ES2311613T3 - Produccion mejorada de isoprenoides. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 340 de la SEQ ID NO: 43; (b) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 349 de la SEQ ID NO: 45; (c) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 388 de la SEQ ID NO: 47; (d) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 378 de la SEQ ID NO: 49; (e) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 305 de la SEQ ID NO: 51; (f) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 332 de la SEQ ID NO: 53; (g) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido elegido entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53, el fragmento que tiene la actividad de hidroximetilglutaril-CoA-reductasa (HMG-CoA- reductasa), isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonatoquinasa, fosfomevalonato-quinasa o difosfomevalonato-descarboxilasa; (h) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 43 45, 47, 49, 51 ó 53.

Description

Producción mejorada de isoprenoides.
La presente invención se refiere a nuevos polinucleótidos y secuencias de polipéptidos útiles para obtención biosintética de isoprenoides. Más en particular, la presente invención proporciona células producidas por métodos recombinantes que presentan una producción mejorada de zeaxantina. Se facilitan también métodos de obtención y de uso de tales líneas celulares.
Los carotenoides son compuestos isoprenoides C-40 comercialmente importantes, empleados como suplementos nutritivos, fármacos y colorantes alimentarios para personas humanas y como pigmentos para el pienso animal. Los carotenoides actualmente importantes desde el punto de vista industrial se producen principalmente por síntesis química (\beta-caroteno, cantaxantina y astaxantina) o por extracción de fuentes naturales (luteína de la maravilla, capsantina del pigmento picante). Sin embargo, la producción de carotenoides empleando microorganismos se ha logrado también en algunos casos. Por ejemplo, se produce \beta-caroteno por fermentación con el hongo Blakeslea trispora (US-5,328,845) o por cultivo estancado empleando la alga halotolerante Dunaliella salina [Borowitzka, J. Biotechnol. 70, 313-321, 1999]. Se ha descrito la producción de licopeno en B. trispora (WO 00/77234). Se produce la astaxantina por fermentación empleando levaduras (Phaffia rhodozyma, (recientemente rebautizada como Xanthophillomyces dendorous)) (US-6,015,684) o en fotobiorreactores o estanques abiertos empleando la alga Haematococcus pluvialis [Lorenz y Cysewski, Trends Biotechnol. 18, 160-167, 1999; Olaizola, J. Appl. Phycol. 12, 499-506, 2000]. Sin embargo, estos sistemas de producción microbiana no permiten obtener carotenoides en cantidades suficientes para la producción económicamente viable a escala industrial.
A mediados de la década de los años 1960, los científicos de Hoffmann-La Roche aislaron varias bacterias marinas, que producen el carotenoide amarillo, la zeaxantina, que tiene aplicación en pigmentación en avicultura y en la prevención de la degeneración macular propia de la edad avanzada en humanos. Una bacteria, que presenta niveles prometedores de producción de zeaxantina, ha recibido la designación de cepa R-1512 y se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) como cepa ATCC 21588 (US-3,891,504). Utilizando las normas taxonómicas aceptadas en aquel tiempo (clasificación realizada por la Escuela Técnica Superior de Zürich (Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich) y la National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station de Aberdeen, Escocia), se ha clasificado el organismo productor de zeaxantina como miembro del género Flavobacterium, pero no se le ha asignado un nombre de especie.
Posteriormente se ha realizado una amplia mutagénesis y programa de exploración para aislar los mutantes del R-1512 que tienen mayor productividad de zeaxantina. En lo que respecta al trabajo realizado hasta el presente, hay dos mutantes significativos. Estos mutantes, en orden de sus productividades de zeaxantina, son el R1534 y el R114. Hay un gran número de mutantes adicionales que se han empleado a lo largo de los años para los estudios bioquímicos de biosíntesis de carotenoides [Goodwin, Biochem. Soc. Symp. 35, 233-244, 1972; McDermott y col., Biochem. J. 134, 1115-1117, 1973; Britton y col., Arch. Microbiol. 113, 33-37, 1977; Mohanty y col., Helvetica Chimica Acta 83, 2036-2053, 2000].
Los intentos iniciales de desarrollar procesos de fermentación industrialmente viables para la producción de la zeaxantina utilizando mutantes derivados por métodos clásicos de la cepa R-1512 no tuvieron éxito. Sin embargo, con la llegada de la biología molecular se abrió la posibilidad de desarrollo de cepas que produjeran mayor cantidad de zeaxantina. El primer paso en esta dirección se tomó con la clonación y la secuenciación del conglomerado genético del carotenoide de la cepa R1534.
En US-6,087,152 se describe que los genes de carotenoide se expresan funcionalmente en la Escherichia coli y el Bacillus subtilis resultando de ella la producción de en estos hospedantes. También en US-6,087,152 se describe que modificando el conglomerado genético del carotenoide o añadiendo un gen de una bacteria productora de astaxantina, es posible producir carotenoides distintos de la zeaxantina (EP-872,554). Además, en el documento EP-872,554 se describe que la producción de carotenoides aumenta en la cepa R1534 introduciendo conglomerados genéticos de carotenoides clonados en un plásmido multicopia.
En US-3,891,504 se describe una cepa bacteriana R-1521 clasificada en aquel tiempo como flavobacteria, pero ahora clasificada como paracoco. En EP-747 483 se describen los microorganismos anteriormente llamados flavobacterias, ahora paracocos, de la cepa R-1534. En WO 00/01650 se describen los genes y la organización genómica del método del mevalonato en varios cocos gram-positivos.
A pesar de la enorme diversidad estructural de los compuestos isoprenoides, todos ellos pueden obtenerse por biosíntesis a partir del precursor C-5, el isopentenil-pirofosfato (IPP). Hasta principios de la década de los años 1990 se aceptaba en general que el IPP se sintetizaba en todos organismos a través de la vía mevalonato, incluso a pesar de que algunos resultados experimentales no eran consistentes con este esquema biogénico [Eisenreich y col., Chemistry and Biology 5, R221-R233, 1998].
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Después se han podido reconciliar las discrepancias gracias al descubrimiento de una vía alternativa de biosíntesis del IPP, la vía de la desoxixilulosa (DXP) (nota: la vía alternativa de la biosíntesis del IPP ha recibido varios nombres en la bibliografía científica (vía DXP, vía DOXP, vía MEP, vía GAP/piruvato y la vía de no mevalonato). Aquí empleamos el nombre de vía DXP únicamente por simplicidad). Se han identificado las cinco primeras reacciones de la vía DXP [Herz y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 97, 2486-2490, 2000], pero todavía no se han esclarecido los pasos siguientes que conducen a la formación del IPP.
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McDermott y col. (lugar citado) y Britton y col. [J. Chem. Soc. Chem. Comm. p. 27, 1979] indican que los extractos brutos de zeaxantina producidos por las cepas mutantes derivadas del material aislado original de Roche incorporan mevalonato marcado que se ha transformado en zeaxantina. No existen motivos para poner en duda la evidencia de la biosíntesis del IPP por la vía del mevalonato, pero antes del descubrimiento de la vía DXP se ha realizado un trabajo y se ha publicado que algunas bacterias (especie Streptomyces) poseen ambas vías para la síntesis del IPP y que la expresión de estas vías está regulada temporalmente [Seto y col., Tetrahedron Lett. 37, 7979-7982, 1996; Dairi y col., Mol. Gen. Genet. 262, 957-964, 2000]. Además, en la actualidad se ha demostrado que solamente un pequeño número de eubacterias tienen la posibilidad de la vía del mevalonato para la síntesis del IPP. Se han clonado y secuenciado los genes que codifican a las enzimas de la vía del mevalonato a partir de algunas de estas bacterias [Wilding y col., J. Bacteriol. 182, 4319-4327, 2000; Takagi y col., J. Bacteriol. 182, 4153-4157, 2000].
Existen varios ejemplos, en los que la aplicación de la ingeniería metabólica ha conseguir alterar o mejorar la producción de carotenoides en microorganismos [Lagarde y col., Appl. Env. Microbiol. 66, 64-72, 2000; Wang y col., Biotechnol. Bioeng. 62, 235-241, 1999; Wang y col., Biotechnol. Prog. 16, 922-926, 2000) (y las referencias que allí se citan); Sandmann y col., Trends Biotechnol. 17, 233-237, 2000; Misawa y Shimada, J. Biotechnol. 59, 169-181, 1998; Matthews y Wurtzel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 396-400, 2000; Albrecht y col., Nature Biotechnol. 18, 843-846, 2000; Schmidt-Dannert y col., Nature Biotechnol. 18, 750-753, 2000]. Por ejemplo, puede someterse la E. coli, una bacteria no carotenogénica, a ingeniería genética para que produzca carotenoides introduciéndole los genes clonados de carotenoide (crt) de las bacterias Agrobacterium aurantiacum, Erwinia herbicola o Erwinia uredovora (Misawa y Shimada, lugar citado). Harker y Bramley [FEBS Lett. 448, 115-119, 1999] y Matthews y Wurtzel (lugar citado) publican que la producción de carotenoides en dichas cepas de ingeniería genética de E. coli podría mejorarse con la sobreexpresión del gen que codifica a la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa (DXPS), la primera enzima de la vía DXP (la E. coli solamente posee la posibilidad de realizar la vía DXP para la biosíntesis de isoprenoides y no puede realizar la vía del mevalonato [Lange y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 97, 13172-13177, 2000]. Harker y Bramley (lugar citado) publican además un aumento del compuesto isoprenoide ubiquinona-8, en las células superproductoras de DXPS. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la disponibilidad limitada del IPP, resultante de una insuficiente actividad "in vivo" del DXPS, limita la producción de carotenoides y de otros compuestos isoprenoides en las cepas de ingeniería genética. Empleando un sistema similar de E. coli, Kim y Keasling [Biotechnol. Bioeng. 72, 408-415, 2001] describen que la sobreexpresión combinada de los genes que codifican al DXPS y la segunda enzima de la vía DXP, la DXP-reductoisomerasa (1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa) da lugar a una producción de carotenoides mayor que la sobreexpresión de solamente el gen que codifica al DXPS.
Todos estos estudios se realizaron con la E. coli diseñada para producir carotenoides. Por consiguiente, un inconveniente de estos estudios es que la cantidad de carotenoides producida por estas cepas de E. coli recombinante es muy baja si se compara con las cantidades producidas por los microorganismos precisamente no recombinantes empleados para la producción industrial de carotenoides. Además, una mayor producción de carotenoides en bacterias por ingeniería genética de la vía de biosíntesis del IPP solamente se ha observado en organismos que utilizan la vía DXP para la formación del IPP. No se han realizado estudios similares con bacterias que producen el IPP a través de la vía mevalonato.
La ingeniería metabólica de la vía mevalonato para mejorar la producción de compuestos isoprenoides se ha realizado en levaduras. Por ejemplo, en el documento WO 00/01649 se describe que la producción de compuestos isoprenoides aumenta en el Saccharomyces cerevisiae cuando se sobreexpresa el gen que codifica a la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A-reductasa (HMG-CoA-reductasa). Sin embargo, no se ha demostrado que esta estrategia mejore la producción de isoprenoides en las bacterias y no se ha demostrado en particular que la producción de carotenoides en bacterias pueda mejorarse amplificando la expresión de los genes de la vía mevalonato. Se ha demostrado que algunos genes de la vía mevalonato de eucariotas [Campos y col., Biochem. J. 353, 59-67, 2001] y de la bacteria Streptomyces sp., cepa CL190 (Takagi y col., lugar citado) pueden expresarse en la E. coli, pero no se ha publicado que haya una mayor producción de isoprenoides en las cepas.
Además de las reacciones que forman al IPP (mediante las vías DXP o mevalonato) y las reacciones que convierten al farnesil-pirofosfato (FPP) en diversos isoprenoides más (p. ej., carotenoides, quinonas), se conocen dos reacciones que intervienen en la biosíntesis de los isoprenoides. La isomerasa IPP interconvierte al IPP y en su isómero, el dimetilalil-pirofosfato (DMAPP). Existen dos formas de la isomerasa IPP, la enzima de tipo 1, que es bien conocida en eucariotas y algunas bacterias y la enzima de tipo 2, identificada recientemente, que es dependiente de FMN y NADP(H) [Kaneda y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 98, 932-937, 2001].
Diversas publicaciones describen que en la E. coli diseñada para producir carotenoides, la amplificación de los genes de la isomerasa IPP nativa o heteróloga de tipo 1 (idi) estimula la producción de carotenoides [Kajiwara y col., Biochem. J. 324, 421-426, 1997; Verdoes y van Ooyen, Acta Bot. Gallica 146, 43-53, 1999; Wang y col., lugar citado]. En una publicación (Wang y col., lugar citado), describen además que la sobreexpresión del gen ispA, que codifica a la FPP-sintasa (farnesil-difosfato-sintasa) aumenta la producción de carotenoides en una cepa de E. coli carotenogénica por ingeniería genéticasi se combina con la sobreexpresión de los genes idi y crtE (GGPP-sintasa/geranil-geranil-difosfato-sintasa). Al igual que en el caso de la vía de biosíntesis del IPP, no se ha demostrado que la sobreexpresión de genes que codifican a la isomerasa IPP o la sintasa FPP mejore la producción de carotenoides en un microorganismo carotenogénico natural. Además, los niveles de carotenoides producidos en las cepas de E. coli antes descritas son muy bajos y no se ha demostrado que estas estrategias funcionen en un microorganismo industrial, en el que la producción de carotenoides ya era elevada.
Resumiendo, no existe evidencia previa de que una mayor expresión del o de los genes que codifican a las enzimas de la vía mevalonato pueda mejorar la producción de carotenoides en bacterias carotenogénicas naturales o bacterias no carotenogénicas naturales sometidas a ingeniería genética para convertirlas en carotenogénicas.
Una forma de ejecución de la presente invención es un polipéptido aislado que incluye una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo siguiente: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 340 de la SEQ ID NO: 43; (b) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 349 de la SEQ ID NO: 45; (c) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 388 de la SEQ ID NO: 47; (d) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 378 de la SEQ ID NO: 49; (e) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 305 de la SEQ ID NO: 51; (f) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 332 de la SEQ ID NO: 53; (g) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido elegido entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53, el fragmento que tiene la actividad de HMG-CoA-reductasa, isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomeva-
lonato-descarboxilasa; (h) una variante modificada conservadoramente de las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 ó 53.
Tal como se ha mencionado antes, la presente invención incluye a las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53, que son secuencias de polipéptidos que corresponden a las siguientes enzimas de la vía mevalonato: hidroximetil-glutaril-CoA (HMGCoA) reductasa, isopentenil-difosfato (IPP) isomerasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-quinasas, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa, respectivamente. La presente invención incluye además por lo menos 30 aminoácidos contiguos de cada secuencia identificada o un número suficiente de aminoácidos contiguos para definir una molécula biológicamente activa.
La presente invención incluye también fragmentos de un polipéptido elegido entre las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53. El fragmento debería tener una longitud por lo menos de aprox. 30 aminoácidos, pero ha de tener la actividad del polipéptido identificado, p. ej., en el caso de la SEQ ID NO: 43, un fragmento de la misma que está comprendido dentro del alcance de la presente invención tiene la actividad de la HMG-CoA-reductasa. Tal como se emplea aquí, una medida de la actividad de los fragmentos respectivos se define en el ejemplo 1. Un fragmento que tenga una actividad por encima de la línea de base, tal como se define en el ejemplo 1, se considera que es biológicamente activo y está comprendido dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención incluye también una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas, ya definidas antes, a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 42 (es decir, el operón mevalonato) o un complemento de la SEQ ID NO: 42. El polinucleótido tiene que codificar por lo menos a una de las enzimas de la vía mevalonato. Para los fines de la presente invención, una "sonda de hibridación" es una secuencia de polinucleótido que contiene aprox. 10-9066 nucleótidos de la SEQ ID NO: 42.
En esta forma de ejecución, el polipéptido aislado puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 53. Como alternativa, el polipéptido aislado puede tener aprox. 30 aminoácidos contiguos elegidos entre la zona de las respectivas secuencias de aminoácidos que tienen la menor identidad, cuando se comparan con la enzima de la misma función de diferentes especies. Así, por ejemplo, un polipéptido de la presente invención puede incluir los aminoácidos 68-97 de la SEQ ID NO: 43, 1-30 de la SEQ ID NO: 45, 269-298 de la SEQ ID NO: 47, 109-138 de la SEQ ID NO: 49, 198-227 de la SEQ ID NO: 51 ó 81-110 de la SEQ ID NO: 53.
Se describe también un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 287 de la SEQ ID NO: 159; (b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 159; (c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEQ ID NO: 159, el fragmento que tiene la actividad de farnesildifosfato-sintasa (FPP-sintasa); (d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen ispA (es decir, los nucleótidos 295-1158 de la SEQ ID NO: 157) o un complemento de la misma, en la que el polipéptido tiene la actividad de FPP-sintasa; y (e) variantes modificadas conservadoramente de la SEQ ID NO: 159.
Por lo tanto, el aminoácido puede codificarse con el marco de lectura abierto completo que codifica a la FPP-sintasa, es decir, los restos 1-287 de la SEQ ID NO: 159, por lo menos 30 restos contiguos de la misma, o un fragmento de la SEQ ID NO: 159 que tenga actividad de FPP-sintasa cuando se mide mediante el ensayo descrito en el ejemplo 1. Se describen además secuencias de aminoácidos codificadas por el o los polinucleótido(s) que en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación que incluye por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen ispA (es decir, los nucleótidos 295-1158 de la SEQ ID NO: 157) o un complemento de la misma, dicho polipéptido tiene actividad de FPP-sintasa, ya definida antes.
El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159.
Se describe también un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo siguiente: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 142 de la SEQ ID NO: 160; (b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 160; (c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEQ ID NO: 160, el fragmento que tiene la actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa (DXPS); (d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones restrictivas, hibrida a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 o a un complemento de la misma, dicho polipéptido tiene la actividad de DXPS; y (e) variantes modificadas conservadoramente de la SEQ ID NO: 160.
Por tanto, el aminoácido puede codificarse con el marco de lectura abierto completo que codifica al DXPS, es decir, los restos 1-142 de la SEQ ID NO: 160, por lo menos 30 restos contiguos de la misma, o un fragmento de la SEQ ID NO: 160 que tenga actividad de DXPS, medida según el ensayo descrito en el ejemplo 1. Se describen además secuencias de aminoácidos codificadas por polinucleótido(s) que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación que incluye por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen DXPS (es decir, los nucleótidos 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157) o un complemento de la misma, dicho polipéptido tiene actividad de DXPS ya definida antes. El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160.
Se describe también un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 390 de la SEQ ID NO: 178; (b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 178; (c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEQ ID NO: 178, el fragmento que tiene la actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa; (d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que en condiciones restrictivas hibrida a una sonda de hibridación que tiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen phaA (es decir, los nucleótidos 1-1179 de la SEQ ID NO: 177) o un complemento de la misma, dicho polipéptido tiene la actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa y (e) variantes modificadas conservadoramente de la SEQ ID NO: 178.
Por tanto, el aminoácido puede codificarse el marco de lectura abierto entero que codifica a la acetil-CoA-acetiltransferasa, es decir, los restos 1-143 de la SEQ ID NO: 178, por lo menos 30 restos contiguos de la misma, o un fragmento de la SEQ ID NO: 178 que tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa medida con arreglo al ensayo descrito en el ejemplo 1. Además, esta forma de ejecución de la invención incluye también secuencia(s) de aminoácidos codificadas por polinucleótido(s) que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación que incluye por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen phaA (es decir, los nucleótidos 1-1170 de la SEQ ID NO: 177), o a un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa ya definida antes. El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178.
Se describe también un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre: (a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 240 de la SEQ ID NO: 179; (b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 179; (c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido de la SEQ ID NO: 179, el fragmento que tiene la actividad de acetoacetil-CoA-reductasa; (d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen phaB (es decir, nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177) o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene la actividad de acetoacetil-CoA-reductasa; y (e) variantes modificadas conservadoramente de la SEQ ID NO: 179.
Por tanto, el aminoácido puede codificarse con el marco de lectura abierto entero que codifica a la acetoacetil-CoA-reductasa, es decir, restos 1-240 de la SEQ ID NO: 179, por lo menos 30 restos contiguos de la misma, o un fragmento de la SEQ ID NO: 179 que tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa medida con arreglo al ensayo descrito en el ejemplo 1. Además, este incluye también secuencia(s) de aminoácidos codificadas por polinucleótido(s) que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación que incluye por lo menos 30 nucleótidos consecutivos del gen phaB (es decir, nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177) o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa ya definida antes.
El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179.
Los términos "polipéptido", "secuencia de polipéptido", "aminoácido" y "secuencia de aminoácidos" se emplean aquí indistintamente y significan un oligopéptido, péptido, polipéptido o secuencia de proteína o un fragmento de uno cualquiera de estos, así como las moléculas de origen natural o sintéticas. En este contexto, "fragmentos", "fragmentos inmunogénicos" o "fragmentos antigénicos" indican fragmentos de uno cualquiera de los polipéptidos aquí definidos que tienen una longitud de por lo menos aprox. 30 aminoácidos y que conservan cierta actividad biológica o actividad inmunológica del polipéptido en cuestión. Cuando aquí se menciona la "secuencia de aminoácidos" es para indicar una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína de origen natural, "secuencia de aminoácidos" y los términos similares no se emplean para limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula de proteína mencionada.
Con respecto a los polipéptidos, el término "aislado" significa una proteína o un polipéptido que se ha separado de los componentes que la acompañan en su estado natural. Una proteína monomérica está aislada cuando por lo menos aprox. del 60 al 75% de una muestra presenta una secuencia de polipéptido individual. Una proteína aislada tendrá por ejemplo aprox. del 60 al 90% p/p de una muestra de proteína, con mayor frecuencia aprox. el 95% y con preferencia tendrá una pureza aprox. del 99%. La pureza u homogeneidad de las proteínas puede indicarse de muchas maneras bien conocidas en la técnica, por ejemplo la electroforesis a través de gel de poliacrilamida de una muestra de proteína y posterior visualización de una banda de polipéptido individual por tinción del gel. Para ciertos fines, la aplicación de la HPLC u otros medios bien conocidos de la técnica puede proporcionar una resolución más alta para la purificación.
Tal como se emplea aquí, el término "biológicamente activo" indica una proteína que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de una molécula de origen natural. De igual manera, "inmunológicamente activo" indica la capacidad de un polipéptido natural, recombinante o sintético o de cualquier oligopéptido del mismo de inducir una respuesta inmune específica en animales o células apropiados y para fijarse sobre determinados anticuerpos.
Otra forma de ejecución de la invención es una secuencia aislada de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos del operón mevalonato (SEQ ID NO: 42) o fragmentos de la SEQ ID NO: 42. Las variantes y fragmentos de la SEQ ID NO: 42 tienen que codificar un polipéptido que tenga una actividad elegida entre: HMG-CoA-reductasa, isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa.
Esta forma de ejecución incluye también la secuencia de polinucleótido que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibrida a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos está formada aprox. por un número de 10 a 9066 nucleótidos de la SEQ ID NO: 42, con preferencia por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de tales secuencias, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre: HMG-CoA-reductasa, isopentenil-difosfato-isomerasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa.
Esta forma de ejecución incluye también la secuencia aislada de polinucleótido que abarca los siguientes restos de la SEQ ID NO: 42: de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887, de 7880 a 8878. Los fragmentos de estas secuencias están también dentro del alcance de la invención, en el supuesto de que codifiquen a un polipéptido que tenga actividad de HMG-CoA-reductasa, actividad de isopentenil-difosfato-isomerasa, actividad de HMG-CoA-sintasa, actividad de mevalonato-quinasa, actividad de fosfomevalonato-quinasa y actividad de difosfomevalonato-descarboxilasa, respectivamente.
Esta forma de ejecución incluye también a la secuencia de polinucleótido que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibrida a una sonda de hibridación elegida entre una secuencia de nucleótidos que consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de los siguientes restos de la SEQ ID NO: 42: de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887, de 7880 a 8878 o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de HMG-CoA-reductasa, actividad de isopentenil-difosfato-isomerasa, actividad de HMG-CoA-sintasa, actividad de mevalonato-quinasa, actividad de fosfomevalonato-quinasa y actividad de difosfomevalonato-descarboxilasa, respectivamente.
Con preferencia, el polinucleótido aislado consta de los nucleótidos de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887 o de 7880 a 8878 de la SEQ ID NO: 42.
Se describe también una secuencia aislada de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 157, variantes de la SEQ ID NO: 157 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codón de la cepa 1534 del Paracoccus sp. (ver tabla14) o fragmentos de la SEQ ID NO: 157 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de FPP-sintasa, actividad de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o la actividad de XseB. Esto incluye también secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación cuya secuencia de nucleótidos consta de por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de la SEQ ID NO: 157, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de FPP-sintasa, actividad de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o la actividad de XseB.
Con preferencia, el polinucleótido aislado consta de los nucleótidos 59-292, 295-1158 o 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157.
Se describe también una secuencia aislada de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo siguiente: los nucleótidos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones de la SEQ ID NO: 157 que contiene una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157 que codifica a un polipéptido que tiene la función de XseB, y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación la secuencia de nucleótidos que consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de tal secuencia, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene la función de XseB.
Con preferencia, el polinucleótido aislado consta de los nucleótidos de 59 a 292 de la SEQ ID NO: 157.
Se describe también una secuencia aislada de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo siguiente: nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 que contiene una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 que codifica la actividad de la FPP-sintasa, y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de tal secuencia, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de FPP-sintasa.
Con preferencia, la secuencia de nucleótidos aislada consta de los nucleótidos 295-1158 de la SEQ ID NO: 157.
Se describe también una secuencia aislada de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 que contiene una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (ver tabla14) o fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 que codifica a un polipéptido que tiene actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa. Esto incluye también a las secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa.
Con preferencia, el polinucleótido aislado consta de los nucleótidos de 1185 a 1610 de la SEQ ID NO: 157.
Se describe también una secuencia aislada de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contiene una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (ver tabla 14) o fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifica a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre acetil-CoA-acetiltransferasa y acetoacetil-CoA-reductasa. Esto incluye también secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, ya definidas antes, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 177, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por la acetil-CoA-acetiltransferasa y acetoacetil-CoA-reductasa.
La secuencia aislada de polinucleótido puede incluir a los nucleótidos de 1 a 1170 de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contiene una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (ver tabla14) o fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifica a un polipéptido que tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa. Esto incluye también a secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de nucleótidos de 1 a 1170 de la SEQ ID NO: 177, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa.
Con preferencia, la secuencia aislada de polinucleótido consta de los nucleótidos 1-1170 de la SEQ ID NO: 177.
Como alternativa, la secuencia aislada de polinucleótido puede tener los nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (ver tabla14) o fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa. Esto incluye también secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos, los nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa.
Con preferencia, el polinucleótido aislado consta de los nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177.
La secuencia aislada de polinucleótido puede tener una secuencia de nucleótidos elegida entre la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 177 y combinaciones de las mismas. Tal como se emplea aquí, la expresión "y combinaciones de los mismas" referida a secuencias de nucleótidos significa que cualquier combinación de las secuencias mencionadas puede formar la secuencia aislada de polinucleótido. Pueden utilizarse además las copias múltiples de la misma secuencia, es decir, los concatámeros. De igual manera, tal como se describe con mayor detalle a continuación, las copias múltiples de plásmidos que contiene la misma secuencia de polinucleótido pueden transferirse a células hospedantes idóneas.
Tal como se emplea aquí, un polinucleótido "aislado" (p. ej., un RNA, DNA o un polímero mixto) es aquel que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que de modo natural acompañan a una secuencia nativa o polipéptido, p. ej., ribosomas, polimerasas, muchas otras secuencias de genoma y proteínas. El término abarca a un polinucleótido que se haya separado de su entorno natural e incluye a los materiales DNA aislados recombinantes o clonados y análogos sintetizados por métodos químicos o análogos sintetizados por métodos biológicos con sistemas heterólogos.
La expresión "secuencia de ácido nucleico" indica un polímero de hebra simple o doble de bases desoxirribonucleótido o ribonucleótido leída desde el extremo 5' al extremo 3'. Esto incluye al DNA cromosómico, a los plásmidos autorreplicadores, a los polímeros infecciosos de DNA o RNA y al DNA o RNA que desempeña un rol primariamente estructural.
Una "secuencia de control de expresión" se define como un ordenamiento de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Un ejemplo de tal secuencia de control de expresión es un "promotor". Los promotores incluyen a las secuencias de ácido nucleico necesarias además del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor incluye además opcionalmente elementos ampliadores o represores distales, que están situados en varios millares de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de condiciones ambientales y de desarrollo.
Un promotor "inducible" es un promotor que es activo durante la regulación ambiental o evolutiva. El término "unido operativamente" indica una unión funcional entre una secuencia de ácido nucleico de control de expresión (por ejemplo los sitios de fijación de un promotor o un ordenamiento de sitios de fijación de factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, dicha secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Un secuencia de polinucleótido es "heteróloga con respecto a" un organismo o una segunda secuencia de polinucleótido si se origen en una especie ajena o, si es de la misma especia, si tiene su forma original modificada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora heteróloga indica una secuencia codificadora de una especie diferente de aquella, de la cual se deriva el promotor, o, si es de la misma especie, una secuencia codificadora que es diferente de cualquier variante alélica de origen natural.
En el caso tanto de la expresión de transgenes como de la inhibición de genes endógenos (p. ej., por supresión antisentido o sentido), los expertos podrán reconocer que la secuencia de polinucleótido insertada no necesita ser idéntica, sino que puede basta con que sea "sustancialmente idéntica" a la secuencia del gen, del cual se deriva.
En el caso en el que la secuencia insertada de polinucleótido se transcriba y traduzca para producir un polipéptido funcional, los expertos podrán reconocer que, debido a la degeneración del codón, un gran número de secuencias de polinucleótidos podrán codificar a un mismo polipéptido. Estas variantes están específicamente dentro del alcance de la presente invención. La presente invención incluye además específicamente a aquellas secuencias que son sustancialmente idénticas (determinadas del modo descrito a continuación) entre sí y que codifican a polipéptidos que son mutantes de polipéptidos de tipo salvaje o bien retienen la función del polipéptido (p. ej., resultante de las sustituciones conservadoras de aminoácidos en el polipéptido). Además, las variantes pueden ser aquellas que codifican a las mutantes negativas dominantes, tal como se describe a continuación.
Dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos se dice que son "idénticas", si la secuencia de nucleótidos o restos aminoácido, respectivamente, de las dos secuencias es la misma cuando se alinea para la correspondencia máxima, tal como se describe a continuación. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, indican dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de restos aminoácido restos o de nucleótidos que son los mismos, si se comparan y se alinean para la correspondencia máxima a lo largo del marco de comparación, medida empleando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Si el porcentaje de identidad de secuencia se emplea en relación a las proteínas o péptidos, se reconocerá que las posiciones de los restos que no son idénticas a menudo difieren por las sustituciones conservadoras de aminoácidos, cuando dichos restos aminoácido están sustituidos por otros restos aminoácido de propiedades químicas similares (p. ej., carga o carácter hidrófobo) y por tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Si las secuencias difieren en las sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de la secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir el carácter conservador de la sustitución. Los medios para efectuar este ajuste ya son conocidos por los expertos. Esto implica por ejemplo puntuar una sustitución conservadora como un desapareamiento (mismatch) parcial y no total, con lo cual se aumenta el porcentaje de identidad de la secuencia. Por ejemplo si un aminoácido idéntico recibe la puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe la puntuación de cero, una sustitución conservadora tendrá una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula con arreglo p. ej. al algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4, 11-17, 1988, p. ej., del modo realizado por el programa informático PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., EE.UU.).
La expresión "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, indica secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de restos aminoácido o nucleótidos de por lo menos el 60%, con preferencia el 80%, con preferencia especial el 90-95%, cuando se alinean para la correspondencia máxima a lo largo de un marco de comparación tal como se mide empleando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Esta definición indica también una secuencia, cuyo complemento se hibrida con la secuencia a ensayar.
Para la comparación de secuencias, una secuencia actúa por ejemplo como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias a ensayar. Empleando un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias a ensayar y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de las secuencias.
Pueden utilizarse los parámetros del programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias a ensayar y las relaciona con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.
Una ventana o "marco de comparación," tal como se emplea aquí, indica la referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas elegidas entre el grupo formado por 20-600, normalmente aprox. 50-200, con mayor frecuencia aprox. 100-150, en los que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima. Los métodos de alineamiento de secuencias con fines comparativos son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede efectuarse, p. ej., con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482, 1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443, 1970), por la búsqueda del método de similaridad de Pearson y Lipman, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 85, 2444, 1988, por realizaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o por alineamiento manual e inspección visual.
Un ejemplo de algoritmo útil es el PILEUP. El PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias de un grupo de secuencias afines empleando alineamientos progresivos, por pares, que muestran la relación y la identidad porcentual de las secuencias. Permite trazar además un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de aglomeración empleadas para generar el alineamiento. El PILEUP emplea una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35, 351-360, 1987. El método aplicado es similar al descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5, 151-153, 1989. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de ellas de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple se inicia con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, generando un aglomerado de secuencias alineadas de dos en dos. Después se alinea este aglomerado con la secuencia siguiente que tiene el mayor parecido, o con el aglomerado de secuencias alineadas que guardan la mayor similitud. Se alinean dos aglomerados de secuencias por simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se realiza con una serie de alineamientos progresivos, por parejas. El programa se lleva a cabo designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o de nucleótidos para las regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias a analizar para determinar la relación de la identidad porcentual de secuencias empleando los parámetros siguientes: peso de la brecha por defecto (3,00), peso de la longitud de brecha por defecto (0,10) y brechas finales ponderadas.
Otro ejemplo de algoritmo idóneo para determinar la identidad porcentual de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST [Altschul y col., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990]. El programa informático para efectuar los análisis BLAST es de dominio público y puede solicitarse al Centro Nacional de Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Este algoritmo implica en primer lugar identificar las parejas de secuencias de puntuación alta (las HSP) identificando pequeñas palabras de longitud W de la secuencia buscada, que encajan o satisfacen un cierto valor de puntuación umbral T positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia existente en la base de datos. T indica el umbral de puntuación de la palabra de vecindad (Altschul y col., lugar citado). Estos aciertos de palabras de vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas que permitan encontrar HSP más largas que los contengan. Se extienden los aciertos de palabras en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras se pueda seguir aumentando la puntuación de alineamiento acumulado. La extensión de dos aciertos de palabra en cada dirección se interrumpe cuando: la puntuación de alineamiento acumulado disminuye en una cantidad X desde el valor máximo logrado; la puntuación acumulada se sitúa en cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST emplea como defecto una longitud de palabra (W) de 11, los alineamientos (B) de matriz de puntuación BLOSUM62 (verHenikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915, 1989) de 50, la expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y la comparación de las dos hebras.
El algoritmo BLAST realiza además un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias [véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787, 1993]. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad que tiene de producirse fortuitamente el apareamiento o encaje entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mínima en la comparación del ácido nucleico analizado con el ácido nucleico de referencia es menor que aprox. 0,2, con mayor preferencia menor que aprox. 0,01 y con preferencia especial menor que aprox. 0,001.
"Variantes modificadas conservadoramente" es una expresión que se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas conservadoramente significan aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, en el caso de que el ácido nucleico no codifique una secuencia de aminoácidos, significa secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de codones de ácido nucleico funcionalmente idénticos pueden codificar a una proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos al aminoácido alanina. De este modo, en cada posición, en la que una alanina está especificada por un codón, el codón puede alterarse para formar cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. En ellas, cada secuencia de ácido nucleico que modifica a un polipéptido describe también cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Los expertos en la materia sabrán reconocer que cada codón de un ácido nucleico (excepto el AUG, que normalmente es el único codón de la metionina) puede modificarse para formar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido está implícita en cada secuencia
descrita.
Al igual que en el caso de las secuencias de aminoácidos, los expertos en genética podrán reconocer que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales de un ácido nucleico, o las sustituciones de un péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altere a un aminoácido individual o un porcentaje bajo de aminoácidos (es decir, menos del 20%, por ejemplo el 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ó 1%) de la secuencia codificada, son una "variante modificada conservadoramente", en la que la alteración se traduce en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica.
Los seis grupos siguientes contienen, cada uno, aminoácidos que son sustituciones conservadoras de otro:
alanina (A), serina (S), treonina (T);
ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
asparagina (N), glutamina (Q);
arginina (R), lisina (K);
isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y
fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W) (véase, p. ej., Creighton, Proteins, 1984)).
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Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene reactividad cruzada en sentido inmunológico con los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en sus sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones restrictivas, del modo descrito a continuación.
La frase "se hibrida específicamente con" indica la fijación, formación de dúplex o hibridación de una molécula solamente con una secuencia de nucleótido concreta en condiciones restrictivas de hibridación, cuando la secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., DNA o RNA celular total o biblioteca).
La expresión "condiciones restrictivas de hibridación" indica las condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana, por ejemplo en una mezcla compleja de secuencias de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones restrictivas son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía amplia de la hibridación de ácidos nucleicos se encontrará en Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Hybridization with Nucleic Probes", "Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays", 1993). En general, se eligen condiciones muy restrictivas en torno a aprox. 5-10ºC por debajo del punto de fusión (T_{m}) térmico de la secuencia específica para una fuerza iónica y un pH determinados. En general se eligen condiciones poco restrictivas en torno a aprox. 15-30ºC por debajo de la T_{m}. La T_{m} es la temperatura (para una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) en la que el 50% de las sondas complementarias de la diana se hibrida con la secuencia diana en equilibrio (si las secuencias diana están presentes en exceso, en la T_{m}, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones restrictivas son aquellas en las que la concentración de sal es menor que aprox. 1,0 M de ion sodio, por ejemplo una concentración aprox. de 0,01 a 1,0 M de ion sodio (o de otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es por lo menos aprox. 30ºC para las sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aprox. 60ºC para las sondas largas (p. ej., de más de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizadores, por ejemplo la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, la señal positiva será por lo menos el doble de la hibridación de base, con preferencia 10 veces mayor que la hibridación de base.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos a los que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico empleando la degeneración máxima de codón permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos se hibridan por ejemplo en condiciones moderadamente restrictivas de hibridación.
En la presente invención, el DNA o cDNA genómico que contiene a los ácidos nucleicos de la invención puede identificarse en "Southern blots" estándar en condiciones restrictivas empleando las secuencias de ácido nucleico aquí descritas. Para los fines de esta solicitud, las condiciones restrictivas idóneas para tales hibridaciones son aquellas que incluyen la hibridación en un tampón de 40% de formamida, 1M NaCl, 1% dodecil-sulfato sódico (SDS) a 37ºC y por lo menos un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de por lo menos aprox. 50ºC, normalmente aprox. entre 55ºC y 60ºC, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Una hibridación positiva es por lo menos el doble de la base. Los expertos en genética reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones alternativas de hibridación y lavado para llegar a condiciones de restricción similares.
Otra indicación de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos es que la secuencia de referencia, amplificada mediante un par de cebadores oligonucleótidos, puede utilizarse después como sonda en condiciones restrictivas de hibridación para aislar la secuencia de ensayo del cDNA o de la biblioteca genómica, o para identificar la secuencia a ensayar, p. ej., en un "Northern" o "Southern blot".
La presente invención incluye también vectores de expresión ya definidos antes. Los vectores de expresión incluyen una o más copias de cada una de las secuencias de polinucleótidos definidas antes. Los vectores de expresión de la presente invención pueden contener una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos aquí definidas, por ejemplo SEQ ID NO: 42, o los siguientes restos de la SEQ ID NO: 42: de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887, de 7880 a 8878. Los vectores de expresión pueden tener combinaciones de las secuencias de polinucleótidos aquí definidas, por ejemplo, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 177.
Las secuencias de polinucleótidos de los vectores de expresión pueden opcionalmente unirse operativamente a una secuencia de control de expresión ya definida antes e ilustrada en los ejemplos.
La presente invención incluye también, por ejemplo, los siguientes vectores de expresión: pBBR-K-mev-op16-1, pBBRK-mev-op16-2, pDS-mvaA, pDS-idi, pDS-hcs, pDS-mvk, pDS-pmk, pDS-mvd, pDS-His-mvaA, pDS-His-idi, pDS-Hishcs, pDS-His-mvk, pDS-His-pmk, pDS-His-mvd, pBBR-K-Zea4, pBBR-K-Zea4-up, pBBR-K-Zea4-down, pBBR-K-PcrtEcrtE-3, pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBR-tK-PcrtE-pmk, pBBR-tK-PcrtE-mvd, pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3, pDS-His-phaA, pBBR-K-PcrtE-crtW, pBBR-K-PcrtE-crtWZ, pBBR-KPcrtE-crtZW y combinaciones de los mismos. Estos vectores de expresión se definen con mayor detalle en los ejemplos que siguen.
Además, la presente invención incluye también cualquier vector de expresión que contenga una de las secuencias aquí definidas, dicho vector de expresión se emplea para expresar un compuesto isoprenoide, por ejemplo un carotenoide, con preferencia la zeaxantina, en una célula hospedante idónea.
Tal como se emplea aquí, la expresión "vector de expresión" es un vehículo replicable que lleva y es capaz de mediar en la expresión de una secuencia de DNA que codifica a las secuencias de polinucleótidos aquí definidas.
En el contexto presente, el término "replicable" significa que el vector es capaz de replicarse en un tipo determinado de célula hospedante, en la que se haya introducido. En la posición inmediata en dirección ascendente (upstream) de la secuencia de polinucleótido(s) de interés, puede proporcionarse una secuencia que codifica a un péptido señal, cuya presencia asegura la secreción del polipéptido codificado, expresado por las células hospedantes que albergan al vector. La secuencia de señal puede ser una que esté naturalmente asociada con la secuencia elegida de polinucleótido o de otro origen.
El vector puede ser cualquier vector, que de modo conveniente puede someterse a procedimientos recombinantes de DNA y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedante en la que se quiera introducir. Por tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe en forma de entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica; los ejemplos de tal vector son un plásmido, un fago, un cósmido o un minicromosoma. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedante, se integra en el genoma de dicha célula hospedante y se replica junto con el o los cromosomas, en los que se ha integrado. Los ejemplos de vectores idóneos se ilustran en los ejemplos. El vector de expresión de la invención puede llevar cualquiera de las secuencias de DNA de la invención definidas a continuación y emplearse para la expresión de cualquiera de los polipéptidos de la invención definidos a continuación.
La presente invención incluye también a las células cultivadas que contengan una o más de las secuencias de polinucleótidos y/o uno o más de los vectores de expresión aquí definidos. Tal como se emplea aquí, una "célula cultivada" incluye a todas las células capaces de crecer en condiciones definidas y expresar a uno o más de los polipéptidos codificados por un polinucleótido de la presente invención. Con preferencia, la célula cultivada es una levadura, un hongo, una bacteria o una alga. Con mayor preferencia, la célula cultivada es un Paracoccus, Flavobacterium, Agrobacterium, Alcaligenes, Erwinia, E. coli o B. subtilis. Con mayor preferencia todavía, la célula es un Paracoccus, por ejemplo, el R-1506, R-1512, R1534 o R114. La presente invención incluye también la progenie de una cualquiera de las células aquí identificadas que exprese a un polipéptido aquí descrito. En la presente invención, una célula es una progenie de otra célula si su huella dactilar de DNA AFLP es indistinguible empleando las condiciones definidas en el ejemplo 2 de la huella dactilar de la célula parental putativa.
Por tanto, las células cultivadas según la presente invención pueden contener, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42, o los siguientes restos de la SEQ ID NO: 42: de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887, de 7880 a 8878, así como los restos 59-292, 295-1158 ó 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 y los restos 1-1170 ó 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177. Estas secuencias pueden transferirse a las células solas o como parte de un vector de expresión. Opcionalmente, estas secuencias pueden estar también unidas operativamente a la o las secuencias de control de expresión. Las células cultivas pueden contener también combinaciones de las secuencias de polinucleótidos aquí identificadas, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 177.
Las células cultivadas pueden contener además polinucleótidos que codifiquen a una o más enzimas de la vía biosintética de los carotenoides. Por ejemplo, las células cultivadas pueden contener una o más copias de las SEQ ID NO: 180, 182, y 184, solas o en combinación con una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos aquí identificadas. De este modo, las secuencias de polinucleótidos aquí descritas pueden transferirse a una célula cultiva solas o en combinación con otra secuencia de polinucleótido que pueda proporcionar una mayor producción del compuesto isoprenoide deseado, por ejemplo, los carotenoides del tipo zeaxantina o astaxantina. A tal respecto, la presente invención incluye el uso de cualquier polinucleótido que codifique, por ejemplo, un polipéptido que participe en la biosíntesis de carotenoides, por ejemplo la GGPP-sintasa, la \beta-caroteno-\beta4-oxigenasa (cetolasa) y/o \beta-caroteno-hidroxilasa. Además, las combinaciones de polinucleótidos que codifican a polipéptidos que intervienen en la biosíntesis de carotenoides pueden utilizarse en combinación con uno o más de los polinucleótidos aquí identificados de los mismos o de diferentes vectores de expresión. Tales constructos pueden transferirse a una célula cultivada según la presente invención para proporcionar una célula que exprese a un isoprenoide de interés.
Por ejemplo, una célula cultivada según la presente invención puede contener uno o más de los siguientes vectores de expresión: pBBR-K-mev-op16-1, pBBR-K-mev-op16-2, pDS-mvaA, pDS-idi, pDS-hcs, pDS-mvk, pDS-pmk, pDS-mvd, pDS-His-mvaA, pDS-His-idi, pDS-His-hcs, pDS-His-mvk, pDS-His-pmk, pDS-His-mvd, pBBR-K-Zea4, pBBRK-Zea4-up, pBBR-K-Zea4-down, pBBR-K-PcrtE-crtE-3, pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBR-tK-PcrtE-pmk, pBBR-tK-PcrtE-mvd, pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3, pDS-His-phaA, pBBR-KPcrtE-crtW, pBBR-K-PcrtE-crtWZ, pBBR-K-PcrtE-crtZW o combinaciones de los mismos.
\newpage
Otra forma de ejecución de la invención es un método para producir un carotenoide. En este método, se cultiva una célula cultivada, ya definida antes, en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido ya definida antes. Las condiciones de cultivo que permiten la expresión de un polipéptido se proporcionan en los ejemplos siguientes, pero pueden modificarse, si fuera necesario, para adaptarse al uso concreto pretendido. Después se aísla el carotenoide de la célula o, si se hubiera secretado, del medio en el que se halla la
célula.
En la presente invención, un "carotenoide" incluye los compuestos siguientes: fitoeno, licopeno, \beta-caroteno, zeaxantina, cantaxantina, astaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona, adonirrubina y combinaciones de los mismos. Con preferencia, el carotenoide es la zeaxantina.
Otra forma de ejecución de la invención es un método para obtener una célula que produzca carotenoides. Este método incluye: (a) introducir en una célula una secuencia de polinucleótido que codifica a una enzima de la vía mevalonato, dicha enzima se expresa en la célula; y (b) seleccionar una célula que contenga la secuencia de polinucleótido del paso (a), que produzca un carotenoide en un nivel que es aprox. 1,1-1.000 veces el nivel del carotenoide producido por la célula antes de la introducción de la secuencia de polinucleótido.
Tal como se emplea aquí, la expresión "una enzima de la vía del mevalonato" significa las enzimas que intervienen en la vía del mevalonato de la biosíntesis de la IPP y están codificadas por los genes atoB o phaA, hcs, mvaA, mvk, pmk y mvd. Para los fines de la presente invención, una enzima se "expresa en la célula" si se detecta empleando uno cualquiera de los ensayos de actividad descritos en el ejemplo 1. Los ensayos para detectar la producción de un carotenoide son bien conocidos en la técnica. En los ejemplos 1, 11 y 12 se proporcionan procedimientos típicos de ensayo para identificar la presencia de la zeaxantina, el licopeno y la astaxantina, respectivamente. De manera similar se pueden utilizar los métodos de ensayo de otros carotenoides para detectar la presencia en la célula o medio p. ej. del fitoeno, cantaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona y adonirrubina.
Por tanto, este método puede utilizarse para producir los siguientes carotenoides representativos: fitoeno, licopeno, \beta-caroteno, zeaxantina, cantaxantina, astaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona, adonirrubina y combinaciones de los mismos. En este método, el carotenoide preferido es la zeaxantina.
Este método consiste en obtener células capaces de producir un carotenoide en un nivel que es aprox. 1,1-1.000 veces, con preferencia aprox. 1,5-500 veces, por ejemplo aprox. 100 veces o por lo menos 10 veces superior al nivel de carotenoide producido por la célula antes de la introducción de la secuencia de polinucleótido.
En este método, la célula produce aprox. de 1 mg/l a 10 g/l de carotenoide. Es preferido que la célula produzca aprox. de 100 mg/l a 9 g/l, por ejemplo aprox. de 500 mg/l a 8 g/l o aprox. de 1 g/l a 5 g/l de carotenoide.
En este método, la célula puede seleccionarse entre una levadura, un hongo, una bacteria y una alga. Con preferencia, la célula es una bacteria elegida entre Paracoccus, Flavobacterium, Agrobacterium, Alcaligenes, Erwinia, E. coli y B. subtilis. Con mayor preferencia, la bacteria es un Paracoccus.
En este método, la célula puede ser una célula mutante. Tal como se emplea aquí, una "célula mutante" es cualquiera célula que contenga una secuencia no nativa de polinucleótido o una secuencia de polinucleótido que se haya alterado a partir de su forma nativa (p. ej., por reordenamiento o deleción o sustitución de 1-100, con preferencia 20-50, con mayor preferencia menos de 10 nucleótidos). Dicha secuencia no nativa puede obtenerse por mutagénesis aleatoria, mutagénesis química, irradiación UV y similares.
Con preferencia, la mutación es el resultado de una mayor expresión de uno o más genes de la vía mevalonato que se traduce en un aumento de la producción de un carotenoide, por ejemplo de la zeaxantina. Los métodos para generar, explorar e identificar dichas células mutantes son bien conocidos en la técnica y se ilustran en los ejemplos que siguen. Los ejemplos de tales mutantes son el R114 o el R1534. Con preferencia, la célula mutante es el R114.
En este método, la secuencia de polinucleótido es la SEQ ID NO: 42 o los siguientes restos de la SEQ ID NO: 42: de 2622 a 3644, de 3641 a 4690, de 4687 a 5853, de 5834 a 6970, de 6970 a 7887, de 7880 a 8878. Estas secuencias pueden utilizarse en este método solas o como parte de un vector de expresión. Opcionalmente, estas secuencias pueden estar también unidas operativamente a secuencia(s) de control de expresión. En este método pueden utilizarse combinaciones de las secuencias de polinucleótidos aquí identificadas, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 177.
Los ejemplos de vectores de expresión que pueden elegirse para el uso en este método incluyen al pBBR-K-mev-op16-1, pBBRK-mev-op16-2, pDS-mvaA, pDS-idi, pDS-hcs, pDS-mvk, pDS-pmk, pDS-mvd, pDS-His-mvaA, pDS-His-idi, pDS-Hishcs, pDS-His-mvk, pDS-His-pmk, pDS-His-mvd, pBBR-K-Zea4, pBBR-K-Zea4-up, pBBR-K-Zea4-down, pBBR-K-PcrtEcrtE-3, pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBR-tK-PcrtE-pmk, pBBR-tK-PcrtE-mvd, pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3, pDS-His-phaA, pBBR-K-PcrtE-crtW, pBBR-K-PcrtE-crtWZ, pBBR-KPcrtE-crtZW y combinaciones de los mismos.
En este método, la secuencia de polinucleótido se introduce en la célula aplicando cualquier medio convencional. Los ejemplos de métodos idóneos para introducir una secuencia de polinucleótido en una célula incluyen la transformación, transducción, transfección, lipofección, electroporación [véase p. ej., Shigekawa y Dower, Biotechniques 6, 742-751, 1988], conjugación [véase p. ej., Koehler y Thorne, Journal of Bacteriology 169, 5771-5278, 1987] y biolística.
El uso de la conjugación para transferir una secuencia de polinucleótido, por ejemplo en forma de un vector de expresión, a bacterias receptoras es en general eficaz y es un procedimiento bien conocido (p. ej. US-5,985,623). En función de la cepa de bacterias, puede ser más frecuente el uso de la transformación de células competentes de DNA purificado.
Las técnicas ya conocidas de electroporación (tanto "in vitro" como "in vivo") funcionan aplicando un pulso breve de alto voltaje a electrodos posicionados alrededor de la región de tratamiento (p. ej. US-6,208,893). El campo eléctrico generado entre los electrodos provoca que la membrana de la célula se convierta temporalmente en porosa, en tal momento las moléculas del agente implantador penetran en las células. En las aplicaciones conocidas de electroporación, este campo eléctrico abarca un solo pulso de onda cuadrada del orden de 1000 V/cm de una duración aprox. de 100 ms. Este pulso puede generarse, por ejemplo, por aplicaciones ya conocidas del Electro Square Porator T820, fabricado por la BTX Division de Genetronics, Inc.
La biolística es un sistema para la introducción de polinucleótidos en una célula diana empleando técnicas de bombardeo de microproyectiles.
Una forma de ejecución ilustrativa de un método para la introducción de polinucleótidos en células diana por aceleración es el sistema llamado Biolistics Particle Delivery System, que puede utilizarse para propulsar partículas recubiertas con DNA o células a través de una retícula, por ejemplo una retícula de acero inoxidable o de Nytex, hacia la superficie del filtro cubierto con las células cultivadas diana. La retícula o pantalla dispersa las partículas, de modo que no impacten con las células diana formando agregados grandes. Se cree que dicha intervención de la pantalla entre el aparato proyector y las células bombardeadas reduce el tamaño de los agregados de los proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación reduciendo los daños causados a las células receptoras por los proyectiles que son demasiado grandes.
Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran con preferencia en filtros o en un medio de cultivo sólido. Como alternativa, pueden colocarse otras células diana en un medio de cultivo sólido. Se posicionan las células objeto de bombardeo a una distancia apropiada, por debajo de la placa receptora de los microproyectiles. Si se desea, pueden posicionar una o más pantallas entre el dispositivo acelerador y las células a bombardear. Con el uso de estas técnicas bien conocidas se pueden obtener hasta 1000 o incluso más focos de células que de modo transitorio expresan a un gen marcador. El número de células en foco que expresan al producto genético exógeno 48 horas después del bombardeo se sitúa con frecuencia entre 1 y 10 y en promedio entre 1 y 3.
En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones del cultivo previo al bombardeo y los parámetros del bombardeo para obtener el mayor número posible de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como los biológicos del bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son los que abarcan la manipulación del precipitado de polinucleótido/microproyectil o los que afectan el vuelo y la velocidad de los macro- o micro-proyectiles. Los factores biológicos incluyen todos los pasos efectuados en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células diana para facilitar el alivio después del trauma asociado con el bombardeo y también la naturaleza del DNA transformante, por ejemplo el DNA linealizado o los plásmidos superhelicoidales (supercoiled) intactos.
Se contempla, por tanto, que uno quiera ajustar varios parámetros del bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar totalmente las condiciones. Uno puede desear en especial ajustar los parámetros físicos, tales como la distancia de brecha, la distancia de vuelo, la distancia de tejido y la presión de helio. Uno puede también minimizar los factores de reducción del trauma (los TRF) modificando las condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células receptoras y que pueden influir además en las eficacia de transformación e integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación del tejido y el estadio de subcultivo o el ciclo celular de las células receptoras pueden ajustar para conseguir una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes rutinarios es bien conocida de los expertos a la luz de la presente descripción.
Los métodos de transformación mediada por partículas son bien conocidos de los técnicos en genética. p. ej. en US-5,015,580 se describe la transformación de granos de soja aplicando esta técnica.
Otra forma de ejecución de la invención es un método para la ingeniería genética de una bacteria para producir un compuesto isoprenoide. Tal bacteria se obtiene (a) cultivando una bacteria original en un medio en condiciones que permitan la expresión de un isoprenoide y seleccionando una bacteria mutante del medio de cultivo que produzca aprox. 1,1-1.000 veces más de isoprenoide que las bacterias originales; (b) introduciendo en la bacteria mutante un vector de expresión que contenga una secuencia de polinucleótido representado mediante la SEQ ID NO: 42 unido operativamente a una secuencia de control de expresión; y (c) seleccionando una bacteria que contenga el vector de expresión y produzca por lo menos aprox. 1,1 veces más de isoprenoide que la mutante del paso (a).
\newpage
En esta forma de ejecución, un compuesto isoprenoide significa un compuesto basados estructuralmente en las unidades isopentenil-difosfato (IPP) de la fórmula:
300
Tales compuestos incluyen a los hemiterpenos, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos (p. ej., fitosteroles, fitoestrógenos, fitoecdisteronas, estrógenos, fitoestrógenos), tetraterpenos (carotenoides) y politerpenos. Con preferencia, el isoprenoide es un carotenoide, por ejemplo, uno de los carotenoides identificados antes, en particular la zeaxantina.
La bacteria puede ser cualquier bacteria que sea capaz de producir un compuesto isoprenoide aplicando los procesos aquí descritos. Con preferencia, la bacteria es un Paracoccus, Flavobacterium, Agrobacterium, Alcaligenes, Erwinia, E. coli o B. subtilis. Con mayor preferencia todavía, la bacteria es un Paracoccus. Con preferencia, la bacteria original es el R-1506 o el R-1512 y la bacteria mutante es la R1534 o la R114, con preferencia la R114.
Se cultiva la bacteria en un medio y en condiciones optimizadas para la producción del isoprenoide. La elección del medio y condiciones de cultivo es bien conocida de los expertos en la materia. Los ensayos descritos en los ejemplos 1, 11 y 12 proporcionan métodos idóneos para determinar la presencia de ciertos carotenoides en un medio de cultivo. Optimizando las condiciones de cultivo y midiendo la producción del isoprenoide deseado, de este modo se pueden efectuar el cultivo y la elección de un mutante que cumplan los parámetros de producción específicos aquí descritos. De este modo se podrá seleccionar una bacteria mutante que produzca aprox. de 1,1 a 1.000 veces más isoprenoide que la bacteria original. Con preferencia, la bacteria mutante produce aprox. entre 1,5 y 500 veces más de isoprenoide que la bacteria original, por ejemplo, por lo menos aprox. 100 veces o por lo menos aprox. 10 veces más de isoprenoide que la bacteria original. Después se cultiva esta bacteria y se emplea en los pasos siguientes.
Después de seleccionar la bacteria mutante que produce el nivel deseado de un isoprenoide, se introduce un vector de expresión en la bacteria aplicando uno cualquiera de los métodos definidos antes o descritos en los ejemplos. En la célula mutante puede introducirse cualquiera de los vectores de expresión aquí definidos. Con preferencia, el vector de expresión contiene la SEQ ID NO: 42. Una vez se ha introducido el vector de expresión en las bacterias mutantes, se selecciona un transformante estable que produzca por lo menos aprox. 1,1 veces, por ejemplo aprox. de 5 a 20 veces más de isoprenoide que el mutante no transformante. Después se cultiva el transformante seleccionado en condiciones idóneas para la producción de isoprenoides y a continuación se aísla el isoprenoide de la célula o del medio de cultivo.
Otro paso de este método es la introducción de una mutación en la bacteria mutante que dé lugar a una mayor producción de compuesto isoprenoide por acción de la bacteria. La mutación puede seleccionarse por lo menos entre las siguientes: inactivación de la vía del polihidroxialcanoato (PHA), aumento de la expresión de la acetil-CoA-acetiltransferasa, aumento de la expresión de la FPP-sintasa, aumento de la expresión de una enzima en una vía biosintética de carotenoides y aumento de la expresión de una enzima para convertir el isopentenil-difosfato (IPP) en dimetilalil-difosfato (DMAPP).
La inactivación de la vía del PHA puede lograrse seleccionando una bacteria mutante que no exprese un polipéptido codificado por phaB (posiciones de nucleótido 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177) o desbaratando la expresión del gen phaB de tipo salvaje por recombinación homóloga empleando la SEQ ID NO: 177 o fragmentos de la misma.
En este método, el aumento de la expresión de la acetil-CoA-acetiltransferasa puede lograr introduciendo en la bacteria mutante un vector que contenga una secuencia de polinucleótido representada por la SEQ ID NO: 175 o las posiciones de nucleótido 1-1170 de la SEQ ID NO: 177 unidas operativamente a una secuencia de control de expresión. En este método, el aumento de la expresión de la FPP-sintasa puede lograrse introduciendo en la bacteria mutante un vector que contenga una secuencia de polinucleótido representada por los nucleótidos 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 unida operativamente a una secuencia de control de expresión. En este método, el aumento de expresión de un gen de carotenoide puede lograrse introduciendo en la bacteria mutante un vector que contenga una secuencia de polinucleótido que codifica a una o más enzimas de la vía biosintética del carotenoide, por ejemplo una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 180, 182 y 184 unida operativamente a una secuencia de control de expresión.
En este método, es preferido que el compuesto isoprenoide sea el isopentenil-difosfato (IPP). Es también preferido que el compuesto isoprenoide sea un carotenoide, por ejemplo el fitoeno, licopeno, \beta-caroteno, zeaxantina, cantaxantina, astaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona, adonirrubina o combinaciones de los mismos.
Se describe también un microorganismo del género Paracoccus, dicho microorganismo tiene las características siguientes: (a) una similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 12 de >97% aplicando una matriz de similitudes obtenida a partir del cálculo de homología con el programa informático GeneCompar v. 2.0 con una penalización de brecha de 0%; (b) una homología con el R-1512, R1534, R114 o R-1506 de >70% empleando una hibridación DNA:DNA a 81,5ºC; (c) un contenido de G+C de su DNA genómico que varía menos del 1% con respecto al contenido de G+C del DNA genómico del R114, R-1512, R1534, y R-1506; y (d) una huella dactilar DNA promedio que aglomera aprox. una similitud del 58% con respecto a las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 utilizando el procedimiento AFLP del ejemplo 2, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966).
Los métodos para determinar cada una de estas características se describen por completo en el ejemplo 2 y se ha contemplado que estos métodos se empleen de tal manera que permitan identificar fácilmente a los microorganismos que cumplen los requisitos anteriores. Es preferido que un microorganismo tenga cada una de las características recién definidas (es decir, a-d). Sin embargo, se describe también cualquier combinación de las características a-d, que proporcione una información suficiente para describir de modo taxonómicamente válido un microorganismo perteneciente a la misma especie que el R114, R-1512, R1534 y R-1506, exceptuando al Paracoccus sp. (MBIC3966).
Se describe también un microorganismo del género Paracoccus, dicho microorganismo tiene las características siguientes: (a) 18:1w7c que contiene por lo menos aprox. un 75% de los ácidos grasos totales de las membranas celulares; (b) la incapacidad de usar el adonitol, i-eritritol, gentiobiosa, \beta-metilglucósido, D-sorbitol, xilitol y ácido quínico como fuentes de carbono para el crecimiento; y (c) la capacidad de utilizar la L-asparagina y ácido L-aspártico como fuentes de carbono para el crecimiento, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966).
Los métodos para determinar cada una de estas características se describen también plenamente en el ejemplo 2 y se contempla que estos métodos se utilicen de modo que puedan identificarse fácilmente los microorganismos que cumplen los criterios anteriores. Es preferido que un microorganismo tenga cada una de las características recién descritas (es decir, a-c). Sin embargo, se describe también cualquier combinación de las características a-c, que proporcione información suficiente para describir de modo taxonómicamente válido a un microorganismo que pertenezca a la misma especie que el R114, R-1512, R1534 y R-1506, con la excepción del Paracoccus sp. (MBIC3966).
Se describe también un microorganismo del género Paracoccus, dicho microorganismo tiene las características siguientes: (a) capacidad para crecer a 40ºC; (b) capacidad para crecer en un medio que tiene un 8% de NaCl; (c) capacidad para crecer en un medio que tiene un pH de 9,1; y (d) pigmentación amarillo-anaranjada de la colonia, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966).
Se describen también plenamente los métodos de determinación de cada una de estas características en el ejemplo 2 y se contempla que estos métodos se utilicen de manera que puedan identificarse fácilmente los microorganismos que cumplen los criterios recién definidos. Es preferido que un microorganismo tenga cada una de las características recién descritas (es decir, a-d). Sin embargo se describe también cualquier combinación de las características a-d, que proporcione una información suficiente para describir de un modo taxonómicamente válido un microorganismo perteneciente a la misma especie que el R114, R-1512, R1534 y R-1506, con excepción del Paracoccus sp. (MBIC3966).
Un microorganismo puede identificarse también empleando cualquier combinación de las 11 características recién definidas, que proporcione una información suficiente para describir de modo taxonómicamente válido un microorganismo perteneciente a la misma especie que el R114, R-1512, R1534 y R-1506, con excepción del Paracoccus sp. (MBIC3966).
Con arreglo a lo descrito anteriormente, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 340 de la SEQ ID NO: 43, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 68-97 de la SEQ ID NO: 43;
(b) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 349 de la SEQ ID NO: 45, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 1-30 de la SEQ ID NO: 45;
(c) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 388 de la SEQ ID NO: 47, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 269-298 de la SEQ ID NO: 47;
(d) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 378 de la SEQ ID NO: 49, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 109-138 de la SEQ ID NO: 49;
(e) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 305 de la SEQ ID NO: 51, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 198-227 de la SEQ ID NO: 51;
(f) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 332 de la SEQ ID NO: 53, en particular una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 81-110 de la SEQ ID NO: 53;
(g) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido elegido entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53, el fragmento que tiene la actividad de hidroximetilglutaril-CoA-reductasa (HMG-CoA-reductasa), isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa o difosfomevalonato-descarboxilasa;
(h) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 ó 53. Se describen también:
(1) un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 287 de la SEQ ID NO: 159;
(b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 159;
(c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEQ ID NO: 159, el fragmento que tiene la actividad de farnesil-difosfato-sintasa (FPP-sintasa);
(d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene la actividad de FPP-sintasa; y
(e) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 159.
(2) un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 142 de la SEQ ID NO: 160;
(b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 160;
(c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEQ ID NO: 160, el fragmento que tiene la actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa (DXPS);
(d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene la actividad de DXPS;
(e) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 160.
(3) un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 390 de la SEQ ID NO: 178;
(b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 178;
(c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido de la SEQ ID NO: 178, el fragmento que tiene la actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa;
(d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos que cubren las posiciones 1-1170 de la SEQ ID NO: 177 o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene la actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa; y
(e) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 178.
(4) un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 240 de la SEQ ID NO: 179;
(b) por lo menos 30 restos aminoácido contiguos de la SEQ ID NO: 179;
(c) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido de la SEQ ID NO: 179, el fragmento que tiene la actividad de acetoacetil-CoA-reductasa;
(d) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a una sonda de hibridación que contiene por lo menos 30 nucleótidos consecutivos que cubren las posiciones 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177 o un complemento de los mismos, dicho polipéptido tiene la actividad de acetoacetil-CoA-reductasa; y
(e) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 179.
(5) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo formado por la SEQ ID NO: 42, variantes de la SEQ ID NO: 42 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por la hidroximetilglutaril-CoA-reductasa (HMG-CoA-reductasa), isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa y las secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 42, o el complemento de la SEQ ID NO: 42, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por HMG-CoA-reductasa, isopentenil-difosfato-isomerasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa; en particular
(a) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por los nucleótidos de 2622 a 3644 de la SEQ ID NO: 42, fragmentos de la misma que codifican a un polipéptido que tiene actividad de HMG-CoA-reductasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 2622 a 3644 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de HMG-CoA-reductasa, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 2622 a 3644 de la SEQ ID NO: 42;
(b) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42, variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de isopentenil-difosfato-isomerasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de isopentenil-difosfato-isomerasa, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42;
(c) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por los nucleótidos de 4687 a 5853 de la SEQ ID NO: 42, las variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de HMG-CoA-sintasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 4687 a 5853 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de HMG-CoA-sintasa, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42;
(d) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por los nucleótidos de 5834 a 6970 de la SEQ ID NO: 42, variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de mevalonato-quinasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 5834 a 6970 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de mevalonato-quinasa, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42;
(e) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por los nucleótidos de 6970 a 7887 de la SEQ ID NO: 42, variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de fosfomevalonato-quinasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 6970 a 7887 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de los mismos, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de fosfomevalonato-quinasa, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42; o
(f) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por los nucleótidos de 7880 a 8878 de la SEQ ID NO: 42, variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de difosfomevalonato-descarboxilasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren los restos de 7880 a 8878 de la SEQ ID NO: 42, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de difosfomevalonato-descarboxilasa, más en particular un polinucleótido aislado que consta de los nucleótidos de 7880 a 8878 de la SEQ ID NO: 42, más en particular una secuencia de polinucleótido que consta de los nucleótidos de 3641 a 4690 de la SEQ ID NO: 42;
(6) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 157, variantes de la SEQ ID NO: 157 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 157 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de farnesil-difosfato (FPP) sintasa, actividad de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o un polipéptido que tiene la actividad de XseB, y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de la SEQ ID NO: 157, dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por la actividad de FPP-sintasa, actividad de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa y la actividad de XseB, en particular
(a) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por una secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la misma que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157 que codifican a un polipéptido que tiene la función de XseB, y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 59-292 de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de tal secuencia, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene la función de XseB, más en particular un polinucleótido aislado que consta de los nucleótidos de 59 a 292 de la SEQ ID NO: 157;
(b) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 que codifica una actividad de FPP-sintasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 295-1158 de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de tal secuencia, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de FPP-sintasa, más en particular un polinucleótido aislado que consta de los nucleótidos de 295 a 1158 de la SEQ ID NO: 157;
(c) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157, variantes de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157, que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la secuencia de nucleótidos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren las posiciones 1185-1610 de la SEQ ID NO: 157, o el complemento de tal secuencia, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa, más en particular un polinucleótido aislado que consta de nucleótidos de 1185 a 1610 de la SEQ ID NO: 157;
(7) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifican a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por la acetil-CoA-acetiltransferasa y acetoacetil-CoA-reductasa, y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 177, o el complemento de la SEQ ID NO: 177, dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por acetil-CoA-acetiltransferasa y acetoacetil-CoA-reductasa, en particular
(a) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por nucleótidos de 1 a 1170 de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren restos de 1 a 1170 de la SEQ ID NO: 177, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa, más en particular una secuencia aislada de polinucleótido que consta de los nucleótidos 1-1170 de la SEQ ID NO: 177;
(b) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177, variantes de la SEQ ID NO: 177 que contienen una o más sustituciones con arreglo a la tabla de uso de codones de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14), fragmentos de la SEQ ID NO: 177 que codifican a un polipéptido que tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa y secuencias de polinucleótidos que, en condiciones restrictivas, hibridan a una sonda de hibridación, cuya secuencia de nucleótidos consta por lo menos de 30 nucleótidos contiguos que cubren restos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177, o un complemento de la misma, dicho polinucleótido codifica a un polipéptido que tiene actividad de acetoacetil-CoA-reductasa, más en particular una secuencia aislada de polinucleótido que consta de los nucleótidos 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177;
(8) una secuencia aislada de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 177 y combinaciones de las mismas;
(9) un vector de expresión que contiene la secuencia de polinucleótido de uno cualquiera de (6) (a) a (6) (f), de (7) (a) a (7) (c), de (8) (a), (8) (b) o (9), en particular un vector de expresión, cuya secuencia de polinucleótido está unida operativamente a una secuencia de control de expresión, p. ej. un vector de expresión que contiene además una secuencia de polinucleótido que codifica a una enzima de la vía biosintética de los carotenoides, más en particular un vector de expresión, cuya secuencia de polinucleótido se elige entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184 y combinaciones de las mismas, que están unidas operativamente a una secuencia de control de expresión;
(10) un vector de expresión elegido entre el grupo formado por el pBBR-K-mev-op16-1, pBBR-K-mev-op16-2, pDS-mvaA, pDS-idi, pDS-hcs, pDS-mvk, pDS-pmk, pDS-mvd, pDS-His-mvaA, pDS-His-idi, pDS-His-hcs, pDSHis-mvk, pDS-His-pmk, pDS-His-mvd, pBBR-K-Zea4, pBBR-K-Zea4-up, pBBR-K-Zea4-down, pBBR-K-PcrtEcrtE-3, pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBR-tK-PcrtEpmk, pBBR-tK-PcrtE-mvd, pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3, pDS-His-phaA, pBBR-K-PcrtE-crtW, pBBR-K-PcrtEcrtWZ, pBBR-K-PcrtE-crtZW, y combinaciones de los mismos, en particular
(a) un vector de expresión elegido entre el grupo formado por pBBR-K-mev-op16-1 y pBBR-K-mevop16-2,
(b) un vector de expresión elegido entre el grupo formado por pBBR-K-Zea4, pBBR-K-Zea4-up y pBBRK-Zea4-down;
(c) un vector de expresión elegido entre el grupo formado por pBBR-K-PcrtE-crtE-3, pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBR-tK-PcrtE-pmk, pBBR-tK-PcrtE-mvd y combinaciones de los mismos;
(d) un vector de expresión que es el pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3;
(e) un vector de expresión que es el pDS-His-phaA; o
(f) un vector de expresión elegido entre el grupo formado por pBBR-K-PcrtE-crtW, pBBR-K-PcrtE-crtWZ y pBBR-K-PcrtE-crtZW;
(11) una célula cultivada que contiene la secuencia de polinucleótido de uno cualquiera de (6) (a) a (f), de (7) (a) a (c), de (8) (a), (8) (b) o (9), o un vector de expresión de (10) o (11), o una progenie de la célula, dicha célula expresa un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido, en particular una célula que se caracteriza además por una propiedad elegida entre
(a) que contiene además una secuencia de polinucleótido que codifica a una enzima de la vía biosintética de los carotenoides, más en particular una célula cultivada, cuya secuencia de polinucleótido que codifica la enzima de la vía biosintética de los carotenoides se elige entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 180, 182 y 184, o una progenie de la célula, dicha célula expresa polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos, y
(b) que es un miembro de un grupo formado por la levadura, los hongos, las bacterias y las algas, en particular a bacteria elegida entre el grupo formado por el Paracoccus, Flavobacterium, Agrobacterium, Alcaligenes, Erwinia, E. coli y B. subtilis, más en particular Paracoccus, más en particular Paracoccus elegido entre el grupo formado por el R-1506, R-1512, R1534 y R114;
(12) un método de producir un carotenoide que consiste en cultivar una célula de (12) en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido y aislar el carotenoide de la célula o del medio en el que se halla de la célula;
(13) un método de obtener una célula productora de carotenoides, que consiste en:
(a) introducir en una célula una secuencia de polinucleótido que codifica a una enzima de la vía mevalonato, dicha enzima se expresa en la célula; y
(b) elegir una célula que contenga la secuencia de polinucleótido del paso (a) que produce un carotenoide a un nivel que es aprox. 1,1-1.000 veces el nivel del carotenoide producido por la célula antes de la introducción de la secuencia de polinucleótido, en particular un método elegido entre los métodos caracterizados por una de las propiedades siguientes:
\newpage
(i) el paso de la selección consiste en elegir una célula que contenga la secuencia de polinucleótido del paso (a) que produce un carotenoide a un nivel que es aprox. 1,5-500 veces, en particular aprox. 100 veces, o por lo menos aprox. 10 veces, el nivel del carotenoide producido por la célula antes de la introducción de la secuencia de polinucleótido;
(ii) la célula que produce aprox. entre 1 mg/l y 10 g/l de un carotenoide.
(iii) la célula elegida entre el grupo formado por una levadura, un hongo, una bacteria y una alga, en particular la elegida entre el grupo formado por el Paracoccus, Flavobacterium, Agrobacterium, Alcaligenes, Erwinia, E coli, y B. subtilis, más en particular el Paracoccus;
(iv) la célula del paso (a) que es una célula mutante, en particular la elegida entre el grupo formado por el R114 y el R1534, en particular la célula mutante que produce aprox. 1,1-1.000 veces, en particular aprox. 1,5-500 veces, más en particular por lo menos aprox. 100 veces más o por lo menos aprox. 10 veces más que el nivel de carotenoide producido por la célula original no mutante;
(v) la secuencia de polinucleótido elegida entre las secuencias de polinucleótidos de (6) (a) a (f), de (7) (a) a (c), (8) (a), (8) (b) y (9), en particular, cuya secuencia de polinucleótido está unida operativamente a una secuencia de control de expresión;
(vi) la secuencia de polinucleótido que es un vector de expresión de (10) o (11);
(vii) el paso de la introducción se elige entre el grupo formado por la transformación, transducción, transfección, lipofección, electroporación, conjugación y biolística.
(viii) el carotenoide se elige entre el grupo formado por el fitoeno, licopeno, \beta-caroteno, zeaxantina, cantaxantina, astaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona, adonirrubina y combinaciones de los mismos, en particular el carotenoide es la zeaxantina;
(14) un método para la ingeniería genética de una bacteria para que produzca un compuesto isoprenoide, que consiste en:
(a) cultivar una bacteria original en un medio, en condiciones, que permitan la expresión de un compuesto isoprenoide, y elegir una bacteria mutante del medio de cultivo, que produzca aprox. 1,1-1,000 veces más de un compuesto isoprenoide que la bacteria original;
(b) introducir en la bacteria mutante un vector de expresión que contenga una secuencia de polinucleótido representada en la SEQ ID NO: 42 unida operativamente a una secuencia de control de expresión; y
(c) elegir una bacteria que contenga el vector de expresión y produzca por lo menos aprox. 1,1 veces más de un compuesto isoprenoide que la mutante del paso (a), en particular
(i) un método que consiste además en introducir una mutación en la bacteria mutante, más en particular un método, en el que la mutación provoca un efecto elegido entre por lo menos uno de los siguientes: inactivar la vía del polihidroxialcanoato (PHA), aumentar la expresión de la acetil-CoA-acetiltransferasa, aumentar la expresión de la farnesil-difosfato (FPP) sintasa, aumentar la expresión de una enzima de la vía de síntesis de un carotenoide, aumentar la expresión de una enzima para convertir el isopentenil-difosfato (IPP) en el dimetilalil-difosfato (DMAPP),
más en particular un método, en el que la inactivación de la vía del PHA consiste en seleccionar una bacteria mutante que no exprese un polipéptido codificado por el phaB (posiciones de nucleótido 1258-1980 de la SEQ ID NO: 177) o desbaratar la expresión del gen phaB de tipo salvaje por recombinación homóloga empleando la SEQ ID NO: 177 o un fragmento de la misma, o
un método, en el que el aumento de la expresión de la acetil-CoA-acetiltransferasa consiste en introducir en la bacteria mutante un vector que contiene una secuencia de polinucleótido representada por la SEQ ID NO: 175 o las posiciones de nucleótido 1-1170 de la SEQ ID NO: 177 unidas operativamente a una secuencia de control de expresión, o
un método, en el que el aumento de la expresión de la FPP-sintasa consiste en introducir en la bacteria mutante un vector que contiene una secuencia de polinucleótido representada por los nucleótidos 295-1158 de la SEQ ID NO: 157 unida operativamente a una secuencia de control de expresión, o
un método, en el que el aumento de expresión de una enzima en una vía de síntesis de carotenoide consiste en introducir en la bacteria mutante un vector que contenga una secuencia de polinucleótido elegida entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 180, 182 y 184, unida operativamente a una secuencia de control de expresión;
(b) un método, en el que el isoprenoide es el isopentenil-difosfato (IPP).
\newpage
(c) un método, en el que el isoprenoide es un carotenoide, en particular un método, en el que el carotenoide se elige entre el grupo formado por el fitoeno, licopeno, \beta-caroteno, zeaxantina, cantaxantina, astaxantina, adonixantina, criptoxantina, equinenona, adonirrubina y combinaciones de los mismos;
(d) un método, en el que la bacteria original es un Paracoccus, en particular el R-1512 o R-1506, o R1534 o R114, en particular en el que el mutante es el R114;
(15) un microorganismo del género Paracoccus, dicho microorganismo tiene las características siguientes:
(i) una similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 12 de >97% aplicando una matriz de similitud obtenida por cálculo de homología empleando el programa informático GeneCompar v. 2.0 con una penalización de brecha de 0%;
una homología con la cepa R-1512, R1534, R114 o R-1506 de >70% empleando una hibridación DNA:DNA a 81,5ºC;
un contenido de G+C de su DNA genómico que varía menos del 1% del contenido de G+C del DNA genómico del R114, R-1512, R1534 y R-1506; y
una huella dactilar de DNA promedio que aglomera aprox. un 58% de similitud con las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 empleando el procedimiento AFLP del ejemplo 2, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966);
(ii) 18:1w7c que consta por lo menos aprox. del 75% del total de ácidos grasos de las membranas celulares;
la incapacidad de uso del adonitol, i-eritritol, gentiobiosa, \beta-metilglucósido, D-sorbitol, xilitol y ácido quínico como fuentes de carbono para el crecimiento; y
la capacidad de emplear la L-asparagina y ácido L-aspártico como fuentes de carbono para el crecimiento, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966); o
(iii) la capacidad de crecer a 40ºC;
la capacidad de crecer en un medio que tiene un 8% de NaCl;
la capacidad de crecer en un medio que tiene un pH de 9,1; y una pigmentación de colonia de color amarillo-anaranjado, con la condición de que el microorganismo no sea el Paracoccus sp. (MBIC3966).
Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar mejor ciertos aspectos de la presente invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y en modo alguno se pretende limitar con ellos el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1 Métodos analíticos y bioquímicos (a) Análisis de carotenoides
Preparación de la muestra. En primer lugar se prepara una mezcla 1:1 de los disolventes sulfóxido de dimetilo (DMSO) y tetrahidrofurano (THF). Se estabiliza esta mezcla de disolventes con la adición de hidroxitolueno butilado (BHT, 0,5 g/l de la mezcla de disolventes). Se añaden cuatro mililitros de la mezcla DMSO/THF estabilizada a 0,4 ml de cultivo bacteriano en un tubo desechable de polipropileno para centrífuga de 15 ml (que da un factor final de dilución de 1/11). Se tapan los tubos y se mezclan en un mezclador de vórtice durante 10 segundos cada uno. Se colocan las muestras en un agitador de tipo Brinkmann Vibramix durante 20 minutos. Se centrifugan los tubos a temperatura ambiente durante 4 minutos a 4000 rpm y se transfieren partes alícuotas del líquido sobrenadantes transparente de color amarillo/anaranjado a viales de vidrio marrón para el análisis por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC).
HPLC. Se desarrolla un método HPLC en fase inversa para la determinación simultánea de la astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, \beta-caroteno y licopeno. Este método es capaz de separar también los principales isómeros cis de la zeaxantina. Se realiza la cromatografía empleando un sistema Agilent 1100 HPLC equipado con un sistema automático termostatado de introducción de muestras y un detector de matriz de diodos. Los parámetros del método son los siguientes:
columna: YMC Carotenoid C30, tamaño de partícula: 5 micras, 250*4,6 mm de diámetro interior, acero (YMC, artículo nº CT99S052546WT)
columna de guarda: cartucho Pelliguard LC-18, 20 mm (SUPELCO, artículo nº 59654)
fase móvil: gradiente de metanol (MeOH)/éter de metilo y tert-butilo (TBME)
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duración de la cromatografía: 28 min; presión típica de columna: 90 bar en el inicio; caudal: 1,0 ml/min; detección: UV a 450 nm; volumen inyectado: 10 ml; temperatura de columna: 15ºC.
Reactivos. El metanol y el TBME son de calidad HPLC y se adquieren a las empresas EM Science y J.T. Baker, respectivamente. Se adquiere el DMSO (omnisolve) a la empresa EM Science. El THF (disolvente de HPLC) es de Burdick and Jackson.
Cálculos. Se realizan los análisis cuantitativos con un calibrado de dos niveles empleando patrones externos (facilitados por Hoffmann-La Roche, Basilea, Suiza). Los cálculos se basan en las áreas de los picos.
Selectividad. La selectividad del método se verifica inyectando soluciones patrón de los compuestos carotenoides de referencia importantes. Se separan por completo los compuestos deseados (carotenoides todo-trans) y no presentan interferencias.
Pueden eluirse simultáneamente algunos isómeros cis de menor importancia, aunque estos isómeros potencialmente interferentes son raros y no necesitan considerarse en los análisis rutinarios. Los tiempos de retención de los compuestos se recogen en la tabla 1.
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TABLA 1 Tiempos de retención de carotenoides
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Linealidad. Se disuelven 25 miligramos de zeaxantina todo-trans en 50 ml de una mezcla DMSO/THF (obteniéndose una concentración final de zeaxantina de 500 mg/ml). Se prepara una serie de diluciones (concentraciones finales de zeaxantina de 250,100, 50,10, 5, 1, y 0,1 mg/ml) y se analizan por el método HPLC recién descrito. Se encuentra un intervalo lineal de 0,1 mg/ml a 250 mg/ml. El coeficiente de correlación es de 0,9998.
Límite de detección. El límite inferior de detección de la zeaxantina en este método se determina que es igual a 60 mg/l. Un mayor volumen de inyección y la optimización de los parámetros de integración permiten bajar el límite de detección hasta aproximadamente 5 mg/l.
Reproducibilidad. El tiempo de retención de la zeaxantina todo-trans es muy estable (desviación estándar relativa (RSD) = 0,2%). La reproducibilidad de las áreas de los picos, basada en diez análisis repetitivos de la misma muestra de cultivo, se determina que es igual al 0,17% de RSD para la zeaxantina todo-trans y un 1,0% para la criptoxantina.
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(b) Preparación de los extractos brutos y métodos de ensayo enzimático
Preparación de los extractos brutos. Los extractos brutos de Paracoccus y E. coli se preparan resuspendiendo los culotes celulares en 1 ml de tampón de extracción (tampón empleado en función de la enzima que se analiza - las composiciones se especifican junto con cada procedimiento de ensayo enzimático que se describe a continuación). Se introducen las suspensiones celulares en un vial de plástico de 2 ml y se someten a disgregación en agitación con esferillas de vidrio empleando un aparato Mini Bead Beater 8 (Biospec Products, Bartlesville, OK, EE.UU.). La disgregación se realiza a 4ºC utilizando en un ajuste de agitación medio. Se centrifugan las preparaciones disgregadas a 21.000 x g a 4ºC durante 20 minutos para sedimentar los escombros celulares y los líquidos sobrenadantes se emplean directamente para los ensayos enzimáticos.
Determinaciones de proteínas. Las concentraciones de proteína en los extractos brutos se determinan por el método de Bradford [Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976] empleando el reactivo de ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Se emplea albúmina de suero bovino como proteína de referencia para la construcción de las curvas patrón.
Ensayos de acetil-CoA-acetiltransferasa. Se preparan los extractos brutos en tampón 150 mM de EPPS (ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[3-propanosulfónico]) de pH 8,0. Se efectúan los ensayos en la dirección tiólisis con arreglo al método descrito por Slater y col. [J. Bacteriol. 180, 1979-1987, 1998]. Este ensayo mide espectrofotométricamente a 304 nm la desaparición de la acetoacetil-CoA. Las mezclas reaccionantes contienen tampón 150 mM EPPS (pH 8,0), 50 mM MgCl_{2}, 100 mM CoA, 40 mM acetoacetil-CoA y extracto en bruto. Se llevan a cabo las reacciones a 30ºC y se inician con la adición del extracto en bruto. Se hace el seguimiento de la desaparición de la acetoacetil-CoA a 304 nm empleando un lector de placas del tipo SpectraMAX Plus (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, EE.UU.) y una placa de microvaloración de cuarzo (puede utilizarse también cualquier espectrofotómetro estándar). Se calcula la actividad (expresada en U/mg de proteína) empleando una curva patrón construida con acetoacetil-CoA (1 unidad de actividad = 1 mmol de acetoacetil-CoA consumido/min). El límite inferior de detección de la actividad de la acetil-CoA-acetiltransferasa es de 0,006 U/mg.
Ensayos de la HMG-CoA-sintasa. Se ensaya la HMG-CoA-sintasa con arreglo al método de Honda y col. [Hepatology 27, 154-159, 1998]. En este ensayo, la formación de HMG-CoA a partir de la acetil-CoA y acetoacetil-CoA se mide directamente separando el producto de reacción y los sustratos por HPLC. Los extractos brutos se preparan en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Las mezclas reaccionantes (0,1 ml) contienen tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 20 mM MgCl_{2}, 0,1 mM acetoacetil-CoA, 0,8 mM acetil-CoA y extracto en bruto. Se preincuban las reacciones a 30ºC durante 2 minutos antes de la adición del extracto en bruto. Después de 5 minutos de reacción a 30ºC, se interrumpen las reacciones por adición de 0,2 ml de 200 mM fosfato de tetra-butil-amonio (TBAP, disuelto en metanol-agua (3:2, el pH final es de 5,5) y que contienen 0,2 mM propionil-CoA como patrón interno de recuperación). Después se centrifuga la mezcla a 4ºC durante 3 minutos a 21.000 x g y a continuación se guarda en hielo hasta que se analiza por HPLC en fase inversa con par iónico. Se separan la HMG-CoA y la propionil-CoA de la acetil-CoA y acetoacetil-CoA utilizando una columna Nova-Pak C18 (3,9 x 150 mm, Waters Corporation, Milford, MA, EE.UU.). El volumen inyectado es de 20 ml, la fase móvil es 50 mM TBAP disuelto en metanol-agua (1:1, el pH final es de 5,5) y el caudal es de 1,0 ml/min. Se detectan la HMG-CoA y la propionil-CoA por absorbancia a 254 nm. Se cuantifica la HMG-CoA producida en la reacción por comparación con una curva patrón creada empleando la HMG-CoA auténtica. Se define la actividad en U/mg de proteína. Una unidad de actividad = 1 nmol de HMG-CoA producido/min. El límite inferior de detección de la HMG-CoA-sintasa es aprox. de 1 U/mg.
Ensayos de la HMG-CoA-reductasa. Se preparan los extractos brutos en tampón fosfato potásico 25 mM (pH 7,2) que contiene 50 mM KCI, 1 mM EDTA y un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU., nº de catálogo = P-2714). Los ensayos se realizan con arreglo al método de Takahashi y col. [J. Bacteriol. 181, 1256-1263, 1999]. En este ensayo se mide espectrofotométricamente a 340 nm la oxidación de NADPH dependiente de la HMG-CoA. Las mezclas reaccionantes contienen tampón fosfato potásico 25 mM (pH 7,2), 50 mM KCI, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, 0,3 mM NADPH, 0,3 mM R,S-HMG-CoA y extracto en bruto. Las reacciones se llevan a cabo a 30ºC y se inician con la adición de HMG-CoA. Se hace el seguimiento de la oxidación de NADPH dependiente de la HMG-CoA a 340 nm empleando un lector de placas de tipo SpectraMAX Plus (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, EE.UU.) y una placa de microvaloración de cuarzo (puede utilizarse cualquier espectrofotómetro estándar).
Se calcula la actividad (expresada en U/mg de proteína) empleando una curva estándar construida con NADPH (1 unidad de actividad = 1 mmol de NADPH oxidado/min). El límite inferior de detección de la actividad de la HMG-CoA-reductasa es de 0,03 U/mg.
Ensayos de mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y mevalonato-difosfato-descarboxilasa. La preparación de los sustratos y los procedimientos de ensayo de la mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y mevalonato-difosfato-descarboxilasa se ha descrito con detalle en Popják [Methods Enzymol. 15, 393-425, 1969]. Para todos los ensayos, una unidad de actividad enzimática se define como 1 mmol de producto formado/minuto. Además de estos ensayos espectrofotométricos y radiocromatográficos, pueden utilizar métodos alternativos, por ejemplo empleando la separación HPLC de sustratos de reacción y productos. El límite inferior de detección de la mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y mevalonato-difosfato-descarboxilasa se sitúa por ejemplo en aprox. 0,001 U/mg de proteína.
Ensayos de isomerasa IPP. Se preparan los extractos en bruto en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Los ensayos se realizan empleando el método de Spurgeon y col. [Arch. Biochem. Biophys. 230, 445-454, 1984]. Este ensayo se basa en la diferencia en la labilidad en medio ácido del IPP y DMAPP. Las mezclas reaccionantes (0,1 ml de volumen final) contienen tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 2 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl_{2}, 20 mM IPP-[1-C^{14}] y extracto en bruto. Se llevan a cabo las reacciones a 30ºC durante 15 minutos y se terminan con la adición de 0,3 ml de una mezcla de HCl concentrado:metanol (4:1) y con una incubación adicional a 37ºC durante 20 min. Se añade hexano (0,9 ml) se mezclan los contenidos de los tubos (4 veces durante 10 segundos empleando un mezclador de vórtice).
Después de la centrifugación (21.000 x g, 5 minutos), se transfieren 0,6 ml de la fase de hexano a un vial de centelleo, se añade líquido de centelleo se hace el recuento de la radioactividad. Se expresa la actividad en U/mg de proteína. Una unidad de actividad = 1 pmol de IPP-[1-C^{14}] incorporado a producto lábiles en medio ácido/min. El límite inferior de detección de la actividad de isomerasa IPP es de 1 U/mg.
Ensayos de FPP-sintasa. Se preparan los extractos brutos en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). El procedimiento de ensayo de la FPP-sintasa es similar al ensayo de la isomerasa IPP recién descrito, basándose en la diferencia de labilidad en medio ácido de la IPP y FPP (Spurgeon y col., lugar citado). Las mezclas reaccionantes (0,1 ml de volumen final) contienen tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), 2 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl_{2}, 20 mM IPP-[1-C^{14}], 25 mM GPP (geranil-pirofosfato) y extracto en bruto. Se llevan a cabo las reacciones a 30ºC durante 15 minutos y se terminan con la adición de 0,3 ml de una mezcla de HCl concentrado:metanol (4:1) y una incubación adicional a 37ºC durante 20 minutos. Se añade hexano (0,9 ml) y se mezclan los tubos (4x, 10 segundos en un mezclador de vórtice). Después de la centrifugación (21.000 x g, 5 minutos), se transfieren 0,6 ml de la fase hexano a un vial de centelleo, se añade líquido de centelleo y se determina la radiactividad. Las unidades de actividad enzimática y el límite inferior de detección son los mismos que se han definido antes para la isomerasa IPP. En los casos en los que una gran actividad de isomerasa IPP interfiera con la medición de la actividad de la FPP-sintasa, puede preincubarse el extracto en bruto durante 5 minutos en presencia de yodoacetamida 5 mM para inhibir la actividad de la isomerasa IPP.
Ensayos de la GGPP-sintasa. Se preparan los extractos brutos en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contiene 2 mM ditiotreitol. Se ensaya la GGPP-sintasa con arreglo al procedimiento de Kuzuguchi y col. [J. Biol. Chem. 274, 5888-5894, 1999]. Este ensayo se basa en el mismo principio que se ha descrito antes para la PP-sintasa. Las mezclas reaccionantes (0,1 ml de volumen final) contienen tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), 2 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl_{2}, 20 mM IPP-[1-C^{14}], 25 mM FPP y extracto en bruto. Todas las condiciones de reacción y el posterior tratamiento de las muestras para el recuento por centelleo son idénticas a las descritas antes para la FPP-sintasa. El tratamiento del extracto con yodoacetamida para inhibir la actividad de la isomerasa IPP actividad puede realizarse también del modo antes descrito. Las unidades de actividad enzimática y el límite inferior de detección son los mismos que se han definido antes para la isomerasa IPP.
Ensayos de la acetoacetil-CoA-reductasa. Se preparan los extractos brutos en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contiene 50 mM KCl y 5 mM ditiotreitol. Se ensaya la acetoacetil-CoA-reductasa con arreglo al procedimiento de Chohan y Copeland [Appl. Environ. Microbiol. 64, 2859-2863, 1998]. Este ensayo mide espectrofotométricamente a 340 nm la oxidación del NADPH dependiente de la acetoacetil-CoA. Las mezclas reaccionantes (1 ml) contienen tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), 15 mM MgCl_{2}, 250 mM NADPH y 100 mM acetoacetil-CoA. Se realizan las reacciones en una cubeta de cuarzo a 30ºC y se inician con la adición de acetoacetil-CoA. Se calcula la actividad (expresada en U/mg proteína) empleando una curva estándar construida con NADPH (1 unidad de actividad = 1 mmol NADPH oxidada/min). El límite inferior de detección de la actividad de la acetoacetil-CoA-reductasa es de aprox. 0,01 U/mg.
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Ejemplo 2 Reclasificación taxonómica del Flavobacterium sp. en Paracoccus
En este ejemplo se describe la reclasificación taxonómica de la bacteria productora de zeaxantina, anteriormente llamada cepa R-1512 de Flavobacterium sp. (ATCC 21588) en la cepa R-1512 del Paracoccus sp. (ATCC 21588). Las Colecciones Belgas Coordinadas de Microorganismos/Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Gante (BCCM^{TM}/LMG) han realizado un análisis genómico y bioquímico-fisiológico exhaustivo empleando métodos del estado de la técnica actualmente aceptados como estándar científico para la clasificación bacteriana. Aparte de la cepa R-1512 del Paracoccus sp. se incluyen también en el estudio otras bacterias diversas pertenecientes al género Paracoccus (resumidas en la tabla 2).
TABLA 2 Bacterias empleadas para el estudio taxonómico
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Las cepas R1534 y R114 son mutantes derivadas de la cepa R-1512 por mutagénesis clásica y exploración en busca de una mayor producción de zeaxantina. La exploración primaria se realiza seleccionando las colonias que producen la mayor intensidad de color. Se efectúa una exploración secundaria en medio de cultivo líquido por métodos HPLC según el ejemplo 1. La cepa R-1506 es un aislado independiente obtenido de la misma exploración inicial de los microorganismos del entorno que generan la cepa R-1512. Se identifican las cepas MBIC3024, MBIC3966, MBIC4017 y MBIC4020 como miembros del género Paracoccus por la secuencia de nucleótidos de sus genes 16S rDNA (las secuencias de DNA se han depositado en la base de datos pública EMBL, ver tabla 5). El Paracoccus marcusii DSM 11574^{T} y el Paracoccus carotinifaciens E-396^{T} son cepas tipo descritas recientemente de bacterias productoras de carotenoides [Harker y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 543-548, 1998; Tsubokura y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 277-282, 1999]. El Paracoccus solventivorans DSM 6637^{T} se incluye como cepa de "control", es un miembro del género Paracoccus pero poco afín con las demás bacterias empleadas.
Los ensayos preliminares permiten llegar a las conclusiones siguientes. Cada uno de los métodos aquí definidos tiene una capacidad bien reconocida para definir la afinidad taxonómica o el grado relativo de similitud entre los organismos. Los métodos y su utilización para delinear tasas bacterianas se describen y se comparan con detalle en Van Damme y col., Microbiological Reviews 60, 407-438, 1996 y Janssen y col., Microbiology 142, 1881-1893, 1996.
(1) Los análisis de ácidos grasos de las membranas celulares de cepas R1534 y R114 indican que las dos cepas son muy similares e indican una afinidad taxonómica de estas cepas con el Paracoccus denitrificans y el Rhodobacter capsulatus.
(2) La electroforesis unidimensional a través de gel de las proteínas celulares indica una gran similitud (es decir, una afinidad a nivel intraespecie) entre el R1534 y el R114, pero los perfiles no justifican la inclusión de estas cepas dentro del R. capsulatus ni dentro P. denitrificans.
(3) La hibridación DNA:DNA entre cepa R1534 y R. capsulatus LMG2962^{T} y P. denitrificans LMG4218^{T} confirma que la cepa R1534 no es R. capsulatus ni P. denitrificans.
(4) La secuenciación de los genes 16S rDNA de las cepas R1534 y R114 indica que estos organismos pertenecen al género Paracoccus, pero que representan una nueva especie. El mayor grado de similitud de secuencias se observa con el gen de 16S rDNA de las cepas MBIC3966, MBIC4020 y MBIC3024 del Paracoccus sp.
(5) La huella dactilar del DNA de las cepas R1534 y R-1512 empleando el polimorfismo amplificado de longitud de fragmento (AFLP^{TM}) indica una gran similitud global del DNA genómico de las dos cepas, lo cual indica una afinidad intraespecífica (es decir, el AFLP^{TM} puede diferenciar entre los miembros de la misma especie).
En las secciones que siguen se describen los resultados y las conclusiones del presente estudio taxonómico exhaustivo de la cepa R-1512 de Paracoccus sp. (y sus derivados mutantes R1534 y R114).
Secuenciación del 16S rDNA y estudio filogenético. Se cultivan las bacterias descritas en la tabla 2 en un medio LMG 185 ((TSA) BBL 11768 suplementado, si fuera necesario, con un 1,5% de agar de Difco Bacto). Se prepara el DNA genómico con arreglo al método de Niemann y col. [J. Appl. Microbiol. 82, 477-484, 1997]. Los genes que codifican al 16S rDNA se amplifican a partir del DNA genómico de las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) empleando las cebadores que se recogen en la tabla 3.
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TABLA 3 Cebadores empleados para la amplificación PCR del DNA que codifica al 16S rDNA de las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 del cepas Paracoccus sp.
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Los DNA amplificados por PCR se purifican con el kit de purificación llamado Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se efectúa la secuenciación completa empleando un secuenciador de DNA 377 de Applied Biosystems, Inc. y aplicando los métodos indicados por el fabricante (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, EE.UU.) empleando el kit llamado "ABI PRISM^{TM} Big Dye^{TM} Terminator Cycle Secuenciation Ready Reaction Kit (con la AmpliTaq® DNA Polimerasa, Fs)". Los cebadores empleados para la secuenciación del DNA se recogen en la tabla 4.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Cebadores empleados para la secuenciación de segmentos de genes amplificados por PCR, que codifican al 16S rDNA de las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 de Paracoccus sp
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Se emplean cinco cebadores hacia delante y tres cebadores inversos para obtener un solapamiento parcial de las secuencias, que asegure datos de secuencia recogidos de modo muy fiable. Se efectúa la recogida de secuencia con el programa informático AutoAssembler (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, EE.UU.). El análisis filogenético se realiza empleando el paquete informático GeneCompar^{TM} (v. 2.0, Applied Maths B.V.B.A., Courtrai, Bélgica) después de incluir las secuencias de consenso (de las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506) en un alineamiento de secuencias de subunidades ribosómicas pequeñas recogidas de la biblioteca internacional EMBL de secuencias de nucleótidos. Este alineamiento se calcula por pares empleando una penalización de brecha abierta del 100% y una penalización de brecha unitaria del 0%. Se crea una matriz de similitud por cálculo de homología con una penalización de brecha del 0% y después de haber descartados las bases desconocidas. Se construye el árbol resultante empleando un método de asociación de vecinos.
La secuencia de nucleótidos del gen 16s rDNA de la cepa R-1512 del Paracoccus sp. se ilustra en la SEQ ID NO: 12. En la tabla 5 se presenta la matriz de distancias, presentada como porcentaje de similitud de secuencias del 16S rDNA entre la cepa R-1512 y su cepa más afín. Las secuencias de la cepa R-1512 y sus derivados mutantes R1534 y R114 son idénticas. La secuencia del R-1506 difiere solamente en un nucleótido de la secuencia de las últimas cepas. Esto demuestra que las cepas R-1512 y R-1506 tienen una gran afinidad en sentido filogenético y muy probablemente pertenecen a la misma especie (confirmado por hibridación DNA:DNA, ver más abajo). Por comparación de las secuencias R-1512 y R-1506 con las públicamente disponibles de la biblioteca EMBL se asignan las cepas R-1512 y R-1506 al género Paracoccus. Sin embargo, las similitudes de secuencia observadas en todas las especies de Paracoccus descritas actualmente de modo taxonómicamente válido son <97%, el valor generalmente aceptado como límite de la posible afinidad a nivel de especies [Stackebrandt y Goebel, Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 846-849, 1994]. Esto demuestra que las cepas R-1512 (y sus derivados mutantes) y la R-1506 pertenecen a una o dos de las nuevas especies de Paracoccus. Se observan similitudes de secuencia del >97% (significativas para una posible relación a nivel de especies) entre cuatro cepas de Paracoccus sin nombres y las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506, lo cual sugiere que una o más de las cepas sin nombre (MBIC) pueden guardar relación a nivel de especie con las cepas R-1512 y R-1506. En base a los análisis de racimos (cluster) (que representa al árbol filogenético de la afinidad filogenética entre las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506 MBIC3966 del Paracoccus sp. y otros miembros del género Paracoccus), se eligen las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506 y cuatro cepas de Paracoccus sin nombre (MBIC3024, MBIC3966, MBIC4017 y MBIC4020) para los ensayos de hibridación DNA:DNA para analizar la afinidad entre especies.
TABLA 5 Matriz de distancias, presentada en forma de porcentaje e similitud de la secuencia de 16S rDNA entre la cepa R-1512 del Paracoccus sp. y sus cepas más afines
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Hibridación DNA:DNA y determinación del contenido de G+C. Las bacterias descritas en la tabla 5 se cultivan en un medio LMG 185. Se obtiene el DNA genómico con arreglo al método de Wilson [en Ausabel y col. (coord.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York, 2.4.1-2.4.5, 1987]. El contenido de G+C en los DNA se determina por HPLC con arreglo al método de Mesbach y col. [Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 159-167, 1989] modificado por Logan y col. [Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1741-1753, 2000]. Los valores obtenidos son el promedio de estas mediciones de la misma muestra de DNA. Las hibridaciones DNA:DNA se realizan aplicando el mismo método de relación inicial de renaturalización descrito por De Ley y col. [Eur. J. Biochem. 12, 133-142, 1970]. La temperatura de hibridación es de 81,5ºC. Según este método, Vauterin y col. [Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 472-489, 1995] describen una desviación promedio de +/-5,8%. El contenido de G+C de los DNA bacterianos y los resultados de los ensayos de hibridación de DNA se resumen en la tabla 6.
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TABLA 6 Contenido de G+C (% molar) de DNA de cepas de Paracoccus spp. y homología porcentual de DNA entre las cepas
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Las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506 y MBIC3966 presentan una homología de DNA de >70% (el límite generalmente aceptado para la deslinealización de especies [Wayne y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 37, 463-464, 1987] y por ello pertenecen a la misma especie dentro del género Paracoccus. El contenido en G+C de estas cinco cepas varía del 66,9% al 67,7%, por ello permanecen dentro del 1%, característico de una especie bien definida. Por otro lado, la baja homología de DNA entre las cepas MBIC3024, MBIC4017 y MBIC4020 y las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506 y MBIC3966 indica que las MBIC3024, MBIC4017 y MBIC4020 pertenecen cada una de ellas a especies genómicas diferentes dentro del género Paracoccus.
Determinación de la huella dactilar de DNA empleando el AFLP^{TM}. El AFLP^{TM} es una técnica basada en la PCR para hallar la huella dactilar completa del DNA del genoma mediante la amplificación y la visualización selectivas de los fragmentos de restricción [Vos y col., Nucleic Acids Research 23, 4407-4414, 1995; Janssen y col., lugar citado]. En este análisis se comparan las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506, MBIC3966 de Paracoccus sp. con la DSM 11574^{T} de Paracoccus marcusii para evaluar la afinidad intraespecie. Se cultivan estas bacterias en un medio LMG 185. El DNA genómico de cada una de estas bacterias se prepara con arreglo al método de Wilson (lugar citado). Se digiere el DNA purificado con dos enzimas de restricción, una cuchilla (cutter) de 4 bases y una cuchilla de 6 bases. De este modo se obtiene un número limitado de fragmentos con dos extremos diferentes y de un tamaño adecuado para una PCR eficiente. Se ligan los adaptadores (moléculas pequeñas de DNA de doble hebra de 15-20 bp) que contienen un extremo compatible al extremo "pegajoso" apropiado de los fragmentos de restricción. Los dos adaptadores son específicos de semisitio de restricción y tienen diferentes secuencias. Estos adaptadores sirven como sitios de fijación para los cebadores de la PCR. Aquí, las enzimas de restricción empleadas son la ApaI (una cuchilla de seis bases, secuencia de reconocimiento: GGGCC/C) y la TaqI (una cuchilla de cuatro bases, secuencia de reconocimiento T/GCA). Las secuencias de los adaptadores ligados a los extremos pegajosos generados por rotura con las enzimas de restricción se recogen en la tabla 7 (las SEQ ID NO: 13-22). Se aplica la PCR para la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción. Los cebadores de la PCR se fusionan específicamente sobre los extremos del adaptador de los fragmentos de restricción. Debido a que los cebadores, en su extremo 3', contienen una base llamada "base selectiva" que se extiende más allá del sitio de restricción dentro del fragmento, solamente se amplificarán aquellos fragmentos de restricción que tengan la secuencia complementaria apropiada, adyacente al sitio de restricción. Las secuencias de las seis combinaciones de cebadores de la PCR se representan también en la tabla 7.
TABLA 7 Adaptadores y cebadores de PCR empleados para el análisis AFLP^{TM}
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Después de la amplificación, los productos de la PCR se separan con arreglo a su longitud en un gel de poliacrilamida de alta resolución empleando un secuenciador de DNA (ABI 377). Los fragmentos que contienen un adaptador específico del semisitio de restricción creado con una cuchilla de 6-bp se visualizan autorradiografía debido al marcado del extremo 5' del cebador correspondiente con 32P. Se escanean las plantillas electroforéticas y se analizan numéricamente con el programa informático Gel-Compar^{TM} 4.2 (Applied Maths, B.V.B.A., Courtrai, Bélgica) y se aglomeran empleando el coeficiente de encaja de curvas de Pearson y unión de promedios no ponderados de grupos por pares [los métodos aglomeración se revisan en Sneath y Sokal, en: Numerical Taxonomy; Freeman & Son, San Francisco, 1973].
En las seis combinaciones primeras (PC A-H, tabla 7), las huellas dactilares de DNA de la cepas R-1512, R1534 y R114 de Paracoccus sp. son muy similares, si no idénticas. En los casos en los que se observan diferencias menores, no se evalúa la reproducibilidad. La gran similitud o identidad entre las tres cepas era de esperar porque las cepas R1534 y R114 derivan de la cepa R-1512. Con todas las combinaciones de cebadores, las cepas R-1512, R1534 y R114 se discriminan netamente de las cepas R-1506 y MBIC3966, las dos cepas últimas pertenecen por igual a la nueva especie de Paracoccus. Sin embargo, las huellas dactilares no aportan una indicación clara de que las cepas R-1512, R1534 y R114 sean más afines a la R-1506 o a la MBIC3966. En las condiciones aplicadas, las cinco cepas del nuevo aglomerado de especies con un nivel promedio de similitud de aprox. el 58% (este valor es el promedio de seis valores de los puntos de entronque de la nueva especie en los seis ensayos AFLP^{TM} (seis combinaciones de cebadores)) y el aglomerado puede discriminarse claramente del perfil de Paracoccus marcusii DSM 11574^{T}, la cepa tipo de una especie de Paracoccus productora de carotenoides filogenéticamente afín. El valor medio de similitud de los seis puntos de entronque del Paracoccus marcusii DSM 11574^{T} y la nueva especie es de aprox. el 11%.
Análisis de ácidos grasos. La composición de ácidos grasos de las membranas celulares de la cepas R-1512, R1534, R114, R-1506, MBIC3966 de Paracoccus sp. se comparan con las cepas tipo P. marcusii DSM 11574^{T}, P. carotinifaciens E-396^{T} y P. solventivorans DSM 6637^{T}. Se cultivan las bacterias a 28ºC durante 24 horas en un medio LMG 185. Se determinan las composiciones de ácidos grasos por cromatografía de gases empleando un sistema comercial de MIDI (Microbial Identification System, Inc., DE, EE.UU.). Se realiza la extracción y el análisis de ácidos grasos con arreglo a las recomendaciones del sistema MIDI. En la tabla 8 se recogen los resultados de todas las cepas analizadas. Se calcula el perfil promedio de las cinco cepas de la nueva especie Paracoccus (R-1512, R1534, R114, R-1506, MBIC3966). Los ocho organismos presentan una composición comparable de ácidos grasos de sus membranas celulares, siendo el compuesto principal el 18:1 w7c. Se observan únicamente diferencias poco importantes en la composición de ácidos grasos entre la nueva especie de Paracoccus y las tres cepas tipo.
Utilización de fuentes de carbono para el crecimiento. Para estudiar la utilización aeróbica de fuentes de carbono, se emplean microplacas de microvaloración del tipo BIOLOG-SF-N (Biolog Inc., Hayward, CA, EE.UU.) que contienen 95 sustratos, excepto que en el hoyo E6 se emplea un sustrato de D,L-lactato de metilo en lugar de la habitual sal sódica del ácido D,L-láctico. Se cultivan células de cada una de las cepas identificadas en la tabla 9 a 28ºC durante 24 horas en el medio LMG 12 (agar marino, Difco 0979). Se prepara una suspensión celular con una densidad equivalente a 0,5 unidades McFarland en agua destilada estéril. Se esta suspensión se vierten 18 gotas sobre 21 ml de medio AUX (API 20NE, bioMérieux, France) y se mezclan suavemente. Se transfieren 0,1 mililitros de suspensión a cada hoyo de las microplacas BIOLOG y se incuban las placas a 30ºC. Se inspeccionan visualmente los hoyos para ver el crecimiento después de 48 horas y después de 6 días. Además, al cabo de 6 días se confirma la puntuación visual con una lectura de las placas de microvaloración efectuada con lector de placas BIOLOG.
Los resultados del análisis BIOLOG se recogen en la tabla 9. Se determina el crecimiento (reacción positiva) en forma de incremento de turbidez con respecto al hoyo de referencia sin sustrato. Cabe distinguir entre buen crecimiento (+), crecimiento débil (\pm) y sin crecimiento (-). Los resultados entre paréntesis son los obtenidos después de 6 días, si son diferentes de los obtenidos al cabo de 48 horas. Un interrogante indica un resultado poco claro a los 6 días. De las 95 fuentes de carbono ensayadas, 12 se pudieron usar y 47 no se pudieron emplear para el crecimiento de todas las cinco cepas que comprende la nueva especie de Paracoccus (R-1512, R1534, R114, R-1506 y MBIC3966). Estas cinco cepas dieron respuestas de crecimiento variables a los 36 sustratos restantes. La nueva especie de Paracoccus pudo distinguirse de otras dos bacterias productoras de carotenoides (P. marcusii DSM 11574^{T} y P. carotinifaciens E-396^{T}) por su incapacidad de utilizar siete fuentes de carbono (adonitol, i-eritritol, gentiobiosa, \beta-metilglucósido, D-sorbitol, xilitol y ácido quínico). Dos fuentes de carbono empleadas por los cinco miembros de la nueva especie de Paracoccus (L-asparagina y ácido L-aspártico) no se emplean para el crecimiento del P. marcusii DSM 11574^{T}.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 8 Composición de ácidos grasos de las membranas celulares de las cepas R-1512, R1534, R114, R-1506, MBIC3966 de Paracoccus sp. y tres cepas tipo de otra especie de Paracoccus, a saber, P. marcusii DSM 11574^{T}, P. carotinifaciens E-396^{T} y P. solventivorans DSM 6637^{T}
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Ensayo bioquímicos. Se ensayan las propiedades bioquímicas seleccionadas empleando cintas API 20NE (bioMérieux, Francia). Se cultivan células de cada cepa bacteriana identificada en la tabla 10 a 28ºC durante 24 horas en un medio LMG 12. Se preparan suspensiones celulares y se inoculan las cintas con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se incuban las cintas a 28ºC y se determinan los resultados después de 24 y 48 horas. Los resultados se recogen en la tabla 10. De las nuevas propiedades analizadas, solamente una (la actividad de ureasa) dio una respuesta variable entre las cinco cepas de la nueva especie de Paracoccus. Estos nueve ensayos no permiten diferenciar entre la nueva especie de Paracoccus y Paracoccus marcusii DSM 11574^{T} y P. carotinifaciens E-396^{T}.
TABLA 9 Utilización de fuentes de carbono para el crecimiento de las cepas de Paracoccus spp
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GalNAc: N-acetil-D-galactosamina; GlucNAc: N-acetil-D-glucosamina; \beta-metilgluc: \beta-metilglucósido; mmsucc: mono-metilsuccinato; gal-a-lactona: lactona del ácido D-galactónico; AHBA: ácido \alpha-hidroxibutírico; BHBA: ácido \beta-hidroxibutírico; GHBA: ácido \gamma-hidroxibutírico; PHPAA: ácido p-hidroxifenilacético; AKBA: ácido \alpha-cetobutírico; AKGA: ácido \alpha-cetoglutárico; AKVA: ácido \alpha-cetovalérico; LAME: D,L-lactato de metilo; saccA: ácido D-sacárico; bromosuccA: ácido bromosuccínico; GAA: ácido glicil-L-aspártico; GGA: ácido glicil-L-glutámico; HydPro: hidroxi-L-prolina; piroGluA: ácido L-piroglutámico; GABA: ácido \gamma-aminobutírico; PEA: feniletilamina; GlycP: D,L-\alpha-glicerinafosfato; Gluc-1-P: glucosa-1-fosfato; Gluc-6-P: glucosa-6-fosfato.
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TABLA 10 Propiedades bioquímicas de las cepas de Paracoccus spp.: 12 = R1512; 34 = R1534; 14 = R114, 06 = R1506; 66 = MBIC3966; 74 = DSM 11574^{T}, 96 = E-396^{T}, 37 = DSM 6637^{T}
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Ensayos fisiológicos. Se realizan diversos ensayos fisiológicos y morfológicos con las cinco cepas de la nueva especie de Paracoccus, junto con el Paracoccus marcusii DSM 11574^{T}, Paracoccus carotinifaciens E-396^{T} y Paracoccus solventivorans DSM 6637^{T}. Los métodos aplicados para cada ensayo son los siguientes.
Intervalo de temperaturas de crecimiento. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en un medio LMG 12. Se prepara una suspensión celular con una densidad entre 1-2 unidades McFarland en agua destilada estéril. De esta suspensión se vierten 3 gotas sobre la superficie de agar del medio LMG 12. Se diluye una gota por rayado, las 2 gotas restantes se dejan sin tocar. Se incuban las placas en condiciones aeróbicas a 10ºC, 25ºC, 30ºC, 33ºC, 37ºC y 40ºC y se observa su crecimiento después de 24 horas, 48 horas y 5 días. Se determina el crecimiento visualmente (confluyente en las gotas y en forma de colonias en los rayados de inóculo diluido) comparándolo con el crecimiento a 30ºC (es decir, el "control"). Se atribuye la puntuación siguiente (frente a la placa de control): mejor crecimiento (++), buen crecimiento (equivalente al del control) (+), crecimiento más débil (\pm), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-). Los resultados entre paréntesis son los observados en las zonas rayadas, si son diferentes del crecimiento confluyente de las gotas no tocadas.
Tolerancia de la sal. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en un medio LMG 12. Se prepara una suspensión celular de una densidad de 1-2 unidades McFarland en agua destilada estéril. De esta suspensión se vierten 3 gotas sobre la superficie agar del medio LMG 12 suplementado con NaCl hasta alcanzar concentraciones finales de 3%, 6% y 8%. Se diluye una gota por rayado, las 2 gotas restantes se dejan sin tocar. Se incuban las placas en condiciones aeróbicas a 28ºC y se observa su crecimiento después de 24 horas, 48 horas y 5 días. Se determina el crecimiento visualmente (confluyente en las gotas y en forma de colonias en los rayados de inóculo diluido) comparándolo con el crecimiento sin adición de NaCl (es decir, el "control"). Se atribuye la puntuación siguiente (frente a la placa de control): mejor crecimiento (++), buen crecimiento (equivalente al del control) (+), crecimiento más débil (\pm), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-). Los resultados entre paréntesis son los observados en las zonas rayadas, si son diferentes del crecimiento confluyente de las gotas no tocadas.
Intervalo de pH para el crecimiento. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en medio LMG 12. Se prepara una suspensión celular con una densidad entre 1-2 unidades McFarland en agua destilada estéril. De esta suspensión se vierten 3 gotas en tubos que contienen 10 ml de medio LMG 12 líquido con pH modificado, obteniéndose valores finales después del autoclave de pH 6,1, pH 6,3, pH 7,0, pH 7,7, pH 8,1 y pH 9,1. Se incuban los cultivos líquidos en condiciones aeróbicas (sin agitación) a 28ºC. Se observa el crecimiento al cabo de 24 horas, 48 horas, 3 días y 6 días. Se determina el crecimiento como aumento de la turbidez (medida como transmisión % empleando un turbidímetro BIOLOG) por comparación con el crecimiento a pH 7,0 (control). Se atribuye la puntuación siguiente (frente a la placa de control): mejor crecimiento (++), buen crecimiento (equivalente al del control) (+), crecimiento más débil (\pm), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-).
Hidrólisis de almidón. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en placas de medio LMG 12. De la placa se saca un rizo de células que se transfiere en forma de raya sobre la superficie de agar del medio LMG 12 suplementado con un 0,2% de almidón soluble. Se incuban las placas a 28ºC en condiciones aeróbicas. Cuando las cepas han desarrollado un buen crecimiento (al cabo de 48 horas), se inunda la placa con una solución de lugol (0,5% de I_{2} y 1% de KI en agua destilada). Se determina la hidrólisis como zona transparente a lo largo del crecimiento (a diferencia del color azul del agar cuando el almidón no se ha hidrolizado).
Desnitrificación. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en placas con medio LMG 12. Se toma un rizo de células de la placa y se introduce por incisión en tubos que contienen un medio LMG 12 semisólido (0,1% de agar) suplementado con un 1% de KNO_{3}. Se incuban las placas a 28ºC durante 5 días. Se determina la desnitrificación (N_{2} a partir de nitrato) como formación de gas a lo largo de la incisión.
Crecimiento en condiciones anaeróbicas sin añadir aceptores de electrones. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en placas que contienen medio LMG 12. Se toma de la placa un rizo de células y se rayan sobre la superficie de agar del medio LMG 12. Se incuban las placas de agar a 30ºC en condiciones anaeróbicas (aprox. 10% de CO_{2} + aprox. 90% N_{2}). Se observan las placas para determinar el crecimiento después de 24 horas y después de 5 días. Se determina el crecimiento visualmente y se compara con el existente en condiciones aeróbicas (control). Se atribuye la puntuación siguiente (frente al control): mejor crecimiento (++), buen crecimiento (equivalente al del control) (+), crecimiento más débil (\pm), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-).
Crecimiento en condiciones anaeróbicas añadiendo glucosa (fermentación). Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en una placa con medio LMG 12. Se toma de la placa un rizo de células y se introduce por incisión en tubos que contienen medio agar basal de Hugh y Leifson [J. Bacteriol. 66, 24-26, 1953]. Se añade aceite de parafina en la parte alta del medio y se incuban los tubos a 30ºC. Se observa el crecimiento en los tubos y la formación de ácido después de 48 horas y de 5 días. El crecimiento se determina visualmente. Se atribuye la puntuación siguiente: buen crecimiento (+), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-).
Crecimiento en condiciones anaeróbicas con KNO_{3} como aceptor de electrones. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en placas de medio LMG 12. De la placa se toma un rizo de células y se introduce por rayado sobre la superficie de agar del medio LMG 12 suplementado con un 0,1% de KNO_{3}. Se incuban las placas a 30ºC en condiciones anaeróbicas (aprox. 10% de CO_{2} + aprox. 90% de N_{2}) y se determina el crecimiento al cabo de 3 días. Se determina el crecimiento visualmente por comparación con las condiciones aeróbicas (control). Se atribuye la puntuación siguiente (frente al control): mejor crecimiento (++), buen crecimiento (equivalente al del control) (+), crecimiento más débil (\pm), crecimiento pobre (\underline{\pm}) y sin crecimiento (-).
Reacciones de catalasa y oxidasa. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en placas con medio LMG 12. Un resultado positivo de la actividad de catalasa es la producción burbujas de gas después de suspender una colonia en una gota de H_{2}O_{2} del 10%. Un resultado positivo de actividad de oxidasa es la formación de un color rojo púrpura después de frotar una colonia sobre un papel de filtro impregnado con tetrametilparafenileno al 1%.
Pigmentación de colonias. Se cultivan las células a 28ºC durante 5 días en un medio LMG 12. El color de colonias se observa visualmente.
Morfología y motilidad de las células. Se cultivan las células a 28ºC durante 24 horas en un medio LMG 12. Las soluciones se hacen con una solución salina estéril. Se observa la morfología y la motilidad de las células con un microscopio de luz de tipo Olympus equipado con óptica de contraste de fases (1000 aumentos).
Los resultados de los ensayos fisiológicos y morfológicos se recogen en la tabla 1. Las cinco cepas de la nueva especie de Paracoccus responden de modo esencialmente idéntico en todos los ensayos fisiológicos y morfológicos realizados. En los ensayos se obtienen respuestas idénticas para las cinco cepas de la nueva especie Paracoccus pero que permite la discriminación de estos organismos del Paracoccus marcusii DSM 11574^{T} y/o del Paracoccus carotinifaciens E-396^{T} en base al crecimiento a 40ºC, el crecimiento con 8% de NaCl, el crecimiento a pH 9,1 y la pigmentación de colonias.
Producción de zeaxantina en las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506. Se cultivan las cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 en medio ME que contiene (por litro de agua destilada): 5 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 30 g de NaCl y 5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O. Se ajusta el pH del medio a 7,2 con NaOH 5N antes de la esterilización por autoclave. Se cultivan todas las cepas (volumen de 25 ml en matraces erlenmeyer de 250 ml con tapones de plástico) a 28ºC con agitación a 200 rpm. Los cultivos sembrados se inoculan de patrones glicerinados congelados y se cultivan durante una noche. Se transfieren partes alícuotas a matraces de ensayo para logar una densidad óptica inicial a 660 nm (OD_{660}) de 0,16. Después se cultivan estas cepas a 28ºC con agitación a 200 rpm. Se hace el seguimiento del crecimiento a lo largo del cultivo y a 6, 10 (ó 15 para la cepa R114) y 24 horas, se saca una parte alícuota para el análisis de los carotenoides por el método descrito en el ejemplo 1.
El tiempo de doblado de las cepas R-1512, R1534 y R-1506 en estas condiciones es de 0,85 horas, 1,15 horas y 1,05 horas, respectivamente. La cepa R114 presenta de modo reproducible un perfil de crecimiento bifásico; el tiempo de doblado de la cepa R114 en la fase inicial es de 1,4 horas mientras que el tiempo de doblado en la segunda fase es de 3,2 horas.
En la tabla 12 se recogen la producción de la zeaxantina producción y la formación específica (producción de zeaxantina normalizada a OD_{660}) por las cepas de Paracoccus sp. en un medio ME. Los datos son promedios de cuatro ensayos independientes y dentro de cada ensayo cada cepa se ensaya en matraces por duplicado. Se observa claramente una producción mejorada de zeaxantina en las cepas mutantes R1534 y R114 derivadas por métodos clásicos, comparada con la de la cepa parental R-1512. La producción de zeaxantina por la cepa R-1506 es aproximadamente la misma que la de la cepa R-1512. No se detectan otros carotenoides en ninguno de los cultivos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 11 Características fisiológicas de las cepas de Paracoccus spp.: 12 = R1512; 34 = R1534; 14 = R114, 06 = R1506; 66 = MBIC3966; 74 = DSM 11574^{T}, 96 = E-396^{T}, 37 = DSM 6637^{T}
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TABLA 12 Producción de zeaxantina en cepas R-1512, R1534, R114 y R-1506 de Paracoccus sp
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Ejemplo 3 Biosíntesis del IPP por la vía del mevalonato en la cepa R114 de Paracoccus sp. productora de zeaxantina
Con el fin de determinar el origen biosintético (es decir, la vía del mevalonato o del DXP) de los precursores isoprenoides en la cepa R114 del Paracoccus sp. se recurre a una estrategia de "retrobiosíntesis" [Eisenreich y Bacher, en: Setlow (coord.), Genetic Engineering, Principles and Methods, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York, 22, 121-153, 2000]. Esta estrategia de predicción para el análisis de los datos permite la evaluación inequívoca del catabolismo de la glucosa a partir del análisis de un solo producto natural posterior (down-stream). En la presente obra, el crecimiento en cuestión de las bacterias en medios que contienen diversas mezclas binarias de glucosa sin marca y glucosas específicas marcadas con C^{13} y posterior purificación de la zeaxantina producida y análisis los modelos marcados por espectroscopía RMN. A continuación se dan más detalles de los métodos empleados y los resultados experimentales.
Crecimiento de la cepa R114 de Paracoccus sp. para ensayados con marcado de C^{13}. Se adquiere la D-glucosa sin marcar de la empresa Fluka (Milwaukee, WI, EE.UU.). Se adquiere la D-glucosa-[U-6C^{13}] a la empresa Isotec (Miamisburg, OH, EE.UU.), mientras que la D-glucosa-[1-1C^{13}], la D-glucosa-[2-1C^{13}] y la D-glucosa-[6-1C^{13}] proceden de los Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, EE.UU.). El extracto de levadura y la peptona (de caseína, digerida en el páncreas) se adquieren a EM Science (Gibbstown, NJ, EE.UU.). Las demás sales y disolventes son de calidad analítica y se adquieren a los proveedores habituales de reactivos.
Todos los cultivos se inician a partir de suspensiones de células congeladas (densidad celular de 12 unidades de OD_{660}, 25% de glicerina, almacenadas a -70ºC). Se emplea un ml de suspensión celular descongelada para inocular los precultivos (matraces agitables con deflector de 500 ml), que contienen 100 ml de medio 362F/2 de la composición siguiente: 30 g/l de D-glucosa, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,75 g/l de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, 0,625 g/l de K_{2}HPO_{4}, 187,5 mg/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,2 g/l de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O, 15 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 12,5 mg/l de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 5 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,5 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O, 15 mg/l de Na-EDTA y 9,375 ml/l de HCl (solución patrón del 37%). El pH inicial del medio es de 7,2.
Se incuba el precultivo a 28ºC con agitación a 200 rpm durante 24 h, pasado este tiempo la OD_{660} se sitúa aprox. en 22 unidades de absorbancia. Después se mantienen los cultivos principales en biorreactores Bioflo 3000 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE.UU.) que contienen medio 362F/2 de la composición siguiente: 30 g/l total de D-glucosa (ver a continuación las proporciones de C^{13}: glucosa sin marcar), 20 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 10 g/l de NaCl, 5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,5 g/l de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, 1,25 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,4 g/l de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot
6H_{2}O, 375 mg/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 30 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 25 mg/l de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 10 mg/l de MnSO_{4}.H_{2}O, 1 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O, 30 mg/l de Na-EDTA y 18,75 ml/l de HCl (solución patrón al 37%). Las cantidades de cada glucosa marcada con C^{13} (expresadas en forma de porcentaje del total de los 30 g/l de glucosa en el medio) en cuatro ensayos separados son: condición 1, 4% D-glucosa-U-6C^{13}]; condición 2, 50% de D-glucosa-[1-1C^{13}]; condición 3, 25% de D-glucosa-[2-1C^{13}] + 1% de D-glucosa-[U-6C^{13}]; condición 4, 25% de D-glucosa-[6-1C^{13}] + 1% de D-glucosa-[U-6C^{16}]. Se incluye también un control que contiene únicamente glucosa sin marcar. Para las condiciones 1 y 2 (y el control sin marcar), el volumen del control es de 2 l, mientras que el volumen del cultivo para las condiciones 3 y 4 es de 1 l. Se inocula el precultivo en los biorreactores, 20 ml/l del volumen inicial) y el cultivo se realiza durante 22-24 horas, pasado este tiempo ya no queda glucosa en el medio. Las condiciones de cultivo son: 28ºC, pH 7,2 (controlado por adición de H_{3}PO_{4} del 25% y NH_{4}OH del 28%), controlando el oxígeno disuelto (en una cascada con agitación) a un mínimo del 40%, velocidad de agitación y de aireación: 300 rpm (mínimo) y 1 wm, respectivamente.
Purificación de la zeaxantina. Al final de los pasos de cultivo, se enfrían los cultivos a 15ºC. Se añaden quinientos ml de etanol absoluto por litro de cultivo y se continúa la agitación a 100 rpm durante 20 min. Se centrifuga el cultivo tratado a 5000 x g durante 20 min y se descarta el líquido sobrenadante. Después se extrae el culote húmedo con 5 volúmenes de THF durante 20 min con agitación. Se centrifuga la mezcla extraída, se guarda el líquido sobrenadante y se extrae el culote resultante por segunda vez con 1 volumen de THF en las mismas condiciones y se centrifuga de nuevo. Se reúnen los líquidos sobrenadantes (extractos) y se concentran a 50 ml por evaporación en evaporador rotatorio. Se añaden cinco mililitros de hexano a la solución concentrada de THF. Una vez finalizada la mezcla, el sistema forma una emulsión que puede separarse por centrifugación. Se recoge la fase acuosa, se diluye con un volumen igual de una solución saturada de NaCl y se extrae de nuevo con diclorometano.
Se recoge la fase diclorometano y se reúne con la fase THF/hexano. Se concentra de nuevo la mezcla de extractos orgánicos en un evaporador rotatorio para eliminar el diclorometano. Se introduce la solución en lo alto de una columna de gel de sílice y se eluye con una mezcla (1:1) de n-hexano y éter. En primer lugar se eluye una pequeña banda ligeramente amarilla, que se descarta. El principal producto zeaxantina eluye en una banda ancha, que se mueve largamente a través de la columna. Se necesitan aprox. 2 litros de disolvente para eluir por completo la banda principal. Se recogen los líquidos eluidos en un matraz de fondo redondo y se elimina el disolvente por evaporación a 40ºC en un evaporador rotatorio. Se disuelve el resto en una pequeña cantidad de dicloroetano a 40ºC y después se deja enfriar lentamente la solución. Se añade por goteo hexano a la mezcla hasta que se observa turbidez. La cristalización finaliza a 4ºC al cabo de 48 horas. Se recogen los cristales en un papel de filtro, se lavan con metanol frío y se secan con vacío.
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Estudios RMN. Se analiza la zeaxantina por espectroscopía RMN. Como referencia, la estructura química de la zeaxantina se ilustra en la fórmula siguiente:
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Los espectros RMN-H^{1} y RMN-C^{13} se registran a 500,13 MHz y 125,6 MHz, respectivamente, en un espectrómetro del tipo Bruker DRX 500. La introducción y los parámetros de procesado de los ensayos unidimensionales y de los ensayos bidimensionales inadecuados se realizan con el programa informático estándar de Bruker (XWINNMR). El disolvente empleado es el cloroformo deuterado. Los desplazamientos químicos se refieren a las señales del
disolvente.
Los espectros RMN-C^{13} de las muestras de zeaxantina marcadas con el isótopo y de las muestras de zeaxantina de abundancia natural de C^{13} se registran en las mismas condiciones de ensayo. Se determinan las integrales para cada señal de RMN-C^{13} y la integral de la señal de cada átomo de carbono respectivo del compuesto marcado se refiere al material de abundancia natural, obteniéndose de este modo las abundancias relativas de C^{13} para cada posición de la especie molecular marcada. Las abundancias relativas se convierten seguidamente en abundancias absolutas de satélites de unión C^{13} en la señal RMN-H^{1} de H-18 a 1,71 ppm. En el espectro RMN-C^{13} de la muestra de zeaxantina de marcadores múltiples, cada satélite se integra por separado. La integral de cada par de satélites en cuestión se refiere después a la integral de la señal total de un átomo de carbono determinado. La zeaxantina abarca un total de ocho restos isoprenoides (2 unidades DMAPP y 6 unidades IPP); solamente se observan 20 señales RMN-C^{13} debido a la degeneración del desplazamiento químico.
En el ensayo con la mezcla de la glucosa-[U-6C^{13}] y la glucosa sin marcar (1:7,5; p/p), se marcan todos los átomos de carbono de la zeaxantina y se presentan satélites debido a las uniones C^{13}C^{13} (tabla 13). Las señales de los 4 átomos de carbono tienen satélites intensos debido a las uniones C^{13}C^{13} (61,2 \pm 0,6% de la intensidad global de la señal RMN de un átomo dado, tabla 13). El recuento de las señales para los átomos metilo C-17/C-17' presentan solamente satélites débiles unidos a C^{13} de una intensidad relativa del 6%. Las señales centrales representan material derivado de la glucosa sin marcar. Las señales no presentan evidencia de unión de largo alcance. La conectividad del carbono se recoge fácilmente de las constantes de unión C^{13}C^{13} (tabla 13) y de los ensayos bidimensionales inadecuados.
Tres de los átomos de carbono se dotan del marcador glucosa[6-1C^{13}]. Los dos carbonos restantes se marcan con glucosa[2-1C^{13}]. La glucosa[1-1C^{13}] no contribuye en cantidades significativas al marcado de la zeaxantina.
La abundancia de la C^{13} de todos los átomos de carbono no isócronos se determina por comparación con los espectros de zeaxantina sin marcar y por evaluación de los satélites de unión H^{1}C^{13} del espectro RMN-H^{1} (tabla 13). La fracción de pares de átomos de carbono transferidos conjuntamente en el ensayo con la glucosa[U-6C^{13}] se determina por integración de los satélites de unión.
Los modelos de marcado del bloque de construcción del IPP pueden reconstruirse cuidadosamente del modo indicado en las desviaciones estándar para el precursor IPP reconstruido. Los modelos de marcado reconstruidos de DMAPP e IPP son idénticos dentro de los límites del ensayo.
TABLA 13 Resultados de RMN de la zeaxantina marcada con C^{13} producida por la cepa R114 del Paracoccus sp. con glucosas marcadas con C^{13}
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Los modelos de marcado experimental recién determinados pueden compararse con varias predicciones, tomando en consideración que no solo la vía del mevalonato frente a la vía del DXP para la biosíntesis del isoprenoide, sino también diferentes vías de biosíntesis de metabolismo de la glucosa. Las eubacterias emplean habitualmente la glucosa primariamente a través de la vía glucolítica o la vía de Entner-Doudoroff. La glucólisis genera dos moléculas de triosa-fosfato a partir de la glucosa. Los carbonos C-1 y C-6 de la glucosa se dirigen ambos a la posición 3 de los triosa-fosfatos producidos durante la glucólisis. Por otro lado, en la vía de Entner-Doudoroff, la glucosa se convierte en una mezcla de gliceraldehído-3-fosfato y piruvato. El C-1 de la glucosa se dirige exclusivamente al C-1 del piruvato y el C-6 de la glucosa se dirige exclusivamente al C-3 del gliceraldehído-3-fosfato.
Los compuestos intermedios y los productos de la vía glucolítica de Entner-Doudoroff sirven como materiales de partida para las dos vías biosintéticas de los isoprenoides. En lo que respecta a la vía del mevalonato, el piruvato así como el triosa-fosfato pueden convertirse en el precursor acetil-CoA. El catabolismo de la glucosa mediante la vía glucolítica parte tanto del carbono C-1 como del carbono C-6 de la glucosa y se dirige al grupo metilo de la acetil-CoA. El catabolismo de la glucosa a través de la vía de Entner-Doudoroff se traduce en una pérdida del C-1 de la glucosa durante la transformación del piruvato en acetil-CoA.
El enriquecimiento observado experimentalmente y los modelos de unión C^{13}C^{13} de la zeaxantina producida por la cepa R114 del Paracoccus sp. están en perfecta armonía con los modelos de unión requeridos para la biosíntesis de la zeaxantina por combinación de la vía de Entner-Doudoroff y la vía del mevalonato. Si las dos vías, la vía glucolítica y la vía de Entner-Doudoroff, están operativas simultáneamente en las condiciones experimentales aplicadas, entonces por lo menos una parte del marcador de la glucosa[1-1C^{13}] debería contribuir a la zeaxantina. Además, la vía del mevalonato puede contribuir de modo óptimo a bloquear los dos átomos de carbono que generan los terpenoides, mientras que en la vía DXP tres unidades de carbono pueden entregarse a los isoprenoides a través de los precursores triosa-fosfato. Aunque tales bloques de tres carbonos se quedan separados por el reordenamiento propio de la vía DXP, los bloques de los tres átomos de carbono marcados todavía pueden reconocerse a través de una condensación de largo alcance. Las correspondientes condensaciones C^{13}-C^{13} de largo alcance se han observado en la biosíntesis del carotenoide luteína a partir de la [2,3,4,5-4C^{13}]1-desoxi-D-xilulosa por acción de células vegetales cultivadas (Cantharantus roseus) [Arigoni y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 94, 10600-10605, 1997]. En los ensayos presentes de la zeaxantina producida por la cepa R114 de Paracoccus sp. no se observan condensaciones de largo alcance de este tipo.
Debe notarse que, mientras los resultados aquí presentados confirman la producción de isoprenoides por acción de la cepa R114 de Paracoccus sp. a través de la vía del mevalonato e indican que, en las condiciones de crecimiento aplicadas, hay poco metabolismo o ningún metabolismo de la glucosa por glucólisis, estos resultados no descartan la posibilidad de que haya cierto metabolismo de glucosa a través de la vía del pentosa-fosfato además de la vía de Entner-Doudoroff. La determinación cuantitativa del metabolismo de la glucosa mediante las dos vías mencionadas en último lugar se ha podido obtener por análisis de los modelos de marcado de los aminoácidos derivados del piruvato (de igual manera que se ha hecho para el Paracoccus denitrificans [Dunstan y col., Biomedical and Environ. Mass Spectrometry 19, 369-381, 1990].
Ejemplo 4 Clonación y secuenciación de de genes que codifican la isomerasa IPP y las enzimas de la vía del mevalonato a partir de la cepa R114 de Paracoccus sp
Condiciones de cultivo. Se cultiva la cepa R114 del Paracoccus sp. a 28ºC en medio F (10 g/l de triptona, 10 g/l de extracto de levadura, 30 g/l de NaCl, 10 g/l de D-glucosa, 5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH 7,0) o en el medio de precultivo descrito en el anterior ejemplo 3. Los cultivos líquidos se mantienen en un agitador rotatorio a 200 rpm.
Aislamiento del DNA genómico. Se centrifuga un cultivo de 600 ml de la cepa R114 de Paracoccus sp. a 4ºC y 10.000 x g durante 10 minutos, se lava el culote una vez con 200 ml de tampón de lisis (0,1M NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) y una vez con 100 ml de tampón de lisis. Se suspende de nuevo el culote final en 20 ml de tampón de lisis que contienen 50 mg de lisozima y 1 mg de RNasa A (sin DNasa). Después de una incubación a 37ºC durante 15 minutos se le añaden 1,5 ml de N-lauroil-sarcosinato sódico al 20% y 2,25 mg de proteinasa K. Después de una incubación a 50ºC durante 30-60 minutos, se extrae el lisado con un volumen de fenol saturado con tampón, pH 7,5-7,8 (LifeTechnologies, Rockville, MD, EE.UU.) mediante un mezclado suave pero completo.
Se centrifuga la emulsión a 30.000 x g durante 20 minutos y se extrae de nuevo la fase acuosa con fenol. Se separan las fases del modo antes descrito y se extrae la fase acuosa dos veces con un volumen de fenol:cloroformo (1:1). En este paso, la centrifugación a 3.200 x g durante 20 minutos en un rotor de paletas oscilantes es suficiente para obtener una separación satisfactoria de las fases. Después de una extracción final con un volumen de cloroformo, se añaden 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M (pH 5,2) y sobre esta solución se vierten 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo. Se enrolla el DNA precipitado con una varilla de vidrio, se impregna con etanol del 70% durante 5 minutos, se enjuaga con cloroformo y después se seca con aire durante 5-10 minutos. Se suspende de nuevo el DNA durante una noche en 5 ml de TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA). Dado que la solución es amarilla por las trazas de zeaxantina, se repiten las extracciones orgánicas y los enrollados antes descritos hasta obtener una preparación transparente.
Aislamiento del \lambda-DNA. Se emplea el kit Qiagen® Lambda Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) con arreglo a las instrucciones del fabricante.
Reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se adquieren los oligonucleótidos de la empresa LifeTechnologies (Rockville, MD, EE.UU.). Se efectúa la PCR en un sistema llamado GeneAmp® PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) empleando el sistema PCR enriquecido por CG (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se emplea por ejemplo una concentración de MgCl_{2} de 1,5 mM y se añade la solución de resolución en una concentración final de 1M.
Marcado y detección del DNA. Se emplean los kits llamados PCR DIG Probe Synthesis Kit y DIG Luminescent Detection Kit para el marcado y la detección del DNA, respectivamente (ambos suministrados por Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania).
Secuenciación del DNA. Las reacciones de secuenciación se llevan a cabo empleando el kit llamado BigDye®DNA sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con arreglo a las instrucciones del fabricante. Los materiales resultantes de las reacciones de secuenciación se purifican en columnas llamadas DyeEx^{TM} spin (Qiagen, Hilden, Alemania) y la separación y detección de los fragmentos se realiza con un analizador del tipo ABI Prism^{TM} 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Biblioteca \lambda. Se adquiere a Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.) una biblioteca de fabricación propia con el DNA de la cepa R114 de Paracoccus sp. parcialmente digerida en Sau3AI, en lambda FIX® II.
Clonación, secuenciación y caracterización del aglomerado de genes de la vía del mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. Una de las enzimas de la vía del mevalonato, la mevalonato-difosfato-descarboxilasa, contiene regiones muy conservadas que abarcan diversos aminoácidos. Se eligen tres regiones de este tipo del alineamiento de todas las mevalonato-difosfato-descarboxilasas bacterianas disponibles y se designan los oligonucleótidos aplicando el uso de codones preferido hallado en el conglomerado de genes de carotenoide de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (tabla 14).
Los oligonucleótidos diseñados a partir de dos regiones de homología se recogen en la tabla 15. Para reducir el grado de degeneración se designan grupos de oligonucleótidos de cada péptido. Por ejemplo, los oligonucleótidos mvd-103a-d difieren solamente en el tercer nucleótido del extremo 3', cada uno de ellos podría actuar como un posible codón de la glicina (se incluye el GGA, aunque se emplea raramente, porque está muy próximo al extremo 3'). Se justifican aminoácidos alternos designando oligonucleótidos a ambos restos, p. ej. los oligonucleótidos mvd-101a y mvd-101b son específicos de leucina y de isoleucina, respectivamente, en la segunda posición del péptido 1 (tabla 15). La PCR con los oligonucleótidos mvd-101 y mvd-104 o mvd-106, empleando como molde el DNA de la cepa 114 del Paracoccus sp., permite obtener un producto del tamaño esperado. Se clona el producto de la PCR en el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se secuencia. Se emplea el fragmento clonado como sonda para el análisis Southern del DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. y se observa que se hibrida con el fragmento BamHI-SalI de aprox. 950 bp. Se corta el DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. con BamHI y SalI y se separan los fragmentos por electroforesis a través de un gel de agarosa. Se aísla una región de aprox. 950 bp y se clona en el vector pUC19. Después se explora esta biblioteca parcial empleando como sonda el fragmento mvd-PCR y se secuencia el inserto de un clon positivo. Se explora en paralelo una biblioteca \lambda del DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. empleando como sonda el fragmento mvd-PCR. Se aísla el DNA de los dos clones \lambda positivos y se cortan con BamHI y SalI o EcoRI y SalI. Se aísla un gran número de fragmentos de restricción y se clonan en el vector pUC19. Varios fragmentos contienen secuencias homólogas de genes que codifican a proteínas de la vía del mevalonato. Los clones que conectan estas secuencias individuales se obtienen por PCR con cebadores derivados de las secuencias de los fragmentos de restricción clonados empleando como molde el DNA de los clones \lambda. Las secuencias ensambladas de todos los fragmentos (las SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50 y 52) y las secuencias de las proteínas codificadas se recogen en el listado de secuencias (las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53). Debido a una limitación del programa PatentIn, los operones con genes solapados no pueden mostrarse en forma de secuencia individual. Por lo tanto, para cada gen del operón mevalonato, se repite la secuencia entera de nucleótidos del operón para cada gen. Por consiguiente, las SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50 y 52 son idénticas. Para los fines de la presente invención, empleamos la SEQ ID NO: 42 para indicar la secuencia de nucleótidos del operón de mevalonato.
El ordenamiento de los genes de la vía mevalonato en la cepa R114 del Paracoccus sp. es único si se compara con los aglomerados de genes de mevalonato conocidos de otras bacterias. Aparte de la cepa R114 del Paracoccus sp., solamente la Borrelia burgdorferi y la cepa CL190 del Streptomyces sp. (Takagi y col., lugar citado) tienen todos los genes de mevalonato en un solo operón (Wilding y col., lugar citado). En el Streptococcus pyrogenes, todos los genes de mevalonato están aglomerados en un solo lugar, pero agrupados en dos operones. Las demás especies tienen dos operones con las dos quinasas y la mevalonato-difosfato-descarboxilasa agrupados en un operón y la HMG-CoA-sintasa y la HMG-CoA-reductasa en un segundo lugar, ya sea formando un operón (en el Streptococcus pneumoniae) ya sea en unidades separadas de transcripción. Todas las especies, excepto los miembros del Staphylococcus tienen un gen adicional unido al aglomerado del mevalonato, que recientemente se ha identificado como isomerasa IPP (el gen idi de la cepa CL190 del Streptomyces sp.) (Kaneda y col., lugar citado). Las dos especies de Enterococcus y el Staphylococcus haemolyticus tienen un gen de acetil-CoA-acetiltransferasa unido al gen de la HMG-CoA-reductasa. En la especie Enterococcus, los dos últimos genes están fusionados.
TABLA 14 Uso de codones en los genes carotenoides (crt) de la cepa R1534 del Paracoccus sp.
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TABLA 15 Oligonucleótidos diseñados a partir de dos péptidos Mvd bacterianos conservados
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Los genes del operón mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. se identifican por homología de los productos genéticos con las proteínas en las bases de datos generales. Se realiza un alineamiento de aminoácidos de la HMG-CoA-reductasa de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 43) con las HMG-CoA-reductasas de la clase bacteriana I de la cepa CL190 de Streptomyces sp. (SEQ ID NO: 54), S. griseolosporeus (SEQ ID NO: 55) y la cepa KO-3899 de Streptomyces sp. (SEQ ID NO: 56). Los números de registro de los bancos de datos EMBL/GenBank/DDBJ son q9z9n4 para la cepa CL190 del Streptomyces sp., q9znhl para el S. griseolosporeus y q9znh0 para la cepa KO-3899 del Streptomyces sp. Hay dos clases de HMG-CoA-reductasas [Bochar y col., Mol. Genet. Metab. 66, 122-127, 1999; Boucher y col., Mol. Microbiol. 37, 703-716, 2000]. Las HMG-CoA-reductasas eubacterianas son en general de la clase II, mientras que las enzimas de la clase I se encuentran en eucariotes y arqueas. Las HMG-CoA-reductasas de Streptomyces y de Paracoccus junto con la enzima del Vibrio cholerae son las únicas HMG-CoA-reductasas bacterianas de la clase I que se conocen hasta el presente.
Se realiza un alineamiento de aminoácidos de la isopentenil-difosfato-isomerasa (IPP-isomerasa) (idi) de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 45) con homólogos muy afines encontrados en la base de datos EMBL, es decir, la Erwinia herbicola (Q01335) (SEQ ID NO: 57), Borrelia burgdorferi (051627) (SEQ ID NO: 58), Synechocystis sp. PCC 6803 (P74287) (SEQ ID NO: 59), Streptomyces sp. CL190 (Q9KWG2) (SEQ ID NO: 60), Streptomyces griseolosporeus (Q9KWF6) (SEQ ID NO: 61), Sulfolobus solfataricus (P95997) (SEQ ID NO: 62), Rickettsia prowazekii (Q9ZD90) (SEQ ID NO: 63), Deinococcus radiodurans (Q9RVE2) (SEQ ID NO: 64), Aeropyrum pernix (Q9YB30) (SEQ ID NO: 65), Halobacterium sp. NRC-1 (054623) (SEQ ID NO: 66), Archaeoglobus fulgidus (027997) (SEQ ID NO: 67), Pyrococcus abyssi (Q9UZS9) (SEQ ID NO: 68), Pyrococcus horikoshii (058893) (SEQ ID NO: 69), Methanobacterium thermoautotrophicum (026154) (SEQ ID NO: 70), Methanococcus jannaschii (Q58272) (SEQ ID NO: 71), Thermoplasma acidophilum (CAC11250) (SEQ ID NO: 72) y Leishmania major (Q9NDJ5) (SEQ ID NO: 73). Los números de registro en las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ se indican entre paréntesis después del nombre del organismo. Las nueve primeras secuencias son de eubacterias y las ocho secuencias siguientes son de arqueas. Es interesante notar que una especie eucariota, el parásito protozoico Leishmania major (SEQ ID NO: 73) tiene también una proteína que es muy homóloga. Esto no era de esperar, porque otros eucariotas tienen un idi diferente, denominado tipo 1 (Kaneda y col., lugar citado). Una proteína hipotética conservada del Bacillus subtilis, YpgA, tiene también una homología sustancial, pero es considerablemente menor que los idi de tipo 2.
Se realiza un alineamiento de aminoácidos de la HMG-CoA-sintasa bacteriana de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 47) con homólogos afines hallados en la base de datos EMBL, es decir, el Streptococcus pneumoniae (AAG02453) (SEQ ID NO: 74), Streptococcus pyrogenes (AAG02448) (SEQ ID NO: 75), Entereococcus faecalis (AAG02438) (SEQ ID NO: 76), Enterococcus faecium (AAG02443) (SEQ ID NO: 77), Staphylococcus haemolyticus (AAG02427) (SEQ ID NO-78), Staphylococcus epidermis (AAG02433) (SEQ ID NO: 79), Staphylococcus aureus (AAG02422) (SEQ ID NO: 80), Staphylococcus carnosus (Q9ZB67) (SEQ ID NO: 81), Streptomyces sp. CL190 (Q9KWG1) (SEQ ID NO: 82), Streptomyces griseolosporeus (Q9KWF5) (SEQ ID NO: 83) y Borrelia burgdorferi (051626) (SEQ ID NO: 84). Los números de registro de las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ se indican entre paréntesis después del nombre de cada organismo. Los 43 aminoácidos primeros de la secuencia del Streptomyces griseolosporeus faltan en la versión de la base de datos.
Se realiza un alineamiento de aminoácidos de la mevalonato-difosfato-descarboxilasa bacteriana de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 53) con las proteínas ortólogas de otras bacterias, a saber: el Streptococcus pneumoniae (AAG02456) (SEQ ID NO: 85), Streptococcus pyrogenes (AAG02451) (SEQ ID NO: 86), Entereococcus faecalis (AAG02441) (SEQ ID NO: 87), Enterococcus faecium (AAG02446) (SEQ ID NO: 88), Staphylococcus haemolyticus (AAG02431) (SEQ ID NO: 89), Staphylococcus epidermis (AAG02436) (SEQ ID NO: 90), Staphylococcus aureus (AAG02425) (SEQ ID NO: 91), Streptomyces sp. CL190 (Q9KWG4) (SEQ ID NO: 92), Streptomyces griseolosporeus (Q9KWF8) (SEQ ID NO: 93) y Borrelia burgdorferi (051629) (SEQ ID NO: 94). Los números de registro de las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ se indican entre paréntesis después del nombre de cada organismo.
Dos proteínas del Myxococcus xanthus, la Tac y la Taf (números de registro en las bases de datos: q9xb06 y q9xb03, respectivamente) y una proteína del B. subtilis, la PksG, una proteína de la biosíntesis de policetida putativa (número de registro en la base de datos: p40830), tienen una homología sustancial con la HMG-CoA-sintasa de la cepa R114 del Paracoccus sp. La homología entre la HMG-CoA-sintasa de la cepa R114 del Paracoccus sp. y las proteínas Tac y Taf del M. xanthus es mayor que la homología entre las HMG-CoA-sintasas de la cepa R114 del Paracoccus sp. y los eucariotas. Las HMG-CoA-sintasas bacterianas y las mevalonato-difosfato-descarboxilasas bacterianas comparten una homología sustancial con sus ortólogos eucariotas. Las HMG-CoA-sintasas arqueanas forman un grupo afín más distante de enzimas (Wilding y col., lugar citado) y en las arqueas no se encuentra ortólogos de la mevalonato-difosfato-descarboxilasa [Smit y Mushegian, Genome Res. 10, 1468-1484, 2000].
Se realizan alineamientos de la mevalonato-quinasa (Mvk) (SEQ ID NO: 49) y la fosfomevalonato-quinasa (Pmk) (SEQ ID NO: 51) de la cepa R114 del Paracoccus sp. con proteínas ortólogas de otras bacterias, a saber: el Streptococcus pneumoniae (AAG02455) (SEQ ID NO: 95), Streptococcus pyrogenes (AAGo2450) (SEQ ID NO: 96), Entereococcus faecalis (AAG02440) (SEQ ID NO: 97), Enterococcus faecium (AAG02445) (SEQ ID NO: 98), Staphylococcus haemolyticus (AAG02430) (SEQ ID NO: 99), Staphylococcus epidermis (AAG02435) (SEQ ID NO: 100), Staphylococcus aureus (AAG02424) (SEQ ID NO: 101), Streptomyces sp. CL190 (Q9KWG5) (SEQ ID NO: 102), Streptomyces griseolosporeus (Q9KWF9) (SEQ ID NO: 103) y Borrelia burgdorferi (051631) (SEQ ID NO: 104)(Mvk); y Streptococcus pneumoniae (AAG02457) (SEQ ID NO: 105), Streptococcus pyrogenes (AAG02452) (SEQ ID NO: 106), Entereococcus faecalis (AAG02442) (SEQ ID NO: 107), Enterococcus faecium (AAG02447) (SEQ ID NO: 108), Staphylococcus haemolyticus (AAG02432) (SEQ ID NO: 109), Staphylococcus epidermis (AAG02437) (SEQ ID NO: 110), Staphylococcus aureus (AAG02426) (SEQ ID NO: 111), Streptomyces sp. CL190 (Q9KWG3) (SEQ ID NO: 112), Streptomyces griseolosporeus (Q9KWF7) (SEQ ID NO: 113) y Borrelia burgdorferi (051630) (SEQ ID NO: 114) (Pmk). Los números de registro de las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ se indican entre paréntesis después del nombre de cada organismo.
Hay mucha menos homología entre las quinasas bacterianas que entre los ortólogos bacterianos de otras enzimas de la vía del mevalonato. La mevalonato-quinasa de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 49) tiene un inserto de 37 aminoácidos en la región terminal amino, que carece de otras mevalonato-quinasas. Junto con las Mvk bacterianas, algunas enzimas arqueanas, p. ej. las del Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum y Pyrococcus abyssi, se hallan entre los mejores homólogos de la Mvk de la cepa R114 del Paracoccus sp. La homología entre las fosfomevalonato-quinasas bacterianas es incluso más débil que la homología entre las mevalonato-quinasas bacterianas. Las proteínas de mejores homologías con la Pmk de la cepa R114 del Paracoccus sp. (SEQ ID NO: 51) son las Mvk de las arqueas, p. ej. el Aeropyrum pernix, Pyrococcus horikoshii, M. thermoautotrophicum, P. abyssi y A. fulgidus. Dado que no se encuentran Pmk en las arqueas (Smit y Mushegian, lugar citado), esto sugiere que la misma quinasa puede realizar las dos fosforilaciones.
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Ejemplo 5 Sobreexpresión de los genes de la vía del mevalonato y los genes idi de la cepa R114 del Paracoccus sp. en E. coli
Clonación y expresión del operón mevalonato en E. coli. Se emplea un clon \lambda, llamado clon 16, de la biblioteca \lambda de la cepa R114 del Paracoccus sp. (ver ejemplo 4) como molde de la amplificación PCR del operón de mevalonato completo. Para la PCR se emplean los cebadores Mevop-2020 y Mevop-9027 (tabla 16).
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TABLA 16 Cebadores empleados para la amplificación del operón de mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp
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Se clona el producto resultante de la PCR en TOPO-XL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), formándose el plásmido TOPO-XL-mev-op16. Se corta el inserto que lleva el operón mevalonato con HindIII y SacI y se clona en el vector pBBRIMCS2 cortado con HindIII-SacI [Kovach y col., Gene 166, 175-176, 1995], formándose el plásmido pBBR-K-mev-op16. Se utiliza el plásmido pBBR-K-mev-op16 para transformar la cepa TG1 de E. coli competente en electroporación [Stratagene, La Jolla, CA; Sambrook y col., en: Nolan, C. (coord.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (segunda edición), p. A.12, 1989]. Se cultivan dos transformantes positivos representativos (E. coli TG1/pBBR-K-mev-op16-1 y E. coli TG1/pBBR-K-mev-op16-2) en caldo Luria (LB, GibcoBRL, Life Technologies) que contiene 50 mg/l de canamicina y se ensaya su actividad de HMG-CoA-reductasa (codificada por el gen mvaA de la cepa R114 del Paracoccus sp.) aplicando los métodos descritos en el ejemplo 1. La E. coli no posee un gen que codifique a la enzima HMG-CoA-reductasa, de ahí la falta de actividad detectable. Los extractos brutos de los dos transformantes representativos de E. coli TG1/pBBR-K-mev-op16 tienen una actividad de HMGCoA-reductasa fácilmente medible, lo cual demuestra la expresión heteróloga del gen mvaA clonado.
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TABLA 17 Actividad de HMG-CoA-reductasa en los extractos brutos de células Tg1 de E. coli TG1 que llevan el aglomerado del gen mevalonato clonado de la cepa R114 del Paracoccus sp
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Clonación y expresión del gen idi y genes individuales de la vía de mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. en E. coli. Las regiones codificadoras de los genes del operón mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. se amplifican por PCR empleando los cebadores recogidos en la tabla 18. Los cebadores se diseñan de tal manera que los codones de inicio ATG constituyan la segunda mitad del sitio NdeI (sitio de reconocimiento de rotura CATATG) y se introducen los sitios BamHI (GGATCC) inmediatamente después de los codones de paro. Se clonan todos los productos de la PCR en el vector pCR®2.1-TOPO. Los nombres de los vectores resultantes se incluyen en la lista de la tabla 19. Excepto el gen de mevalonato-quinasa, todos los genes contienen los sitios de restricción de BamHI, NdeI o EcoRI, que tienen que eliminarse para facilitar los posteriores pasos de clonación. Los sitios se eliminan introduciendo mutaciones silenciosas empleando el kit llamado QuikChange^{TM}site-directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) y los oligonucleótidos que figuran en la tabla 20. Las regiones codificadoras mutagenizadas se cortan de los plásmidos TOPO con BamHI y NdeI y se ligan a los vectores de expresión pDS-His y pDS cortados con BamHI-NdeI.
Estos vectores de expresión se derivan del pDSNdeHis, que se describe en el ejemplo 2 de EP 821,063. Se construye el pDS-His a partir del pDSNdeHis por deleción del NheI de 857 bp y del fragmento XbaI que lleva un gen silencioso de cloranfenicol-acetiltransferasa. Se construye el plásmido pDS a partir del pDS-His sustituyendo un fragmento pequeño de EcoRI-BamHI por los cebadores fusionados S/D-1 (5' AATTAAAGGAGGGTTTCATATGAATTCG) (SEQ ID NO: 117) y S/D-2 (5' GATCCGAATTCATATGAAACCCTCCTTT) (SEQ ID NO: 118).
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TABLA 18 Oligonucleótidos para la clonación de los genes del operón mevalonato
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TABLA 19 Nombres de plásmidos de expresión y compuestos intermedios de construcción
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TABLA 20 Oligonucleótidos para la mutagénesis dirigida a sitio
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La cepa M15 de E. coli [Villarejo y Zabin, J. Bacteriol. 120, 466-474, 1974] que lleva el plásmido pREP4 (número de registro del EMBL/GenBank: A25856) que contiene al lacI (represor de lac) se transforma con las mezclas de ligación y se seleccionan las células recombinantes por crecimiento en placas de LB-agar suplementado con 100 mg/l de ampicilina y 25 mg/l de canamicina. Los clones positivos que contienen el inserto del gen del operón correcto de mevalonato se verifican por PCR.
Para la expresión de los genes insertados, se cultiva cada una de las cepas de E. coli en medio LB que contiene 25 mg/l de canamicina y 100 mg/l de ampicilina a 37ºC durante una noche. Al día siguiente se inoculan 25 ml de medio fresco con 0,5 ml de los cultivos de la noche y se cultivan las mezclas resultantes a 37ºC. Cuando la OD_{600} de los cultivos alcanza el valor de 0,4, se induce la expresión de los genes clonados por adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM y se continúa la incubación de los cultivos (con agitación) durante cuatro horas, pasado este tiempo se recogen las células por centrifugación.
La preparación del extracto en bruto, los ensayos de la HMG-CoA-reductasa y los ensayos de la isomerasa IPP se realizan del modo descrito en el ejemplo 1. En las tablas 21 y 22 se recogen las actividades de HMG-CoA-reductasa y isomerasa IPP, respectivamente, en las cepas recombinantes de E. coli. Una vez realizada la inducción de IPTG, las cepas M15/pDS-mvaA y M15/pDS-idi contienen niveles altos de actividad de HMG-CoA-reductasa y de isomerasa IPP, respectivamente. Esto ilustra la capacidad de sobreexpresar los genes de la vía del mevalonato (y sobreproducir sus productos genéticos cognatos en forma activa) de la cepa R114 del Paracoccus sp. en la E. coli.
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TABLA 21 Inducción de la actividad de HMG-CoA-reductasa en cepas de E. coli que sobreexpresan el gen mvaA clonado de la cepa R114 del Paracoccus sp
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Los extractos brutos empleados para los ensayos enzimáticos se analizan por electroforesis con dodecilsulfato sódico a través de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Para las cepas M15/pDS-mvaA de E. coli yM15/pDS-His-mvaA de E. coli, la presencia o ausencia de una proteína altamente expresada del peso molecular esperado (36,3 kD) guarda relación con la actividad de HMG-CoA-reductasa medidas en los extractos (tabla 21). La ausencia de la proteína marcada con puede explicarse por la expresión reducida a nivel de transcripción o traducción por la inestabilidad del mRNA o de la proteína. Los extractos brutos de M15/pDS-idi de E. coli y de M15/pDS-His-idi de E. coli presentan ambosproteínas altamente expresadas de los pesos moleculares esperados de 37,3 kD y 39,0 kD, respectivamente. Sin embargo, solamente el extracto de la M15/pDs-idi de E. coli tiene más actividad de isomerasa IPP (tabla 22), lo cual indica que la forma de la enzima marcada con histidina no es funcional en estas condiciones.
Con el análisis SDS-PAGE de los extractos brutos de las cepas de E. coli que sobreexpresan los cuatro genes restantes de operón mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. (hcs, pmk, mvk y mvd, ver tabla 19) no se detecta una expresión de elevada de la forma nativa de la enzima después de la inducción IPTG, a pesar de que no puede descartarse un cierto grado de expresión. Por otro lado, se observa una expresión elevada en la forma marcada con His de las cuatro proteínas.
Ejemplo 6 Producción mejorada de zeaxantina en cepa R114 del Paracoccus sp. por sobreexpresión del gen crtE
Construcción de los plásmidos pBBR-K-Zea4, pBBR-K-Zea4-up y pBBR-K-Zea4-down y efectos de estos plásmidos en la producción de zeaxantina en la cepa R114 del Paracoccus sp. El aglomerado de genes de carotenoide (crt) de la cepa R1534 del Paracoccus sp. se escinde del plásmido pZea-4 [Pasamontes y col., Gene 185, 35-41, 1997] en forma de fragmento BamHI-EcoRI de 8,3 kb. Se liga este fragmento que contiene el aglomerado genético crt al vector pBBR1MCS-2 (GenBank, nº de registro: U23751) cortado con BamHI y EcoRI, formándose el pBBR-K-Zea4. Se introduce el plásmido pBBR-K-Zea4 en la cepa R114 del Paracoccus sp. por conjugación para comprobar si da lugar a una mejor producción de zeaxantina. Se ensayan la cepa R114 de control y dos materiales aislados de la cepa R114/pBBR-K-Zea4 para comprobar su producción de zeaxantina en cultivos en matraces agitables (empleando el medio 362F/2, ver ejemplo 11). Los datos recogidos en la tabla 23 demuestran que las dos cepas recombinantes que llevan el plásmido pBBR-K-Zea4 producen niveles significativamente mayores de zeaxantina que la R114 y tienen velocidades de producción significativamente mayores (mg de zeaxantina/OD_{660}). Esto sugiere que uno o más de los genes dentro del inserto clonado en pBBR-K-Zea4 codifica a la o la(s) enzimas que limitaban las producción de zeaxantina en la cepa R114 del Paracoccus sp.
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TABLA 23 Producción de zeaxantina en las cepas R114 y R114/pBBR-K-Zea4
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Para localizar el efecto positivo se crean dos derivados plásmidos que contienen las regiones subclonadas del inserto clonado presente en el pBBR-K-Zea4. La región ascendente (upstream) del inserto pBBR-K-Zea4, que contiene el ORF 5 y los genes atoB y crtE, (Pasamontes y col., lugar citado) está flanqueada por sitios únicos para las enzimas de restricción XbaI y AvrII. Se construye el plásmido pBBR-K-Zea4-down por digestión del pBBR-K-Zea4 con estas dos enzimas y deleción de la región "upstream". De forma similar se construye el plásmido pBBR-K-Zea4-up por deleción de la región descendente (downstream) dentro del inserto clonado en el pBBR-K-Zea4, empleando las enzimas de restricción EcoRV y StuI. Se transfieren los dos nuevos plásmidos a la cepa R114 del Paracoccus sp. por conjugación. Se compara la producción de zeaxantina (cultivo en matraces agitables, en las mismas condiciones que se han descrito antes) en las cepas R114 (hospedante control), R114/pBBR-K (control de vector vacío), R114/ pBBRK-Zea4-down y R114/pBBR-K-Zea4-up (tabla 24). Los datos demuestran claramente que el efecto positivo en la producción de zeaxantina se debe a la presencia del segmento clonado que contiene al ORF5, atoB y crtE,en múltiples copias, es decir, el inserto presente en el plásmido pBBR-K-Zea4-up. Se construye una serie de plásmidos de deleción a partir del pBBR-K-Zea4-up. Introduciendo cada uno de estos plásmidos en la cepa R114 y comprobando la producción de zeaxantina se determina que era la sobreexpresión del gen crtE lo que aportaba una producción mayor de zeaxantina en las cepas R114/pBBR-KZea4 y pBBR-K-Zea4-up. Este resultado es consistente con que la actividad de GGPP-sintasa (codificada por el crtE) está limitando la producción de zeaxantina en la cepa R114 del Paracoccus sp. Aplicando los métodos descritos en el ejemplo 1, se encuentra que el extracto bruto de la cepa R114/pBBR-K-Zea4-up tiene una actividad de GGPP-sintasa 2,6 veces mayor que la R114. Para comprobar directamente este hecho se construye un nuevo plásmido que permita solamente la sobreexpresión del gen crtE del modo que se describe en las dos secciones que siguen.
TABLA 24 Producción de zeaxantina en cepas que llevan derivados de deleción del plásmido pBBR-K-Zea4
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Construcción de vectores de expresión pBBR-K-PcrtE y pBBR-tK-PcrtE. Se corta el vector pBBR1MCS-2 con BstXI y Bsu36I y se liga el fragmento mayor con los oligonucleótidos fusionados MCS-2 (5' TCAGAATTCGGTAC
CATATGAAGCTTGGATCCGGGG 3') (SEQ ID NO: 145) por arriba y MCS-2 (5' GGATCCAAGCTTCATATGG
TACCGAATTC 3') (SEQ ID NO: 146) por abajo, formándose el vector pBBR-K-Nde. La región ascendente (upstream) de 270 bp del gen crtE del conglomerado genético del carotenoide de la cepa R114 del Paracoccus sp., que contiene el promotor putativo crtE (PcrtE) que incluye el sitio de fijación del ribosoma y el codón de inicio crtE (Pasamontes y col., lugar citado) se amplifica a partir del DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. por PCR con los cebadores crtE-up (5' GGAATTCGCTGCTGAACGCGATGGCG 3') (SEQ ID NO: 147) y crtE-down (5' GGGGTACCATATGTGCCTTCGTTGCGTCAGTC 3') (SEQ ID NO: 148). Se corta el producto de la PCR con EcoRI y NdeI y se inserta en la estructura del pBBR-K-Nde cortado con EcoRI-NdeI, formándose el plásmido pBBR-K-PcrtE. Se incluye el sitio NdeI, que contiene el codón de inicio ATG del crtE, en el cebador crtE-down. Por lo tanto, cualquier región codificadora introducida con el codón de inicio insertado en el sitio NdeI debería expresarse empleando el sitio de fijación ribosómica del crtE. Se corta el plásmido pBBR-K-PcrtE con BamHI y se insertan los oligonucleótidos fusionados pha-t-up (5' GATCCGGCGTGTGCGCAATTTAATTGCGCACACGCCCCCTGCGTTTAAAC 3') (SEQ ID NO: 149) y pha-t-down (5' GATCGTTTAAACGCAGGGGGCGTGTGCGCAATTAAATTGCGCACACGCCG 3') (SEQ ID NO: 150). Se verifica la inserción por secuenciación y la versión del plásmido que tiene los óligos insertados en la orientación que reconstituye el sitio BamHI en posición más próxima al promotor PcrtE se llama pBBR-tK-PcrtE. La secuencia insertada lleva un terminador transcripcional putativo hallado entre los genes phaA y phaB de la cepa R114 del Paracoccus sp. (ver ejemplo 10) y, por consiguiente, debería asegurar la terminación correcta de los transcritos iniciados por el promotor PcrtE.
Construcción del plásmido pBBR-K-PcrtE-crtE-3. Para construir un plásmido multi-copia de mayor expresión del gen crtE en la cepa R114 del Paracoccus sp. hospedante, se amplifica el gen crtE a partir del plásmido p59-2 (Pasamontes y col., lugar citado) por PCR empleando los cebadores crtE-Nde (5' AAGGCCTCATATGACGCC
CAAGCAGCAATT 3') (SEQ ID NO: 151) y crtE-Bam (5' CGGGATCCTAGGCGCTGCGGCGGATG 3') (SEQ ID NO: 152). Se clona el fragmento amplificado en el vector pCR®2.1-TOPO, formándose el plásmido TOPO-crtE. Se subclona el fragmento NdeI-BamHI del TOPO-crtE en el plásmido pBBR-K-PcrtE digerido con NdeI-BamHI, formándose el pBBR-K-PcrtE-crtE. Finalmente se construye el pBBR-K-PcrtE-crtE-3 por sustitución del fragmento menor BglII del pBBR-K-PcrtE-crtE por el fragmento menor Bg/II del pBBRK-Zea4-up. Se transfiere el plásmido pBBR-K-PcrtE-crtE-3 a la cepa R114 del Paracoccus sp. por electroporación. Aplicando los métodos descritos en el ejemplo 1, se encuentra que la actividad de GGPP-sintasa de los extractos brutos es 2,9 veces mayor en la cepa R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3 que en la cepa R114. Este elevado grado de actividad es similar al observado en R114/pBBR-K-Zea4-up. En la tabla 25 se demuestra que la producción de zeaxantina en la cepa R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3 es esencialmente idéntica a la de la cepa R114/pBBR-K-Zea4-up.
TABLA 25 Comparación de la producción de zeaxantina en las cepas R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3 y R114/pBBR-KZea4-up
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Ejemplo 7 Expresión de genes individuales de operón de mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. en el hospedante nativo, la cepa R114 del Paracoccus sp
Expresión de genes individuales clonados del operón de mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. en la cepa hospedante R114 del Paracoccus sp. Se escinden las regiones codificadoras mutagenizadas de los genes del operón mevalonato en plásmidos TOPO (ver ejemplo 5) con BamHI y NdeI y se ligan con el vector pBBR-tK-PcrtE (ver ejemplo 6) cortado con BamHI-NdeI. Se introducen los plásmidos resultantes pBBR-tK-PcrtE-mvaA, pBBR-tK-PcrtE-idi, pBBR-tK-PcrtE-hcs, pBBR-tK-PcrtE-mvk, pBBRtK-PcrtE-pmk y pBBR-tK-PcrtE-mvd en la cepa R114 del Paracoccus sp. por electroporación. Se seleccionan los transformantes en medio agar que contiene 50 mg/l de canamicina y se verifican por PCR.
Para ilustrar que los genes de la vía mevalonato obtenidos a través de plásmidos pueden expresarse en la cepa hospedante nativa R114 del Paracoccus sp. se compara la actividad de HMG-CoA-reductasa en los extractos brutos de las cepas R114/pBBR-K (control) y R114/pBBR-tK-PcrtE-mvaA (los métodos empleados se han descrito en el ejemplo 1). Las actividades específicas de HMG-CoA-reductasa en las cepas R114/pBBR-K y R114/pBBR-tK-PcrtE-mvaA son de 2,37 U/mg y 6,0 U/mg, respectivamente. Por lo tanto, la presencia del gen mvaA en un plásmido multicopia (y expresado a partir del promotor PcrtE) da lugar a un aumento por un factor 2,5 de la actividad de HMG-CoA-reductasa con respecto a la actividad base (es decir, codificada por cromosomas) de la cepa R114 que lleva el vector pBBR-K vacío.
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Ejemplo 8 Construcción de "mini-operones" para la sobreexpresión simultánea de genes clonados de la vía mevalonato con el gen crtE de la cepa R114 del Paracoccus sp
Construcción de plásmidos. Tal como se indica en el ejemplo 6, la introducción del plásmido pBBR-K-PcrtE-crtE-3 en la cepa R114 del Paracoccus sp. se traduce en una mayor producción de zeaxantina, lo cual indica que la actividad de GGPP-sintasa limitaba la cantidad de la biosíntesis de la zeaxantina en la cepa R114. En el ejemplo 7 se demuestra además que los genes que codifican a las enzimas de la vía del mevalonato podrían sobreexpresarse en la cepa hospedante nativa R114 del Paracoccus sp. y esto se traduciría en una mayor actividad de la enzima codificada. Sin embargo, ninguna de las cepas recombinantes de la cepa R114 del Paracoccus sp. que lleva plásmidos que contienen cada gen individual del operón mevalonato presenta una mayor producción de zeaxantina si se compara con la cepa R114. Es posible que el beneficio de la sobreexpresión de los genes del operón mevalonato en la cepa R114 del Paracoccus sp. quede enmascarado por el "cuello de botella" en dirección descendente de la vía de la zeaxantina (GGPP-sintasa). La creación de plásmidos que permitan la sobreexpresión simultánea de cada gen de la vía del mevalonato (o quizás combinaciones de estos genes) junto con el crtE podría aliviar todas las limitaciones de productividad de la vía sintética de zeaxantina en su conjunto, mejorando así la producción de zeaxantina. En la sección siguiente se describe la creación de "mini-operones" diseñados para permitir la co-sobreexpresión del crtE y de cada uno de los genes que codifican a las cinco enzimas de la vía del mevalonato.
Los genes crtE, mvaA, idi y mvk se escinden de los respectivos plásmidos TOPO (descritos en los ejemplos 5 y 6) con BamHI y NdeI y se ligan al vector pOCV-1 (descrito en el ejemplo 12) cortado con BamHI-NdeI. En gen crtE no tiene la adenina como último nucleótido de la región codificadora y, además, tiene un codón de paro TAG en lugar del TGA y una distancia inadecuada entre el codón de inicio y el sitio BamHI. Por lo tanto, el extremo del crtE no cumple los requisitos de los vectores de construcción de operones (véase el ejemplo 12) y el crtE tiene que ser el último gen en cualquier operón construido con pOCV-1-crtE. Para cumplir esta exigencia de una adenina como primer nucleótido del segundo codón y el último nucleótido del último codón, tienen que introducirse mutaciones en los tres genes del operón mevalonato. El segundo codón de pmk, el GAT, que codifica a la Asp, se cambia por AAT, que codifica a la Asn. El último codón de mvd termina en una T y los últimos codones de pmk y hcs terminan en una C. Cambiando estos nucleótidos por A se generan mutaciones silenciosas, excepto para pmk en el que el último aminoácido se cambia de Asp a Glu. Se diseñan oligonucleótidos para introducir los cambios necesarios mediante PCR. Las secuencias de los oligonucleótidos y los moldes empleados para estas reacciones PCR se recogen en la tabla 26. Todos los productos de la PCR se clonan en el vector pCR®2.1-TOPO, formándose los plásmidos TOPO-mvd^{OCV}, TOPO-pmk^{OCV} y TOPO-hcs^{OCV}. Se escinden los insertos con NdeI y BamHI y se ligan a la estructura del pOCV-2 (ver ejemplo 12) cortada con NdeI-BamHI. Los pasos finales de clonación para ensamblar cada uno de los "mini-operones" son similares y se ilustran en el esquema representativo de la construcción del pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3.
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TABLA 26 Oligonucleótidos y moldes empleados para la PCR de la construcción de los plásmidos TOPO-mvd^{OCV}, TOPO-pmk^{OCV} y TOPO-hcs^{OCV}
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Ejemplo 9 Clonación y secuenciación del gen ispA que codifica a la FPP-sintasa de la cepa R114 del Paracoccus sp
Dado que la FPP-sintasa está situada en vía central de biosíntesis de la zeaxantina en la cepa R114 del Paracoccus sp., el aumento de la actividad de esta enzima por aumento de la dosificación del gen ispA tiene el potencial de mejorar la producción de zeaxantina. Por esta razón se clona el gen ispA de la cepa R114 del Paracoccus sp. y se secuencia del modo siguiente. Las secuencias de aminoácidos de seis FPP-sintasas bacterianas se obtienen de bases de datos públicas. Estas secuencias tienen varias regiones muy conservadas. Dos regiones y los oligonucleótidos empleados para la PCR se recogen en la tabla 27.
La PCR con los oligonucleótidos GTT-1 y GTT-2, empleando como molde el DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp., da lugar a un producto del tamaño esperado. El producto de la PCR se clona en el vector pCR®2.1-TOPO y se secuencia. Se emplea el fragmento clonado como sonda para el análisis Southern del DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. y se encuentra que se hibrida con el fragmento BamHINcoI de aprox. 1,9 kb. Se corta el DNA de la cepa R114 del Paracoccus sp. con BamHI y NcoI y se separan los fragmentos por electroforesis a través de gel de agarosa. Se aísla la región entre 1,5 y 2,1 kb y se clona con los sitios BamHI y NcoI de un vector de clonación. Después se explora la biblioteca parcial empleando como sonda el fragmento ispA-PCR y se aíslan dos clones positivos. La secuenciación confirma que los plásmidos de ambos clones contienen el gen ispA. En dirección ascendente (upstream) del ispA (SEQ ID NO: 159) está el gen de la pequeña subunidad de exonucleasa VII, el XseB (SEQ ID NO: 158), y en sentido descendente (downstream) está el gen dxs (SEQ ID NO: 160) que codifica a la 1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa. Este es el mismo ordenamiento de genes que se encuentra en la E. coli. La secuencia del fragmento NcoI-BamHI se ilustra en la SEQ ID NO: 157, las secuencias de aminoácidos de XseB, IspA y Dxs se ilustran en la SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 160, respectivamente. El codón de inicio del ispA puede ser el GTG o el ATG, formándose dos y un resto metionina, respectivamente, en el extremo amino del ispA nativo.
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Aplicando la misma estrategia general de clonación que en los ejemplos 5-7, se construye un nuevo plásmido, el pBBR-tK-PcrtE-ispA-2, que permite la sobre expresión del gen ispA en la cepa hospedante nativa R114 del Paracoccus sp. Se introduce el plásmido en la cepa R114 por electroporación, y se confirman los transformantes por PCR. Se cultivan tres transformantes representativos y una cepa de control (R114/pBBR-K) en un medio 362F/2 (ejemplo 11), se preparan los extractos brutos y se ensayan para determinar la actividad del producto del gen ispA, la FPP-sintasa, con arreglo a los métodos descritos en el ejemplo 1. La actividad específica de la FPP-sintasa de base (codificada cromosómicamente) en el R114/pBBR-K es de 62,6 U/mg. La actividad de FPP-sintasa de los tres transformantes es de 108,3 U/mg (aumento del 73%), 98,5 U/mg (aumento del 57%) y 83,8 U/mg (aumento del 34%), lo cual demuestra la sobreexpresión del gen ispA y la superproducción de su producto, la FPP-sintasa, en una forma activa de la cepa R114 del Paracoccus sp.
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TABLA 27 Oligonucleótidos diseñados a partir de dos péptidos ispA bacterianos conservados
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Ejemplo 10 Clonación y secuenciación de los genes que codifican a la acetil-CoA-acetiltransferasa de la cepa R114 del Paracoccus sp
El primer paso comprometido de la biosíntesis de IPP es la condensación de la acetil-CoA y acetoacetil-CoA en hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) por la HMG-CoA-sintasa. Se forma el sustrato acetoacetil-CoA con la enzima acetil-CoA-acetiltransferasa (también conocida como acetoacetil-CoA-tiolasa o \beta-cetotiolasa) por condensación de dos moléculas de acetil-CoA. Dado que esta reacción conduce al metabolismo central (de la acetil-CoA) a la biosíntesis de isoprenoide a través de la vía del mevalonato, un aumento de la actividad de la acetil-CoA-acetiltransferasa por amplificación genética tiene el potencial de aumentar el flujo de carbono a los carotenoides y otros isoprenoides "in vivo". En la cepa R114 del Paracoccus sp. hay por lo menos dos genes, el atoB y el phaA, que codifican a las acetil-CoA-acetiltransferasas. El extremo del gen atoB está situado 165 nucleótidos en sentido ascendente (upstream) del inicio del crtE en las cepas R1534(US 6,087,152) y R114 (esta solicitud) del Paracoccus sp. La secuencia de nucleótidos del gen atoB y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la acetil-CoA-acetiltransferasa codificada de la cepa R1534 del Paracoccus sp. se ilustran en la SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 176, respectivamente.
Utilizando la misma estrategia general descrita en el ejemplo 5, se clona el gen atoB en los plásmidos pDS y pDS-His. Los nuevos plásmidos, el pDS-atoB y el pDS-His-atoB se introducen en la cepa M15 de la E. coli. Se cultivan las cepas resultantes M15/pDS-atoB yM15/pDS-His-atoB con y sin inducción de IPTG (del modo descrito en el ejemplo 5) y se preparan los extractos brutos para los ensayos de acetil-CoA-acetiltransferasa (los métodos aplicados se describen en el ejemplo 1) y para el análisis SDS-PAGE. Las actividades específicas de acetil-CoA-acetiltransferasa en extractos de M15/pDS-atoB yM15/pDSHis-atoB (con inducción de IPTG) son de 0,2 U/mg y 13,52 U/mg, respectivamente. La actividad basal medida en la en E. coli sin los plásmidos es de 0,006 U/mg. Después de la inducción de IPTG se superproduce el producto del gen atoB, la acetil-CoA-acetiltransferasa, en la E. coli M15. Se superproducen tanto la M15/pDS-atoB como su forma marcada con His (la M15/pDS/his-atoB). El grado de superproducción es mucho mayor en la M15/pDS-His-atoB, lo cual es consistente con la actividad de acetil-CoA-acetiltransferasa medida en los extractos (inducidos) de las dos cepas.
La acetoacetil-CoA es también el sustrato del primer paso comprometido de la biosíntesis del polihidroxialcanoato (PHA). En muchas bacterias, los genes que intervienen en la biosíntesis del PHA se agrupan en operones [Madison y Huisman, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 21-53, 1999]. En el Paracoccus denitrificans, los genes phaA y phaB que codifican a la acetil-CoA-acetiltransferasa y acetoacetil-CoA-reductasa, respectivamente, están aglomerados en un operón [Yabutani y col., FEMS Microbiol. Lett. 133, 85-90, 1995], mientras que el phaC, el gen que codifica a la última enzima de la vía de biosíntesis, lapoli(3-hidroxialcanoato)-sintasa, no forma parte de este operón [Ueda y col., J. Bacteriol. 178, 774-779, 1995]. Los fragmentos de PCR que contienen partes del phaA de la cepa R1534 del Paracoccus sp. y del phaC de la cepa R114 del Paracoccus sp. se obtienen empleando cebadores basados en las secuencias de los genes phaA y phaC del P. denitrificans. Los fragmentos de PCR se emplean después como sondas para explorar la biblioteca \lambda de la cepa R114 del Paracoccus sp. (ver ejemplo 4).
Se han aislado varios clones \lambda que se hibridan con las sondas phaA o phaC y se verifica la presencia de los genes phaA o phaC en los insertos mediante análisis de las secuencias. Se analizan además tres clones \lambda del phaA por subclonación y secuenciación, con lo cual el phaB se encuentra en posición posterior (downstream) del phaA. Por tanto, como es el caso del P. denitrificans, los genes phaA y phaB está aglomerados, mientras que el gen phaC está situado en otra parte del genoma. La secuencia de nucleótidos del aglomerado del phaAB de la cepa R114 del Paracoccus sp. y las secuencias deducidas de aminoácidos de la acetil-CoA-acetiltransferasa (PhaA) se ilustran en la SEQ ID NO: 177 y las SEQ ID NO: 178 y 179, respectivamente. La aglomeración de los genes que intervienen en la biosíntesis del PHA en los operones sugiere que por lo menos el phaA y el phaB se expresan juntos cuando la célula produce los poli(3-hidroxialcanoatos). Por otro lado, una señal putativa de paro transcripcional se encuentra entre los genes phaA y phaB de la cepa R114 del Paracoccus sp., que está ausente del operón del phaB del P. denitrificans (Yabutani y col., lugar citado). Por tanto, la expresión de los dos genes no se ha podido asociar en la cepa R114 del Paracoccus sp.
Aplicando la misma estrategia general descrita en el ejemplo 5, se clona el gen phaA en el plásmido pDS-His. Se introduce el nuevo plásmido, el pDS-His-phaA, en la cepa M15 de la E. coli. Se cultiva la cepa resultante M15/pDS-His-phaA con y sin inducción de IPTG (del modo descrito en el ejemplo 5) y se preparan los extractos brutos para el análisis SDS-PAGE. Se superproduce PhaA (acetil-CoA-acetiltransferasa) de la cepa R114 marcada con His del Paracoccus sp. después de la inducción con IPTG en el hospedante M15 de E. coli.
Ya se ha mencionado antes el beneficio potencial de amplificar los genes atoB o phaA que codifican a la acetil-Co-acetiltransferasa, para la producción de la zeaxantina. Puede ser beneficioso además para la producción de zeaxantina disminuir o eliminar la actividad de la acetoacetil-CoA-reductasa (el producto del gen phaB) para evitar la diversión de algunas de las acetoacetil-CoA formadas "in vivo" hacia la vía del PHA. Los mutantes de la cepa R114 del Paracoccus sp. carentes de actividad de phaB pueden obtenerse por técnicas de reemplazo genético (reemplazando específicamente el gen phaB de tipo salvaje del cromosoma por una forma inactiva del gen) o por mutagénesis clásica y exploración.
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Ejemplo 11 Modelo para la producción industrial de licopeno empleando mutantes derivados de la cepa R144 del Paracoccus sp
El licopeno es un carotenoide rojo, que es compuesto intermedio de la biosíntesis de la zeaxantina en la nueva especie de Paracoccus representada por la cepa R-1512 y sus derivados mutantes R1534 y R114. El licopeno por sí mismo tiene un potencial comercial significativo, por lo que era interesante comprobar el potencial de la nueva especie de Paracoccus para producir licopeno mediante fermentación industrial. Para obtener mutantes bloqueados de la biosíntesis de la zeaxantina que acumulen licopeno, se somete la cepa R144 del Paracoccus sp. a mutagénesis con luz ultravioleta (UV) y posterior exploración en búsqueda de las colonias rojas. Se realiza la mutagénesis UV del modo siguiente. Un cultivo de la cepa R114 durante una noche se mantiene en medio ME (ver ejemplo 2). Se subcultiva el cultivo de la noche con medio ME fresco (OD_{610} inicial = 0,1) y se incuba a 28ºC durante 3 horas. Se centrifugan partes alícuotas de este cultivo y se lava el culote con tampón de fosfato potásico 20 mM (pH = 7,2). Después de una segunda centrifugación, se suspende de nuevo el culote hasta una OD_{610} final de 0,1. Se introducen partes alícuotas de diez mililitros de la suspensión celular en vasos de precipitados de vidrio, de 100 ml, estériles. Se irradia la capa fina de la suspensión celular con luz UV de una intensidad de 1450 \muW/cm^{2} durante un período de tiempo óptimo, determinado de antemano. Se mezcla la suspensión celular del vaso de precipitados durante la irradiación con un clip sujetapapeles y un agitador magnético. Las suspensiones de células mutagenizadas (y los controles sin mutagenizar) se introducen en placas con medio agar 362/F2 (tabla 28). Se efectúan recuentos por triplicado de las placas viables (en luz de recinto semioscuro) de las suspensiones antes y después de la mutagénesis. Se incuban las placas a 28ºC durante 4-5 días y se puntúan las colonias. Se identifican varias colonias rojas (productoras putativas de licopeno) y se purifican por nueva extensión. Se evalúa también un mutante, llamado UV7-1, determinando su producción de licopeno.
En la tabla 29 se recoge la producción de zeaxantina y de licopeno por la cepa de control R114 y su derivado mutante UV7-1. La cepa R114 produce únicamente zeaxantina. El mutante UV7-1 produce principalmente licopeno, pero también una cantidad residual de zeaxantina, lo cual sugiere que el bloque mutante del UV7-1 (presumiblemente el gen crtY) no está completo. Estos resultados demuestran que es posible derivar cepas productoras de licopeno de la cepa R144 del Paracoccus sp.
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TABLA 28 Composición y preparación del medio 362F/2
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TABLA 29 Producción de zeaxantina y licopeno por la cepa R114 del Paracoccus sp. y su derivado mutante rojo UV7-1
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Ejemplo 12 Modelo de producción industrial de astaxantina por fermentación empleando cepas derivadas de la cepa R144 del Paracoccus sp
La astaxantina es un carotenoide comercialmente importante que se emplea en la industria de cultivos acuáticos. En el documento EP 872,554 se describe que la producción de astaxantina podría lograrse en E. coli introduciéndole plásmidos que contengan combinaciones de los genes de carotenoide (crt) clonados de la cepa R1534 del Paracoccus sp. y la cepa E-396^{T} del Paracoccus carotinifaciens. Juntos, los genes crt clonados (crtEBIYZ) y crtW (\beta-caroteno \beta-4-oxigenasa) codifican la totalidad de la vía biosintética del FPP que pasa por la zeaxantina y llega a la astaxantina. Las secuencias de los genes E-396 crtW del P. carotinifaciens, R1534 crtZ del Paracoccus sp. y R1534 crtE del Paracoccus sp. y los polipéptidos codificados se describen en las SEQ ID NO: 180 y 181 (crtW); 182 y 184 (crtZ); y 184 y 185 (crtE). Sin embargo, no se indica que pueda lograrse la producción de astaxantina en la familia de la cepa hospedante R144 del Paracoccus sp. Para demostrar la utilidad de las cepas recombinantes derivadas de la cepa R114 para la producción de la astaxantina se introduce el gen crtW clonado (SEQ ID NO: 180) en la cepa R114 del modo siguiente.
TABLA 30 Cebadores empleados para el trabajo descrito en el ejemplo 12
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Se amplifica el gen crtW por PCR a partir del aglomerado crt clonado de la cepa E-396^{T} del Paracoccus carotinifaciens (Tsubokura y col., lugar citado; EP 872,554) empleando los cebadores crtW-Nde y crtW-Bam (tabla 30). Se diseñan los cebadores de tal manera que el codón de inicio ATG constituya la segunda mitad de un sitio NdeI (sitio de reconocimiento de rotura: CATATG) y se introduce un sitio BamHI (GGATCC) inmediatamente después del codón de paro. Se clona el producto de la PCR en el vector pCR®2.1-TOPO, formándose el plásmido TOPO-crtW. Se escinde el gen crtW con NdeI y BamHI y se subclona en el vector pBBR-K-PcrtE (descrito en el ejemplo 6) cortado con NdeI-BamHI para crear el plásmido pBBR-K-PcrtE-crtW.
Se transfiere el plásmido pBBR-K-PcrtE-crtW a la cepa R144 del Paracoccus sp. aplicando un procedimiento de conjugación bacteriana estándar {la cepa S17 de E. coli [Priefer y col., J. Bacteriol. 163, 324-330, 1985] es el organismo dador}. Se seleccionan los transconjugantes en medio 362F/2 agar (tabla 28) que contiene 50 mg/l de canamicina y se purifican por nueva extensión en el mismo medio. Se confirma la presencia del plásmido pBBR-K-PcrtE-crtW en la cepa por PCR. Se mide la producción de carotenoides por las cepas R114 (hospedante, control), R114/pBBR-K (vector vacío, control) y R114/pBBR-K-PcrtE-crtW en cultivos en matraces agitables del modo descrito en los ejemplos 1 y 2, excepto que se emplea el medio líquido 362F/2 en lugar del medio ME. Los resultados se recogen en la tabla 31. Las cepas de control R114 y R114/pBBR-K producen únicamente zeaxantina. En la cepa R114/pBBR-K-PcrtE-crtW, la zeaxantina queda completamente consumida por la \beta-caroteno-\beta-4-oxigenasa codificada por el plásmido. Sin embargo, aunque se produce astaxantina, los dos cetocarotenoides restantes, la adonixantina y la cantaxantina, se acumulan hasta niveles más elevados. Esto indica un desequilibrio "in vivo" de la \beta-caroteno-hidroxilasa (codificada por el gen crtZ cromosómico de la cepa R114) y la \beta-caroteno-\beta-4-oxigenasa clonada (CrtW).
Para verificar esta hipótesis, se crean dos nuevos plásmidos que contienen los genes crtZ y crtW juntos en mini-operones. Se elige un orden diferente de los genes en los dos constructos (es decir, crtZ-crtW y crtW-crtZ) para probar y crear relaciones diferentes de expresión de los genes crtZ y crtW. La construcción de los nuevos plásmidos requiere ensamblar un conjunto especial de vectores de clonación, del modo siguiente. Se diseña una serie de vectores de construcción de operones (basados en el vector pCR®2.1-TOPO) para facilitar el ensamblado de los genes (en este caso, el crtZ y el crtW) en los operones. Los genes de interés han de tener un codón de inicio ATG, incrustado en el sitio NdeI (CATATG), y un codón de paro TGA seguido inmediatamente por un sitio BamHI.
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TABLA 31 Producción de astaxantina en la cepa R114 del Paracoccus que contiene plásmidos de expresión del gen crtW solos y en combinación con el gen crtZ
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Además, el primer nucleótido después del codón de inicio y el último nucleótido antes del codón de paro tienen que ser adenina y el gen debe carecer de sitio por lo menos para las enzimas BsgI, BseMII, BseRI y GsuI. Se construyen cuatro vectores de construcción de operones, que difieren en el ordenamiento de sus secuencias poliengarce (las SEQ ID NO: 190-197). Los sitios de rotura de las dos primeras enzimas se hallan en el sitio NdeI. Los sitios de rotura para las dos últimas enzimas se hallan delante del sitio BamHi. El sitio BseRI del pOCV-1 y pOCV-4 no es único y no puede utilizarse para la construcción de los operones.
Los genes a ensamablar en operones se insertan en primer lugar individualmente entre los sitios NdeI y BamHI de los vectores apropiados para la construcción de operones. El plásmido resultante, con el gen en posición ascendente (upstream) del operón previsto se corta después con una de las dos enzimas en el extremo del poliengarce y con una enzima que tiene un sitio único dentro de la estructura del vector. El plásmido que contiene el gen del operón previsto en posición descendente (downstream) se corta con una de las dos primera enzimas del poliengarce y se emplea la misma enzima (con un sitio único dentro de la estructura del vector) para el primer plásmido (que contiene el gen deseado en posición ascendente, "upstream"). Se aíslan y se ligan los fragmentos que llevan los genes, formándose un plásmido pOCV que tiene ambos genes entre los sitios NdeI y BamHI. Pueden añadirse más genes de manera similar. Los genes ensamblados se solapan de modo que los dos primeros nucleótidos, TG, del codón de paro TGA del gen situado en posición anterior (upstream) coincidan con los dos últimos nucleótidos del codón de inicio ATG del gen situado en posición posterior (downstream). El mismo solapamiento se encuentra entre los genes del operón (crtZYIB) carotenoide (crt) de la cepa R1534 del Paracoccus sp. (Pasamontes y col., lugar citado).
La estructura del pOCV se deriva del pCR®2.1-TOPO. El sitio BseMII de la región necesario para la replicación, en posición posterior del origen ColE1, se elimina por mutagénesis dirigida a sitio, cambiando el sitio de CTCAG a CACAG. Los tres sitios BseMII restantes y un sitio GsuI se eliminan quitando un fragmento DdeI-Asp700 de 0,8 kb. El vector restante se liga al extremo romo después del llenado del extremo retirado DdeI. Se insertan los poliengarces entre los sitios BamHI y XbaI mediante los oligonucleótidos fusionados con los voladizos 5' apropiados.
Se construye el plásmido pBBR-K-PcrtE-crtZW empleando el vector pOCV-2 de construcción de operones del modo siguiente. Se amplifica el gen crtZ por PCR de la cepa R144 del Paracoccus sp. empleando los cebadores crtZ-Nde y crtZ-Bam (tabla 30). Se diseñan los cebadores de tal manera que el codón de inicio ATG constituya la segunda mitad del sitio NdeI (sitio de reconocimiento de rotura: CATATG) y se introduce el sitio BamHI (GGATCC) inmediatamente después del codón de paro. El producto de la PCR se clona en el vector pCR®2.1-TOPO, formándose el plásmido TOPO-crtZ. Para ensamblar los genes en un mini-operón, ambos genes, el crtZ y el crtW se escinden con NdeI y BamHI de los plásmidos TOPO-crtZ y TOPO-crtW y se subclonan en el vector pOCV-2 cortado con NdeI-BamHI, creándose los plásmidos pOCV-2-crtZ y pOCV-2-crtW. Se corta el plásmido pOCV-2-crtZ con BseMII y PstI (hay un sitio PstI único en el gen de resistencia a la canamicina) y se liga el fragmento de 2,4 kb (que contiene al crtZ) con el fragmento BseRI-PstI del pOCV-2-crtW de 1876 bp, que contiene al crtW. Se corta el plásmido resultante pOCV-2-crtZW con NdeI y BamHI y se liga el fragmento crtZW con la estructura NdeI-BamHI del pBBR-K-PcrtE para formar el pBBR-K-PcrtE-crtZW. Se construye el plásmido pBBR-K-PcrtE-crtWZ de manera similar.
Los datos de la tabla 31 indican que la relación entre adonixantina, cantaxantina y astaxantina no cambia de modo apreciable en la cepa R114/pBBR-K-PcrtE-crtWZ comparada con la cepa pBBR-K-PcrtE-crtW. Sin embargo, en la cepa pBBR-KPcrtE-crtZW,la producción de cetocarotenoides se desplaza en favor de la astaxantina. Este resultado indica que el nivel de expresión depende de la posición del gen dentro del mini-operón y sugiere que aumento "in vivo" el nivel de la actividad de la \beta-caroteno-hidroxilasa se genera un equilibro entre las actividades de esta enzima y de la \beta-caroteno-\beta-4-oxigenasa que es más favorable para la conversión de la zeaxantina en astaxantina.
Los resultados descritos en este ejemplo indican además que es posible, mediante la ingeniería genética apropiada, producir no solo la astaxantina, sino también otros cetocarotenoides de interés comercial en la cepa R144 del Paracoccus sp. o sus afines. Por ejemplo, la expresión de un gen que codifica a la \beta-caroteno-\beta-4-oxigenasa en una mutante crtZ de la cepa R114 (carente de actividad de \beta-caroteno-hidroxilasa) proporcionaría la producción exclusivamente de cetocarotenoides, p. ej., equinenona o cantaxantina, sin co-producción de carotenoides hidroxilados. En su conjunto, los resultados presentados en este ejemplo y en el ejemplo 11 demuestran la amplia utilidad de la cepa R144 del Paracoccus sp. y sus afines para producir carotenoides industrialmente importantes.
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Ejemplo 13 Acumulación de mevalonato en cultivos de genes que sobreexpresan la cepa R144 del Paracoccus sp. de la vía del mevalonato
La sobreexpresión de los genes de la vía del mevalonato en la cepa R144 del Paracoccus sp. conduce a un mayor caudal de carbono a lo largo de la vía del mevalonato. Se describe la construcción del plásmido pBBR-K-mev-op16-2 en el ejemplo 5. Se construye el plásmido pBBR-K-mev-op-up-4 del modo siguiente. Se obtiene un fragmento de DNA que contiene la mayor parte del gen mvaA y los genes idi y hcs enteros en un fragmento de SmaI-SalI de 3,1 kb por digestión parcial de un clon \lambda que contiene el operón mevalonato de la cepa R114 del Paracoccus sp. (ver ejemplo 4). Se subclona este fragmento en pUC19, formándose el plásmido pUC19mev-op-up'. Para facilitar la subclonación se reclona el fragmento KpnI-HindIII del pUC19mev-opup', que contiene los genes de mevalonato, en el vector pBluescriptKS+, formándose el plásmido pBluKSp-mev-opup'. Después se clona un fragmento SalI de 1,7 kb del pUC19mev-op-up' el sitio SalI del plásmido 2ES2-1, que es un plásmido derivado de pUC19 que contiene el fragmento M SalI-EcoRI clonado de la cepa R144 del Paracoccus sp. (véase el ejemplo 4). De este modo se forma el plásmido pUC19mev-op-up-2. Después se obtiene el plásmido pUCmev-op-up-3 por combinación del fragmento BbsI-BsaI del pUC19mev-op-up-2 que lleva el comienzo del operón mevalonato con el fragmento BbsI-BsaI del pBluKSp-mev-op-up' que contiene al idi y al hcs. Por separado se introduce un sitio MluI único entre los sitios NsiI y KpnI del vector pBBR1MCS-2 (véase el ejemplo 5) por inserción del cebador fusionado que contiene el sitio de restricción MluI. Se corta el nuevo vector de clonación resultante, el pBBR-K-Mlu, con MluI y KpnI y se inserta el fragmento MluI-KpnI del pUCmevop-up-3, que contiene los tres primeros genes del operón mevalonato, formándose el plásmido pBBR-K-mev-op-up-3. Después se construye el plásmido pBBR-K-mev-op-up-4 por inserción del fragmento SmaI del plásmido 16SB3, que contiene la mayor parte del gen mvk y el extremo 5' del pmk (el plásmido 16SB3 es un plásmido derivado del pUC19 que contiene el fragmento A SalI-BamHI de la cepa R144 del Paracoccus sp.; véase el ejemplo 4). El inserto del plásmido pBBR-K-mev-op-up-4 contiene la región del promotor de operón mevalonato putativo, los primeros cuatro genes del operón mevalonato y el extremo 5' del pmk.
Se introduce cada uno de los plásmidos pBBR-K-mev-op16-2 y pBBR-K-mev-op-up-4 en la cepa R144 del Paracoccus sp. por electroporación. Se comparan las producciones de zeaxantina y mevalonato de las nuevas cepas con la cepa R114 de control. Se cultivan las cepas en matraces de agitación con deflector en medio líquido 362F/2 (véase el ejemplo 11) durante 72 horas.
En el caso de las cepas R114/pBBR-K-mev-op16-2 y R114/pBBR-K-mev-op-up-4 se añade también canamicina (50 mg/l) a los cultivos. La temperatura de cultivo es de 28ºC y la agitación se realiza a 200 rpm. Se mide la zeaxantina por el método descrito en el ejemplo 1, mientras que el mevalonato de los líquidos sobrenadantes de los cultivos se mide del modo siguiente: se centrifuga una muestra de 0,6 ml de cultivo a 13.000 x g durante 4 minutos. Se añaden cuatrocientos microlitros del líquido sobrenadante a 400 microlitros de metanol y se mezclan en vórtice durante 1 min. Se centrifuga de nuevo la mezcla a 13.000 x g durante 4 minutos. Después se analiza directamente el líquido sobrenadante por cromatografía de gases (CG) empleando el método de Lindemann y col. [J. Pharm. Biomed. Anal. 9, 311-316, 1991] con modificaciones poco importantes del modo siguiente. La CG se realiza en un instrumento Hewlett-Packard 6890plus (Hewlett-Packard, Avondale, PA, EE.UU.) equipado con un inyector del tipo frío en columna y un detector de ionización de llama. Se prepara un microlitro de muestra del modo antes descrito y se inyecta en una columna capilar de gel de sílice fundido (longitud: 15 m; diámetro interior: 0,32 mm) recubierta con una película de 0,52 micras de polietilenglicol reticulado modificado (HP-FFAP, Agilent Technologies, EE.UU.). Como gas portador se emplea el helio, con una presión de entrada de 0,6 bares. La temperatura del inyector programable sube una rampa de 82ºC a 250ºC a razón de 30ºC/minuto. El perfil de temperatura de la temperatura es de 80ºC durante 0,5 minutos, después se efectúa un gradiente lineal de temperatura a razón de a 15ºC/min hasta 250ºC y finalmente se mantiene en 250ºC durante 5 minutos. La temperatura del detector se mantiene en 320ºC.
En el primer ensayo se mide la producción de zeaxantina y mevalonato en las cepas R114 y R114/pBBRK-mev-op16-2 (tabla 32). Las dos cepas producen cantidades similares de zeaxantina, pero la cepa R114/pBBR-K-mev-op16-2 produce un nivel cuatro veces mayor de mevalonato. Estos resultados indican que la sobreexpresión de los genes de la vía del mevalonato en la cepa R144 del Paracoccus sp. se traduce en un mayor caudal de carbono a lo largo de la vía del mevalonato. La acumulación de mevalonato era de esperar, porque la cepa R114/pBBR-K-mev-op16-2 no tiene un gen crtE sobreexpresado y el producto genético crtE (la GGPP-sintasa) se sabe que es un paso que limita la producción de zeaxantina en la cepa R144 del Paracoccus sp. (véanse los ejemplos 6 y 8). Las células que tienen una cantidad limitadora de GGPP-sintasa, después de la superproducción de las enzimas de la vía del mevalonato, sería de esperar que acumularan el FPP y es bien sabido que el FPP es un potente inhibidor de la mevalonato-quinasa [Dorsey y Porter, J. Biol. Chem. 243, 4667-4670, 1968; Gray y Kekwick, BBA 279, 290-296, 1972; Hinson y col. J. Lipids Res. 38, 2216-2223, 1997]. Por consiguiente, la acumulación de FPP resultante de la sobreexpresión de los genes de la vía del mevalonato podría provocar la inhibición de la mevalonato-quinasa, que a su vez se manifiesta en una acumulación de mevalonato en el cultivo.
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TABLA 32 Producción de zeaxantina y mevalonato en las cepas R114 y R114/pBBR-K-mev-op16-2
50
En un segundo ensayo se miden las producciones de zeaxantina y mevalonato en la cepa R114 y dos materiales aislados independientes de R114/pBBR-K-mev-op-up-4 (tabla 33). Estos resultados demuestran una vez más que la sobreexpresión de los genes de la vía del mevalonato aumentan el caudal de carbono a lo largo de la vía del mevalonato.
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TABLA 33 Producción de zeaxantina y mevalonato en las cepas R114 y R114/pBBR-K-mev-op-up-4
51 
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El siguiente material biológico se ha depositado en los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2201, EE.UU., y se le asignan los siguientes números de registro (accession numbers):
52
<110> BERRY, Alan
\hskip1cm
BRETZEL, Werner 
\hskip1cm
HUMBELIN, Markus 
\hskip1cm
LOPEZ-ULIBARRI, Rual 
\hskip1cm
MAYER, Anne 
\hskip1cm
YELISEEV, Alexei 
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<120> PRODUCCIÓN MEJORADA DE ISOPRENOIDES
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<130> C38435/121966
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<160> 197
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
agagtttgat cctggctcag 
\hfill
20 
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<210> 2
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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<220>
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<221> propiedades diversas
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<223> n es c o t
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggctcagg angaacgctg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggaggtga tccagccgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcctacggg aggcagcagt 
\hfill
20 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcagccgc ggtaatac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aactcaaagg aattgacgg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtcccgcaa cgagcgcaac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctacacacg tgctacaatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actgctgcct cccgtaggag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtattaccgc ggctgctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgcgctcg ttgcgggact 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R-1512
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtagactg cgtacaggcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catctgacgc atgt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgatgagt cctgac 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactcaggac tggc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgcgtac aggccca 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgatgagtcc tgaccgaa 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgatgagtcc tgaccgac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgcgtac aggcccc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgcgtac aggcccg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgatgagtcc tgaccgag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> NO SEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Leu o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccsctgatca artaytgggg baaratc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcsctgatca artaytgggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcsatcatca artaytgggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaartayt ggggtaa 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaartayt ggggcaa 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaartayt gggggaa 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaartayt ggggaaa 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> NO SEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Asn o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a o c
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es y o r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acsatggayg csggbccsna ngts 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es t o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es r o y
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgstacctrc gsccvggsnt ncas 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtacctac gsccvgg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtacctgc gsccvgg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctacctac gsccvgg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctacctgc gsccvgg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacctacgsc cvggsttrca 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacctgcgsc cvggsttrca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacctacgsc cvggsgtyca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacctgcgsc cvggsgtyca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2622)..(3644)
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<223> gen mvaA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
56
57
58
59
60
61
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
63
64 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3641)..(4690)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> idi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
66
67
68
69
70
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
73
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4687)..(5853)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hcs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
76
77
78
79
80
81
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
84
85
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5834)..(6970)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mvk
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
87
88
89
90
91
92
93 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
94
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6970)..(7887)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pmk
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
96
97
98
99
100
101
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
103
104 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7880)..(8878)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mvd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
105
106
107
108
109
110
111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
112
113
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces sp. cepa CL190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
115
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces griseolosporeus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
117
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces sp. cepa KO-3899
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
120
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia herbicola 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
122
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
124
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis sp. PCC 6803
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
126
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces sp. CL190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
128
129
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces griseolosporeus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
131
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus solfataricus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
133
134 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rickettsia prowazekii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
135
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Deinococcus radiodurans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
137
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aeropyrum pernix 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
139
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Halobacterium sp. NRC-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
141
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Archaeoglobus fulgidus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
143
144 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pyrococcus abyssi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
145
146
147 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pyrococcus horikoshii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
148
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
150
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Methanococcus jannaschii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
152
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoplasma acidophilum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
154
155 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leishmania major 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
156
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
159
160 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyrogenes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
161
162
163 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecalis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
164
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecium 
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<400> 77
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166
167
168 
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<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus haemolyticus 
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<400> 78
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169
170 
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<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus epidermis 
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<400> 79
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171
172
173 
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<210> 80
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<211> 388
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus 
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<400> 80
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174
175 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus carnosus 
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<400> 81
176
178 
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<210> 82
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<211> 389
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<212> PRT
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<213> Streptomyces sp. CL190
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179
180 
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<210> 83
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<211> 389
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<212> PRT
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<213> Streptomyces griseolosporeus 
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181
182 
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<212> PRT
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183
184 
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<211> 317
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<212> PRT
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185
186 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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187
188 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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189
190 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Enterococcus faecium 
\newpage
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191
193 
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus haemolyticus 
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<400> 89
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194
195 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus epidermis 
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196
197 
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<211> 327
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<212> PRT
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198
199 
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201
202 
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<212> PRT
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<213> Streptomyces griseolosporeus 
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\vskip0.400000\baselineskip
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203
204 
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
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205
206 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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207 
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<212> PRT
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209
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<212> PRT
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<213> Enterococcus faecalis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
211
212 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecium 
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<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
213
214 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus haemolyticus 
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<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
215
216 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus epidermis 
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217
218 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus 
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219
220 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Streptomyces sp. CL190
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221
222 
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Streptomyces griseolosporeus 
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224
225 
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<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi 
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226
227 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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229 
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<211> 335
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Enterococcus faecalis 
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232
233 
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235
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239
240 
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242 
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<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi 
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gggcaagctt gtccacggca cgaccaagca 
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<212> DNA
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cgtaatccgc ggccgcgttt ccagcgcgtc 
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aattaaagga gggtttcata tgaattcg 
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<212> DNA
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gatccgaatt catatgaaac cctccttt 
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<212> DNA
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aaggcctcat atgatttccc ataccccggt 
\hfill
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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cgggatcctc atcgctccat ctccatgt 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgaccgaca gcaaggatca 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc attgacggat aagcgagg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgaaagtgc ctaagatga 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc aggcctgccg gtcgacat 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgagcaccg gcaggcctga agca 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc atccctgccc cggcagcggt t 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atggatcagg tcatccgcgc 
\hfill
30 
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc agtcatcgaa aacaagtc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgactgatg ccgtccgcga 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc aacgcccctc gaacggcg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggcattcg ggcggcatcc aggtctcgct g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcgagacc tggatgccgc ccgaatgccg g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtgcagggc tggattctgt cggaataccc g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggtattcc gacagaatcc agccctgcac g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggctgcgcg ccggcatccg gcatttcgac g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcgaaatg ccggatgccg gcgcgcagcc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtgcgacg ggcgagttct tcgatgcgcg g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcgcatcg aagaactcgc ccgtcgcacc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgcccgtc acatacgacg aatacgttgc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcaacgtat tcgtcgtatg tgacgggcgt g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggctcggg cttggctcct cggcggcggt g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccgccgcc gaggagccaa gcccgagcct c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggcacgctg ctggacccgg gcgacgcctt c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggcgtcg cccgggtcca gcagcgtgcc g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagaattcg gtaccatatg aagcttggat ccgggg 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatccaagc ttcatatggt accgaattc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaattcgct gctgaacgcg atggcg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtaccat atgtgccttc gttgcgtcag tc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccggcgt gtgcgcaatt taattgcgca cacgccccct gcgtttaaac 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcgtttaa acgcaggggg cgtgtgcgca attaaattgc gcacacgccg 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgacgccca agcagcaatt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatccta ggcgctgcgg cggatg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggatcctc atgcctgccg gtcgacatag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggcacat atgaatcagg tcatccgcgc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccggatcct cattcatcga aaacaagtcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgccggatc ctcatcgccc ctcgaacggc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59)..(292)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> XseB
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1185)..(1610)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IspA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (295)..(1158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dxs
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
249
250
251 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
252 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
253
254 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
255 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bradyrhizobium japonicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
256 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhizobium sp. cepa NGR234
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
257 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus stearothermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
258 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
259 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
260 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
261 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaygayga yctgcc 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bradyrhizobium japonicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
262 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhizobium sp. cepa NGR234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
263 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus stearothermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
264 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
265 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
266 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
267 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaygayatcc tggay 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1173)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acetil-CoA acetiltransferasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
268
269
270 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
271
272
273 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1980
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1170)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> phaA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1179)..(1194)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1196)..(1210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1258)..(1980)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> phaB
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
274
275
276
277 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1179)..(1194)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1196)..(1210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
278
279
280 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R114
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1179)..(1194)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> propiedades diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1196)..(1210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición invertida entre genes que constituye una señal putat. de paro transcrip.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
281
282 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus carotinifaciens E-396
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(726)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-caroteno-beta-4-oxigenasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
283
284 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus carotinifaciens E-396
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
286 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(507)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-caroteno-hidroxilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
288 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
289 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 888
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(885)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> farnesiltransferasa o geranilgeranil-difosfato-sintasa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
290
291 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccus sp. R1534
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
292
293 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgagcgcac atgccctgcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatcctc atgcggtgtc ccccttgg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggcctcat atgagcactt gggccgcaat 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatcctca tgtattgcga tccgcccctt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcagcctc aggtcgacat atgcggccgc atccggatcc ctcctcctcc ag 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgtcggag tccagctgta tacgccggcg taggcctagg gaggaggagg tc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcaggagg aggtcgacat atgcggccgc atccggatcc ctgaggctcc ag 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgtcctcc tccagctgta tacgccggcg taggcctagg gactccgagg tc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
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<211> 52
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggagcctc aggtcgacat atgcggccgc atccggatcc ctcctcctgc ac 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
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<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacctcggag tccagctgta tacgccggcg taggcctagg gaggaggacg tg 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 196
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctggaggagg aggtcgacat atgcggccgc atccggatcc ctgaggctgc ac 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
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<211> 52
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<212> DNA
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<213> constructo sintético
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<400> 197
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\hskip-.1em\dddseqskip
gacctcctcc tccagctgta tacgccggcg taggcctagg gactccgacg tg 
\hfill
52

Claims (8)

1. Un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo formado por:
(a) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 340 de la SEQ ID NO: 43;
(b) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 349 de la SEQ ID NO: 45;
(c) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 388 de la SEQ ID NO: 47;
(d) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 378 de la SEQ ID NO: 49;
(e) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 305 de la SEQ ID NO: 51;
(f) una secuencia de aminoácidos indicada como los restos de 1 a 332 de la SEQ ID NO: 53;
(g) una secuencia de aminoácidos de un fragmento de un polipéptido elegido entre el grupo formado por las SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53, el fragmento que tiene la actividad de hidroximetilglutaril-CoA-reductasa (HMG-CoA-reductasa), isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa o difosfomevalonato-descarboxilasa;
(h) una variante modificada conservadoramente de la SEQ ID NO: 43 45, 47, 49, 51 ó 53.
2. Una secuencia de polinucleótido aislado que contiene una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo formado por la SEQ ID NO: 42, fragmentos de la SEQ ID NO: 42 que codifican a un polipéptido que tiene una actividad elegida entre el grupo formado por la hidroximetilglutaril-CoA-reductasa (HMG-CoA-reductasa), isopentenil-difosfato-isomerasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA-sintasa), mevalonato-quinasa, fosfomevalonato-quinasa y difosfomevalonato-descarboxilasa.
3. Un vector de expresión que contiene la secuencia de polinucleótido según la reivindicación 2.
4. Una célula cultivada que contiene un vector de expresión según la reivindicación 3 o una progenie de la célula, dicha célula expresa un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido según la reivindicación 2.
5. Un método de producir un carotenoide que consiste en cultiva una célula según la reivindicación 4 en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido y aislar el carotenoide de la célula o del medio en que se halla la célula.
6. Un método de obtener una célula productora de carotenoide que consiste en:
(a) introducir en una célula una secuencia de polinucleótido que codifique a un polipéptido según la reivindicación 1, dicho polipéptido se expresa en la célula; y
(b) seleccionar una célula que contenga la secuencia de polinucleótido del paso (a) que produce un carotenoide a un nivel que es aprox. 1,1-1.000 veces el nivel de carotenoide producido por la célula antes de la introducción de la secuencia de polinucleótido.
7. Un método de ingeniería genética de una bacteria para producir un compuesto isoprenoide que consiste en:
(a) cultivar una bacteria original en un medio en condiciones que permitan la producción de un compuesto isoprenoide y seleccionar una bacteria mutante del medio de cultivo que produce aprox. 1,1-1.000 veces más de un compuesto isoprenoide que la bacteria original;
(b) introducir en la bacteria mutante un vector de expresión que contenga una secuencia de polinucleótido representado por la SEQ ID NO: 42 unida operativamente a una secuencia de control de expresión; y
(c) seleccionar una bacteria que contenga el vector de expresión y produce por lo menos aprox. 1,1 veces más de un compuesto isoprenoide que la mutante del paso (a).
8. Un microorganismo del género Paracoccus que tiene la designación de depósito PTA-3335 en la ATCC.
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