CN103589765B - 制备鼠李糖脂发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物制剂的制备，特别是指制备鼠李糖脂发酵液的方法。将扩培后含有铜绿假单胞菌CGMCC NO.8377（Pscudomonas acruginosa）的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值进行通气发酵，在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。本发明解决了现有技术存在的生产成本高、产品得率低等问题，具有产品得率高、菌种代谢正常、生产成本低、工艺易于实现等特点。
Description
技术领域
本发明属于微生物制剂的制备，特别是指制备鼠李糖脂发酵液的方法。
背景技术
鼠李糖脂是一种新型生物表面活性剂，具有乳化、增溶和降低界面张力等功能，且低毒、易生物降解，在石油化工、生物医药、食品卫生及环境保护等领域有良好应用前景。通常的生产方法是利用铜绿假单胞菌以葡萄糖、蓖麻油等不同碳源为基础原料合成鼠李糖脂。上述现有技术存在的问题是以葡萄糖、蓖麻油等基础原料生产鼠李糖脂成本较高；同时由于工艺设计的不合理，存在着产品得率低（发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为55ｇ／L），发酵过程中由于鼠李糖脂的产生发酵液中的泡沫增多，使发酵过程中通风量量小，导致菌种由于供氧量的不足，影响发酵过程中的菌种代谢速度等。
发明内容
本发明的目的在于提供产品得率高、生产成本低的制备鼠李糖脂发酵液的方法。
本发明的整体技术构思是：
制备鼠李糖脂发酵液的方法，包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有铜绿假单胞菌CGMCC NO.8377（Pscudomonas acruginosa）的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值；
B、进行通气发酵；
C、在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
本发明中用于生产鼠李糖脂发酵液的菌种铜绿假单胞菌（Pscudomonasacruginosa）已于2013年10月23日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.8377，该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的具体技术内容还有：
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1%-2%；废糖蜜1%-2%；硫酸铵0.2%-0.3%；黄原胶或温轮胶0.1%-0.15%；磷酸氢二钠0.2%-0.3%；磷酸二氢钾0.1%-0.2%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7.0-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.5%-1%，黄原胶或温轮胶0.05%-0.08%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油0.5%-1.0%，硝酸铵0.1%-0.2%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2%-3%，黄原胶或温轮胶0.02%-0.05%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油0.5-1%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
为便于工业化生产的需要，优选且较为常见的技术方案是，所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐培养基进行发酵。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、转速为200-250转/分钟、培养周期为20-25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2%，蛋白胨0.2-0.4%，酵母膏0.2-0.3%，琼脂2-2.5%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2%，硝酸钠0.4-0.7%,酵母膏0.1-0.3%,胰蛋白胨0.15-0.3%,余量为无菌水，pH=7.0-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、通风量0.2vvm-0.35vvm、培养周期为24-26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2%，磷酸氢二胺0.7-0.9%，硫酸铵0.1-0.2%，大豆分离蛋白0.1-0.3%，酵母膏0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期为10-15小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1-2%，废糖蜜1-2%，硝酸铵0.6-0.8%，硫酸铵0.2-0.3%，黄原胶或温轮胶0.05-0.1%，酵母膏0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45%。
所述的温轮胶为河北鑫合生物化工有限公司生产。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明以铜绿假单胞菌CGMCC NO.8377作为原始菌种，采用玉米油及废糖蜜作为二级扩大培养及发酵的主要碳源，有效利用了工业废料，降低了生产成本，发酵过程中菌种代谢正常，生产工艺合理易于实现，产品得率高（发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为65-70ｇ／L）。
2、在发酵过程中补料加入增稠剂黄原胶、温轮胶或玉米油，可有效提高对于发酵液的粘度控制，稳定控制发酵过程中泡沫的产生。
鼠李糖脂评价方法（参照《微生物学通报》2006年33（4）鼠李糖脂快速定量分析方法及其影响因素研究）
鼠李糖脂的测定——蒽酮比色法
一、仪器、试剂和材料
1、仪器：电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等
2、试剂：
（1）鼠李糖标准液：l00μg/ml；
（2）浓硫酸；
（3）蒽酮试剂：0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中。当日配制使用。
3、材料：铜绿假单胞菌WJ-1的发酵液；
二、操作步骤
1、鼠李糖标准曲线的制作
取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的鼠李糖溶液：
在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0min取出，用冰浴冷却至室温，在553nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准鼠李糖脂含量（μg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。
2、发酵液样品预处理：
（1）10ml发酵液加热到60℃，4000rpm离心除去菌体；
（2）加入HCl进行水解。在进行水解的时候温度应该在100-120℃之间，pH值应该在1.5左右，时间为3.5小时；
（3）过滤取上清液，用乙酸乙酯抽提除去β-羟基癸酸，分层取清液，取上清液1ml加入19ml蒸馏水稀释20倍；
3、发酵液样品测量
在大试管中（试管内径16-20mm，可使硫酸加入后快速散热，从而达到良好的混合）中加0.2%的蒽酮-浓硫酸为显色剂4.0ml,沿试管壁滴加样品1.0ml稀释液,迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发，沸水浴加热20min,之后用冰却于室温30min内在530nm处测定溶液的OD值。平行三份；空白管以等量稀释液不加蒽酮-硫酸试剂。根据A553平均值在标准曲线上查出鼠李糖的含量（mg）。
三、结果处理
含中层杂质水解液时鼠李糖溶液标准曲线（y=0.0088x-0.0145,r2=019968）
其中：x——鼠李糖脂的浓度；y——吸光度
其中：X——在标准曲线上查出的糖含量（mg），
V总——提取液总体积（ml），
V测——测定时取用体积（ml），
D——稀释倍数。
本发明中用于生产鼠李糖脂发酵液的菌种铜绿假单胞菌（Pscudomonasacruginosa）已于2013年10月23日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.8377。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
制备鼠李糖脂发酵液的方法，包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有铜绿假单胞菌CGMCC NO.8377（Pscudomonas acruginosa）的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值；
B、进行通气发酵；
C、在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
本实施例中用于生产鼠李糖脂发酵液的菌种铜绿假单胞菌（Pscudomonasacruginosa）已于2013年10月23日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.8377。
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1%；废糖蜜1%；硫酸铵0.2%；黄原胶或温轮胶0.1%；磷酸氢二钠0.2%；磷酸二氢钾0.1%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.5%，黄原胶或温轮胶0.05%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油0.5%，硝酸铵0.1%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2%，黄原胶或温轮胶0.02%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油0.5%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
为便于工业化生产的需要，优选且较为常见的技术方案是，所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐培养基进行发酵。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35℃、转速为200转/分钟、培养周期为20小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，琼脂2%，余量为无菌水，pH=7-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1%，硝酸钠0.4,酵母膏0.1%,胰蛋白胨0.15%,余量为无菌水，pH=7.0-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为35℃、通风量0.2vvm-0.35vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖1%，磷酸氢二胺0.7%，硫酸铵0.1%，大豆分离蛋白0.1%，酵母膏0.01%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为35℃、通风量0.4vvm、培养周期为10小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1%，废糖蜜1%，硝酸铵0.6%，硫酸铵0.2%，黄原胶或温轮胶0.05%，酵母膏0.01%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45%。
所述的温轮胶为河北鑫合生物化工有限公司生产。
经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为66ｇ／L。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油2%；废糖蜜2%；硫酸铵0.3%；黄原胶或温轮胶0.15%；磷酸氢二钠0.3%；磷酸二氢钾0.2%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7.0-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油1%，黄原胶或温轮胶0.08%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油1.0%，硝酸铵0.2%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油3%，黄原胶或温轮胶0.05%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油1%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为39℃、转速为250转/分钟、培养周期为25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，蛋白胨0.4%，酵母膏0.3%，琼脂2.5%，余量为无菌水，pH=7-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，硝酸钠0.7%,酵母膏0.3%,胰蛋白胨0.3%,余量为无菌水，pH=7-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为39℃、通风量0.35vvm、培养周期为26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，磷酸氢二胺0.9%，硫酸铵0.2%，大豆分离蛋白0.3%，酵母膏0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为39℃、通风量0.6vvm、培养周期为15小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油2%，废糖蜜2%，硝酸铵0.8%，硫酸铵0.3%，黄原胶或温轮胶0.1%，酵母膏0.02%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为70ｇ／L。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1.5%；废糖蜜1.5%；硫酸铵0.25%；黄原胶或温轮胶0.13%；磷酸氢二钠0.25%；磷酸二氢钾0.15%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.7%，黄原胶或温轮胶0.06%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油0.8%，硝酸铵0.15%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2.5%，黄原胶或温轮胶0.04%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油0.8%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为37℃、转速为230转/分钟、培养周期为22小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1.5%，蛋白胨0.3%，酵母膏0.25%，琼脂2.2%，余量为无菌水，pH=7-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1.5%，硝酸钠0.6%,酵母膏0.2%,胰蛋白胨0.25%,余量为无菌水，pH=7-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为38℃、通风量0.3vvm、培养周期为25小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖1.5%，磷酸氢二胺0.8%，硫酸铵0.15%，大豆分离蛋白0.2%，酵母膏0.015%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为37℃、通风量0.5vvm、培养周期为13小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1.5%，废糖蜜1.5%，硝酸铵0.7%，硫酸铵0.25%，黄原胶或温轮胶0.08%，酵母膏0.015%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为68ｇ／L。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油2%；废糖蜜1%；硫酸铵0.2%；黄原胶或温轮胶0.1%；磷酸氢二钠0.3%；磷酸二氢钾0.2%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.5%，黄原胶或温轮胶0.05%-0.08%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油1%，硝酸铵0.2%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2%，黄原胶或温轮胶0.02%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油1%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35℃、转速为250转/分钟、培养周期为25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，酵母膏0.3%，琼脂2%，余量为无菌水，pH=7-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，硝酸钠0.7%,酵母膏0.1%,胰蛋白胨0.15%,余量为无菌水，pH=7.0-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为39℃、通风量0.2vvm、培养周期为26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，磷酸氢二胺0.9%，硫酸铵0.2%，大豆分离蛋白0.1%，酵母膏0.01%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为39℃、通风量0.6vvm、培养周期为10小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油2%，废糖蜜2%，硝酸铵0.6%，硫酸铵0.2%，黄原胶或温轮胶0.05%，酵母膏0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为68ｇ／L。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1%；废糖蜜1%；硫酸铵0.25%；黄原胶或温轮胶0.15%；磷酸氢二钠0.25%；磷酸二氢钾0.15%；余量为无菌水；发酵培养基的pH=7.0-7.2。
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.5%，黄原胶或温轮胶0.08%，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油1%，硝酸铵0.15%，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2.5%，黄原胶或温轮胶0.02%，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油0.5%，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为36℃、转速为220转/分钟、培养周期为23小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比=1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1.5%，蛋白胨0.3%，酵母膏0.3%，琼脂2%，余量为无菌水，pH=7-7.2;
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，硝酸钠0.7%,酵母膏0.1%,胰蛋白胨0.2%,余量为无菌水，pH=7-7.3。
所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为37℃、通风量0.25vvm、培养周期为25小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖2%，磷酸氢二胺0.9%，硫酸铵0.2%，大豆分离蛋白0.3%，酵母膏0.01%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为39℃、通风量0.6vvm、培养周期为10小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油2%，废糖蜜1。5%，硝酸铵0.7%，硫酸铵0.25%，黄原胶或温轮胶0.08%，酵母膏0.01%，余量为无菌水，pH=7-7.2。
经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为65ｇ／L。
Claims (7)
1.制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有铜绿假单胞菌(Pscudomonas acruginosa)CGMCC NO.8377的种子液按照质量百分比为8％-10％的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值；
B、进行通气发酵；
C、在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液；
所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1％-2％；废糖蜜1％-2％；硫酸铵0.2％-0.3％；黄原胶或温轮胶0.1％-0.15％；磷酸氢二钠0.2％-0.3％；磷酸二氢钾0.1％-0.2％；余量为无菌水；发酵培养基的pH＝7.0-7.2；
所述的步骤C中的发酵条件为：
6-8小时：补料玉米油0.5％-1％，黄原胶或温轮胶0.05％-0.08％，风量0.4-0.6vvm；
14-16小时：补入玉米油0.5％-1.0％，硝酸铵0.1％-0.2％，风量0.4-0.6vvm；
28-30小时：补入玉米油2％-3％，黄原胶或温轮胶0.02％-0.05％，风量0.4-0.6vvm；
36-40小时：补入玉米油0.5-1％，风量0.4-0.6vvm；
41小时-放罐：风量0.6-0.7vvm；
所补入的物料为质量百分数。
2.根据权利要求1所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐培养基进行发酵。
3.根据权利要求2所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、转速为200-250转/分钟、培养周期为20-25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种：种子液的质量比＝1：200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2％，蛋白胨0.2-0.4％，酵母膏0.2-0.3％，琼脂2-2.5％，余量为无菌水，pH＝7.0-7.2；
摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2％，硝酸钠0.4-0.7％,酵母膏0.1-0.3％,胰蛋白胨0.15-0.3％,余量为无菌水，pH＝7.0-7.3。
4.根据权利要求2所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1％的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、通风量0.2vvm-0.35vvm、培养周期为24-26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖1-2％，磷酸氢二胺0.7-0.9％，硫酸铵0.1-0.2％，大豆分离蛋白0.1-0.3％，酵母膏0.01-0.02％，余量为无菌水，pH＝7.0-7.2。
5.根据权利要求2所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8％-10％的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为35℃-39℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期为10-15小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
玉米油1-2％，废糖蜜1-2％，硝酸铵0.6-0.8％，硫酸铵0.2-0.3％，黄原胶或温轮胶0.05-0.1％，酵母膏0.01-0.02％，余量为无菌水，pH＝7.0-7.2。
6.根据权利要求1所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45％。
7.根据权利要求5所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45％。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Li AH et al.Rhamnolipid production by pseudomonas Aeruginosa GIM 32 using different substrates including molasses distillery wastewater.《Applied Biochemistry and Biotechnology》.2011,第163卷(第5期),600-611. * |
| 辛兴.模拟空间诱变铜绿假单胞菌M14808产鼠李糖脂发酵工艺的优化及动力学研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》.2012,(第7期),正文6、14-20页. * |
| 韩秋惠等.新分离Microbacterium sp XT11菌产黄原胶降解酶生产条件的优化研究.《生物技术通报》.2006,469-471、475页. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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