CN104531580B - 一种高性能文莱胶菌株及其应用 - Google Patents

一种高性能文莱胶菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文莱胶生产领域，特别涉及一种高性能文莱胶菌株及其应用。一种高性能文莱胶菌株，2014年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9919，保藏名称为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)W‑1。本发明提供的高性能文莱胶菌株，通过将原始菌株进行紫外诱变筛选获得，相对于原始菌株，该菌株生长周期短，发酵生产的文莱胶出胶率高，得到的文莱胶粘度更高、更耐盐和更耐高温。本发明还提供了所述高性能文莱胶菌株在文莱胶发酵中的应用。本发明提供的高性能文莱胶菌株，发酵生产的文莱胶出胶率高，得到的文莱胶粘度更高、更耐盐和更耐高温。

Description

一种高性能文莱胶菌株及其应用
技术领域
本发明涉及文莱胶生产领域，具体而言，涉及一种高性能文莱胶菌株及其应用。
背景技术
文莱胶作为一种新型的微生物多糖，它具有许多优良而独特的理化特性，在石油、化工、食品、化妆品等领域具有广泛的应用。其中，文莱胶特有的悬浮、稳定、增稠等性能，并广泛应用于钻井泥浆配剂、建筑混泥土及砂浆配剂、涂料及自流平砂浆配剂等领域，与黄原胶相比具有得天独厚的优势。在国内许多科研机构及相关企业也早已认识到了这一点，并对其进行了广泛的研究，但其核心技术一直被美国公司牢牢控制，所以国内的文莱胶产业一直处于起步摸索阶段，没有形成大的规模，质量方面也远远落后于美国公司标准。
菌种是发酵行业的龙头，没有好的菌种发酵也就无从谈起。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种高性能文莱胶菌株，该菌株生长周期短，发酵产生的文莱胶综合性能优良。
本发明的第二目的在于提供一种所述的高性能文莱胶菌株的应用，该高性能文莱胶菌株发酵生产的文莱胶，出胶率高；得到的文莱胶粘度更高、更耐盐和更耐高温。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种高性能文莱胶菌株，2014年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9919，保藏名称为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)W-1；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明提供的高性能文莱胶菌株，通过将原始菌株进行紫外诱变筛选获得，相对于原始菌株，该菌株生长周期短，发酵生产的文莱胶出胶率高，得到的文莱胶粘度更高、更耐盐和更耐高温。
本发明还提供了所述高性能文莱胶菌株在文莱胶发酵中的应用。
本发明提供的高性能文莱胶菌株，发酵生产的文莱胶出胶率高，得到的文莱胶粘度更高、更耐盐和更耐高温。
为了使高性能文莱胶菌株生长更为旺盛，优选地，所述高性能文莱胶菌株发酵采用摇床培养，摇床培养的转速为150-400r/min。
更优选地，所述高性能文莱胶菌株发酵采用摇床培养，摇床培养的转速为300-350r/min。
为了使高性能文莱胶菌株在发酵罐内生长更为旺盛，优选地，所述高性能文莱胶菌株发酵采用发酵罐进行，发酵过程中的溶氧不低于10％。
更优选地，所述高性能文莱胶菌株发酵采用发酵罐进行，发酵过程中的溶氧为25-30％。
进一步地，所述高性能文莱胶菌株发酵完成得到的文莱胶发酵液粘度达到10000-10500cp。
进一步地，所述文莱胶的出胶率为3.2％-3.5％。比原始菌株发酵的出胶率提高了10％左右。
进一步地，所述文莱胶的耐温达到100℃。将发酵得到的文莱胶经100℃的高温处理后，文莱胶的粘度基本没变化，表现了很好的耐高温性能。
进一步地，所述文莱胶耐盐浓度达到42g/L。将发酵得到的文莱胶在盐浓度为42g/L的溶液中测粘度，明显优越于原始菌株产生的文莱胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种高性能文莱胶菌株，该菌株生长周期短，发酵生产的文莱胶出胶率高，得到的文莱胶综合性能优良；
(2)通过调整高性能文莱胶菌株的发酵条件，提高了其出胶率以及综合性能。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
高性能文莱胶菌株的获得
1.原始菌种活化：原始菌种为鞘氨醇单胞菌属(SphingomonasSpecies.ATCC31555)，从江南大学购买，该菌株也可通过市售购买；原始菌种为冻干粉状，在无菌操作台中利用无菌操作技术将其转接于斜面培养基中，30℃培养72h；其中，斜面培养基配方：蔗糖1％，大豆蛋白胨2％，酵母膏0.5％，琼脂2％，其余为蒸馏水，pH控制：7.0-7.2；
2.斜面培养后的状态：菌苔黄色，较薄，表面湿润，进一步培养后颜色加深，表面干燥；
3.斜面再次培养：将72h后的斜面培养物再次转接于斜面进行二次培养，培养温度30℃，时间72h；
4.斜面二次培养后的状态：菌苔黄色，较厚，表面湿润，进一步培养后颜色加深，表面干燥；
5.平板培养：将生长好的斜面菌体划线于平板中，采用分区划线法划出单个菌落，30℃平板培养72h；
6.挑选个大饱满的单个菌落，接种于500ml摇瓶中，摇床培养，摇床培养条件：温度30℃，转速200转/分，接种量为2环/100ml，摇瓶中培养基为100ml，摇瓶培养基配方：葡萄糖2.5％，硝酸铵0.05％，酵母粉0.05％，蛋白胨0.02％，磷酸二氢钾0.5％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸亚铁0.0005％，余量为蒸馏水；摇瓶期间每隔4小时检测种子密度，结果如表1所示。
表1 摇瓶不同时间中的菌体密度
周期(h) 菌体密度(cfu/ml)
18 1.3E+09
22 3.2E+09
26 5.3E+09
30 9.00E+09
34 7.95E+09
从表1可以看出，在摇瓶培养30h左右菌体密度达到最高值。
7.将摇床培养至30h的菌液制成菌悬液，无菌吸取菌悬液5ml加入直径90mm空白培养皿中，将此培养皿置于无菌操作台中，开启15W紫外线灯照射1min，照射距离20cm；
8.诱变完成后，将菌悬液划线于平板中，采用分区划线法划出单个菌落，放30℃培养箱中培养72h；
9.挑选多个个大饱满的单个菌落进行摇床培养30h，摇瓶培养结束后，接种发酵培养基进行发酵培养，发酵培养使用摇床培养，温度为30℃，转速为200转/分，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，发酵过程中的溶氧不低于10％；
10.将发酵培养得到的多个发酵液测试出胶率、粘度、耐盐，筛选得到鞘氨醇单胞菌W-1，并进行保藏；将鞘氨醇单胞菌W-1经多次传代试验检测，该菌种遗传性状稳定。
实施例2
将原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1分别进行摇瓶培养，培养条件以及培养基同实施例1；
组1：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养使用摇床培养，温度为30℃，转速为:150转/分，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％；
组2：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养使用摇床培养，温度为30℃，转速为:300转/分，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，
组3：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养使用摇床培养，温度为30℃，转速为:350转/分，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，
组4：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养使用摇床培养，温度为30℃，转速为:400转/分，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％。
取各发酵液100ml置于烧杯中，利用LVDV-ⅠPrime粘度计测量发酵液的粘度。数据如表2所示。
表2 不同转速下发酵液的粘度
从表2可以看出，发酵通过摇床的方式培养，转速在300-350r/min能得到具有更高粘度的发酵液。
实施例3
将原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1分别进行摇瓶培养，培养条件以及培养基同实施例1；
组1：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养采用发酵罐，温度为30℃，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，其中，发酵过程中的溶氧为10％；
组2：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养采用发酵罐，温度为30℃，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，其中，发酵过程中的溶氧为25％；
组3：摇瓶培养30h得到原始菌株和鞘氨醇单胞菌W-1的菌液，计算菌的浓度，相同接菌量接种至发酵培养基进行发酵培养，发酵培养采用发酵罐，温度为30℃，发酵培养70h；发酵培养基：葡萄糖20g/L，硝酸铵0.5g/L，酵母粉0.4g/L，KH2PO44g/L，K2HPO43g/L,FeSO40.0025g/L，微量元素综合液1ml/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；其中，微量元素综合液含有硫酸镁0.5％，硫酸锰0.1％，硫酸锌0.25％，其中，发酵过程中的溶氧为30％；
(1)取各发酵液100ml置于烧杯中，利用LVDV-ⅠPrime粘度计直接测量发酵液的粘度。数据如表3所示。
表3 不同溶氧下发酵液的粘度
从表3可以看出，发酵通过发酵罐的方式培养，溶氧在25％-30％的条件下能得到具有更高粘度的发酵液。
并且可以看出，本发明提供的高性能文莱胶菌株经发酵罐发酵得到的发酵液的粘度明显高于原始菌株。
(2)、用塑料杯各称取100g鞘氨醇单胞菌W-1的发酵液和原始菌株的发酵液，分别加入95％乙醇250g，充分搅拌后静置使发酵液充分脱水析出，过滤，滤出的湿胶用乙醇冲洗脱色2-3次，105℃干燥箱干燥至恒重，从干燥箱取出样品后称重计算：出胶率(％)＝干燥后样品重/100g×100％；得到的数据如表4所示。
表4 各组出胶率
从表4可以看出，鞘氨醇单胞菌W-1发酵，得到的出胶率在3.2％-3.5％之间；同时，原始菌株的发酵得到的出胶率在2.8-3.0％之间，本发明提供的高性能文莱胶菌株发酵得到的文莱胶的出胶率明显高于原始菌株。
(3)六速粘度(Six speed viscosity)检测
取1g干燥的文莱胶产品放入350ml的42g/L NaCl溶液中，搅拌使其充分溶解，用六速粘度计测量各转速数值并记录，具体测定方法见中国钻井液材料规范GT/T5005-201015.6项。结果如表5所示。
表5 六速粘度所测数值
从表5可以看出，本发明提供的高性能文莱胶菌株发酵得到的文莱胶，六速粘度计测量各转速数值，明显优于原始菌株，说明本发明提供的高性能文莱胶菌株发酵得到的文莱胶的性能更为优良。文莱胶在盐浓度为42g/L的条件下，粘度值均在45cp以上。
(4)各取1g与(3)中同样的文莱胶产品放入350ml的42g/L NaCl溶液中，搅拌使其充分溶解，放入100℃的水浴中保持20min，取出后立即用六速粘度计测量各转速数值并记录。结果如表3所示。
表6 六速粘度所测数值
从表6可以看出，本发明提供的鞘氨醇单胞菌W-1发酵得到的文莱胶经热处理后，其六速粘度值几乎无变化；而原始菌株发酵得到的文莱胶经热处理后，其六速粘度值大幅下降，说明本发明提供的鞘氨醇单胞菌W-1发酵得到的文莱胶具有更好的耐热性。
此外，本发明还将鞘氨醇单胞菌W-1与原始菌株同时划板进行平板培养，培养3天发现，两者生长形态一致，但是，鞘氨醇单胞菌W-1的单菌落要比原始菌株的单菌落要大些。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种高性能文莱胶菌株，其特征在于，2014年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9919，保藏名称为鞘氨醇单胞菌W-1。
2.权利要求1所述的高性能文莱胶菌株在文莱胶发酵中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高性能文莱胶菌株发酵采用摇床培养，摇床培养的转速为150-400r/min。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高性能文莱胶菌株发酵采用摇床培养，摇床培养的转速为300-350r/min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高性能文莱胶菌株发酵采用发酵罐进行，发酵过程中的溶氧不低于10％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高性能文莱胶菌株发酵采用发酵罐进行，发酵过程中的溶氧为25-30％。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高性能文莱胶菌株发酵完成得到的文莱胶发酵液粘度达到10000-10500cp。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述文莱胶的出胶率为3.2％-3.5％。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述文莱胶的耐温达到100℃。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述文莱胶在盐浓度为42g/L的条件下，粘度值均在45cp以上。
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