CN101613725A - 利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用发酵合成所需的化合物的方法，特别是指一种利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法。它以铜绿假单胞菌作为原始菌种，采用葵子油及废糖蜜作为二级扩大培养及发酵的主要碳源，通过斜面种子的制备，将斜面种子经扩大培养制备成种子液，将种子液接种到发酵罐中经通风培养、补料控制最终制备成含生物表面活性剂鼠李糖脂的发酵液。本发明解决了现有技术存在的生产成本高、产品得率低的问题，具有生产工艺合理且易于实现，生产成本低、产品得率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用发酵合成所需的化合物的方法，特别是指一种利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法。
背景技术
鼠李糖脂作为生物表面活性剂，其制备主要包括斜面菌种的制备、摇瓶种子液的制备、将种子液接入发酵培养基进行发酵等工艺步骤，上述现有技术由于采用成本较高的原料作为发酵培养基的主要碳源，生产成本较高；同时由于工艺设计的不合理，存在着产品得率低(鼠李糖脂的浓度为30g/L)的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，利用以葵子油和废糖蜜作为二级扩大培养培养基和发酵培养基的碳源，并优化了生产工艺，使生产成本大大降低，产品得率高。
本发明的整体生产工艺是：
利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将步骤A中的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将步骤B中制备的种子液按种子液：发酵培养基为8％-10％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.0-2.0 废糖蜜1.0-2.0 硫酸铵0.2-0.3 尿素0.2-0.3
磷酸氢二钠0.2-0.3 磷酸二氢钾0.1-0.2
发酵培养基的初始pH为7.0-7.2，发酵条件为温度32℃-36℃，发酵周期为60-75小时，通风量0.2-0.6vvm，在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量；
原始菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
本发明的具体工艺条件和工艺配比是：
步骤A中斜面菌种的制备过程中的培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1-2 蛋白胨0.2-0.4
酵母膏0.2-0.3琼脂2-2.5
培养基的pH7.0-7.2。
步骤B中的扩大培养包括摇瓶种子制备、一级种子制备和二级种子制备，将斜面菌种接入摇瓶扩大培养基经发酵制成摇瓶摇瓶种子，将摇瓶种子接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，将一级种子接入二级扩大培养基经发酵制成二级种子；摇瓶扩大培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1-2 硝酸钠0.4-0.7 酵母膏0.1-0.3 蛋白胨0.15-0.3
摇瓶扩大培养基的pH7.0-7.3，接种量为斜面菌种∶培养基＝1∶200，培养温度32℃-36℃，转速200-250转/分钟，发酵周期20-25小时。
所述的一级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
液体石蜡1.0-2.0 葡萄糖1.0-2.0 硝酸钠0.7-0.9
硫酸铵0.1-0.2 尿素0.1-0.3 酵母膏0.01-0.02
一级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为摇瓶种子：一级扩大培养的培养基为＝1∶100，培养条件为温度32℃-36℃，培养周期为24-26小时，通风量为0.2-0.35vvm，OD值为2.2-2.6时移种。
所述的二级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.0-2.0 废糖蜜1.0-2.0 硝酸钠0.6-0.8
硫酸铵0.2-0.3 尿素0.2-0.4 酵母膏0.01-0.02
二级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为一级种子∶二级扩大培养的培养基为＝8-10∶100，培养条件为温度32℃-36℃，培养周期为10-15小时，通风量为0.4-0.6vvm，OD值为2.8-3.2时移种。
所述的在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量具体包括如下工艺步骤：
发酵6-14小时补葵子油0.5-1.0％、尿素0.1-0.2％，通风量0.4-0.6vvm；发酵14-28小时补入葵子油0.5-1.0％、尿素0.1-0.2％，通风量0.3-0.4vvm；周期28-36小时补入葵子油2.0-3.0％，通风量0.2-0.3vvm；发酵36-50小时补入葵子油0.5-1.0％；通风量0.4-0.6vvm；发酵50-75小时之间的通风量为0.4-0.6vvm；以上补入葵子油、尿素的百分含量为质量百分含量。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步：
本发明的工艺设计合理，易于实现，同时生产过程也是一个环境净化、变废为宝的过程。由于采用葵子油和废糖蜜作为二级扩大培养的培养基和发酵培养基的碳源，生产成本大大降低，通过优化和改进生产工艺，产品得率高，经检测，发酵终了时鼠李糖脂的浓度为46-55g/L。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述：
本实施例的整体工艺步骤如下：
利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将步骤A中的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将步骤B中制备的种子液按种子液：发酵培养基为8％-10％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.5 废糖蜜1.8 硫酸铵0.26 尿素0.24
磷酸氢二钠0.23 磷酸二氢钾0.14
发酵培养基的初始pH为7.0-7.2，发酵条件为温度35℃，发酵周期为66小时，通风量0.2-0.6vvm，在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量；
原始菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
本实施例的具体工艺条件和工艺配比是：
步骤A中斜面菌种的制备过程中的培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1.5 蛋白胨0.26
酵母膏0.23 琼脂2.2
培养基的pH7.0-7.2。
步骤B中的扩大培养包括摇瓶种子制备、一级种子制备和二级种子制备，将斜面菌种接入摇瓶扩大培养基经发酵制成摇瓶摇瓶种子，将摇瓶种子接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，将一级种子接入二级扩大培养基经发酵制成二级种子；摇瓶扩大培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1.7 硝酸钠0.5 酵母膏0.2 蛋白胨0.2
摇瓶扩大培养基的pH7.0-7.3，接种量为斜面菌种∶培养基＝1∶200，培养温度33℃，转速200-250转/分钟，发酵周期23小时。
所述的一级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
液体石蜡1.7 葡萄糖1.3 硝酸钠0.76
硫酸铵0.12 尿素0.18 酵母膏0.015
一级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为摇瓶种子∶一级扩大培养的培养基为＝1∶100，培养条件为温度32℃，培养周期为24-26小时，通风量为0.3vvm，OD值为2.2-2.6时移种。
所述的二级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.2 废糖蜜1.2 硝酸钠0.66
硫酸铵0.23 尿素0.24 酵母膏0.017
二级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为一级种子∶二级扩大培养的培养基为＝8∶100，培养条件为温度35℃，培养周期为13小时，通风量为0.4-0.6vvm，OD值为2.8-3.2时移种。
所述的在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量具体包括如下工艺步骤：
发酵6-14小时补葵子油0.8％、尿素0.15％，通风量0.4-0.6vvm；发酵14-28小时补入葵子油0.7％、尿素0.18％，通风量0.3-0.4vvm；周期28-36小时补入葵子油2.8％，通风量0.26vvm；发酵36-50小时补入葵子油0.58％；通风量0.46vvm；发酵50-75小时之间的通风量为0.4-0.6vvm；以上补入葵子油、尿素的百分含量为质量百分含量。
Claims (6)
1、利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将步骤A中的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将步骤B中制备的种子液按种子液∶发酵培养基为8％-10％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，制成含鼠李糖脂的发酵液，其中发酵培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.0-2.0 废糖蜜1.0-2.0 硫酸铵0.2-0.3 尿素0.2-0.3
磷酸氢二钠0.2-0.3 磷酸二氢钾0.1-0.2
发酵培养基的初始pH为7.0-7.2，发酵条件为温度32℃-36℃，发酵周期为60-75小时，通风量0.2-0.6vvm，在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量；
原始菌种选用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
2、根据权利要求1所述的利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于所述的步骤A中斜面菌种的制备过程中的培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1-2 蛋白胨0.2-0.4
酵母膏0.2-0.3 琼脂2-2.5
培养基的pH7.0-7.2。
3、根据权利要求1所述的利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于所述的步骤B中的扩大培养包括摇瓶种子制备、一级种子制备和二级种子制备，将斜面菌种接入摇瓶扩大培养基经发酵制成摇瓶摇瓶种子，将摇瓶种子接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，将一级种子接入二级扩大培养基经发酵制成二级种子；摇瓶扩大培养基含有如下质量份数的组分：
葡萄糖1-2 硝酸钠0.4-0.7 酵母膏0.1-0.3 蛋白胨0.1 5-0.3
摇瓶扩大培养基的pH7.0-7.3，接种量为斜面菌种∶培养基＝1∶200，培养温度32℃-36℃，转速200-250转/分钟，发酵周期20-25小时。
4、根据权利要求3所述的利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于所述的一级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
液体石蜡1.0-2.0 葡萄糖1.0-2.0 硝酸钠0.7-0.9
硫酸铵0.1-0.2 尿素0.1-0.3 酵母膏0.01-0.02
一级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为摇瓶种子∶一级扩大培养的培养基为＝1∶100，培养条件为温度32℃-36℃，培养周期为24-26小时，通风量为0.2-0.35vvm，OD值为2.2-2.6时移种。
5、根据权利要求3所述的利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于所述的二级扩大培养中的培养基包括下列质量份数的组分：
葵子油1.0-2.0 废糖蜜1.0-2.0 硝酸钠0.6-0.8
硫酸铵0.2-0.3 尿素0.2-0.4 酵母膏0.01-0.02
二级扩大培养的培养基pH为7.0-7.2，接种量为一级种子∶二级扩大培养的培养基为＝8-10∶100，培养条件为温度32℃-36℃，培养周期为10-15小时，通风量为0.4-0.6vvm，OD值为2.8-3.2时移种。
6、根据权利要求1所述的利用微生物发酵制备鼠李糖脂的方法，其特征在于所述的在发酵进行到6-50小时补入葵子油、尿素并调整通风量具体包括如下工艺步骤：
发酵6-14小时补葵子油0.5-1.0％、尿素0.1-0.2％，通风量0.4-0.6vvm；发酵14-28小时补入葵子油0.5-1.0％、尿素0.1-0.2％，通风量0.3-0.4vvm；周期28-36小时补入葵子油2.0-3.0％，通风量0.2-0.3vvm；发酵36-50小时补入葵子油0.5-1.0％；通风量0.4-0.6vvm；发酵50-75小时之间的通风量为0.4-0.6vvm；以上补入葵子油、尿素的百分含量为质量百分含量。
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