMCC No.6894。
附图说明
图1：A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株的菌落外观形态图；
图2：A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株革兰氏染色结果的显微镜照片图(×1000放大倍数)；
图3：A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株芽孢染色结果的显微镜照片图(×1000放大倍数)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
本发明实施例中所用到的仪器型号参数说明如下：
显微镜：生物显微镜olympus-cx31-32CO2。
培养箱：HWS-350智能恒温恒湿箱，宁波海曙赛福实验仪器厂。
浊度计：浊度计DL-ZD1，珠海迪尔生物工程有限公司。
离心机：白洋B80型自动平衡离心机，白洋离心机厂。
恒温器：其林贝尔干式恒温器GL-150，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
离心机：TG16-WS台式高速离心机，长沙卢湘仪离心机仪器有限公司。
PCR仪：Bio-Rad iCycler PCR仪，上海爱丁堡生物科技发展有限公司。
电泳仪：EPS-100核酸电泳仪，上海圣科仪器设备有限公司。
凝胶成像分析系统：Gel Logic 100凝胶成像分析系统，美国柯达公司。
高效液相色谱仪：Waters高效液相色谱仪2695，美国沃特世公司；waters紫外检测器2489，美国沃特世公司；色谱柱：型号为Chirex 3126(D)-penicillami的手性柱，内径4.6mm，长度250mm，美国菲罗门公司；L-乳酸(色谱纯，98％纯度)，美国西格玛-奥德里奇公司出品；D-乳酸(色谱纯，93％纯度)美国西格玛-奥德里奇公司出品。
本发明实施例中所用到的试剂说明如下：
血平板(英国OXOID哥伦比亚血琼脂平板BR9CM，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司出售)：每升含蛋白胨10g，牛肉浸出粉10g，氯化钠5g，琼脂15g，脱纤维羊血80ml，pH 7.4+0.2。
MRS肉汤培养基基础(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)：每升含葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801ml，pH值6.2±0.1。
MRS液体培养基：MRS肉汤培养基基础48g+蒸馏水1000ml，121℃灭菌15分钟。
MRS固体培养基：MRS肉汤培养基基础48g+琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)15g+蒸馏水1000ml，121℃灭菌15分钟。
MRS半固体培养基：MRS肉汤培养基基础48g+琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)5g+蒸馏水1000ml，121℃灭菌15分钟。
保藏菌种用培养基：MRS肉汤培养基基础48g+碳酸钙(天津市光复科技发展有限公司出售)10g+蒸馏水1000mL，121℃灭菌15分钟。
吲哚试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。
硝酸盐还原试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：蛋白胨10g，硝酸钾2g，蒸馏水1000ml。
明胶液化试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000ml。
柠檬酸盐利用试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：硫酸镁0.2g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸钠5g、琼脂20g，0.2％溴麝香草酚蓝溶液40ml，蒸馏水1000ml。
硫化氢试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：蛋白胨20g，牛肉粉3g，氯化钠10g，酵母粉3g，乳糖10g，葡萄糖1g，柠檬酸铁铵0.5g、硫代硫酸钠0.5g，蒸馏水1000ml。
精氨酸双水解试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售)：蛋白胨5g，肉浸膏5g，葡萄糖0.5g，吡多醛5mg，L-精氨酸10g，1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.625ml，甲酚红液2.5ml，蒸馏水1000ml。
淀粉水解培养基基础(杭州百思特生物技术有限公司出售)：蛋白胨5g，牛肉粉5g，淀粉3g，琼脂15g，氯化钠5g。
淀粉水解试验固体培养基：淀粉水解培养基基础33g，MRS肉汤培养基基础12g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌15分钟。
石蕊牛奶生化管(青岛日水生物技术有限公司出售)：脱脂奶粉100g，石蕊0.75g，蒸馏水1000ml。
API50CHL培养基(法国生物梅里埃公司出售)：多胨10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，溴甲酚酯0.17g，蒸馏水1000ml。
API50CH碳水化合物鉴定试剂条(法国生物梅里埃公司出售)，含阴性对照及以下49种碳水化合物：D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、水杨苷、D-麦芽糖、D-蔗糖、葡萄糖酸钾、甘露醇、赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、甲基-βD吡喃木糖苷、卫茅醇、肌醇、甲基-aD吡喃甘露糖苷、甲基-aD吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷、D-纤维二糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-海藻糖、菊粉、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-龙胆二糖、D-土伦糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇、2-酮基葡萄糖酸钾及5-酮基葡萄糖酸钾。
Chelex-100树脂：BioRad公司(美国伯乐公司)
Biowest Regular Agarose G-10(西班牙琼脂糖G-10)：Gene Co.LTD(美国基因有限公司)。
LA Taq(长片段保真Taq DNA聚合物酶)：TaKaRaBiotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
Ex Taq(高保真Taq DNA聚合物酶)：TaKaRa Biotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)(10倍长片段保真Taq酶PCR缓冲液II(加入Mg2+))：TaKaRa Biotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)(10倍高保真Taq酶PCR缓冲液(加入Mg2+))：TaKaRa Biotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
dNTP Mixture(dNTP混合物)：TaKaRa Biotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
6×Loading Buffer(6倍上样缓冲液)：TaKaRa Biotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
DL2,000DNA Marker (DL2,000DNA 标记)：TaKaRaBiotectnology(Dalian)Co.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。
细菌16S rDNA通用引物(F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，R：5’ACGGCTACCTTGTTACGACTT3’)：由生工生物工程(上海)有限公司合成。
HSP60基因、pheS基因、rpoA基因及tuf基因的相应PCR引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
实施例1乳杆菌属棒状乳杆菌陕西亚种中各个菌株的鉴定
(1)本发明的菌株的分离筛选过程
随机取12份陕西西安地区民间传统酸菜原液；用灭菌接种环取原液，在血平板上三区划线接种，35℃培养48小时后观察菌落生长状况；用灭菌接种环从平板上选取菌落形态不同的菌落，分别采用三区划线法接种于不同的血平板，35℃培养48小时，观察每个平板菌落形态是否一致，重复以上操作直至每个平板上菌落形态一致，最终分离到4株产高光学纯度D-乳酸的菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)。
(2)4个菌株的产乳酸旋光性实验
实验方法：
采用高效液相色谱法测定D-乳酸、L-乳酸的含量。
色谱条件：
流动相：2mmol/L CuSO4溶液(溶剂为5％的异丙醇溶液)，使用前经0.45μm滤膜过滤；流动相流速为0.7ml/min；柱温30℃；紫外检测器，检测波长为254am；
分析步骤：
按上述色谱条件准备好色谱仪和流动相；将试验菌株新鲜培养物接种于MRS液体培养基，35℃培养48小时。将发酵液在8000r/min下离心15分钟，上清液再通过0.45μm滤膜过滤，取1ml滤液进行10倍稀释，然后超声脱气，即为待测液；将待测液样品放入样品瓶中，进样量20μl，进样时间30分钟。使用标准曲线法，根据已建立的标准曲线积分计算出待测液样品中D-乳酸及L-乳酸的含量。
实验结果：见表1
表1产乳酸旋光性实验结果
(3)菌体的形态及生理特征鉴定实验
实验方法：
菌落及细菌形态观察：将试验菌株分别采用三区划线法接种于MRS平板，烛缸法35℃培养48小时后肉眼观察菌落形态。用灭菌接种环挑取单个菌落，涂于滴有生理盐水的载玻片上，显微镜下观察有无动力。涂片风干后火焰固定，革兰氏染色观察细菌形态，石炭酸复红法染色观察有无芽孢。MRS平板置于室温10天后再次石炭酸复红法染色观察有无芽孢。
温度梯度试验：将试验菌株新鲜培养物接种于MRS液体培养基，设阴性对照，分别置于4℃、15℃、35℃、45℃培养2周，逐日肉眼观察培养基是否混浊、有无沉淀，最后将液体培养基取样涂片革兰氏染色显微镜下观察。培养基变混浊且(或)有沉淀，涂片见革兰氏阳性杆菌者为阳性。
耐酸碱生长试验：用1mmol/L盐酸溶液及4％碳酸氢钠溶液将MRS液体培养基pH值分别调至2.5、3.5、4.5、6.0、7.0、8.0、9.0及10.0。将试验菌株新鲜培养物分别接种于以上不同pH值的MRS液体培养基，设阴性对照，35℃培养2周。逐日肉眼观察培养基是否混浊、有无沉淀，最后将液体培养基取样涂片革兰氏染色显微镜下观察。培养基变混浊且(或)有沉淀，涂片见革兰氏阳性杆菌者为阳性。
耐盐生长试验：向MRS液体培养基内添加不同量的NaCl，使其NaCl含量(g/100ml)分别为4.5、6.5、9.0及18.0。将试验菌株新鲜培养物分别接种于以上不同NaCl含量的MRS液体培养基，设阴性对照，35℃培养2周。逐日肉眼观察培养基是否混浊、有无沉淀，最后将液体培养基取样涂片革兰氏染色显微镜下观察。培养基变混浊且(或)有沉淀，涂片见革兰氏阳性杆菌者为阳性。
需氧试验：将试验菌株新鲜培养物接种于MRS液体培养基，35℃培养48小时。肉眼观察培养基是否混浊，有无沉淀，表面有无菌膜形成。培养基清亮，表面有菌膜，为专性需氧菌。培养基均匀混浊或伴有沉淀，表面无菌膜，为兼性需氧菌；培养基上部清亮，下部变混浊且(或)有沉淀，为专性厌氧菌。
实验结果：
菌落及细菌形态观察：所有试验菌株菌落均呈圆形，直径约0.5-2mm，乳白色，有光泽，边缘整齐，表面光滑、湿润、微凸(如图1A至D所示)。显微镜下观察细菌呈短杆状，无动力，少数呈短链状排列，革兰氏染色阳性(如图2A至D所示)，芽孢染色无芽孢(如图3A至D所示)。
温度梯度试验：SZD-2、SZD-5、SZD-9和SZD-10菌株各自均呈现出，4℃不生长，15℃及35℃生长良好，45℃迟缓生长。
耐酸碱生长试验：SZD-2、SZD-5、SZD-9和SZD-10菌株各自均呈现出，pH 2.5不生长，pH 3.5、4.5、6.0、7.0、8.0、9.0生长良好，pH10.0不生长。
耐盐生长试验：SZD-2、SZD-5、SZD-9和SZD-10菌株各自均呈现出，4.5％NaCl生长良好，6.5％NaCl迟缓生长，9％NaCl部分(SZD-2、SZD-9、SZD-10)迟缓生长，18％NaCl不生长。
需氧试验：SZD-2、SZD-5、SZD-9和SZD-10菌株均为兼性厌氧菌。
(4)生化特征鉴定实验
实验方法：
接触酶试验：将试验菌株新鲜培养物接种于MRS固体培养基，35℃培养48小时，挑取单个菌落，涂于干净的载玻片上，然后滴加3％的过氧化氢溶液，有气泡为阳性反应，无气泡为阴性反应。
氧化酶试验：将试验菌株新鲜培养物接种于MRS固体培养基，35℃培养48小时，用无菌棉签沾取少量培养物，在棉签上滴加氧化酶试剂1-2滴，棉签变蓝色为阳性反应，不变色为阴性反应。
葡萄糖产气试验：将试验菌株新鲜培养物穿刺接种于MRS半固体培养基，35℃培养48小时，观察培养基内有无气泡产生，有气泡产生为阳性反应，无气泡产生为阴性反应。
明胶液化试验：将试验菌株新鲜培养物接种于明胶试验培养基，35℃培养48小时后将明胶试验培养基轻轻放入4℃冰箱30分钟，观察明胶培养基的液化状况，培养基呈液化状态为阳性，仍呈固体状态为阴性。
吲哚试验：将试验菌株新鲜培养物接种于吲哚试验培养基，35℃培养48小时。慢慢滴加吲哚试剂数滴于培养物液面，轻轻摇动，出现玫瑰红色为阳性反应，出现黄色为阴性反应。
硫化氢试验：将试验菌株新鲜培养物接种于硫化氢试验培养基，35℃培养48小时。培养基呈黑色为阳性反应，无变化为阴性反应，阴性者继续培养至6天，如仍未变黑判为阴性。
硝酸盐还原试验：将试验菌株新鲜培养物接种于硝酸盐还原试验培养基，35℃培养48小时。加入甲液(对氨基苯磺酸0.8g+2.5mol/L乙酸溶液100ml)和乙液(甲萘胺0.5g+2.5mol/L乙酸溶液100ml)各2滴，呈现红棕色为阳性反应，不变色为阴性反应。
精氨酸双水解试验：将试验菌株新鲜培养物接种于精氨酸双水解试验培养基，35℃培养48小时。培养基呈现红色为阳性反应，不变色为阴性反应。
柠檬酸盐利用试验：将试验菌株新鲜培养物划线接种于柠檬酸盐培养基斜面上，35℃培养4天。逐日观察，培养基从绿色变成蓝色为阳性反应，不变色为阴性反应。
石蕊牛奶反应：将试验菌株新鲜培养物接种于石蕊牛奶生化管，用无菌液体石蜡封管，35℃培养2周。逐日观察，牛奶呈现粉红色为产酸，呈现蓝色为产碱，呈现白色为还原，变澄清为胨化，有凝块或变成凝乳为凝固，液面有气泡为产气。
淀粉水解试验：将试验菌株新鲜培养物接种于淀粉水解试验固体培养基上，35℃培养48小时。向培养基内滴入卢哥氏碘液(1g碘，2g碘化钾，溶于300ml水配成溶液)，培养基呈深蓝色、菌落周围出现无色透明环为阳性反应，菌落周围未出现无色透明环为阴性反应。
以上试验均设阴性对照。
实验结果：见表2
表2常规生化试验结果
(35℃培养48小时)
(5)本发明的菌株对碳水化合物的发酵实验
实验方法：
用API 50CH碳水化合物鉴定试剂条进行实验，包括阴性对照及49种碳水化合物。按照说明书制备相当于2个麦氏浊度的菌悬液，将菌悬液加到试剂条上的50个管中，用无菌液体石蜡封管，35℃培养24小时及48小时各观察1次结果。试剂条变为黄色为阳性反应，变为绿色为弱阳性反应，不变色为阴性反应。本实验前后重复2次。
实验结果：见表3
表3碳水化合物发酵试验结果
(35℃培养48小时)
注：+阳性，-阴性，±弱阳性，v两次实验结果不一致，括号内为两次实验结果。所有菌株阴性对照及其它33种碳水化合物(甘油、赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、甲基-βD吡喃木糖苷、卫茅醇、肌醇、甲基-αD吡喃甘露糖苷、甲基-αD吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷、D-纤维二糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-海藻糖、菊粉、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-龙胆二糖、D-土伦糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇、2-酮基葡萄糖酸钾、5-酮基葡萄糖酸钾)均为阴性。
(6)16S rDNA基因联合多种蛋白编码基因同源性鉴定
实验方法：
提取上述4个菌株基因组DNA，应用细菌16S rDNA基因通用引物并设计棒状乳杆菌4种蛋白编码基因(HSP60基因、pheS基因、rpoA基因、tuf基因)的相应特异性引物，进行PCR扩增，并对扩增产物纯化后测序。
其中，以上基因的相应引物和PCR扩增的条件如下：
引物：
16S rDNA基因：
F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT
HSP60基因：
F：TGG TGA TGG GAC GAC CAC TGC
R：GTT CCA CGG ATC TTG TTC
pheS基因：
F：CCGAAAGATCATCCCGCTCGC
R：ATCAACGCCCGCTGCCTTC
rpoA基因：
F：GCGGCGTATCCTCTTGGCTT
R：TCATCATGTCAGCTTCAGTCTTGT
tuf基因：
F：CGC AAC TGA TGG CCC AAT GCC
R：ATG ACG GCC ACC TTC GTC CTT G
以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
PCR反应：将上述4个菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用25μl反应体系进行PCR扩增。
16S rDNA基因PCR反应体系由无菌超纯水15μl、10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)2.5μl、dNTP Mixture(各1.25mM)4μl、引物F(10μM)及引物R(10μM)各1μl、LA Taq(5U/μl)0.25μl、基因组DNA 2μl组成。循环参数：94℃预变性5分钟→94℃变性30秒→60℃退火30秒→72℃延伸2分钟→30个循环→72℃延伸5分钟。
4种蛋白编码基因反应体系相同，由无菌超纯水17μl、10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μl、dNTP Mixture(各2.5mM)2μl、引物F(10μM)及引物R(10μM)各1μl、Ex Taq(5U/μl)0.125μl、基因组DNA 2μl组成。循环参数：94℃预变性5分钟→94℃变性30秒→55℃退火30秒→72℃延伸1分钟→35个循环→72℃延伸6分钟。
扩增反应完毕后，取5μl PCR产物+1μl 6×Loading Buffer，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，通过凝胶成像分析系统照相并观察，确认目标基因扩增成功。
将扩增成功的PCR产物送北京天一辉远生物科技有限责任公司纯化并测序。将测得的受试菌株的16S rDNA基因序列分别与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)及Ribosomal DatabaseProject(http://rdp.cme.msu.edu/indexjsp)中已注册的核酸序列进行同源性比较；蛋白编码基因序列与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中已注册的核酸序列进行同源性比较。
实验结果：
对于以上5个基因，4个菌株测序结果完全一致。5个基因的Genbank登录号如下：
16S rDNA基因：JX914660；
HSP60基因：JX962355；
pheS基因：JX962356；
rpoA基因：JX966341；
tuf基因：JX962357。
同源性鉴定结果如下：
注：(1)标*为与Ribosomal Database Project中的序列进行比对，未标者为与GenBank中的序列进行比对。(2)括号内数字分子为比对后与注册基因序列一致的核苷酸数，分母为进行比对的总核苷酸数。
上面(3)和(4)的鉴定实验表明，本发明分离筛选得到的4株菌均为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，兼性厌氧，在pH4.5生长，接触酶及氧化酶阴性，产乳酸，不产吲哚和硫化氢，不液化明胶，石蕊牛奶试验中使牛奶酸化，根据《伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey′smanual of systematic bacteriology.2009，2nd ed.Vol.3.Springer.p.)，可鉴定其属于乳杆菌属(Lactobacillus)。
上面(5)的实验表明，本发明分离筛选得到的4株菌均发酵甘露醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖，麦芽糖；所有菌株不发酵乳糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、松三糖、木糖及海藻糖。根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(1999年，中国轻工业出版社)、《(伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey′s manual of systematic bacteriology.2009，2nded.Vol.3.Springer.p.)，以上特性符合棒状乳杆菌。另外，上面(6)的实验表明，本发明分离筛选得到的4株菌的16S rDNA基因序列与棒状乳杆菌两个已知亚种相应序列的相似率均达99.9％以上。因此，可鉴定其属于乳杆菌属棒状乳杆菌种(Lactobacillus coryniformis)。
目前棒状乳杆菌分为棒状亚种和扭曲亚种，从生化特性区分二者主要依据所产乳酸旋光性、部分碳水化合物的发酵试验及石蕊牛奶试验等。上面(4)和(5)的实验表明，本发明分离筛选得到的4株菌均水解七叶灵并发酵水杨苷，部分菌株(SZD-2、SZD-10)发酵山梨醇，不符合棒状乳杆菌扭曲亚种特性。本发明分离筛选得到的4株菌均产D-乳酸，使牛奶酸化，均不发酵鼠李糖，不符合棒状乳杆菌棒状亚种特性。依据以上特性，该4株菌与棒状乳杆菌两个已知亚种均不完全相符。
另外，上面(6)的鉴定实验表明，本发明分离筛选得到的4株菌的pheS基因序列与棒状乳杆菌棒状亚种相应序列的相似率为100％，与扭曲亚种相应序列的相似率为97.88％，而rpoA基因序列与棒状乳杆菌扭曲亚种相应序列的相似率为100％，与棒状亚种相应序列的相似率为98.65％；tuf基因序列与棒状乳杆菌扭曲亚种及棒状亚种相应序列的相似率均为99％以上，而HSP60基因序列与棒状乳杆菌扭曲亚种及棒状亚种相应序列的相似率为97.82-98.25％。因此，该4株菌的4个蛋白编码基因序列和棒状乳杆菌的两个已知亚种均不完全相符。
综合分离筛选得到的4株菌的形态学特征、生理生化特征、16S rDNA基因以及4种蛋白编码基因同源性鉴定结果，将该4株菌鉴定为乳杆菌属棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的新亚种，命名为棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)。
关于以往棒状乳杆菌棒状亚种及扭曲亚种的产乳酸性能说明
《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey′s manual of systematic bacteriology.2009，2nd ed.Vol.3.Springer.p.)中将乳酸菌所产乳酸分为D，L，DL，D(L)，L(D)五型，对棒状乳杆菌扭曲亚种所产乳酸描述为D型，但D-乳酸到底占多少比例未作具体说明；对棒状乳杆菌棒状亚种所产乳酸描述为D(L)型，D-乳酸所占比例为80％-85％。
凌代文、东秀珠主编的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》及东秀珠、蔡妙英等主编的《常见细菌系统鉴定手册》中对棒状乳杆菌扭曲亚种所产乳酸描述为D型，意指90％乳酸的旋光型为D-乳酸；对棒状乳杆菌棒状亚种所产乳酸描述为D(L)型，D-乳酸所占比例为80％-85％。
Akira Manome(马目章)等人用棒状乳杆菌扭曲亚种(模式菌株NRIC1051)发酵葡萄糖，所产D-乳酸光学纯度为84.4％。用棒状乳杆菌棒状亚种(模式菌株NRIC 1638)发酵葡萄糖，所产D-乳酸光学纯度为35.0％。(Manome.A，Okada.S.Uchimura.T and Komagata.K.The ratio of L-form to D-form of lacticacid as a criteria for the identification of lactic acid bacteria.J.Gen Appl Microbiol，1998，44：371-374.)(马目章，冈田早苗，内村泰和驹形和男.作为乳酸菌鉴定标准的L-型乳酸与D-型乳酸的比例.普通与应用微生物学杂志，1998，44：371-374.)。
Nguyen CM(阮CM)等人用棒状乳杆菌扭曲亚种(模式菌株ATCC25600)发酵水网藻干生物质，所产D-乳酸光学纯度为95.8-99.6％(Nguyen CM，KimJS，Song JK，et al.d-Lactic acid production from dry biomass of Hydrodictyonreticulatum by simultaneous saccharification and co-fermentation usingLactobacillus coryniformis subsp.torquens[J].Biotechnol Lett，2012，34：2235-2240.)(阮CM，金JS，宋JK等.利用棒状乳杆菌扭曲亚种通过同步糖化与共发酵法发酵水网藻干生物质生产D-乳酸.生物技术通讯，2012，34：2235-2240.)。
Gonz6lez-Vara RA.(瓦萨雷斯-瓦拉R A.)等人用棒状乳杆菌扭曲亚种(模式菌株DSM 20004)发酵葡萄糖，所产D-乳酸光学纯度为93.2-97.2％(González-Vara RA，Pinelli.D，Fajner.D，et al.Production of L(+)and D(-)lacticacid isomers by Lactobacillus casei subsp.casei DSM20011and Lactobacilluscoryniformis subsp.Torquens DSM20004in continuous fermentation[J].J FermentBioeng，1996，81：548-552.)(瓦萨雷斯-瓦拉RA，皮内利D，法伊内尔D等.利用干酪乳杆菌干酪亚种DSM20011和棒状乳杆菌扭曲亚种DSM20004通过连续发酵法生产L(+)乳酸和D(-)乳酸同分异构体.发酵生物工程杂志，1996，81：548-552.)。
由上可知，乳杆菌属棒状乳杆菌两个已知亚种(棒状乳杆菌棒状亚种和棒状乳杆菌扭曲亚种)所产D-乳酸的光学纯度均小于100％，而本发明提供的菌株所产D-乳酸光学纯度均为100％，因此本发明菌株不同于乳杆菌属棒状乳杆菌的两个已知亚种。
Claims (11)
1.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)，其中，所述高光学纯度D-乳酸的光学纯度是100％。
2.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)SZD-2菌株，其保藏编号为CGMCC No.6891，其中，所述高光学纯度D-乳酸的光学纯度是100％。
3.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)SZD-5菌株，其保藏编号为CGMCC No.6892，其中，所述高光学纯度D-乳酸的光学纯度是100％。
4.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)SZD-9菌株，其保藏编号为CGMCC No.6893，其中，所述高光学纯度D-乳酸的光学纯度是100％。
5.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)SZD-10菌株，其保藏编号为CGMCC No.6894，其中，所述高光学纯度D-乳酸的光学纯度是100％。
6.权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种在制备D-乳酸单体中的应用。
7.权利要求2-5任一项所述的菌株在制备D-乳酸单体中的应用。
8.权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
9.权利要求2-5任一项所述的菌株在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，所述制品为手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。
11.如权利要求8或9所述的应用，所述制品为生物塑料制品。
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