CN113481140A - 一种提高鼠李糖脂产量的方法及基因工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高鼠李糖脂产量的方法及基因工程菌，通过抑制铜绿假单胞菌中mexT基因的表达来提高鼠李糖脂产量。本申请的实验证明，与作为出发菌的铜绿假单胞菌相比，mexT转录受抑制的重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成能力显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高鼠李糖脂产量的基因工程方法及基因工程菌。
背景技术
鼠李糖脂是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种糖脂类生物表面活性剂。它具有良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力，在石油开采，生物医药、环境保护以及食品等领域具有广泛的应用前景。目前，鼠李糖脂的生产菌株主要是铜绿假单胞菌。在铜绿假单胞菌中，鼠李糖脂的合成依赖于三条代谢途径，分别为脂质前体β-羟基脂肪酸(HAAs)合成途径、糖基前体dTDP-L-鼠李糖(dTDP-L-rhamnose)合成途径以及将脂质前体和糖基前体进行聚合形成单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。dTDP-L-鼠李糖前体为鼠李糖脂的亲水部分，由D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸变位酶AlgC和RmlDBAC的作用下合成。3-羟基脂肪酸二聚体(HAAs)由RhlA催化3-羟脂酰CoA/ACP合成；然后由鼠李糖脂转移酶I RhlB催化HAAs和dTDP-L-鼠李糖反应生成单鼠李糖脂；最后由鼠李糖基转移酶IIRhlC催化单鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反应生成双鼠李糖脂。
目前用于提高铜绿假单胞菌鼠李糖脂的产量的方法一般是通过各种理化诱变、竞争途径敲除、底物利用能力提升来实现的。理化诱变极易回复突变，造成菌株生产性能的不稳定，而遗传改造往往都是针对合成途径的某一个关键位点来进行改造，鼠李糖脂产量提升的效果有限。因此迫切需要从全局转录水平来对鼠李糖脂合成进行改造，使鼠李糖脂的产量显著提升。
发明内容
为了克服现有技术中的如上缺陷，本发明提供一种通过调控全局转录水平来提高菌株鼠李糖脂产量的方法。本发明是通过对全局转录因子MexT进行失活来实现鼠李糖脂产量的提升。MexT是铜绿假单胞菌中的全局转录因子，参与调控铜绿假单胞菌中数千个基因的表达，例如三型分泌系统(T3SS)、MexEF-OprN外排泵系统等。目前尚未有MexT与鼠李糖脂合成相关的报道，但是申请人对铜绿假单胞菌中MexT失活后发现重组菌株鼠李糖脂产量显著提升。本发明提供的技术方案如下：
一种提高鼠李糖脂产量的方法，通过基因改造使鼠李糖脂生产菌株中的全局转录因子MexT低表达或不表达，获得基因工程菌；通过基因工程菌发酵的方式生产鼠李糖脂。
本发明所述的抑制mexT的表达包括降低细胞中基因mexT的表达或使基因mexT不表达。
可以通过以下一种或多种方式将基因mexT的表达降低或使其不表达：基因mexT的敲除、插入或突变；用弱启动子替代基因mexT的启动子；反义DNA或RNA；以及siRNA。
选择性地，可以使用熟知的敲除技术将基因mexT部分地或全部地敲除或灭活。另一种供选择的是用弱的或非活性的启动子替代基因mexT的启动子，结果导致基因mexT的表达缺失。本领域技术人员知道如何去用另外一种启动子替代基因mexT的启动子。
为了不获得基因mexT的表达，本领域技术人员选择适当的策略引入基因mexT的适当的突变是常规的工作。例如，Sambrook等人描述的体外诱变的方法(分子克隆，实验室手册，第二版，1989年，美国纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社)。相应的方法在商业上也是可以以试剂盒的形式得到的(例如，美国拉由拉市，Stratagene公司的Quikchange定点突变试剂盒。例如，可以通过本领域技术人员熟知的基因替代技术完成基因mexT的敲除。
基因mexT也可以使用反义DNA或(m)RNA或RNAi，优选siRNA，被沉默。本领域技术人员知道如何将基因沉默应用于本发明，以及如何选择和制备适当的基因沉默组建。
本发明使用的铜绿假单胞菌可以为铜绿假单胞菌模式菌株PAO1或者其他能够产生鼠李糖脂或者具备产生鼠李糖脂的潜力的铜绿假单胞菌，对于菌株的所属株系也并无特别限定，可以为铜绿假单胞菌野生株系也可以通过人工或自然突变或改造获得的菌株。理论上采用其他种属的鼠李糖脂生产菌株也可实现，如假单胞菌属的鼠李糖脂生产菌株。
本发明的另一目的在于提供上述方法中的基因工程菌。
进一步的，所述基因工程菌构建方式如下：
1)克隆mexT基因的上下游臂；
2)将上下游臂和线性化载体进行重组连接，构建mexT无痕敲除的重组质粒；在构建mexT无痕敲除的重组质粒时，对于选择的载体并无特殊限制，具有基因敲除的功能即可。
3)将所述重组质粒转化到鼠李糖脂生产菌株中，经同源交换和筛选后获得mexT失活的菌株。
进一步的，步骤1)中，克隆mexT基因的上下游臂各约500bp。
目前，对于利用铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的研究中，大多从鼠李糖脂代谢途径及其副产物竞争途径着手进行基因工程改造，很多改造只能锚定一两个点进行改造，对于鼠李糖脂产量的提升效果有限。本发明通过在铜绿假单胞菌中过抑制mexT基因的表达，构建了重组菌，所述重组铜绿假单胞菌与作为出发菌株的铜绿假单胞菌相比，鼠李糖脂的合成能力提高了48-55％；所述抑制mexT表达的重组铜绿假单胞菌与其他单位点遗传改造的重组的铜绿假单胞菌相比，鼠李糖脂的合成能力显著提高。可能是全局转录因子mexT抑制了鼠李糖脂外排泵系统的效率，从而导致胞内合成的鼠李糖脂无法及时排除胞外，在胞内积累后形成底物抑制效应。因此，在通过遗传改造抑制mexT的表达后，重组菌株鼠李糖脂合成能力显著提升。
附图说明
图1是敲除mexT基因后获得的鼠李糖合成重组菌株PAO1ΔmexT。
图2是PAO1ΔmexT与PAO1合成的总鼠李糖脂浓度图。
图3是重组菌株PAO1ΔmexT与出发菌株PAO1鼠李糖脂的产量的TLC检测。
图4是重组菌株PAO1ΔmexT与出发菌株PAO1鼠李糖脂的产量的LC-MS检测。
图5是在铜绿假单胞菌KT1115中敲除mexT后鼠李糖脂产量的检测结果。
具体实施方式
本发明通过无痕敲除技术对铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌KT1115进行遗传改造，获得了mexT基因缺失突变株PAO1ΔmexT、KT1115ΔmexT，通过对重组菌株和出发菌株鼠李糖脂产量的比较，发现mexT缺失的重组菌株鼠李糖脂合成产量大幅提升。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中铜绿假单胞菌PAO1见参考文献(Complete genome sequence ofPseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen.Nature 2000,406:959-964.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
下述实施例中铜绿假单胞菌KT1115已公开于申请人在先的专利申请CN106987545A，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号CCTCC M 2016686。
下述实施例中的pEX18Gm(Hoang T,Karkhoff-Schweizer R,Kutchma A,Schweizer H.1998.A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences:application forisolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene28:77-86.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
下述实施例中的E.coli S17-1(Simon R,Priefer U,Pühler A(1983)A broadhost range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposonmutagenesis in Gram-negative bacteria.Nature Biotechnology1:784–791.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
实施例敲除的mexT基因对应的蛋白GenBank登录号为：AAG05880.1。
实施例1
本实施例用于说明敲除mexT基因获得只鼠李糖脂合成重组菌株PAO1ΔmexT
PAO1ΔmexT缺失的基因mexT在铜绿假单胞菌PAO1基因组上位点为PA2492(www.pseudomonas.com)，PAO1ΔmexT的构建参考文献Precision-engineering thePseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange.Nature Protocol,2015,10(11):1820-41。敲除质粒为pEX18Gm，将对该基因编码区共第25-1014bp的片段进行敲除。根据mexT基因序列设计引物，扩增其上下游同源片段。用于同源臂扩增的引物如下：
mexT_KO_UF:5’-tatgaccatgattacgaattcGTAGACGCTGGCCTCCACC-3’
mexT_KO_UR:5'-cgatgaacatGGGCATAGGATCACTGACAGGC-3'
mexT_KO_DF:5'-tcctatgcccATGTTCATCGGCGATCCGG-3'
mexT_KO_DR:5'-acgacggccagtgccaagcttGAAGGCCACGCGGTCGAT-3'
PCR扩增的上下游同源片段长度分别为501bp和500bp，然后同源重组连接的方法将同源片段与酶切线性化的载体连接，构建成质粒pEX18Gm-mexT，将其转化到E.coli S17-1后，通过双亲接合的方法使质粒进入铜绿假单胞菌PAO1中，并通过同源单交换使其整合在铜绿假单胞菌PAO1基因组上。然后将单交换菌株在添加10％蔗糖的LBNS培养基中进行筛选，使其进行同源双交换，这样，有一部分菌株会缺失mexT基因，有一部分菌株会恢复突变到野生型，然后通过菌落PCR进行验证，挑选缺失突变株。菌落PCR利用mexT_KO_UF和mexT_KO_DR为正向和反向引物。
结果如图1所示，缺失突变株由于mexT基因大部分片段的缺失，扩增得到约1000bp的片段；恢复突变株得到约2000bp的片段，与野生型菌株一致。挑选mexT基因缺失的重组菌株，用于后续发酵和检测鼠李糖脂产量。
实施例2
PAO1ΔmexT与出发菌株PAO1的鼠李糖脂合成及硫酸蒽酮法检测检测
将PAO1ΔmexT的单菌落分别接种于50mL营养肉汤培养基(营养肉汤培养基的溶剂为水，其溶质及浓度分别为营养肉汤粉8g/L(Oxoid公司)，葡糖糖5g/L)，于37℃、200rpm下振荡培养2天，分别得到PAO1Δrml培养液和PAO1Δrhl培养液。分别取PAO1ΔmexT培养液40mL，于5000rpm下离心10min，分别得到PAO1ΔmexT上清液，用浓盐酸将上清液的调至pH为2。然后加等体积的氯仿/甲醇(v:v＝2:1)溶液，高速漩涡震荡1min，抽提两次，然后合并收集的有机相，真空挥发，最终得到膏状提取物。结果如图3所示，硫酸蒽酮法测得的总的鼠李糖脂浓度分别为PAO1＝192.5±18.3mg/L，PAO1ΔmexT＝596.2±25.8，表明mexT基因缺失后，确实增加了重组菌株鼠李糖脂的产量。
实施例3
PAO1ΔmexT与出发菌株PAO1合成的鼠李糖脂TLC法检测
向膏状提取物中加入20μL氯仿/甲醇进行充分溶解后进行TLC分析。展开剂为氯仿/甲醇/乙酸(展开剂氯仿/甲醇/乙酸中氯仿、甲醇及乙酸的体积比为30:5:1)，显色剂为α-萘酚硫酸试液(α-萘酚硫酸试液中10％α-萘酚乙醇溶液、硫酸及95％乙醇的体积比为10.5:6:44.5)，初步判断鼠李糖脂含量。TLC结果如图3所示，重组菌株PAO1ΔmexT对应的单、双鼠李糖脂强度都要显著高于出发菌株PAO1。
实施例4
PAO1ΔmexT与出发菌株PAO1合成的鼠李糖脂LC-MS检测
为了进一步明确mexT缺失是否体菌株是否增强了菌株的鼠李糖脂合成能力。我们将两株前体菌株上清中提取的膏状提取物进一步利用LC-MS进行鉴定，所用仪器为Agilent1260/6460LC/MSD三重四级杆质谱仪。具体做法如下，将过滤好的5μL样品上样至C18的反向高效液相色谱柱,使用5mM甲胺和浓度梯度的乙腈作为流动相，HPLC流速为0.3ml/min。将含量最大的两种物质进行质谱鉴定。质谱条件如下，温度350度，压力4000V，干氮气12L/min；雾化的氮气为35lb/in2。结果如图4所示，通过与参考文献(rhlA isrequired for the production of a novel biosurfactant promoting swarmingmotility in Pseudomonas aeruginosa:3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs),the precursors of rhamnolipids,Microbiology.2003,149:2005-13.)比较分析结果如图4所示，质谱图表明在503.323和649.383处有明显的鼠李糖脂特征峰出现，且缺失mexT的重组菌株特征峰的高度显著高于出发菌株PAO1，表明mexT缺失增强了菌株的鼠李糖脂合成能力。
实施例5
铜绿假单胞菌非模式菌株KT1115中敲除mexT对鼠李糖脂产量影响
为了证明mexT敲除对鼠李糖脂产量的促进作用具有普适性。我们在铜绿假单胞菌非模式菌株KT1115中进一步验证了mexT敲除对鼠李糖脂产量的影响。KT1115为一株分离自垃圾填埋场的铜绿假单胞菌，具有非常强的鼠李糖脂合成能力。使用实施例1中构建的pEX18Gm-mexT敲除质粒，经过质粒结合转移、同源重组、蔗糖反筛、菌落PCR验证等步骤获得了KT1115中成功敲除mexT的阳性菌株，命名为KT1115ΔmexT。在营养肉汤培养基中对KT1115ΔmexT和原始菌株KT1115进行发酵培养后，提取发酵液中的鼠李糖脂进行硫酸蒽酮法进行定量。结果表明KT1115敲除mexT后，鼠李糖脂的产量显著增多(图5)。表明通过敲除mexT提高鼠李糖脂的产量的方案具有一定的普适性。
Claims (10)
1.一种提高鼠李糖脂产量的方法，其特征在于，通过基因改造抑制鼠李糖脂生产菌株中的全局转录因子MexT的表达，获得基因工程菌；通过基因工程菌发酵的方式生产鼠李糖脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制全局转录因子MexT的表达包括通过基因改造使全局转录因子MexT低表达或不表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过基因mexT的敲除、插入或突变；用弱启动子替代基因mexT的启动子；siRNA；反义DNA/RNA中的任一种的方式使mexT低表达或不表达。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，通过部分或全部敲除鼠李糖脂生产菌株中的mexT基因以抑制mexT的表达。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鼠李糖脂生产菌株为铜绿假单胞菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鼠李糖脂生产菌株为铜绿假单胞菌PAO1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述mexT基因对应的蛋白GenBank登录号为：AAG06866.1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌在NB培养基中发酵生产鼠李糖脂。
9.权利要求1~8任一项所述方法构建的基因工程菌。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，构建方法如下：
1）克隆mexT基因的上下游臂；
2）将上下游臂和线性化载体进行重组连接，构建mexT无痕敲除的重组质粒；
3）将所述重组质粒转化到鼠李糖脂生产菌株中，经同源交换和筛选后获得mexT失活的菌株。
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