CN110317765A

CN110317765A - 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用

Info

Publication number: CN110317765A
Application number: CN201810272730.5A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 殷华; 庄以彬; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: CN110317765B

Abstract

本发明提供了一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株，属于基因工程技术领域，所述大肠杆菌表达菌株共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*、香叶醇合成酶基因、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因。所述大肠杆菌表达菌株生产香叶醇葡萄糖苷产量高、质量可靠、应用前景好。

Description

一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用。

背景技术

香叶醇是无环单萜类化合物，具有温和典雅的玫瑰香气，天然存在于玫瑰精油、香叶油、香茅油、玫瑰草油等200多种精油中。香叶醇广泛用于花香型日用香精，食用香精，酯类香料等，亦是制造香草醇，香草醛、柠檬醛、羟基香草醛、紫罗兰酮和维生素A的原料。香叶醇入药具有平喘、改善肺通气功能和降低气道阻力的功用，临床用于治疗慢性支气管炎。香叶醇具有提高机体免疫功能，且有起效快，副作用小的优点，已经作为癌症治疗的化学预防剂在使用。香叶醇用于抗菌和驱虫，是市场中驱蚊、驱虫产品中的重要成分。

香叶醇葡糖苷本身无香气，性质稳定，在葡萄糖苷酶作用或高温条件下可缓慢释放香气物质。如在化妆品，食品等中添加香叶醇葡糖苷，可被皮肤、食品等中的微生物分泌的糖苷酶分解缓慢释放出香叶醇，在茶叶、卷烟、烘焙食品或熏香剂等中添加香叶醇葡糖苷，可在高温条件下释放出香叶醇，达到释香、增香，香气持久的效果。香叶醇在香精香料产业领域、药物产业领域具有广泛的应用，市场需求量大。香叶醇葡糖苷作为香叶醇的缓释物，具有广阔的市场前景。

香叶醇葡萄糖苷具有以下特征：geranyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C₁₆H₂₈O₆，分子量为316.39，结构式如式I所示

现有技术中对于香叶醇葡萄糖苷的生产多采用以香叶醇为底物进行化学合成的方法，化学合成多存在环境污染、合成步骤复杂、得率低等问题。随着合成生物学技术的进步，以环境友好的微生物发酵生产香叶醇糖苷成为发展趋势。然而目前尚无以葡萄糖等简单碳源从头合成香叶醇葡萄糖苷工程菌株的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*、香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4.

优选的，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述香叶醇合成酶基因GES的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述糖基转移酶基因AdGT4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了所述高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株的制备方法，包括以下步骤：构建共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的第一表达载体；构建共表达香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4的第二表达载体；将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化大肠杆菌获得高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株。

优选的，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*是通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ispA的核酸序列获得；所述定点突变的引物为ispA*-P1，ispA*-P2；所述ispA*-P1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ispA*-P2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*是通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ERG20的核酸序列获得；所述定点突变的引物为ERG20*-P1，ERG20*-P2；所述ERG20*-P1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述ERG20*-P2的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

优选的，所述第一表达载体通过将大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中的ispA基因替换为香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*制备获得。

优选的，所述第二表达载体通过在大肠杆菌表达载体pET-duet1上连接香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4制备获得。

优选的，所述大肠杆菌为BL21(DE3)或MG1655。

本发明还提供了所述的大肠杆菌表达菌株在生产香叶醇葡萄糖苷中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株，共表达了酿酒酵母来源的合成前体IPP和DMAPP途径酶，包括HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1；大肠杆菌来源的atoB和idi；GPP前体合成酶ispA*和ERG20*；植物来源的香叶醇合酶(GES)和糖基转移酶基因AdGT4。本发明提供的大肠杆菌表达菌株中增强了前体香叶基焦磷酸(GPP)合成模块，并将所述GPP合成模块与香叶醇葡萄糖苷合成模块结合在一起，增强了大肠杆菌中从葡萄糖或其他简单碳源到香叶醇的合成，在大肠杆菌中构建出了从头合成香叶醇葡萄糖苷的基因表达途径。所述大肠杆菌表达菌株能够高效合成香叶醇葡糖苷，摇瓶产量可达200mg/L，利用本发明提供的大肠杆菌表达菌株生产香叶醇葡萄糖苷具有质量可靠、产品经济、绿色生产等优点，应用前景非常好，为香叶醇葡萄糖苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为本发明所述大肠杆菌表达菌株中合成香叶醇葡萄糖苷的途径示意图；

图2为实施例1中质粒pBbA5c-GPP与pED-GesA基因结构示意图；

图3为实施例3中菌株B-GesA的发酵产物HPLC图谱；

图4为实施例3菌株B-GesA发酵产生的香叶醇糖苷的MS图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*、香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4。

本发明在所述大肠杆菌表达菌株中过表达了酵母来源的MVA途径的部分基因包括HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1；大肠杆菌本身的MEP途径部分基因atoB和idi；GPP合成酶ispA*和ERG20*；植物来源的香叶醇合酶(GES)和糖基转移酶基因AdGT4。本发明在所述大肠杆菌表达菌株中共表达的上述基因，构建出了香叶醇葡萄糖苷的从头合成途径；本发明中所述大肠杆菌表达菌株中香叶醇葡萄糖苷具体的合成途径如附图1所示：MEP途径是大肠杆菌自身途径，在大肠杆菌中过表达酵母的MVA途径基因增强了IPP和DMAPP的合成，过表达大肠杆菌ispA*基因和来源于酵母的ERG20*增强了大肠杆菌中香叶醇糖苷合成前体GPP的合成，然后过表达GES和AdGT4实现了香叶醇葡萄糖苷的合成。

在本发明中，所述MVA途径的相关基因包括HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1；所述HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1基因优选的来自酿酒酵母，所述HMGS基因的GenBank登录号GeneID优选的为854913；所述tHMGR基因的GenBank登录号GeneID优选的为854900；所述ERG12基因的GenBank登录号GeneID优选的为855248；所述ERG8基因的GenBank登录号GeneID优选的为855260；所述MVD1基因的GenBank登录号GeneID优选的为855779。在本发明中所述大肠杆菌本身的MEP途径部分基因包括atoB和idi；所述atoB基因的GenBank登录号GeneID优选的为946727；所述idi基因的GenBank登录号GeneID优选的为949020。

在本发明中，所述GPP前体合成酶基因ispA*来源于大肠杆菌的法尼基焦磷酸(FPP)合成酶基因ispA，所述法尼基焦磷酸(FPP)合成酶基因ispA基因的GenBank登录号GeneID优选的为945064，在本发明中所述ispA*为ispA的核酸序列突变体，突变后蛋白氨基酸序列第80位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)；所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.1所示。所述ispA基因催化IPP和DMAPP合成FPP，而突变后的ispA*、则催化IPP和DMAPP合成香叶基焦磷酸GPP。

在本发明中，所述GPP前体合成酶基因ERG20*来源于酿酒酵母的法尼基焦磷酸(FPP)合成酶基因ERG20；本发明中所述ERG20基因的GenBank登录号GeneID优选的为GI:1008358。在本发明中所述ERG20*为ERG20核酸序列突变体，突变后的蛋白氨基酸序列第197位的赖氨酸(K)突变为甘氨酸(G)；所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明中所述ERG20基因为法尼基焦磷酸(FPP)合成酶，催化IPP和DMAPP合成FPP，而突变后的ERG20*则催化IPP和DMAPP合成香叶基焦磷酸GPP。

在本发明中，所述大肠杆菌表达菌株还共表达GES基因，本发明中所述GES基因优选的来源于植物罗勒(Ocimum basilicum)的香叶醇合成酶GES基因，所述来源于植物罗勒GES基因的GenBank登录号优选的为AAR11765.1。在本发明中所述大肠杆菌表达菌株中共表达的GES基因更优选的为进行了大肠杆菌密码子优化的基因；所述密码子优化后的GES基因去掉了N端的65个氨基酸序列相应的核苷酸序列；所述密码子优化后的GES基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述大肠杆菌表达菌株还共表达AdGT4基因；本发明中所述AdGT4基因来源于植物奇异果(Actinidia deliciosa)糖基转移酶AdGT4；所述来源于奇异果的AdGT4基因的GenBank登录号优选的为AIL51400.1，在本发明中，所述大肠杆菌表达菌株中共表达的AdGT4基因更优选的为进行了大肠杆菌密码子优化的基因；所述进行了大肠杆菌密码子优化的AdGT4基因序列优选的如SEQ ID No.4所示。本发明中上述基因进行大肠杆菌密码子优化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达系统中更有效地表达。

本发明还提供了所述高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株的制备方法，包括以下步骤：制备共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的第一表达载体；制备共表达香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4的第二表达载体；将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化大肠杆菌获得高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株。

本发明对所述第一表达载体无特殊限定，采用本领域常规的大肠杆菌表达载体，能够实现上述基因的共表达即可。在本发明具体实施过程中，所述第一表达载体优选的通过将大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中的ispA基因替换为香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*制备获得。在本发明中所述大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS优选的购自Addgene，货号35151，由Taek_Soon Lee和Jay Keasling提供；所述大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS携带来自于酿酒酵母的根据大肠杆菌进行密码子优化的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1及大肠杆菌来源的atoB，idi和ispA八个基因。

在本发明中，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*优选的通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ispA的核酸序列获得。在本发明中优选的以ispA基因为模板，以ispA*-P1和ispA*-P2为引物进行PCR扩增，获得香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*。在本发明中，所述ispA基因模板优选的为上述大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中的ispA基因；更优选的为重组的pUC19-ispA质粒。在本发明具体实施过程中，所述重组的pUC19-ispA质粒优选的通过以下方法制备方法：酶切所述大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS，获得ispA；将获得的ispA基因与质粒pUC19连接获得重组的pUC19-ispA质粒。在本发明中所述ispA*-P1的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.5所示；所述ispA*-P2的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.6所示。在本发明中所述PCR扩增体系和扩增程序采用本领域常规的PCR扩增体系和扩增程序，能够实现ispA*的扩增即可。在本发明具体实施过程中，所述PCR扩增体系优选的包括以下组分：10×KOD plus缓冲液5μL，2.5mM dNTP 5μL，25mM MgSO₄4μL，50μM正向引物0.5μL，50μM反向引物0.5μL，模板0.5～1μL，KOD plus DNA聚合酶1μL，补水至50μL。所述PCR扩增程序优选的为：94～98℃预变性4～5分钟；94～98℃变性20～30秒，55～60℃退火30～60秒，68℃延伸30～120秒，28～32个循环；68℃延伸8～10分钟。优选为：98℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火30秒，68℃延伸1～2分钟，30个循环；68℃延伸10分钟。

本发明在获得所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*后，用所述ispA*替换大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中的ispA获得第一表达载体。在本发明中所述替换的方法优选的为采用相同的限制性内切酶分别酶切重组的pUC19-ispA质粒和大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS；然后用连接酶将所述ispA*和切去ispA片段的大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS连接获得第一表达载体。在本发明中所述限制性内切酶优选的为Xhol和HindIII；所述连接酶优选的为T4DNA连接酶。在本发明中所述酶切和连接步骤和参数采用本领域常规的酶切连接步骤和参数即可。在本发明具体实施过程中，优选的采用测序方法来验证所述ispA*基因的正确性。

在本发明中，所述第二表达载体通过在大肠杆菌表达载体pET-duet1上连接香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4制备获得。

在本发明中所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*是通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ERG20的核酸序列获得。在本发明具体实施过程中，首先PCR扩增获得ERG20，然后将获得的ERG20与pEasy-blunt连接获得重组质粒pEB-ERG20；以所述重组质粒pEB-ERG20为模板，用突变引物进行PCR扩增获得ERG20*。在本发明中优选的为以酿酒酵母基因组DNA为模板，ERG20-P1、ERG20-P2为引物，进行PCR扩增获得ERG20。在本发明中，所述ERG20-P1、ERG20-P2引物的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。本发明在获得ERG20后，将所述ERG20与pEasy-blunt质粒片段连接获得重组质粒pEB-ERG20。在本发明中所述pEasy-blunt质粒片段来源于Easy-blunt试剂盒。本发明在获得重组质粒pEB-ERG20后，以所述重组质粒pEB-ERG20为模板，用突变引物扩增获得ERG20*。在本发明中所述突变引物为ERG20*-P1和ERG20*-P2；所述ERG20*-P1和ERG20*-P2的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。在本发明中，所述PCR扩增体系和扩增程序采用本领域常规的PCR扩增体系和扩增程序，能够实现相应基因的扩增即可。在本发明具体实施过程中，所述PCR扩增的体系和扩增程序参照上述ispA*扩增中的扩增体系和扩增程序即可，在此不再赘述。在本发明具体实施过程中，优选的采用测序方法来验证所述ERG20*基因的正确性。

本发明在制备获得第一表达载体和第二表达载体后，将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化大肠杆菌获得高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株。本发明对所述大肠杆菌的种类没有限定采用本领域常规的大肠杆菌即可，优选的为BL21(DE3)或MG1655。在本发明中，所述共同转化的方法采用本领域常规的转化方法即可，在本发明具体实施过程中，将等量的所述第一表达载体和第二表达载体与大肠杆菌感受态细胞混合，29～31℃静置28～32min后，41～43℃水浴热激85～95s获得高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株。

本发明还提供了所述的大肠杆菌表达菌株在生产香叶醇葡萄糖苷中的应用，在本发明中，所述应用优选的为将所述大肠杆菌表达菌株活化培养，基因诱导表达后转接M9液体培养基中发酵培养生产香叶醇葡萄糖苷。

在本发明中所述活化诱导方法优选的包括以下步骤：A)将所述大肠杆菌表达菌株接种于含氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中进行活化培养获得活化的大肠杆菌表达菌株；B)将所述活化的大肠杆菌表达菌株接种于含氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中进行诱导培养，当培养液中的菌体浓度OD₆₀₀为0.6～1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG进行诱导培养。

在本发明中所述活化培养的接种量优选的为1～3体积％；所述活化培养的温度优选的为35～38℃，活化培养的时间优选的为10～16h，活化培养的转速优选的为180～220rpm。所述诱导培养的接种量优选的为1～3体积％，所述诱导培养的温度优选的为16～30℃，诱导培养的转速优选的为180～220rpm，在本发明中，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG后诱导培养的时间优选的为16～24h。在本发明中所述含氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中氯霉素的浓度优选的为20～50mg/L；所述氨苄青霉素的浓度为100～150mg/L。在本发明中所述IPTG在培养液中的终浓度优选的为0.1～0.5mM。

本发明在所述诱导培养后，将所述诱导培养后的大肠杆菌表达菌株等体积转接于M9液体培养基中发酵培养生产香叶醇葡萄糖苷。在本发明中，所述发酵培养的温度优选的为25～35℃，更优选的为28～30℃；所述发酵培养的转速优选的为180～220rpm，更优选的为200rpm。所述发酵培养的时间优选的为36～72h；更优选的为48～60h。

本发明在所述发酵培养结束后优选的从发酵液中分离纯化香叶醇葡萄糖苷。在本发明中，优选的将所述发酵液离心去除菌体，获得上清液，然后将所述上清液进行层析纯化获得香叶醇葡萄糖苷。

在本发明中发酵培养所述大肠杆菌生产香叶醇葡萄糖苷，能够实现工程菌生产香叶醇葡萄糖苷，摇瓶产量可达200mg/L，具有非常好的应用前景，为香叶醇葡萄糖苷的大规模工业生产奠定了基础。

下面结合实施例对本发明提供的一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

对实施例中用到的菌株、载体、酶、试验方法等进行说明。

菌株：大肠菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均为市售商品，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。

载体：大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(简称pBbA5c-MM)购自Addgene，货号35151，由Taek_SoonLee和JayKeasling提供。所述质粒携带来自于酿酒酵母的根据大肠杆菌进行密码子优化的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1及大肠杆菌来源的atoB，idi和ispA八个基因。

大肠杆菌表达载体pUC19、pEasy-blunt质粒和pETDuet-1均可市售获得。

酶：KOD高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购均购自Thermo公司。

实验方法：DNA片段连接条件，限制性内切酶酶切条件均为常规条件。DNA片段回收及质粒提取，使用天根公司DNA回收及质粒提取试剂盒。本发明中质粒的酶切、连接体系和条件为常规的体系和条件。质粒提取和DNA片段回收使用天根公司的质粒提取和DNA片段回收试剂盒。

本发明实施例中，所述测序委托金唯智公司进行。

本发明中质粒或链接产物转化大肠杆菌的转化方法均为常规的化学转化方法。

两端加NdeI，EcoRI限制性酶切位点的GES和两端加NcoI，BamHI限制性内切酶位点的AdGT4由杰瑞公司进行大肠杆菌中密码子优化并合成。

所用引物均由金唯智公司合成，引物序列见表1。

表1所用引物

实施例1高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株的构建

(1)大肠杆菌表达载体P1(pBbA5c-GPP)的构建

ispA*定点突变：以限制性内切酶Xhol、HindIII酶切pBbA5c-MM，凝胶回收2.1kbispA片段和11kb的切去ispA的质粒片段；ispA片段与同样酶切的pUC19用T4DNA连接酶连接，连接产物通过化学法转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取转化子至3ml LB加氯霉素抗性的液体培养基，37度培养8-12个小时，7000rpm离心1min，收取菌体，提取质粒。质粒用限制性内切酶Xhol、HindIII酶切验证正确，得4.8kb的质粒pUC19-ispA。然后以突变引物ispA*-P1，ispA*-P2，以质粒pUC19-ispA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经去甲基化酶DpnI，37度酶切消化过夜，去除质粒pUC19-ispA模板。消化后的产物转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆培养，提取质粒，送金唯智公司测序。经序列比对分析，质粒中ispA基因的的第80位丝氨酸的密码子TCA突变为苯丙氨酸密码子TTT，即命名为pUC19-ispA*，得到ispA*突变基因。

pBbA5c-GPP：以限制性内切酶Xhol、HindIII酶切pUC19-ispA*，回收2.1kb的片段，与上步骤中凝胶回收的11kb pBbA5c-MM的质粒片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α，挑取克隆、培养，提取质粒，酶切验证，基因测序验证，获得pBbA5c-GPP，基因结构示意图如图2所示。

(2)大肠杆菌表达载体P2(pED-GesA)的构建

ERG20*定点突变：首先以酿酒酵母基因组DNA为模板，以ERG20-P1、ERG20-P1为引物PCR扩增ERG20基因，用T4DNA连接酶与Easy-blunt试剂盒中pEasy-blunt质粒片段，进行平端片段连接，转化DH5α，挑取克隆、培养，提取质粒，送金唯智测序，序列分析，获得正确的pEB-ERG20。以ERG20*-P1，ERG20*-P2突变引物、质粒pEB-ERG20为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经DpnI酶切消化过夜去除pEB-ERG20模板。消化后的产物转化DH5α，挑取克隆、培养，提取质粒，送金唯智公司测序，经序列比对分析，含在ERG20基因片段的第197位赖氨酸的密码子AAG突变为甘氨酸密码子GGC的质粒，即为pEASY-ERG20*。

pED-Ges构建：以ERG20*-EcoR与ERG20*-Xhol为引物，以pEASY-ERG20*为模板PCR扩增ERG20*，回收扩增的ERG20*片段，用限制性内切酶EcoRI，Xhol酶切，回收ERG20*酶切片段；以限制性内切酶NdeI Xhol酶切质粒pET-duet1,回收pET-duet1质粒片段；用限制性内切酶NdeI，EcoRI酶切含GES基因的质粒，回收酶切GES基因片段；酶切回收ERG20*基因片段、pET-duet1质粒片段和GES基因片段，以T4DNA连接酶进行三片段连接，转化DH5α，挑取克隆、培养，提取质粒，酶切验证，送金唯智公司测序，序列分析，获得正确的质粒pED-Ges。

pED-GesA构建：以限制性内切酶NcoI，BamHI酶切pED-Ges，回收pED-Ges质粒酶切片段；以限制性内切酶NcoI，BamHI酶切含AdGT4基因的质粒，回收酶切的AdGT4基因片段，以T4DNA连接酶进行两片段连接，转化DH5α，挑取克隆、培养，提取质粒，酶切验证，送金唯智公司测序，序列分析，获得正确的质粒pED-GesA，基因结构示意图如附图2所示。

(3)大肠杆菌表达载体P1和大肠杆菌表达载体P2的共转化

将实施例1中构建的表达载体pBbA5c-GPP和实施例2中构建的表达载体pED-GesA共同转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，转化方法为：取100μL感受态细胞BL21(DE3)于冰上，10分钟后加入2μL表达载体pBbA5c-GPP和2μL表达载体pED-GesA，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入800μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含氯霉素和氨苄青霉素的LB平板上。利用氯霉素和氨苄青霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的BL21(DE3)香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株B-GesA，并通过提取质粒进行酶切验证。

对比例1

按照与实施例1中共转化方法，将表达载体pBbA5c-GPP和中间载体pED-Ges共同转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，构建得到对照菌株B-Ges。

实施例2香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株B-GesA与对照株B-Ges液体发酵

将大肠杆菌表达菌株B-GesA进行发酵培养时，所述发酵培养的方法为将大肠杆菌表达菌株B-GesA在加入有20mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃下培养16小时，然后将培养液按2体积％的转接量转接至加入有相同抗生素的LB液体培养基，当OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃下诱导培养24小时，离心，用等体积的M9液体培养基重悬，置30℃下培养48小时。

实施例3香叶醇葡萄糖苷HPLC检测及LC-MS鉴定

(1)取实施例2的发酵液，12000rpm离心10min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤后，进行HPLC测定。通过安捷伦液相色谱仪对发酵产物进行HPLC分析，其中，进行HPLC测定的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长201nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；梯度洗脱条件：0–5min 5体积％B，6–45min 5体积％B到100体积％B(6–45min内B的浓度均匀增加)；进样量30μL。结果见图3，其中上方的曲线为菌株B-GesA的发酵液HPLC，箭头所指峰为香叶醇糖苷峰；下方的曲线为对照株B-Ges发酵液的HPLC。

菌株B-GesA与对照株B-Ges的发酵产物HPLC图谱分析结果表明，B-GesA在出峰时间40.9min时相对于对照株B-Ges出现了一个新峰。

(2)对B-GesA发酵液新峰进行LC-MS分析。其中，LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长201nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸),B＝甲醇；流速＝1ml/min；梯度洗脱条件：0–5min 5体积％B，6–45min 5体积％B到100体积％B(6–45min内B的浓度均匀增加)；进样量50μL；ESI正离子源，分子量扫描范围50–1000。

结果见图4。LC-MS结果显示对应于HPLC保留时间为40.9min峰的Mr+Na＝316+23＝339.17，为叶醇葡萄糖苷加钠的特征分子量，初步确定新峰为目的产物，香叶醇葡糖苷。

实施例4香叶醇葡萄糖苷分离纯化

香叶醇葡萄糖苷分离纯化：按照实施例2的方法进行发酵液的制备，发酵总量为1L。发酵结束后，将发酵液4000r/min离心15min，取上清。将预处理好的大孔树脂SP-825(树脂用量为发酵液体积的50％)装入层析柱，加入发酵液离心后的上清，流速可控制在2mL/min，使树脂充分吸附发酵产物，待发酵液流尽后，用两倍柱体积的水洗脱残留在树脂柱中的杂质，之后用80％乙醇洗脱两个柱体积，收集洗脱液，旋转蒸发仪减压浓缩得粗提物，用1-2mL甲醇溶解后经HPLC分离得香叶醇葡萄糖苷。HPLC分离条件为：岛津高效液相色谱半制备仪，测定条件包括：检测器SPD-20A，检测波长254nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)B＝甲醇；流速＝4mL/min；洗脱条件同分析条件一致；进样量100μL。

实施例5香叶醇葡萄糖苷核磁鉴定

样品经干燥后溶于500μL为氘代甲醇转入直径2.5mm核磁管中，用BrukerAvanceIII 400MHz核磁共振仪测定¹H NMR，鉴定为香叶醇葡萄糖苷。核磁数据如下：¹H-NMR(CD₃OD,400MHz)δ5.28(t,J＝6.1Hz,1H),5.08(t,J＝6.1Hz,1H),4.96(d,J＝4.8Hz,1H),4.88(dd,J＝12.5,4.2Hz,2H),4.47(t,J＝5.9Hz,1H),4.23(dd,J＝11.7,6.1Hz,1H),4.11(d,J＝7.8Hz,H),4.10(dd,J＝12.4,7.5Hz,1H),3.66(dd,J＝11.2,5.9Hz,1H),3.43(m,1H),3.11(m,1H),2.93(m,1H),2.06(m,2H),2.00(m,2H),1.65(d,J＝0.9Hz,3H),1.61(s,3H),1.57(s,3H)；¹³C-NMR(CD₃OD,400MHz)δ138.9,130.8,123.8,120.7,101.3,76.8,76.7,73.3,70.0,64.2,61.0,25.7,25.4,17.5,16.0.

实施例6香叶醇糖苷产量标定

取一系列浓度的纯化香叶醇葡萄糖苷进行HPLC实验，依据浓度与峰面积之间的关系模拟了曲线方程。依据曲线方程，对实施例2中的菌株B-GesA摇瓶48小时发酵液中香叶醇葡萄糖苷进行产量标定，结果表明摇瓶培养发酵液中香叶醇葡萄糖苷浓度为200mg/L。

由上述实施例可知，本发明提供的大肠杆菌表达菌株中增强了前体香叶基焦磷酸(GPP)合成模块，并将所述GPP合成模块与香叶醇葡萄糖苷合成模块结合在一起，增强了大肠杆菌中从葡萄糖或其他简单碳源到香叶醇的合成，在大肠杆菌中构建出了从头合成香叶醇葡萄糖苷的基因表达途径。所述大肠杆菌表达菌株能够高效合成香叶醇葡糖苷，摇瓶产量可达200mg/L，为香叶醇葡萄糖苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggactttc cgcagcaact cgaagcctgc gttaagcagg ccaaccaggc gctgagccgt 60

tttatcgccc cactgccctt tcagaacact cccgtggtcg aaaccatgca gtatggcgca 120

ttattaggtg gtaagcgcct gcgacctttc ctggtttatg ccaccggtca tatgttcggc 180

gttagcacaa acacgctgga cgcacccgct gccgccgttg agtgtatcca cgcttacttt 240

ttaattcatg atgatttacc ggcaatggat gatgacgatc tgcgtcgcgg tttgccaacc 300

tgccatgtga agtttggcga agcaaacgcg attctcgctg gcgacgcttt acaaacgctg 360

gcgttctcga ttttaagcga tgccgatatg ccggaagtgt cggaccgcga cagaatttcg 420

atgatttctg aactggcgag cgccagtggt attgccggaa tgtgcggtgg tcaggcatta 480

gatttagacg cggaaggcaa acacgtacct ctggacgcgc ttgagcgtat tcatcgtcat 540

aaaaccggcg cattgattcg cgccgccgtt cgccttggtg cattaagcgc cggagataaa 600

ggacgtcgtg ctctgccggt actcgacaag tatgcagaga gcatcggcct tgccttccag 660

gttcaggatg acatcctgga tgtggtggga gatactgcaa cgttgggaaa acgccagggt 720

gccgaccagc aacttggtaa aagtacctac cctgcacttc tgggccttga gcaagcccgg 780

aagaaagccc gggatctgat cgacgatgcc cgtcagtcgc tgaaacaact ggctgaacag 840

tcactcgata cctcggcact ggaagcgcta gcggactaca tcatccagcg taataaataa 900

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcgg cactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataa 1059

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaagaat caagtagcaa acgtcgcgaa tatctgttag aagaaacgac ccgcaaattg 60

cagcgcaatg ataccgaaag cgttgaaaaa ttaaaactga tcgataatat ccagcagtta 120

ggcatcggct attattttga agatgcaatc aatgccgtgc tgcgtagtcc gttttcaacg 180

ggtgaagagg acctgtttac cgcagcctta cgctttcgcc tgttacgtca taatggcatt 240

gaaatctctc cggaaatctt tctgaaattc aaagatgaac gcggtaaatt tgatgaatca 300

gatacactgg gcttactgag tctgtatgaa gcctctaatc tgggcgttgc gggcgaagaa 360

atcctggaag aagcgatgga atttgcggaa gcccgcttac gtcgctcact gagcgaaccg 420

gcagctccat tacatggtga agttgcacag gccttagatg ttcctcgtca tctgcgcatg 480

gctcgcttag aagcacgtcg ctttattgaa cagtatggta aacagtcaga tcatgatggc 540

gatttgctgg aactggccat cttagattat aatcaggttc aggcccagca tcagagcgaa 600

ctgaccgaaa tcattcgttg gtggaaagaa ctgggcttag tggataaact gagctttggt 660

cgtgatcgtc cgttagaatg ctttctgtgg acggtgggtc tgctgccgga acctaaatat 720

tctagcgttc gtatcgaatt agccaaagct atctctatcc tgctggttat cgatgatatt 780

tttgatacct atggcgagat ggatgacttg atcctgttta ccgatgccat tcgccgttgg 840

gatctggaag cgatggaagg tctgccggaa tatatgaaaa tttgctatat ggccctgtat 900

aatacaacca atgaggtgtg ctacaaggtg ctgcgcgata cgggtcgcat tgtgttatta 960

aatctaaaaa gcacatggat cgatatgatc gaaggcttta tggaagaagc caaatggttt 1020

aatggcggta gtgcccctaa actggaagaa tatatcgaaa atggtgtgtc tacggcaggc 1080

gcgtatatgg cctttgctca tatcttcttt ctgattggtg aaggtgtgac acatcaaaac 1140

tcacagctgt ttacccagaa accatatcct aaagtgtttt cagcagcggg tcgtattctg 1200

cgcctgtggg atgacttagg tacagccaaa gaagaacagg aacgcggcga tctagcctct 1260

tgcgtgcagc ttttcatgaa agaaaaaagt ctgaccgaag aagaagctcg ctcacgcatc 1320

ctggaagaaa tcaaaggcct gtggcgcgac ttgaatggtg aattagtgta taacaagaat 1380

ctgccgctga gcatcatcaa agttgccctg aatatggcac gcgctagtca ggttgtgtat 1440

aagcatgatc aggataccta ttttagttca gttgataatt atgtggatgc actgttcttt 1500

acacagtaa 1509

<210> 4

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggtagcg cagggatgcc ggaaaaacct catgcagtgt gtctgccgta tccggcacag 60

ggtcatatta ccccgatgct gaaactggcc aaattactgc atagtaaagg ctttcatgtg 120

acctttgtta ataccgagtt caatcataaa cgcttactga aatctcgcgg tccggatagc 180

ctgaccggcc tgtcaagttt tcgctttgaa accattccgg atggcctgcc ggaatcagat 240

ttggatgcca cccagtttat tccgagcctg tgtgaaagca cccgcaaaaa ttgtttaggc 300

ccgtttcgcc agttactggg caaactgaac aataccgtgt ctagcggcgt tccgccggtg 360

tcttgtgtgg tgagcgatgg cgtgatgagc ttttcattag atgcagcaga agaactgggt 420

attccgcagg ttctgttttg gaccacctca gtttgtggct ttatggccta tgttcattat 480

cgtaatctga ttgaaaaagg ctataccccg ctgaaagatg tgagctatgt gaccaatggc 540

tatctggata ccgtgattga ttggattccg ggtatggaag gtattcgctt aaaggatctg 600

ccgtcatttc tgcgcaccac cgatccgaat gatattatgc tggattttgt gctgagtgaa 660

accaaaaata cccatcgtag tagcgccatt atttttaata cctttgataa actggaacat 720

caggtgctgg aaccgttagc aagcatgttt ccgccgatct acaccattgg tccgttaaac 780

cttctgatga atcagattaa agaagaatct ctgaaaatga ttggctctaa tctgtggaaa 840

gaagaaccga tgtgtattga atggttaaat agtaaagaac cgaaaagcgt ggtgtatgtt 900

aattttggtt ctattaccgt tatgaccccg aatcagttag ttgaatttgc atggggctta 960

gccaatagta atcagagctt tctgtggatt attcgtccgg atctggtggt gggcgaatca 1020

gccgtgctgc cgccggaatt tgttgcagtg accaaagaac gcggtatgtt agcctcttgg 1080

gccccgcagg aagaagtgct ggcacatagc tcagtgggcg gctttctgac ccattgtggt 1140

tggaatagta ccttagaatc tatttcaagc ggcgttgcag tggtttgttg gccgttcttc 1200

gccgaacagc agaccaattg ttggtattgt tgtggcgaac tgggcattgg catggaaatt 1260

gatagcgatg ttaaacgcga agaagttgaa cgcttagtgc gcgaactgat ggtgggcgaa 1320

aaaggcaaag agatgaaaga acgtgcaatg ggttggaaac gtctggcaga agaagccacc 1380

cagtcaagct caggtagctc ttttctgaac ctcgataaat tagttcatca ggtgctgctg 1440

tctccgcgcc cgtaa 1455

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgtatcca cgcttacttt ttaattcatg atgatttac 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtaaatcatc atgaattaaa aagtaagcgt ggatacact 39

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccttcata gttactttcg gcactgctta ctattctttc 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaagaatag taagcagtgc cgaaagtaac tatgaaggag 40

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaagaattca ggagatatac catggcttca gaaaaagaaa ttag 44

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccgcggt tatttgcttc tcttgtaaac 30

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaagaattca ggagatatag catg 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaactcgagt tatttgcttc tcttg 25

Claims

1.一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌表达菌株共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*、香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，所述香叶醇合成酶基因GES的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述糖基转移酶基因AdGT4的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

4.权利要求1～3任意一项所述高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株的制备方法，包括以下步骤：

构建共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*的第一表达载体；

构建共表达香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4的第二表达载体；

将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化大肠杆菌，获得高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*是通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ispA的核酸序列获得；所述定点突变的引物为ispA*-P1，ispA*-P2；所述ispA*-P1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ispA*-P2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*是通过定点突变法尼基焦磷酸FPP合成酶基因ERG20的核酸序列获得；所述定点突变的引物为ERG20*-P1，ERG20*-P2；所述ERG20*-P1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述ERG20*-P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。

7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述第一表达载体通过将大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中的ispA基因替换为香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ispA*制备获得。

8.根据权利要求4或6所述的制备方法，其特征在于，所述第二表达载体通过在大肠杆菌表达载体pET-duet1上连接香叶醇合成酶基因GES、香叶基焦磷酸GPP合成酶基因ERG20*和糖基转移酶基因AdGT4制备获得。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)或MG1655。

10.权利要求1～3任意一项所述的大肠杆菌表达菌株以及权利要求4～9任意一项所述制备方法制备获得的大肠杆菌表达菌株在生产香叶醇葡萄糖苷中的应用。