CN108587989A

CN108587989A - 一种用于生产3-羟基癸酸的菌株及生产方法

Info

Publication number: CN108587989A
Application number: CN201810233766.2A
Authority: CN
Inventors: 王帅; 朱坤; 于海英
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明涉及一种用于生产3‑羟基癸酸(3HD,3‑hydroxydecanoate)的菌株及生产方法，该菌株为铜绿假单胞菌，该菌株的鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)被灭活，且该菌株的rhlA基因被利用，催化3‑羟基酯酰‑CoA/ACP合成羟基脂肪酸二聚体(HAA,3‑(3‑hydroxyalkanoyloxy)alkanoate)。通过实验验证，利用本发明提供的工程菌株，以包括棕榈油和/或甘油为碳源的培养基发酵培养，经过碱水解处理后，可得到高产量、高纯度的3‑羟基癸酸。本发明可用于生产高产量、高纯度的3‑羟基癸酸，且应用前景广阔。

Description

一种用于生产3-羟基癸酸的菌株及生产方法

技术领域

本发明属于生物技术和微生物发酵领域，具体涉及一种工程菌及其在生产3-羟基脂肪酸(3HA，3-hydroxyal kanoate)中的应用。

背景技术

3-羟基脂肪酸(3HA)是生物材料聚羟基脂肪酸酯(PHA, poly hydroxyalkanoates)的常见单体。由于其具有特殊的手性结构，可用作药物、抗生素、维生素、信息素等的合成重要前体物质。根据碳链骨架的长度，3-羟基脂肪酸可分为短链和中长链两类前者的碳链长度为3-5，后者的碳链长度为6-14。3-羟基癸酸(3HD)作为3-羟基脂肪酸的重要一员，被证实具有抑菌、抑制花粉生长及种子发芽等重要活性。

生产3-羟基脂肪酸的传统方法是化学合成法，目前研究较多的是，通过降解PHA得到单体。但是这些方法技术不成熟，工艺复杂，生产投入高，尤其是产物纯度低，大大增加了分离纯化的难度。微生物发酵法直接生产3- 羟基脂肪酸单体，是另一种尝试。硫酯酶具有水解3-羟基酯酰-CoA的活性，通过在大肠杆菌或恶臭假单胞菌中引入TesB(来自大肠杆菌)、PTE1(来自酿酒酵母)等硫酯酶，把3-羟基脂肪酸从辅酶A上水解下来形成游离的3-羟基脂肪酸。但是由于中链3-羟基脂肪酸单体(尤其是8个碳和10个碳)在高浓度下有明显的抑菌作用，所以利用此方法难以实现3-羟基脂肪酸的大量积累。因为缺少有效生产方法，3-羟基脂肪酸作为一种极具应用价值的化合物，其利用受到了极大的限制。探索寻找合适的生产原料、生产菌株以及新的代谢途径，成为实现3-羟基脂肪酸大量生产的关键。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可以利用油脂高效合成鼠李糖脂。鼠李糖脂的合成主要包括三个连续的反应：首先由RhlA催化3-羟脂酰CoA/ACP合成3-羟基脂肪酸二聚体(HAA)；然后由鼠李糖脂转移酶I RhlB 催化HAA和dTDP-L-鼠李糖反应生成单鼠李糖脂；最后由鼠李糖基转移酶II RhlC催化单鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反应生成双鼠李糖脂。HAA是合成3- 羟基脂肪酸的关键前体物质，对HAA进行水解反应即可得到3-羟基脂肪酸单体。由于RhlA对碳链的偏好性，HAA的单体以3-羟基癸酸为主。但在铜绿假单胞菌中，HAA作为中间体用来合成鼠李糖脂，即用现有菌株不能实现HAA 的积累。所以现有的铜绿假单胞菌不能满足用于生产中长链3-羟基脂肪酸的需求。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用于生产3-羟基癸酸的菌株，以及利用该菌株来生产3-羟基脂肪酸二聚体、3-羟基癸酸的生产方法，具有产量高、纯度高和应用前景广阔等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种用于生产3-羟基癸酸的菌株，该菌株为铜绿假单胞菌，该菌株的鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)被灭活，该菌株的rhlA基因被利用，催化3- 羟脂酰CoA/ACP合成羟基脂肪酸二聚体HAA。

上述中“鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)被灭活”具体方式可以为，敲除鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)。

上述中“rhlA基因被利用”具体是指，保留基因组上rhlA基因，利用其自身的高表达。当然，也可以对rhlA进行适当改造。

铜绿假单胞菌只需要能够生产鼠李糖脂或者具备生产鼠李糖脂的潜力即可，对菌株的所述株系并无特别限定。对于所述铜绿假单胞菌的来源可以是野生株系也可以是通过人工或自然突变或改造获得的菌株。

HAA的合成及积累是通过rhlA基因的表达实现的，RhlA催化3-羟基酯酰CoA/ACP合成3-羟基脂肪酸二聚体(HAA)。

本发明通过铜绿假单胞菌中鼠李糖脂代谢途径的基因改造实现了HAA的胞外积累，并对HAA进行碱水解实现3-羟基癸酸的生产，具有产量高、纯度高和应用前景广阔等优点。铜绿假单胞菌rhlA基因对碳链的选择作用，本发明的产品为高纯度的3-羟基癸酸，3-羟基癸酸的终产量可达13g/L。

进一步，该菌株的鼠李糖基转移酶I(rhlB)基因和鼠李糖基转移酶II (rhlC)基因同时被灭活，且该菌株的rhlA基因被利用，催化3-羟基酯酰 -CoA/ACP合成羟基脂肪酸二聚体。

灭活鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)和鼠李糖基转移酶II基因(rhlC) 的具体方法可以为敲除rhlB基因和rhlC基因。其作用分别为，鼠李糖基转移酶I RhlB催化HAA和dTDP-L-鼠李糖反应生成单鼠李糖脂；鼠李糖基转移酶II RhlC催化单鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反应生产双鼠李糖脂。

进一步，rhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步，rhlC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步，rhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。HAA的合成及积累是通过rhlA基因的表达实现的，RhlA催化3-羟基脂酰CoA/ACP合成3- 羟基脂肪酸二聚体(HAA)。

本发明还提供一种生产3-羟基脂肪酸二聚体的方法，包括以下步骤：发酵上述用于生产3-羟基癸酸的菌株，得到3-羟基脂肪酸二聚体。

进一步，发酵时采用的培养基的碳源包括甘油和/或棕榈油。培养基的成分，碳源优先选择甘油和/或棕榈油，其他成分均可以根据本领域的常规技术手段进行选择，例如：对氮源的选择。

本发明还提供一种生产3-羟基癸酸的方法，包括以下步骤：1)发酵上述用于生3-羟基癸酸的菌株，得到3-羟基脂肪酸二聚体；2)将3-羟基脂肪酸二聚体水解为单体，得到3-羟基癸酸。

具体的，上述技术方案包括以下步骤，1)对鼠李糖脂生产菌进行基因改造；敲除鼠李糖基转移酶基因，保留rhlA基因，实现3-羟基脂肪酸二聚体HAA的积累；2)重组菌株发酵培养，培养基的碳源包括甘油和/或棕榈油； 3)羟基脂肪酸二聚体HAA水解为单体。

进一步，步骤2)中，采用碱水解的方法将3-羟基脂肪酸二聚体HAA水解为单体。具体的操作可以为：配制碱性物质(例如：NaOH)和HAA的水溶液，加热反应。此步骤对碱性物质没有特殊要求，只要能够提供碱性环境及反应所需OH^-即可。此步骤HAA的水解反应可彻底进行，且碱溶液浓度越大，温度越高水解速度越快。

进一步，步骤1)中，发酵时，采用的培养基的碳源包括甘油和/或棕榈油。当采用棕榈油为碳源时，3-羟基癸酸(3HD)的产量更高。

本发明的有益效果是：

本发明为3-羟基脂肪酸的生产提供了一个新的代谢途径,改造鼠李糖脂代谢途径。目前对于3-羟基脂肪酸的生产研究，主要集中在对聚羟基脂肪酸的降解。但此方法存在多种问题，首先聚羟基脂肪脂肪酸水解困难，过程复杂，效率低下；其次这种先聚合再水解的方法，增加了代谢通路的复杂程度，本身就降低了效率。而以单体的形式生产3-羟基脂肪酸又存在抑菌作用，尤其以C8、C10链长的最为明显。因此新代谢途径的探索，对3-羟基脂肪酸的生产尤为重要。本发明为3-羟基脂肪酸的生产提供一个新的思路，以二聚体的形式实现发酵液中产物的大量积累，再结合二聚体的碱水解，实现了3-羟基脂肪酸高纯度高产量的生产。此方法存在两个优势，1)二聚体不会对菌体产生毒害作用，可以实现产物的大量积累，从而提高产量；2)相比较聚羟基脂肪酸酯(PHA)水解生产3-羟基脂肪酸，羟基脂肪酸二聚体HAA 的碱水解方法具有水解速度快、效率高、操作简单、反应可彻底进行的特点。例如：当HAA浓度为30g/L时，80℃、0.5mol/LNaOH水溶液处理1.5h,就可以实现完全水解。

附图说明

图1为本发明所述薄层层析结果图。a:展开，氯仿/甲醇/乙酸＝65/15/2 (v/v/v)；显色，5％的硫酸乙醇溶液显色，120℃显色，直到出现清晰的斑点。b,c，d:展开，氯仿/甲醇/乙酸＝99/1/2(v/v/v)；显色，5％的硫酸乙醇溶液显色，120℃显色，直到出现清晰的斑点。点样编号，1，PAO1发酵提取液；2，PAO1(ΔrhlC)发酵提取液；4，PAO1(ΔrhlAB)发酵提取液；5， PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液；6，PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液加碱水解反应； 7，3-羟基癸酸标准品；8，PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液碱水解反应0.5h；9， PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液碱水解反应1h；10，PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液碱水解反应1.5h；11，PAO1(ΔrhlBC)发酵提取液碱水解反应2h；12, PAO1(ΔrhlB)发酵提取液。RL,鼠李糖脂(rhamnolipid)；Mono-RL,单鼠李糖脂(monorhamnolipid)；Di-RL,双鼠李糖脂(dirhamnolipid)；3HD,3-羟基癸酸(3-hydroxydecanoate)；HAA，羟基脂肪酸二聚体 (3-(3-hydroxyal kanoyloxy)alkanoate)。

图2为3-羟基癸酸甲酯的气相色谱图和质谱图。

图3为用称重法测定不同碳源培养下，菌株PAO1(ΔrhlBC)3-羟基癸酸

的产量和OD值。

图4为对称重法测定的3-羟基癸酸量进行气相色谱纯度校正。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

构建上述具有遗传稳定性的重组铜绿假单胞菌的方法包括以下步骤：

1)为了方便于对转基因菌株进行鉴定及筛选，对所用于构建突变菌株的自杀性质粒pK18mobsacB进行加工，插入编码庆大霉素抗性基因抗性盒得到pK18Gm，以便于利用庆大霉素抗性对转化子进行筛选。

2)以铜绿假单胞菌PAO1为出发菌株，将鼠李糖基转移酶II基因rhlC 敲除，得到菌株PAO1(ΔrhlC)。

3)在菌株PAO1(ΔrhlC)、PAO1的基础上敲除鼠李糖基转移酶I基因 rhlB,得到菌株PAO1(ΔrhlBC)、PAO1(ΔrhlB)。

上述的构建方法中，基因的敲除顺序可以改变，所得的重组菌株于上述菌株具有同样的功能。

若无特别说明，本发明所采用的专业术语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载的内容相似或者均等的方法及材料均可应用于本发明所述的方法中。实验中未注明的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆实验指南(第三版)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件或者按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的溶液若无特别说明，均为水溶液。

所述Pseudomonas aeruginosa PAO1(Zhu K,Rock CO.RhlA Converts b-Hydroxyacyl-Acyl Carrier Protein Intermediates in Fatty Acid Synthesis to theb-Hydroxydecanoyl-b-Hydroxydecanoate Component of Rhamnolipids in Pseudomonasaeruginosa.J Bacteriol. 2008,5；190(9):3147-3154.)公众可以从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

下述实施案例中的pK18mobsacB自杀性载体(SchaferA,Tauch.；Smallmobilizablemulti-purpose cloning vector derived from the Escherichia coliplasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutumicum.Gene.1994；145(1):69-73)、质粒pPS856(Choi KH,Schweizer HP.An improved method for rapid generation of unmarked Pseudomonasaeruginosa deletion mutants.BMC Microbiol.2005,5,(30):1-11)公众可以从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、构建自杀性质粒载体pK18Gm

以pK18-Gm(BamHI)-F和pK18-Gm(NcoI)-R为引物，从pPS856质粒为模板扩增Gm抗性基因，然后用BamHI+NcoI进行双酶切，克隆到用 BglⅡ+NcoⅠ双酶切的pK18mobSacB载体中。将连接产物转入大肠杆菌DH5 α，在含有庆大霉素(浓度为25mg/L)的LB平板上筛选阳性克隆。提取质粒得到pK18GM载体。

所述引物序列：

pK18-Gm(BamHI)-F：GCTGAAGGATCCTATACTTTCTAGAG(SEQ ID NO.4)

pK18-Gm(NcoI)-R:CTTACTCCATGGAATTCTAGATCG(SEQ ID NO.5)

实施例2、铜绿假单胞菌PAO1(ΔrhlC)菌株的构建

(1)构建自杀性质粒pk18Gm-rhlC。以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，分别以rhlC-Up(BamHI)-F和rhlC-Up(PstI)-R、rhlC-Down(PstI)-F 和rhlC-Down(HindIII)-R扩增rhlC基因上游序列和下游序列用BamHI和 PstI、PstI和HindIII双酶切，pK18Gm用BamHI和HindIII双酶切。三个片段同时用T4DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，在含有庆大霉素(浓度为25mg/L)的LB平板上筛选阳性克隆。得到自杀性质粒 pk18Gm-rhlC。

(2)利用三亲结合的方法(受体菌株为PAO1，供体菌为大肠杆菌DH5α含自杀性质粒pK18Gm-rhlC，助质粒为pRK2013)将自杀性质粒转入到PAO1，通过同源重组双交换，敲除rhlC基因，获得PAO1(Δ rhlC)重组菌株。方法参照文献Schafer A,Tauch A.；Smallmobilizablemulti-purpose cloning vectors derived from theEscherichiacoli plasmids pK18 and pK19:selection of defineddeletions in the chromosomeof Corynebacterium glutumicum.Gene,145(1994)69-73。

所述引物序列：

rhlC-Up(BamHI)-F：CGGGATCCGT GATCGAGAAG TTTCA(SEQ ID NO.6)

rhlC-Up(PstI)-R：AACTGCAGGA TCGTTCTTCT CCCGTA(SEQ ID NO.7)

rhlC-Down(PstI)-F：AACTGCAGAA CCTGCCGACC CTGA(SEQ ID NO.8)

rhlC-Down(HindIII)-R：CCCAAGCTTC TTGCGCCAAC TGAT(SEQ ID NO.9)

实施例2、铜绿假单胞菌PAO1(ΔrhlB)、PAO1(ΔrhlBC)菌株的构建

(1)构建自杀性质粒pK18Gm-rhlB。以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，分别以rhlB-Up(salI)-F和rhlB-Up(EcoRI)-R、rhlB-down(EcoRI)-F 和rhlB-down(HindIII)-R扩增rhlB基因上游序列和下游序列用salI和 EcoRI、EcoRI和HindIII双酶切，pK18Gm用salI和HindIII双酶切。三个片段同时用T4DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，在含有庆大霉素(浓度为25mg/L)的LB平板上筛选阳性克隆。得到自杀性质粒 pk18Gm-rhlB。

(2)利用三亲结合的方法(受体菌株为PAO1、PAO1(Δ rhlC)，供体菌为大肠杆菌DH5α含自杀性质粒pK18Gm-rhlB，助质粒为pRK2013)将自杀性质粒转入到PAO1、PAO1(ΔrhlC)，通过同源重组双交换，敲除rhlB基因，获得PAO1(ΔrhlB)、PAO1(ΔrhlBC)重组菌株。

所述引物序列：

rhlB-Up(salI)-F:ACGCGTCGACCTGAAAGCCAGCAACCAT(SEQ ID NO.10)

rhlB-Up(EcoRI)-R:CGGAATTCCTACTCCGTGCGTTATGCA(SEQ ID NO.11)

rhlB-down(EcoRI)-F:CGGAATTCGGCGGCCTGTCGGCGTTT(SEQ ID NO.12)

rhlB-down(HindIII)-R:CCAAGCTTCGCCGACACAGAGGCCCC(SEQ ID NO.13)

实施例3、重组菌株PAO1(△rhlB)、PAO1(△rhlC)和PAO1(△rhlBC)与出发菌株PAO1的发酵产物检测与鉴定

实验中每个处理做三个重复，具体如下：

1)配置种子液培养基及发酵培养基：

LB培养基成分：5g/L酵母粉、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl；

发酵培养基基础液组成：3.4g/L KH₂PO₄，4.4g/L K₂HPO₄，7.5g/L NaNO₃， 1.1g/LNaCl，1.1g/L KCl，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.0028g/L FeSO₄·7H₂O， 0.5g/L yeastextract；

微量元素溶液组成：0.29g/L ZnSO₄·7H₂O，0.17g/L MnSO₄·7H₂O，0.24g/L CaCl₂，0.25g/L CuSO₄·5H₂O。

2)发酵培养：将PAO1(△rhlB)、PAO1(△rhlC)、PAO1(△rhlBC)和对照株PAO1的单菌落分别接种于5mL LB营养肉汤培养基中培养24h，次日以2％ (体积百分比)接种量转接至LB肉汤中培养16h，得到种子液。按2％(体积百分比)的接种量，取种子培养液300mL，接种到三角瓶中，三角瓶中含有15mL发酵培养基基础液。后向每个三角瓶中均加入75μL微量元素溶液和 60g/L的棕榈油，37℃、200rpm/min的摇床培养96h。

3)产物的提取：取上述发酵液2mL，10000g条件下离心10min。吸取 1mL上清液，利用质量分数10％的盐酸调节pH至2.0。加入等体积1mL乙酸乙酯充分萃取，10000g条件下离心10min并取出上层有机相。重复抽提一次，合并两次有机相。真空挥发有机相，待乙酸乙酯挥发完全,留样待用。

4)产物鉴定：选择薄层层析的方法对产物进行初步鉴定

硅胶板GF₂₅₄(青岛市基亿达硅胶试剂厂)，玻璃点样毛细管

展开剂，A:氯仿/甲醇/乙酸＝65/15/2(v/v/v)；B:氯仿/甲醇/乙酸＝99/1/2(v/v/v)

显色剂，5％的硫酸乙醇。

(1)取上述提取产物用1mL乙酸乙酯溶解。

(2)在硅胶板距离底边1.5cm处，画点样起始线。用毛细管取1μL第一步中的乙酸乙酯溶液点样，重复3次。

(3)层析缸中提前倒入100mL展开剂，盖好盖子放置一段时间，等待展开剂饱和。把点好的硅胶板快速放入层析缸中，展开剂液面不要没过点样线。

(4)当展开剂的前缘移至薄板上缘约0.5-1cm处，停止展层。将薄板迅速取出放平，用铅笔记下溶剂的前缘位置，并吹干。

(5)将配置好的显色剂装入喷瓶中，采用人工吹气的方式把显示剂均匀喷洒到板子上。等待板子吹干后，放入烘箱，加热显色。

从薄层层析结果(图1-a，使用展开剂A)可以看出，对照菌株PAO1可生产鼠李糖脂，但是不能积累HAA；当rhlC基因敲除后，双鼠李糖脂的样品点消失，只有单鼠李糖脂样品点，并无HAA的积累，我们得到一株只产单鼠李糖脂的菌株PAO1(ΔrhlC)。当rhlB敲除或rhlB和rhlC同时敲除后，结果显示(图1-d，使用展开剂B)菌株PAO1(ΔrhlB)和PAO1(ΔrhlBC)不再合成鼠李糖脂，而是有新的产物得到积累。理论推测为HAA，推测在后续实验中得到证实。由于菌株PAO1(ΔrhlB)和PAO1(ΔrhlBC)产物相同，所以选择鼠李糖基转移酶基因敲除更彻底的PAO1(ΔrhlBC)菌株进行后续实验。

实施例4、HAA的碱水解

1)初步探索，对HAA水解为3-羟基癸酸单体进行了初步的探索。

方法：按前述方法提取1mL发酵液中的HAA，并加0.125mol/LNaOH水溶液，空气浴80℃处理30min,终止反应，并冷却到室温，利用质量分数10％的盐酸调节pH至2.0。加入等体积1mL乙酸乙酯充分萃取，10000g条件下离心10min并取出上层有机相。重复抽提一次，合并两次有机相。真空挥发有机相，待乙酸乙酯挥发完全，留样待用。

同样采用薄层层析的方法对产物鉴定，展开剂选择B液。结果见图2的 b部分的样品6，水解处理后HAA样品点消失，出现新的样品点。对照2-b-7 (即图2的b部分的样品7，3-羟基癸酸标准品样点)，可以看出HAA成功水解为单体。

2)碱水解效率的进一步探索。

对工程菌株PAO1(ΔrhlBC)进行批量发酵，并用乙酸乙酯抽提法(如上所属)大量提取其产物HAA，备用。配置0.125mol/L、0.5mol/L的NaOH 溶液，备用。

(1)用天平在玻璃试管内称取一定量的HAA，加入2mL的0.125mol/L 的NaOH水溶液，HAA终浓度为10g/L。密封试管，60℃空气浴，分别在0.5h、 1h、1.5h、2h依次取出一支试管，冷却到室温。利用质量分数10％的盐酸调节pH至2.0。加入等体积2mL乙酸乙酯充分萃取，10000g条件下离心10min 并取出上层有机相。重复抽提一次，合并两次有机相。真空挥发有机相，待乙酸乙酯挥发完全留样待用。

(2)用天平在玻璃试管内称取一定量的HAA,加入2mL的0.5mol/L的NaOH 水溶液，HAA终浓度分别为10g/L、30g/L、60g/L。密封试管，80℃空气浴，分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h依次取出一支试管，冷却到室温。利用质量分数10％的盐酸调节pH至2.0。加入等体积2mL乙酸乙酯充分萃取， 10000g条件下离心10min并取出上层有机相。重复抽提一次，合并两次有机相。真空挥发有机相，待乙酸乙酯挥发完全留样待用。

同样采用薄层层析的方法对产物鉴定，展开剂选择B液。

结果显示，(1)步骤结果图(图1-c)60℃、0.125mol/LNaOH处理条件下，HAA完全水解为单体需要1.5h。(2)步骤结果(表1)与(1)步骤结果 (图1-c)相比可以看出，HAA的水解速率与NaOH溶液浓度、加热温度和反应时间直接相关。NaOH浓度越大，温度越高，HAA水解速率越快，处理时间越长，反应越彻底。因此碱水解是一个高效、快速、实用性强的水解方法。

表1 HAA碱水解

注：+：样品中的HAA已经完全水解为单体(3HD)；-：样品中的HAA未完全水解；

实施例5、产物的GC-MS鉴定

样品处理，工程菌株PAO1(ΔrhlBC)发酵培养，取1mL依照上述方法碱水解、抽提、真空干燥、备用。加入2mL甲酯化试剂(3％的硫酸甲醇溶液)， 80℃密封试管空气浴1h。用2mL正己烷抽提，蒸干正己烷。加入1mL色谱级正己烷，适当稀释，进GC-MS验证。标准品3-羟基癸酸进行甲酯化，同样进 GC-MS检测。

GC条件：岛津气相；柱子，inter Cap5毛细管柱程序，柱箱温度75℃持续0min，40℃/min升温到160℃保持 0min。10℃/min升温到250℃保持5min。进样器温度280℃，分流比5，检测器(FID)温度300℃。

结果显示(图2)，我们水解得到的产物即为3-羟基癸酸。到此可以说我们建立了一套完整的生产3-羟基癸酸的新方法。

实施例6、3-羟基癸酸的定量

进行批量的发酵实验确认工程菌种PAO1(ΔrhlBC)的终产量，实验选择葡萄糖、甘油、棕榈油三种不同的碳源，除碳源外其他组分均与实施例3中的发酵培养基组分保持一致，生产方法均相同，碳源用量终浓度为60g/L。发酵、水解操作如前所述，用乙酸乙酯抽提并干燥。产品定量采用称取干重并且用气相色谱(GC)检测纯度的方法进行。利用电子天平首先称量用于合并有机相的空试管重量(精确至0.1mg)，待有机相挥发后再次称量含有3- 羟基癸酸试管的重量(精确至0.1mg)，利用差减法计算出提取3-羟基癸酸的重量，随后该样品用于气相色谱(GC)测定产品纯度。当进行完全发酵时产物纯度达到90％以上(图4)。从结果(图3)以葡萄糖为碳源时，菌体长势一般但是产量偏低约2g/L；以甘油为碳源，长势一般，3HD的产量可以达到 5g/L；以棕榈油为碳源的时候表现最好，OD值和3HD的产量都达到最高，3HD 的产量可以达到13g/L，是以甘油为碳源时产量的两倍多。因此棕榈油是我们首选的优质碳源。

对菌株PAO1(ΔrhlB)进行以棕榈油为碳源的发酵实验，其3HD的产量与菌株PAO1(ΔrhlBC)相近。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种用于生产3-羟基癸酸的菌株及生产方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 888

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

atgcggcgcg aaagtctgtt ggtatcggtt tgcaagggcc tgcgggtaca tgtcgagcgc 60

gttgggcagg atcccgggcg cagcacggtg atgctggtca acggcgcgat ggcgaccacc 120

gcctcgttcg cccggacctg caagtgcctg gccgaacatt tcaacgtggt gctgttcgac 180

ctgcccttcg ccgggcagtc gcgtcagcac aacccgcagc gcgggttgat caccaaggac 240

gacgaggtgg aaatcctcct ggcgctgatc gagcgcttcg aggtcaatca cctggtctcc 300

gcgtcctggg gcggtatctc cacgctgctg gcgctgtcgc gcaatccgcg cggcatccgc 360

agctcggtgg tgatggcatt cgcccctgga ctgaaccagg cgatgctcga ctacgtcggg 420

cgggcgcagg cgctgatcga gctggacgac aagtcggcga tcggccatct gctcaacgag 480

accgtcggca aatacctgcc gcagcgcctg aaagccagca accatcagca catggcttcg 540

ctggccaccg gcgaatacga gcaggcgcgc tttcacatcg accaggtgct ggcgctcaac 600

gatcggggct acttggcttg cctggagcgg atccagagcc acgtgcattt catcaacggc 660

agctgggacg aatacaccac cgccgaggac gcccgccagt tccgcgacta cctgccgcac 720

tgcagtttct cgcgggtgga gggcaccggg catttcctcg acctggagtc caagctggca 780

gcggtacgcg tgcaccgcgc cctgctcgag cacctgctga agcaaccgga gccgcagcgg 840

gcggaacgcg cggcgggatt ccacgagatg gccatcggct acgcctga 888

<210> 2

<211> 1281

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 2

atgcacgcca tcctcatcgc catcggctcg gccggcgacg tatttccctt catcggcctg 60

gcccggaccc tgaaactgcg cgggcaccgc gtgagcctct gcaccatccc ggtgtttcgc 120

gacgcggtgg agcagcacgg catcgcgttc gtcccgctga gcgacgaact gacctaccgc 180

cggaccatgg gcgatccgcg cctgtgggac cccaagacgt ccttcggcgt gctctggcaa 240

gccatcgccg ggatgatcga gccggtctac gagtacgtct cggcgcagcg ccatgacgac 300

atcgtggtgg tcggctcgct atgggcgctg ggcgcacgca tcgctcacga gaagtacggg 360

attccctacc tgtccgcgca ggtctcgcca tcgaccctgt tgtcggcgca cctgccgccg 420

gtacacccca agttcaacgt gcccgagcag atgccgctgg cgatgcgcaa gctgctctgg 480

cgctgcatcg agcgcttcaa gctggatcgc acctgcgcgc cggagatcaa cgcggtgcgc 540

cgcaaggtcg gcctggaaac gccggtgaag cgcatcttca cccaatggat gcattcgccg 600

cagggcgtgg tctgcctgtt cccggcctgg ttcgcgccgc cccagcagga ttggccgcaa 660

cccctgcaca tgaccggctt cccgctgttc gacggcagta tcccggggac cccgctcgac 720

gacgaactgc aacgctttct cgatcagggc agccggccgc tggtgttcac ccagggctcg 780

accgaacacc tgcagggcga cttctacgcc atggccctgc gcgcgctgga acgcctcggc 840

gcgcgtggga tcttcctcac cggcgccggc caggaaccgc tgcgcggctt gccgaaccac 900

gtgctgcagc gcgcctacgc gccactggga gccttgctgc catcgtgcgc cgggctggtc 960

catccgggcg gtatcggcgc catgagccta gccttggcgg cgggggtgcc gcaggtgctg 1020

ctgccctgtg cccacgacca gttcgacaat gccgaacggc tggtccggct cggctgcggg 1080

atgcgcctgg gcgtgccgtt gcgcgagcag gagttgcgcg gggcgctgtg gcgcttgctc 1140

gaggacccgg ccatggcggc ggcctgtcgg cgtttcatgg aattgtcaca accgcacagt 1200

atcgcttgcg gtaaagcggc ccaggtggtc gaacgttgtc atagggaggg ggatgctcga 1260

tggctgaagg ctgcgtcctg a 1281

<210> 3

<211> 978

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 3

atggaccgga tagacatggg cgtgctggtg gtactgttca atcctggcga cgacgacctg 60

gaacaccttg gcgaactggc ggcggcgttt ccgcaactgc gcttccttgc cgtcgacaac 120

tcaccgcaca gcgatccgca gcgcaatgcc cggctgcgcg ggcaaggcat cgccgtgctg 180

caccacggca accggcaggg catcgccggc gccttcaacc agggactcga cgcgctattc 240

cggcgtggcg tgcagggtgt gctgctgctc gaccaggact cccgtcccgg cggcgccttc 300

ctcgccgccc agtggcgcaa cctgcaggcg cgcaacggtc aggcctgcct gctcggccca 360

cggatcttcg accggggtga ccggcgcttc ctgccggcca tccatctcga cggactgacg 420

ctcaggcaat tgtctctgga cggcctgacg accccgcagc gcacctcgtt cctgatctcc 480

tccggctgcc tgctgacccg cgaggcctac cagcgcctcg gccacttcga cgaggaactg 540

ttcatcgacc acgtggacac cgaatacagc ctgcgcgccc aggcgctgga cgtgcccctg 600

tacgtcgacc cgcggctggt cctcgagcac cgcatcggca cgcgcaagac ccgccgcctc 660

ggcggtctca gcctcagcgc gatgaaccac gccccgctgc gccgctacta cctggcgcgc 720

aacggcctgc tggtcctgcg ccgctacgcc cggtcctcgc cgctggccct gctggcgaac 780

ctgccgaccc tgacccaggg cctcgcggtg ctcctgctcg aacgcgacaa gctgctcaag 840

ctgcgctgcc tgggctgggg cctgtgggac ggcctgcggg gacgcggcgg cgcgctggag 900

accaaccgcc cgcgcctgct gaagcgcctc gccggcccgg ccgtggcgtc cgtagcttcc 960

ggcaaggcca aggcctag 978

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgaaggat cctatacttt ctagag 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttactccat ggaattctag atcg 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccgt gatcgagaag tttca 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aactgcagga tcgttcttct cccgta 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aactgcagaa cctgccgacc ctga 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccaagcttc ttgcgccaac tgat 24

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac ctgaaagcca gcaaccat 28

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaattcct actccgtgcg ttatgca 27

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggaattcgg cggcctgtcg gcgttt 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaagcttcg ccgacacaga ggcccc 26

Claims

1.一种用于生产3-羟基癸酸的菌株，其特征在于，该菌株为铜绿假单胞菌，该菌株的鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)被灭活，且该菌株的rhlA基因被利用，催化3-羟基酯酰-CoA/ACP合成羟基脂肪酸二聚体(HAA)。

2.根据权利要求1所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，其特征在于，该菌株的鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)和鼠李糖基转移酶II基因(rhlC)同时被灭活。

3.根据权利要求2所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，其特征在于，鼠李糖基转移酶I基因(rhlB)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求2所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，其特征在于，鼠李糖基转移酶II基因(rhlC)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，其特征在于，rhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.一种生产3-羟基脂肪酸二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵权利要求1-5任一项所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，得到3-羟基脂肪酸二聚体。

7.根据权利要求6所述一种生产3-羟基脂肪酸二聚体的方法，其特征在于，发酵时采用的培养基的碳源包括甘油和/或棕榈油。

8.一种生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)发酵权利要求1-5任一项所述用于生产3-羟基癸酸的菌株，得到3-羟基脂肪酸二聚体；2)将3-羟基脂肪酸二聚体水解为单体，得到3-羟基癸酸。

9.根据权利要求8所述生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于，步骤2)中采用碱水解的方法将3-羟基脂肪酸二聚体HAA水解为单体。

10.根据权利要求8或9所述生产3-羟基癸酸的方法其特征在于，步骤1)中，发酵时，采用的培养基的碳源包括甘油和/或棕榈油。