CN104099388A - 提高鼠李糖脂产量的方法及其专用铜绿假单胞菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备鼠李糖脂的方法及其专用铜绿假单胞菌。该制备鼠李糖脂的方法，包括1)和2)：1)构建与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖成能力降低的重组铜绿假单胞菌；2)发酵所述重组铜绿假单胞菌，得到鼠李糖脂。本申请的实验证明，与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成能力提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种提高鼠李糖脂产量的方法及其专用铜绿假单胞菌。
背景技术
鼠李糖脂是一种糖脂类的阴离子表面活性剂。它具有良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力，在石油开采，生物医药、环境保护以及食品等领域具有广泛的应用前景。
目前，鼠李糖脂的生产菌株主要是铜绿假单胞菌，其生产性能的提高一般是通过各种理化诱变技术来提高菌株鼠李糖脂的生产能力，而理化诱变极易回复突变，造成菌株生产性能的不稳定，迫切需要新的构建鼠李糖脂高产菌株的方法。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)向胞外分泌胞外多聚物质将菌体包裹在一起形成生物被膜，多糖是胞外多聚物的主要成分。Pel多糖和Psl多糖是非粘液型(nonmucoid)铜绿假单胞菌产生的两种胞外多糖。Pel(Pellicle formation)是由7个基因组成的操纵子(pel操纵子)(图1)编码的蛋白合成、富含葡萄糖残基、但非纤维素多糖，其具体化学结构尚不清楚。Pel多糖能帮助铜绿假单胞菌在气—液面形成生物被膜(Friedman and Kolter2004)。Psl多糖是铜绿假单胞菌生物被膜基质网络中的一种重要多糖，是PAO1菌株生物被膜形成的关键多糖，该多糖是甘露糖、鼠李糖、葡萄糖组成的重复六糖。Psl多糖由psl(polysaccharide synthesis locus)基因簇编码的一系列蛋白合成(Jackson et al.2004)。psl基因簇含有15个基因(pslA-O)，它们以一个操纵子(operon)的方式转录(图1)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组铜绿假单胞菌在制备鼠李糖脂中的应用；所述重组铜绿假单胞菌与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖合成能力降低，鼠李糖脂合成能力提高。
上述应用中，所述重组铜绿假单胞菌可通过敲除作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和/或其启动子；和/或，敲除所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和/或其启动子构建，所述重组铜绿假单胞菌具体可为M1-M13中的任一种：
M1、将作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)的启动子敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M2、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)的启动子敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M3、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)的启动子和所述Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M4、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M5、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M6、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M7、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M8、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M9、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和所述Psl多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M10、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌。
M11、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M12、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
M13、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)、所述Psl多糖合成基因簇的启动子、Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
上述应用中，所述作为出发菌的铜绿假单胞菌可为铜绿假单胞菌PAO1。
铜绿假单胞菌PAO1的基因组是目前已测序的25种细菌基因组中最大的，包含5570个ORF,(孙景勇.铜绿假单胞菌PAO1的全基因组序列分析.《国外医学(微生物学分册)》.2001年03期)。
为了解决提高铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产量的问题，本发明还提供了如下制备鼠李糖脂的方法。
本发明所提供的制备鼠李糖脂的方法，包括1)和2)：
1)构建与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
2)发酵所述重组铜绿假单胞菌，得到鼠李糖脂。
上述方法中，所述重组铜绿假单胞菌可通过敲除作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和/或其启动子；和/或，敲除所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和/或其启动子构建，所述重组铜绿假单胞菌的构建方法具体可为N1-N13中的任一种：
N1、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N2、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N3、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N4、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N5、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N6、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N7、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N8、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N9、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和所述Psl多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N10、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N11、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N12、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N13、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子、Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
上述方法中，所述作为出发菌的铜绿假单胞菌可为铜绿假单胞菌PAO1。
为了提高铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产量，本发明还提供了如下提高铜绿假单胞菌鼠李糖脂合成能力的方法。
本发明所提供的提高铜绿假单胞菌鼠李糖脂合成能力的方法，包括构建与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖成能力降低的重组铜绿假单胞菌的步骤；所述重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成能力高于所述作为出发菌的铜绿假单胞菌。
上述方法中，所述重组铜绿假单胞菌可通过敲除作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和/或其启动子；和/或，敲除所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和/或其启动子构建，所述重组铜绿假单胞菌的构建方法可为上述N1-N13中的任一种。
上文中，所述鼠李糖脂为单鼠李糖脂和/或双鼠李糖脂。
上述重组铜绿假单胞菌也属于本发明的保护范围。
本申请的实验证明，与作为出发菌的铜绿假单胞菌PAO1相比，将铜绿假单胞菌PAO1的Psl多糖合成基因簇的启动子敲除得到的重组铜绿假单胞菌PAO1-psl的Psl多糖合成能力丧失；将铜绿假单胞菌PAO1的Psl多糖合成基因簇的启动子和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到的重组铜绿假单胞菌PAO1-pslpel的Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均丧失。PAO1总鼠李糖脂的合成量为284.3±28.3mg/L，重组铜绿假单胞菌PAO1-psl总鼠李糖脂的合成量为398.0±39.8mg/L，重组铜绿假单胞菌PAO1-pslpel总鼠李糖脂的合成量为369.6±37.0mg/L；重组铜绿假单胞菌PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的单鼠李糖脂Rha-C10-C10分别为PAO1的117％和211％，PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10分别为PAO1的129％和158％，表明与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，PAO1-psl和PAO1-pslpel合成总鼠李糖脂的量均升高；合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的量也升高，PAO1-pslpel合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的量增高尤为显著。上述结果均说明敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子和/或敲除铜绿假单胞菌PAO1中Pel合成基因簇的启动子后，铜绿假单胞菌的总鼠李糖脂的产量、单鼠李糖脂与双鼠李糖脂均明显升高。实验结果表明与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成能力提高。本申请的Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌可通过无痕缺失手段敲除作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇(psl操纵子)和/或其启动子；和/或，敲除所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇(pel操纵子)和/或其启动子获得，其鼠李糖脂产量更高，生产过程中不需要添加抗生素，其发酵产物中不会产生胞外多糖，有利于后续的分离纯化。
附图说明
图1为psl操纵子和pel操纵子示意图。
图2为PAO1与PAO1-psl和PAO1-pslpel的胞外多糖点杂交检测图。A为胞外多糖Psl的抗血清杂交结果；B为胞外多糖Pel的抗血清杂交结果。
图3为PAO1与PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的总鼠李糖脂浓度图。
图4为PAO1与PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的鼠李糖脂的TLC检测图。其中，1表示PAO1，2表示PAO1-psl，3表示PAO1-pslpel，4表示标准品中单鼠李糖脂以及双鼠李糖脂。
图5为PAO1-pslpel合成的单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)和双鼠李糖脂(Rha-Rha-C10-C10)的HPLC-MS检测图。其中，A为单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)的HPLC-MS峰图；B为双鼠李糖脂(Rha-Rha-C10-C10)的HPLC-MS峰图，C为PAO1-psl和PAO1-pslpel相对PAO1合成的单鼠李糖脂以及双鼠李糖脂的量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
铜绿假单胞菌PAO1(孙景勇.铜绿假单胞菌PAO1的全基因组序列分析.《国外医学(微生物学分册)》.2001年03期)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pEX18Ap(Hoang T,Karkhoff-Schweizer R,Kutchma A,Schweizer H.1998.A broad-host-range Flp-FRT recombination system forsite-specific excision ofchromosomally-located DNA sequences:applicationfor isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene28:77-86.)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的E.coli SM10(Simon R,Priefer U,Pühler A(1983)A broadhost range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposonmutagenesis in Gram-negative bacteria.Nature Biotechnology1:784–791.)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、PAO1-psl和PAO1-pslpel的制备
铜绿假单胞菌PAO1的psl多糖合成基因簇的启动子的核苷酸序列参见下述网站：http://www.pseudomonas.com，铜绿假单胞菌PAO1的Pel多糖合成基因簇的启动子的核苷酸序列参见下述网站：http://www.pseudomonas.com。将铜绿假单胞菌PAO1的psl多糖合成基因簇的启动子敲除得到铜绿假单胞菌PAO1的突变体，将该突变体命名为重组铜绿假单胞菌PAO1-psl，简称为PAO1-psl；将PAO1-psl中的Pel多糖合成基因簇的启动子敲除得到PAO1-psl的突变体，将该突变体命名为重组铜绿假单胞菌PAO1-pslpel，简称为PAO1-pslpel。
PAO1-psl和PAO1-pslpel的制备方法具体如下：
1、PAO1-psl的制备
合成SEQ ID No.1所示的Psl多糖合成基因簇的启动子同源片段，SEQ ID No.1中第8-516位为Psl合成基因簇的启动子上游同源片段，SEQ ID No.1中第523-936位为Psl合成基因簇的启动子下游同源片段。
合成SEQ ID No.2所示的Pel多糖合成基因簇的启动子同源片段，SEQ ID No.2中第8-436位为Pel合成基因簇的启动子上游同源片段，SEQ ID No.2中第443-813位为Pel合成基因簇的启动子下游同源片段。
将SEQ ID No.1第8-936位(即SEQ ID No.1中Eco RI识别位点后的第一位和Bam HI识别位点前一位)所示的Psl多糖合成基因簇启动子同源片段替换pEX18Ap载体中EcoRI和Bam HI识别位点间的序列，保持pEX18Ap载体的其他序列不变，将得到的含有正确序列的重组载体命名为pEX18Ap-psl。将重组载体pEX18Ap-psl转化到E.coli SM10中，将得到的含有重组载体pEX18Ap-psl的E.coli SM10命名为E.coli SM10/pEX18Ap-psl。
将上述E.coli SM10/pEX18Ap-psl中的pEX18Ap-psl通过双亲接合的方法(Hoang T,Karkhoff-Schweizer R,Kutchma A,Schweizer H.1998.Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excisionofchromosomally-located DNA sequences:application for isolation ofunmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene28:77-86.)使pEX18Ap-psl进入铜绿假单胞菌PAO1中，pEX18Ap-psl在铜绿假单胞菌PAO1细胞内通过同源单交换使Psl多糖合成基因簇的启动子同源片段整合在铜绿假单胞菌PAO1基因组上，将得到的重组菌命名为PAO1-psl1。将PAO1-psl1在添加5％蔗糖的LBNS培养基中在37℃条件下进行培养，使PAO1-psl1的抗性基因丢失，得到的无抗生素抗性的重组菌，该重组菌为敲除了Psl多糖合成基因簇启动子且无抗生素抗性的重组菌，将该重组菌命名为PAO1-psl。该菌株通过PCR扩增出相应DNA片段并测序证实已缺失psl基因簇上游214bp(从-267到-54，pslA的第一个碱基为1)。
2、PAO1-pslpel的制备
将SEQ ID No.2第8-813位(即SEQ ID No.2中Eco RI识别位点后的第一位和Bam HI识别位点前一位)所示的Pel多糖合成基因簇启动子同源片段替换pEX18Ap载体中EcoRI和Bam HI识别位点间的序列，保持pEX18Ap载体的其他序列不变，将得到的含有正确序列的重组载体命名为pEX18Ap-pel。将重组载体pEX18Ap-pel转化到E.coli SM10中，将得到的含有重组载体pEX18Ap-pel的E.coli SM10命名为E.coli SM10/pEX18Ap-pel。
将上述E.coli SM10/pEX18Ap-pel中的pEX18Ap-pel通过双亲接合的方法(Hoang T,Karkhoff-Schweizer R,Kutchma A,Schweizer H.1998.Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excisionofchromosomally-located DNA sequences:application for isolation ofunmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene28:77-86.)使pEX18Ap-pel进入步骤1得到的PAO1-psl中，pEX18Ap-pel在PAO1-psl细胞内通过同源单交换使Pel多糖合成基因簇启动子同源片段整合在PAO1-psl基因组上，将得到的重组菌命名为PAO1-pslpel-1。将PAO1-pslpel-1在添加5％蔗糖的LBNS培养基中在37℃条件下进行培养，使PAO1-pslpel-1的抗性基因丢失，得到的无抗生素抗性的重组菌，该重组菌为敲除了Psl合成基因簇启动子和Pel合成基因簇启动子且无抗生素抗性的重组菌，将该重组菌命名为PAO1-pslpel。该菌株通过PCR扩增相应DNA片段并测序证实已缺失pel基因簇上游220bp(从-284到-65，pelA的第一个碱基为
1)和psl基因簇上游214bp(从-267到-54，pslA的第一个碱基为1)。
实施例2、PAO1-psl和PAO1-pslpel与出发菌株PAO1的胞外多糖合成
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
分别将PAO1-psl、PAO1-pslpel与出发菌株PAO1的单克隆在LBNS液体培养基(LBNS液体培养基的溶剂为水，其溶质及浓度分别为酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L)中于37℃、200rpm下振荡培养12h，分别得到PAO1-psl培养液、PAO1-pslpel培养液与PAO1培养液。取PAO1-psl培养液、PAO1-pslpel培养液与PAO1培养液，于12000rpm下离心2min，弃上清液，分别得到PAO1-psl菌体沉淀、PAO1-pslpel菌体沉淀与PAO1菌体沉淀。向菌体含量和体积均相同的PAO1-psl菌体沉淀、PAO1-pslpel菌体沉淀与PAO1菌体沉淀中分别加入200μl的0.5M EDTA，涡旋重悬菌体，得到菌体含量相同的PAO1-psl悬浮液、PAO1-pslpel悬浮液与PAO1悬浮液。分别将PAO1-psl悬浮液、PAO1-pslpel悬浮液与PAO1悬浮液在100℃下孵育5min，并于12000rmp条件下离心5min，弃沉淀，分别得到PAO1-psl上清液、PAO1-pslpel上清液与PAO1上清液。分别向上述三个上清液中加入蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度均为10mg/ml，并于60℃下孵育1h，消化胞外多糖中混有的蛋白。80℃下孵育30min，失活蛋白酶K后，分别得到PAO1-psl胞外多糖液、PAO1-pslpel胞外多糖液与PAO1胞外多糖液。
按照下述文献中的点杂交的方法：Byrd MS,Sadovskaya I,Vinogradov E,LuH,Sprinkle AB,Richardson SH,Ma L,Ralston B,Parsek MR,Anderson EM,LamJS,Wozniak DJ.2009.Genetic and biochemical analyses of the Pseudomonasaeruginosa Psl exopolysaccharide reveal overlapping roles forpolysaccharide synthesis enzymes in Psl and LPS production.Mol.Microbiol.73:622-638.，用特异性的胞外多糖Psl的抗血清(该抗血清按照下述文献中的方法制备：Byrd MS,Sadovskaya I,Vinogradov E,Lu H,Sprinkle AB,RichardsonSH,Ma L,Ralston B,Parsek MR,Anderson EM,Lam JS,Wozniak DJ.2009.Geneticand biochemical analyses of the Pseudomonas aeruginosa Pslexopolysaccharide reveal overlapping roles for polysaccharide synthesisenzymes in Psl and LPS production.Mol.Microbiol.73:622-638.)检测上述PAO1-psl胞外多糖液、PAO1-pslpel胞外多糖液与PAO1胞外多糖液中的Psl多糖，用特异性的胞外多糖Pel的抗血清(该抗血清按照下述文献中的方法制备：PelADeacetylase Activity Is Required for Pel Polysaccharide Synthesis inPseudomonas aeruginosa，Kelly M.Colvin,Noor Alnabelseya,Perrin Baker,John C.，Whitney,P.Lynne Howell and Matthew R.Parsek，J.Bacteriol.2013,195(10):2329-2339.)检测上述PAO1-psl胞外多糖液、PAO1-pslpel胞外多糖液与PAO1胞外多糖液中的Pel多糖，以不产Psl、Pel和脂多糖的algC突变株为阴性对照(Ma,L.,Wang,J.,Wang,S.,Anderson,E.M.,Lam,J.S.,Parsek,M.R.,andWozniak,D.J.(2012)Synthesis of multiple Pseudomonas aeruginosa biofilmmatrix exopolysaccharides is post-transcriptionally regulated.EnvironMicrobiol14:1995-2005.)，结果如图2，实验结果表明PAO1具有合成Psl多糖和Pel多糖的能力，PAO1-psl具有合成Pel多糖的能力，PAO1-psl和PAO1-pslpel的Psl多糖合成能力丧失，PAO1-pslpel的Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均丧失。
实施例3、PAO1-psl和PAO1-pslpel与出发菌株PAO1的鼠李糖脂合成及检测
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
1、PAO1-psl和PAO1-pslpel与出发菌株PAO1的鼠李糖脂合成
将PAO1-psl、PAO1-pslpel与出发菌株PAO1的单菌落分别接种于50mL营养肉汤培养基(营养肉汤培养基的溶剂为水，其溶质及浓度分别为营养肉汤粉8g/L(Oxoid公司)，葡糖糖5g/L)中，于37℃、200rpm下振荡培养2天，分别得到PAO1-psl培养液、PAO1-pslpel培养液与PAO1培养液。分别取PAO1-psl培养液、PAO1-pslpel培养液与PAO1培养液各40mL，于5000rpm下离心10min，分别得到PAO1-psl上清液、PAO1-pslpel上清液与PAO1上清液，分别将PAO1-psl上清液、PAO1-pslpel上清液与PAO1上清液的pH用浓盐酸调至pH为2。分别向pH为2的PAO1-psl上清液、PAO1-pslpel上清液与PAO1上清液中加入等体积的氯仿/甲醇(氯仿/甲醇中氯仿和甲醇的体积比为2:1)溶液，并高速漩涡震荡1min进行抽提，分别得到PAO1-psl有机相1、PAO1-pslpel有机相1、PAO1有机相1和PAO1-psl水相、PAO1-pslpel水相、PAO1水相。分别向PAO1-psl水相、PAO1-pslpel水相、PAO1水相中加入等体积的氯仿/甲醇(氯仿/甲醇中氯仿和甲醇的体积比为2:1)溶液，并高速漩涡震荡1min进行抽提，分别得到PAO1-psl有机相2、PAO1-pslpel有机相2、PAO1有机相2。将PAO1-psl有机相1和PAO1-psl有机相2混合并真空挥发，得到膏状PAO1-psl鼠李糖脂；将PAO1-pslpel有机相1和PAO1-pslpel有机相2混合并真空挥发，得到膏状PAO1-pslpel鼠李糖脂；将PAO1有机相1和PAO1有机相2混合并真空挥发，得到膏状PAO1鼠李糖脂。
2、PAO1-psl和PAO1-pslpel与出发菌株PAO1合成的鼠李糖脂的检测
1)硫酸蒽酮法检测鼠李糖脂
以鼠李糖(国药集团化学试剂有限公司)为标准品，按照硫酸蒽酮法做标准曲线定量分析鼠李糖，根据鼠李糖的含量计算PAO1-psl和PAO1-pslpel与出发菌株PAO1合成的总鼠李糖脂的量(Zhu K,Rock CO.2008.RhlA convertsβ-hydroxyacyl-acyl carrier protein intermediates in fatty acid synthesisto theβ-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate component of rhamnolipids inPseudomonas aeruginosa.J.Bacteriol.190:3147-3154.)，结果如图3所示。PAO1总鼠李糖脂的合成量为284.3±28.3mg/L，重组菌PAO1-psl总鼠李糖脂的合成量为398.0±39.8mg/L，重组菌PAO1-pslpel总鼠李糖脂的合成量为369.6±37.0mg/L，表明敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子或敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子和Pel合成基因簇的启动子后，总鼠李糖脂的产量明显增加；仅敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子比敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子和Pel合成基因簇的启动子菌株合成的总鼠李糖脂的量高。
2)TLC检测检测鼠李糖脂
通过TLC法，以硅胶G为吸附剂，以鼠李糖脂(湖州紫金生物科技有限公司)为标准品，铜绿假单胞菌PAO1合成的鼠李糖脂为对照分别定性分析PAO1-psl和PAO1-pslpel鼠李糖脂中的单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)及双鼠李糖脂(Rha-Rha-C10-C10)，结果如图4所示。流动相为溶液A，溶液A中各组分及其体积百分含量分别为80％三氯甲烷、18％甲醇和2％乙酸。单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的检测均在浓度为25mg/mL的α-萘酚中进行。结果表明，与作为出发菌的铜绿假单胞菌PAO1一样，PAO1-psl和PAO1-pslpel均可合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂。
3)通过HPLC-MS检测鼠李糖脂
将PAO1-psl鼠李糖脂、PAO1-pslpel鼠李糖脂、PAO1鼠李糖脂均用双蒸水稀释3000倍，然后通过HPLC-MS法，以鼠李糖脂(湖州紫金生物科技有限公司)为标准品确定单鼠李糖脂与双鼠李糖出峰时间，以铜绿假单胞菌PAO1合成的单鼠李糖脂与双鼠李糖脂均为100％，分别定量分析PAO1-psl鼠李糖脂、PAO1-pslpel鼠李糖脂中的单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)和双鼠李糖脂(Rha-Rha-C10-C10)(DézielE,Lépine F,Milot S,Villemur R.2003.rhlA is required for the productionof a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonasaeruginosa:3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs),the precursorsof rhamnolipids.Microbiology149:2005-2013；Déziel E,Lépine F,Dennie D,Boismenu D,Mamer OA,Villemur R.1999.Liquid chromatography/massspectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Pseudomonasaeruginosa strain57RP grown on mannitol or naphthalene.Biochim.Biophy.Acta.1440:244-252.)，结果如图5所示。
其中，HPLC的条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反向柱(100mm×2.1mm)
上样量：5μl
流动相：乙腈甲酸铵溶液
程序：
0-3min乙腈的体积百分含量为20％，甲酸铵(5mM)的体积百分含量为80％；
3-20min(不包括3min)乙腈的体积百分含量由20％匀速增加到90％，甲酸铵(5mM)的体积百分含量由80％匀速降低到10％；
20-26min(不包括20min)乙腈的体积百分含量为90％，甲酸铵(5mM)的体积百分含量为10％；
26-28min(不包括26min)乙腈的体积百分含量由80％匀速降低到10％，甲酸铵(5mM)的体积百分含量由20％匀速增加到90％；
28-40min(不包括28min)乙腈的体积百分含量为20％，甲酸铵(5mM)的体积百分含量为80％；
流速：0.3mL/min
MS的具体参数如下：雾化气(N2)：35psi
雾化气(N2)流量：12L/min
温度：350℃
毛细管电压：4,000V
扫描质谱范围：200-900Da
结果显示，PAO1、PAO1-psl和PAO1-pslpel中均合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂，单鼠李糖脂的质谱图如图5中A所示，双鼠李糖脂的质谱图如图5中B所示，PAO1、PAO1-psl和PAO1-pslpel合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的量如图5中C所示，PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的单鼠李糖脂Rha-C10-C10分别为PAO1的117％和211％；PAO1-psl和PAO1-pslpel合成的双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10分别为PAO1的129％和158％。表明敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子后，菌株合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的量均增加，敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子后，菌株合成单鼠李糖脂有大幅度的增加；敲除铜绿假单胞菌PAO1中Psl合成基因簇的启动子和Pel合成基因簇的启动子后，菌株合成单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的量也均增加。
Claims (10)
1.重组铜绿假单胞菌在制备鼠李糖脂中的应用；所述重组铜绿假单胞菌与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖合成能力降低。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述作为出发菌的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述重组铜绿假单胞菌为M1-M13中的任一种：
M1、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M2、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇的启动子敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M3、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M4、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M5、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M6、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M7、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M8、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M9、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和所述Psl多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M10、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
M11、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M12、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
M13、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子、Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除得到的与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
4.制备鼠李糖脂的方法，包括1)和2)：
1)构建与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
2)发酵所述重组铜绿假单胞菌，得到鼠李糖脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述作为出发菌的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述重组铜绿假单胞菌的构建方法为N1-N13中的任一种：
N1、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N2、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N3、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N4、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N5、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N6、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N7、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N8、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N9、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和所述Psl多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N10、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N11、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N12、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N13、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇、所述Psl多糖合成基因簇的启动子、Pel多糖合成基因簇和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌。
7.提高铜绿假单胞菌鼠李糖脂合成能力的方法，包括构建与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低和/或Pel多糖成能力降低的重组铜绿假单胞菌的步骤；所述重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成能力高于所述作为出发菌的铜绿假单胞菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述作为出发菌的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述重组铜绿假单胞菌的构建方法为N1-N13中的任一种：
N1、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N2、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇的启动子敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N3、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和所述Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N4、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N5、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Pel多糖合成基因簇敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Pel多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
N6、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇的启动子和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N7、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N8、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和Pel多糖合成基因簇均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力和Pel多糖合成能力均降低的重组铜绿假单胞菌；
N9、将所述作为出发菌的铜绿假单胞菌的Psl多糖合成基因簇和所述Psl多糖合成基因簇的启动子均敲除，得到与所述作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，Psl多糖合成能力降低的重组铜绿假单胞菌；
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10.权利要求1-3中任一所述的重组铜绿假单胞菌。
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