CN106434779B - 戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了戊糖乳杆菌SS6在产γ‑氨基丁酸中的应用，所述戊糖乳杆菌SS6保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为GDMCC No：60086，利用该菌发酵生产GABA，含量可达3.09mg/mL，GABA具有降血压、促进生长激素分泌和降低胆固醇等多种有益的保健功能，为开发新的富含γ‑氨基丁酸的保健食品提供依据，将所述戊糖乳杆菌SS6应用于富含GABA的食品、保健品的开发，具有广泛的应用前景。

Description

戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）有许多重要的生理功能，如抗焦虑、降血压、降血糖、改善睡眠、修复皮肤（抑制炎症，刺激表皮细胞再生）、调节激素等。现阶段随着对GABA生理和药理功能的不断研究和开发，已经作为一种新型的功能性因子应用于食品和药品等行业中。
在早期，富集生产γ-氨基丁酸主要以化学合成、植物富集和通过大肠杆菌发酵为主，但存在着安全性差，成本高，环境污染严重，富集含量低和食用安全性等问题，所以寻找可利用的食用级安全性菌株在微生物法富集γ-氨基丁酸方面具有潜在的意义和价值。
现有技术分离得到的产γ-氨基丁酸的微生物多为真菌，真菌生长较为缓慢，不能满足生产需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供现有技术分离得到的产γ-氨基丁酸的微生物多为真菌，真菌生长较为缓慢，不能满足生产需要。
本发明的目的是提供戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，所述戊糖乳杆菌SS6保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为GDMCC No：60086。
本发明通过筛选获得一株可产γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌SS6，本发明戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）SS6的16s rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示，通过16S rDNA序列比对分析，与序列号为JN415155.1的戊糖乳杆菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定戊糖乳杆菌SS6属于乳杆菌属（Lactobacillus），为戊糖乳杆菌亚种（Lactobacillus pentosus）。
所述戊糖乳杆菌SS6为革兰氏阳性菌，杆状，无鞭毛，无菌膜，无荚膜；长1.5～3.0μm，宽0.7～0.8μm，菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑不透明，边缘整齐。
戊糖乳杆菌SS6为厌氧菌，接触酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，硫化氢试验呈阴性，吲哚试验呈阴性，酪素水解试验呈阴性，精氨酸产氨试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，七叶苷水解试验呈阳性。
γ-氨基丁酸作为新型功能因子，具有降低血压的作用，因此可将该戊糖乳杆菌SS6扩大培养用于发酵生产γ-氨基丁酸。
具体地，所述的戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，是将戊糖乳杆菌SS6接种于液体培养基中30～37℃下培养36～48h。
更优选地，所述液体培养基的组成为每升培养基中含有5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸钠、20mg L-Glu，余量为蒸馏水。
最优选地，戊糖乳杆菌SS6接种于液体培养基中35℃培养36h，pH值为5.8，所述戊糖乳杆菌SS6的接种量为2%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，所述戊糖乳杆菌SS6保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为GDMCC No：60086，利用该菌发酵生产GABA，含量可达3.09mg/mL，GABA具有降血压、促进生长激素分泌和降低胆固醇等多种有益的保健功能，为开发新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依据，将所述戊糖乳杆菌SS6应用于富含GABA的食品、保健品的开发，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）SS6和相近菌株的16s rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
乳酸菌分离培养基（1000mL）由10g酵母膏、10g牛肉膏、10g蛋白胨、5g葡萄糖、1ml吐温-80、20g碳酸钙、200g西红柿汁、0.1g溴甲酚绿、15g琼脂粉和余量的蒸馏水组成，调节pH至5.8～6.5，于121℃高压灭菌30min。
MRS培养基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]、20g葡萄糖、1mL吐温-80、5g乙酸钠（CH3COONa-3H2O）、2g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、0.58g硫酸镁（MgSO4.7H2O）、0.25g硫酸镁（MnSO4·H2O）、15g琼脂粉和余量的蒸馏水组成，调节pH至5.8～6.5，于121℃高压灭菌30min。
MRS液体培养基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]、20g葡萄糖、1mL吐温-80、5g乙酸钠（CH3COONa-3H2O）、2g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、0.58g硫酸镁（MgSO4.7H2O）、0.25g硫酸镁（MnSO4·H2O）和余量的蒸馏水组成，调节pH至5.8～6.5，于121℃高压灭菌30min。
发酵培养基TYG（1000mL）由5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸钠、20mg L-Glu和余量的蒸馏水组成，调节pH至5.8～6.5，于121℃高压灭菌30min。
实施例1 菌株的分离、筛选与鉴定
菌株分离：选取健康生长桑树上的成熟桑葚果实，于无菌超净台内用无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分，切成1cm小片段置于研砵研磨出汁，吸取100μL果汁于MRS液体培养基中，于30℃恒温培养箱培养2d，待液体培养基变得浑浊按梯度稀释法稀释菌液，吸取稀释度为10-5和10-6的菌体稀释液100μL于乳酸菌分离培养基中，30℃恒温培养箱培养2～3d，待乳酸菌分离培养基中长出菌落（出现圆形乳白或黄色菌落），周围培养基变为黄色者初步确定为菌株SS6，挑取变色圈最大的菌落于MRS培养基培养。
对筛选得到的菌株SS6进行分子鉴定，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对筛选得到的SS6的16S rDNA进行测序。
菌株SS6的16S rDNA序列长度为1472bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树（如图1所示），以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与序列号为JN415155.1的戊糖乳杆菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为99%，通过委托广东省微生物分析检测中心结合菌体形态、生长条件、生理生化鉴定结果确定菌株SS6属于乳杆菌属（Lactobacillus），戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）亚种，因此称为戊糖乳杆菌SS6。
菌株菌落形态鉴定：戊糖乳杆菌SS6为革兰氏阳性菌，杆状，无鞭毛，无荚膜；在MRS固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑不透明，边缘整齐。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠主编 科学出版社）对戊糖乳杆菌SS6进行生理生化鉴定：戊糖乳杆菌SS6为厌氧菌，接触酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，硫化氢试验呈阴性，吲哚试验呈阴性，酪素水解试验呈阴性，精氨酸产氨试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，七叶苷水解试验呈阳性，结果见表1。
以幼龄斜面培养物穿刺接种于休和利夫森二氏（半固体）培养基中，37℃恒温培养72h后观察。如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性，结果如表2。
戊糖乳杆菌SS6可在MRS培养基上生长，其最适生长温度为35℃，最适生长环境的pH值为5.8～6.5。
戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）SS6，保藏在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址是广东省微生物研究所，广州市先烈中路中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为GDMCC No：60086。
实施例2 菌株的培养
1、戊糖乳杆菌SS6的活化：在超净工作台中无菌操作，用接种环挑取戊糖乳杆菌SS6，在平板培养基（MRS培养基）上用接种环划线，在30℃培养箱中静置培养2d。
2、戊糖乳杆菌SS6发酵样品的制备：将分离得到的戊糖乳杆菌SS6接种于50mL发酵培养基TYG中，30℃培养箱中静置培养2d，将发酵混合物沸水浴10min，以10000r/min离心10min，取上层液体即得发酵液。
3、γ-氨基丁酸标准曲线的绘制：分别取1.0mL蒸馏水、浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的γ-氨基丁酸的标准样品溶液，加入120μL 1mol/L LaCL3溶液，混匀震荡反应15min，12 000 r/min离心5 min，取上清0.5 mL于1.5mL离心管中，加入300 µL1mol/L的KOH，振荡反应5 min，12 000 r/min离心5 min。分别取上清液600 µL置于15mL具塞试管中，加pH 10.0的碳酸盐缓冲液400 µL，60%的重蒸酚200 µL，混匀后再加入1mL 7.5%NaClO溶液，充分混匀。静置3 min，于沸水浴中加热10 min，后置冰浴中10 min，待溶液出现蓝绿色后，加入4.0 mL 60%乙醇溶液，以0号管为对照，于645 nm波长处测吸光值。以吸光值为纵坐标，GABA浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。
4、取1mL待测戊糖乳杆菌SS6的发酵液，按上述步骤加入试剂后测定波长645nm处的吸光值，作3个重复，根据标准曲线计算样品γ-氨基丁酸的含量。
试验结果表明：戊糖乳杆菌SS6发酵产γ-氨基丁酸的产量达3.09mg/mL，具有较高的产γ-氨基丁酸的能力，为开发新型的富含γ氨基丁酸的食品提供了依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> 戊糖乳杆菌SS6的16S rDNA序列
<400> 1
cccgtggcgg gctgccctat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240
tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420
taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 480
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 1020
cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440
cttttaggaa ccagccgcta agtgacagat gg 1472

Claims (5)

1.戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，所述戊糖乳杆菌SS6保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为GDMCC No：60086。
2. 根据权利要求1所述的戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，该戊糖乳杆菌SS6的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，将戊糖乳杆菌SS6接种于液体培养基中30～37℃下培养36～48h。
4. 根据权利要求1所述的戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，所述液体培养基的组成为每升培养基中含有5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸钠、20mg L-Glu，余量为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的戊糖乳杆菌SS6在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，戊糖乳杆菌SS6接种于液体培养基中35℃培养36h，pH值为5.8，所述戊糖乳杆菌SS6的接种量为2%。
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