CN113249419B - 胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法 - Google Patents

胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法，利用鼠李糖基转移酶RhlB在胞外催化鼠李糖脂前体dTDP‑L‑鼠李糖和HAAs合成鼠李糖脂。其中dTDP‑L‑鼠李糖和HAAs基于基因改造菌株生产，其中一株菌可合成dTDP‑L‑rhamnose但不能合成HAAs，另外一株菌只能合成HAAs不能合成dTDP‑L‑rhamnose。将这两株菌合成的鼠李糖脂前体进行混合后，可在胞外利用鼠李糖脂合成酶RhlB在胞外催化前体dTDP‑L‑rhamnose和HAAs间连接合成鼠李糖脂。本发明的方法在实施过程中仅需短暂摇匀混合，可以解决鼠李糖脂发酵过程中大量起泡的问题，在鼠李糖脂生物合成领域具有广泛的应用前景。

Description

胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法
技术领域
本发明涉及生物催化领域，具体涉及胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法。
背景技术
鼠李糖脂是一种糖脂类的阴离子表面活性剂。它具有良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力，在石油开采，生物医药、环境保护以及食品等领域具有广泛的应用前景。在铜绿假单胞菌中，鼠李糖脂的合成依赖于三条代谢途径，分别为脂质前体β-羟基脂肪酸(HAAs)合成途径、糖基前体dTDP-L-鼠李糖(dTDP-L-rhamnose)合成途径以及将脂质前体和糖基前体进行聚合形成单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。dTDP-L-鼠李糖前体为鼠李糖脂的亲水部分，由D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸变位酶AlgC和RmlDBAC的作用下合成。3-羟基脂肪酸二聚体(HAAs)由RhlA催化3-羟脂酰CoA/ACP合成；然后由鼠李糖脂转移酶IRhlB催化HAAs和dTDP-L-鼠李糖反应生成单鼠李糖脂；最后由鼠李糖基转移酶II RhlC催化单鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反应生成双鼠李糖脂。
目前，鼠李糖脂的生产菌株主要是利用铜绿假单胞菌单菌发酵进行生产，单菌发酵生产鼠李糖脂的过程中会产生大量的泡沫，不仅影响了鼠李糖脂的产量，而且会应用在发酵过程中大量使用消泡剂影响鼠李糖脂的品质，造成了不必要的经济损失。因此迫切需要开发新型鼠李糖脂生产工艺，解决传统鼠李糖脂单菌发酵过程中的起泡问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种利用酶催化直接合成鼠李糖脂的新方法，直接在胞外将dTDP-L-鼠李糖和HAAs催化合成鼠李糖脂。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法，利用鼠李糖基转移酶RhlB在胞外催化鼠李糖脂前体dTDP-L-鼠李糖和HAAs合成鼠李糖脂。
进一步的，所述dTDP-L-鼠李糖和HAAs基于dTDP-L-鼠李糖生产菌株和HAAs生产菌株获取。
所述dTDP-L-鼠李糖生产菌株基于基因改造菌株生产获得；所述基因改造菌株为原始菌株HAAs合成途径的关键酶失活后的突变株。突变株中关键酶的基因表达量降低或丧失，无法合成HAAs，即只能合成鼠李糖脂前体dTDP-L-鼠李糖不能合成鼠李糖脂，有利于dTDP-L-鼠李糖的积累。所述关键酶为RhlA和/或RhlB，即对rhlAB基因簇中的一个基因或两个基因的组合和/或基因簇启动子进行敲除、大片段缺失、点突变或插入突变，以实现灭活改造。所述原始菌株为具有dTDP-L-鼠李糖和HAAs合成途径的鼠李糖脂生产菌株；优选铜绿假单胞菌，更优选铜绿假单胞菌模式菌株PAO1。
所述HAAs生产菌株基于基因改造菌株生产获得；所述基因改造菌株为原始菌株dTDP-L-鼠李糖合成途径的关键酶失活后的突变株。突变株中关键酶的基因表达量降低或丧失，无法合成dTDP-L-鼠李糖，只能合成鼠李糖脂前体HAAs，因此也就无法合成鼠李糖脂，且有利于HAAs的积累。所述关键酶为RmlA、RmlB、RmlC、RmlD中的一个或多个；即对rmlABCD基因簇中的一个基因或多个基因的组合和/或基因簇启动子进行敲除、大片段缺失、点突变或插入突变，以实现灭活改造。所述原始菌株为具有dTDP-L-鼠李糖和HAAs合成途径的鼠李糖脂生产菌株；优选铜绿假单胞菌；更优选铜绿假单胞菌模式菌株PAO1。
进一步的，本发明所述鼠李糖基转移酶RhlB来源于铜绿假单胞菌；优选铜绿假单胞菌模式菌株PAO1。
RhlB在胞外催化合成鼠李糖脂的具体方式为：利用重组细胞产生的RhlB纯酶或粗酶，或使用表面展示技术将RhlB在铜绿假单胞菌中进行表面展示，实现RhlB在胞外催化合成鼠李糖脂。
优选通过细胞表面展示技术，以OprF为锚定肽，将鼠李糖脂转移酶I RhlB锚定到铜绿假单胞菌的细胞表面，实现RhlB在胞外催化合成鼠李糖脂。
将dTDP-L-鼠李糖生产菌株、HAAs生产菌株发酵的上清液和鼠李糖脂转移酶RhlB纯酶或粗酶或含RhlB酶的菌泥混合反应，实现RhlB在胞外催化合成鼠李糖脂。优选采用静置反应。
本发明使用的铜绿假单胞菌可以为铜绿假单胞菌模式菌株PAO1或者其他能够产生鼠李糖脂或者具备产生鼠李糖脂的潜力的铜绿假单胞菌，对于菌株的所属株系也并无特别限定，可以为铜绿假单胞菌野生株系也可以通过人工或自然突变或改造获得的菌株。理论上采用其他种属的鼠李糖脂生产菌株也可实现，如假单胞菌属的鼠李糖脂生产菌株。
dTDP-L-rhamnose和HAAs都是在细胞内合成，酶RhlB也是在胞内发挥功能的酶，而本发明发现dTDP-L-rhamnose能够自由分泌到胞外，且酶RhlB能够在胞外环境中发挥催化功能。本发明基于这些理论开发了新的鼠李糖脂合成方法，采用基因改造菌株和鼠李糖脂前体进行混合，在胞外利用鼠李糖脂合成酶RhlB在胞外催化前体dTDP-L-rhamnose和HAAs间连接合成鼠李糖脂。本发明的方法生产鼠李糖脂，反应时间短，不需要搅拌，不需要使用消泡剂，可以妥善解决传统鼠李糖脂单菌发酵生产过程中的起泡问题、有利于下游产品的分离纯化。此外，该方法可以通过控制催化酶的类型定制合成高纯度的单、双鼠李糖脂，可极大提高鼠李糖脂的品质。
附图说明
图1是敲除rhlAB基因簇获得只能合成dTDP-L-鼠李糖的工程菌株PAO1Δrhl。
图2是敲除rmlABCD基因簇获得只能合成HAAs的的工程菌株PAO1Δrml。
图3是前体菌株PAO1Δrhl和PAO1Δrml丧失了鼠李糖脂的合成能力的TLC检测。
图4是前体菌株PAO1Δrhl和PAO1Δrml丧失了鼠李糖脂的合成能力的LC-MS检测。
图5是酶催化合成鼠李糖脂体系的示意图。
图6是TLC检测胞外酶催化体系合成的产品。
图7是LC-MS检测胞外酶催化体系合成的产品。
具体实施方式
本发明通过无痕敲除技术对铜绿假单胞菌PAO1进行遗传改造，获得了两株缺失突变株PAO1Δrhl和PAO1Δrml，两株菌分别用来合成鼠李糖脂的前体物质dTDP-L-鼠李糖和HAAs，通过简单的固液分离步骤获取两株菌的发酵上清作为鼠李糖脂合成的前体。通过pHERD20T质粒，在PAO1Δrml中引入OprF-RhlB重组蛋白进行表面展示，获得催化菌株PAO1Δrml/rhlB。将催化菌株的菌泥和前体合成菌株的上清进行混合后，于体外催化鼠李糖脂的合成。本发明提出的鼠李糖脂生产工艺反应时间短、反应过程无泡沫产生，具有潜在的广阔应用前景，有望替代传统鼠李糖脂单菌发酵工艺。此外，本发明具有较强的普适性，可基于不同的鼠李糖脂工业生产菌株进行开发。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中铜绿假单胞菌PAO1见参考文献(Complete genome sequence ofPseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen.Nature 2000,406:959-964.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
下述实施例中的pEX18Gm(Hoang T,Karkhoff-Schweizer R,Kutchma A,Schweizer H.1998.A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences:application forisolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene28:77-86.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
下述实施例中的pHERD20T(Qiu D,Damron FH,Mima T,Schweizer HP,Yu HD(2008)PBAD-based shuttle vectors for functional analysis of toxic and highlyregulated genes in Pseudomonas and Burkholderia spp.and other bacteria.ApplEnviron Microbiol74(23):7422–7426.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
下述实施例中的E.coli S17-1(Simon R,Priefer U,Pühler A(1983)A broadhost range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposonmutagenesis in Gram-negative bacteria.Nature Biotechnology1:784–791.)公众可从南京工业大学获得，申请人承诺，从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
实施例使用的RhlB蛋白GenBank登录号为：AAG06866.1。
实施例1
本实施例用于说明敲除rhlAB基因簇获得只能合成dTDP-L-鼠李糖的前体菌株PAO1Δrhl
PAO1Δrhl缺失的基因rhlA和rhlB在铜绿假单胞菌PAO1基因组上位点为PA3478-PA3479(www.pseudomonas.com)，PAO1Δrhl的构建参考文献Precision-engineering thePseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange.Nature Protocol,2015,10(11):1820-41。敲除质粒为pEX18Gm，将对该基因簇的启动子和rhlA基因编码区共987bp的片段进行敲除。根据rhlAB基因序列和启动子序列设计引物，扩增其上下游同源片段。用于同源臂扩增的引物如下：
rhl_KO_UF:5’-tatgaccatgattacgaattcCCCTCGGCGTGAACCT-3’
rhl_KO_UR:5'-ttgtcgcggctgcggatcgctgtgcg-3'
rhl_KO_DF:5'-ccgcagccgcgacaagctgctcaag-3'
rhl_KO_DR:5'-acgacggccagtgccaagcttTCTCAATCACCTGACCCTGGC-3'
PCR扩增的上下游同源片段长度分别为550bp和545bp，然后同源重组连接的方法将同源片段与酶切线性化的载体连接，构建成质粒pEX18Gm-rhl，将其转化到E.coli S17-1后，通过双亲接合的方法使质粒进入铜绿假单胞菌PAO1中，并通过同源单交换使其整合在铜绿假单胞菌PAO1基因组上。然后将单交换菌株在添加10％蔗糖的LBNS培养基中进行筛选，使其进行同源双交换，这样，有一部分菌株会缺失rhlAB基因，有一部分菌株会恢复突变到野生型，然后通过菌落PCR进行验证，挑选缺失突变株。菌落PCR利用rhl_KO_UF和rhl_KO_DR为正向和反向引物。
结果如图1所示，缺失突变株由于rhlAB基因簇大部分片段的缺失，扩增得到约1095bp的片段；恢复突变株得到1784bp的片段，与野生型菌株一致。挑选rhlAB基因缺失突变株，从而进行后续鼠李糖脂的胞外酶催化合成。
实施例2
本实施例用于说明敲除rmlABCD基因簇获得只能合成HAAs的前体菌株PAO1Δrml
PAO1Δrml缺失的基因rmlABCD在铜绿假单胞菌PAO1基因组上位点为PA5161-PA5164(www.pseudomonas.com)，PAO1Δrml的构建参考文献Precision-engineering thePseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange.Nature Protocol,2015,10(11):1820-41。敲除质粒为pEX18Gm，将对该基因簇的启动子、rmlB基因以及rmlD基因的大部分编码区共1499bp的片段进行敲除。根据rmlABCD基因序列和启动子序列设计引物，扩增其上下游同源片段。用于同源臂扩增的引物如下：
rml_KO_UF:5'-tatgaccatgattacgaattcCTCTCCGACCTGCCCCCC-3'
rml_KO_UR:5'-aatgcaccagAAGTGCCATCACTGGGTAGAAAG-3'
rml_KO_DF:5'-gatggcacttCTGGTGCATTACTCCACCGAC-3'
rml_KO_DR:5'-acgacggccagtgccaagcttTTCCTGGATCATGCGTCCG-3'
PCR扩增的上下游同源片段长度分别为599bp和600bp，然后用同源重组连接的方法将同源片段与酶切线性化的载体连接，构建成质粒pEX18Gm-rml，将其转化到E.coliS17-1后，通过双亲接合的方法使质粒进入铜绿假单胞菌PAO1中，并通过同源单交换使其整合在铜绿假单胞菌PAO1基因组上。然后将单交换菌株在添加10％蔗糖的LBNS培养基中进行筛选，使其进行同源双交换，这样，有一部分菌株会缺失rmlABCD基因，有一部分菌株会恢复突变到野生型，然后通过菌落PCR进行验证，挑选缺失突变株。菌落PCR利用rml_KO_UF和rml_KO_DR为正向和反向引物。
结果如图2所示，缺失突变株由于rmlABCD基因簇大部分片段的缺失，扩增得到约1199bp的片段；恢复突变株得到2698bp的片段，与野生型菌株一致。挑选rmlABCD基因簇缺失突变株，从而进行后续鼠李糖脂的胞外酶催化合成。
实施例3
前体合成菌株PAO1Δrml和PAO1Δrhl的功能验证
1、PAO1Δrml和PAO1Δrhl的鼠李糖脂合成能力检测
将PAO1Δrml和PAO1Δrhl的单菌落分别接种于50mL营养肉汤培养基(营养肉汤培养基的溶剂为水，其溶质及浓度分别为营养肉汤粉8g/L(Oxoid公司)，葡糖糖5g/L)，于37℃、200rpm下振荡培养2天，分别得到PAO1Δrml培养液和PAO1Δrhl培养液。分别取PAO1Δrml培养液和PAO1Δrhl培养液各40mL，于5000rpm下离心10min，分别得到PAO1Δrml上清液和PAO1Δrhl上清液，用浓盐酸将上清液的调至pH为2。然后加等体积的氯仿/甲醇(v:v＝2:1)溶液，高速漩涡震荡1min，抽提两次，然后合并收集的有机相，真空挥发，最终得到膏状提取物。
向膏状提取物中加入20μL氯仿/甲醇进行充分溶解后进行TLC分析。展开剂为氯仿/甲醇/乙酸(展开剂氯仿/甲醇/乙酸中氯仿、甲醇及乙酸的体积比为30:5:1)，显色剂为α-萘酚硫酸试液(α-萘酚硫酸试液中10％α-萘酚乙醇溶液、硫酸及95％乙醇的体积比为10.5:6:44.5)，初步判断鼠李糖脂含量。TLC结果如图3所示，前体菌株PAO1Δrml和PAO1Δrhl都缺失了鼠李糖脂合成关键基因rmlABCD和rhlAB，因此，两株前体菌株均无法合成鼠李糖脂。
为了进一步明确两株前体菌株是否丧失了鼠李糖脂合成能力。我们将两株前体菌株上清中提取的膏状提取物进一步利用LC-MS进行鉴定，所用仪器为Agilent 1260/6460LC/MSD三重四级杆质谱仪。具体做法如下，将过滤好的5μl样品上样至C18的反向高效液相色谱柱,使用5mM甲胺和浓度梯度的乙腈作为流动相，HPLC流速为0.3ml/min。将含量最大的两种物质进行质谱鉴定。质谱条件如下，温度350度，压力4000V，干氮气12L/min；雾化的氮气为35lb/in2。结果如图4所示，通过与参考文献(rhlA is required for theproduction ofa novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonasaeruginosa:3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs),the precursors ofrhamnolipids,Microbiology.2003,149:2005-13.)比较分析可知，两株前体菌株的上清提取物中均未出现单、双鼠李糖脂的特征峰，表明两株菌丧失了鼠李糖脂合成能力。
实施例4
本实施例用于说明利用表面展示技术构建鼠李糖脂酶催化菌株PAO1Δrml/rhlB
用于催化鼠李糖脂前体合成鼠李糖脂的酶为鼠李糖基转移酶RhlB，其在铜绿假单胞菌PAO1基因组上位点为PA3478(www.pseudomonas.com)。本发明采用表面展示技术将RhlB构建到鼠李糖脂合成缺陷菌株PAO1Δrml中。具体操作可参照文献Lee,S.H.,Lee,S.Y.,Park,B.C.,2005.Cell surface display of lipase in Pseudomonas putidaKT2442 using OprF as an anchoringmotifand its biocatalyticapplications.Applied and Environmental Microbiology 71,8581-8586。表面展示选用的质粒为pHERD20T，设计并合成含有同源臂的引物将表面展示的蛋白OprF和鼠李糖脂转移酶RhlB对应的基因构建到pHERD20T载体上。设计的引物如下：
ORB_UF：ATCTGATAAGAATTCATGAAACTGAAGAACACCTTAGGC
ORB_UR：TGGCGTGCATGACGTTGTCGCAAACGCC
ORB_DF：GACAACGTCATGCACGCCATCCTCATC
ORB_DR：GCCAGTGCCAAGCTTTCAGGACGCAGCCTTCAGC
PCR扩增对应的两个基因片段分别长度为661bp、1305bp，然后利用同源重组连接的方法将同源片段与酶切线性化的载体连接，构建成质粒pHERD20T-ORB。随后通过质粒转化的方式使质粒进入铜绿假单胞菌PAO1Δrml中，获得鼠李糖脂合成催化菌株PAO1Δrml/rhlB。
实施例5
本实施例用于说明鼠李糖脂酶胞外酶催化合成体系的建立及产品检测
1、鼠李糖脂酶胞外酶催化合成体系的建立
将前体菌株PAO1Δrml、PAO1Δrhl和PAO1Δrml/rhlB的单菌落分别接种于5mL营养肉汤培养基(营养肉汤培养基的溶剂为水，其溶质及浓度分别为营养肉汤粉8g/L(Oxoid公司)，葡糖糖5g/L)中，于37℃、200rpm下振荡培养24小时，分别得到PAO1Δrml培养液、PAO1Δrhl培养液和PAO1Δrml/rhlB培养液。分别取PAO1Δrml培养液、PAO1Δrhl培养液和PAO1Δrml/rhlB培养液各2mL，于5000rpm下离心10min，分别得到PAO1Δrml上清液、PAO1Δrhl上清液及PAO1Δrml/rhlB菌泥。分别吸取500μL PAO1Δrml上清液和500μLPAO1Δrhl上清液，加入PAO1Δrml/rhlB菌泥中，并高速漩涡震荡1min进行混匀，将PAO1Δrml上清液、PAO1Δrhl上清液及PAO1Δrml/rhlB菌泥混匀后，于37℃水浴反应0.5小时。胞外酶催化合成技术示意图详见图5。
2、鼠李糖脂酶胞外酶催化的产品检测
将上述催化反应结束后，将混合液于5000rpm下离心10min，得反应上清，用浓盐酸将反应上清液调至pH为2。然后加等体积的氯仿/甲醇(v:v＝2:1)溶液，高速漩涡震荡1min，抽提两次，然后合并收集的有机相，真空挥发，最终得到膏状鼠李糖脂提取物。加入20uL的氯仿/甲醇溶液对膏状鼠李糖脂提取物进行溶解，随后利用TLC分析酶催化体系是否合成了鼠李糖脂。TLC的结果如图6所示，和鼠李糖脂标准品相比，本方法设计的酶催化体系成功合成了鼠李糖脂。
实施例6
本实施例用于鉴定胞外酶催化合成鼠李糖脂的组成
利用LC-MS对胞外酶催化鼠李糖脂合成体系的产品进行了进一步鉴定，所用仪器为Agilent 1260/6460LC/MSD三重四级杆质谱仪。具体做法如下，将过滤好的5μL样品上样至C18的反向高效液相色谱柱，使用5mM甲胺和浓度梯度的乙腈作为流动相，HPLC流速为0.3ml/min。将含量最大的两种物质进行质谱鉴定。质谱条件如下，温度350度，压力4000V，干氮气12L/min；雾化的氮气为35lb/in2。结果如图7所示，通过与参考文献(rhlA isrequired for the production of a novel biosurfactant promoting swarmingmotility in Pseudomonas aeruginosa:3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs),the precursors of rhamnolipids，Microbiology.2003,149:2005-13.)比较分析可知，质谱图表明在503.323和649.383处有明显的鼠李糖脂峰出现，表明酶催化体系中有鼠李糖脂的合成，且绝大多数为双鼠李糖脂。

Claims (1)

1.一种胞外酶催化合成鼠李糖脂的方法，其特征在于，利用鼠李糖基转移酶RhlB在胞外催化鼠李糖脂前体dTDP-L-鼠李糖和HAAs合成鼠李糖脂；
所述dTDP-L-鼠李糖和HAAs基于dTDP-L-鼠李糖生产菌株和HAAs生产菌株获取；
所述dTDP-L-鼠李糖生产菌株基于基因改造菌株生产获得；所述基因改造菌株为铜绿假单胞菌模式菌株PAO1 HAAs合成途径的关键酶RhlA、RhlB失活后的突变株；
所述HAAs生产菌株基于基因改造菌株生产获得；所述基因改造菌株为铜绿假单胞菌模式菌株PAO1 dTDP-L-鼠李糖合成途径的关键酶RmlA、RmlB、RmlC和RmlD失活后的突变株；
利用重组细胞产生的RhlB纯酶或粗酶，或以OprF为锚定肽使用表面展示技术将RhlB锚定到dTDP-L-鼠李糖生产菌株的细胞表面进行表面展示，所述RhlB来源于铜绿假单胞菌模式菌株PAO1；将dTDP-L-鼠李糖生产菌株、HAAs生产菌株发酵的上清液和鼠李糖脂转移酶RhlB纯酶或粗酶或含RhlB酶的菌泥混合反应，实现RhlB在胞外催化合成鼠李糖脂。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099388A (zh) * 2014-07-10 2014-10-15 中国科学院微生物研究所 提高鼠李糖脂产量的方法及其专用铜绿假单胞菌
CN106754609A (zh) * 2017-03-21 2017-05-31 山东大学苏州研究院 一株减毒高产鼠李糖脂的工程菌株及其构建与应用
CN107828796A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 东莞理工学院 抑制铜绿假单胞菌中基因rsaL表达的应用及基因rsaL的表达受抑制的铜绿假单胞菌
CN108060111A (zh) * 2017-10-27 2018-05-22 中国科学院微生物研究所 一种提高鼠李糖脂产量的铜绿假单胞菌及其构建方法
CN111849846A (zh) * 2020-07-06 2020-10-30 曲阜师范大学 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099388A (zh) * 2014-07-10 2014-10-15 中国科学院微生物研究所 提高鼠李糖脂产量的方法及其专用铜绿假单胞菌
CN106754609A (zh) * 2017-03-21 2017-05-31 山东大学苏州研究院 一株减毒高产鼠李糖脂的工程菌株及其构建与应用
CN108060111A (zh) * 2017-10-27 2018-05-22 中国科学院微生物研究所 一种提高鼠李糖脂产量的铜绿假单胞菌及其构建方法
CN107828796A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 东莞理工学院 抑制铜绿假单胞菌中基因rsaL表达的应用及基因rsaL的表达受抑制的铜绿假单胞菌
CN111849846A (zh) * 2020-07-06 2020-10-30 曲阜师范大学 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lee,S.H et al.Cell surface display of lipase in Pseudomonas putida KT2442 using OprF as an anchoringmotifand its biocatalytic applications.《Applied and Environmental Microbiology 》.2005,全文. *
Skarphedinn Halldorsson et al .Azithromycin Maintains Airway Epithelial Integrity during Pseudomonas aeruginosa Infection.《Am J Respir Cell Mol Biol》.2010,第42卷(第1期),全文. *

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