KR20150125653A - 아이소프렌의 생물학적 생성을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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에펜디 레너드
제레미 민샬
존 네스
토마스 조셉 퍼셀
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칼리스타, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 탄소 공급원료, 예컨대 메탄 또는 천연 가스를 이용하는 메탄영양 박테리아를 사용하여 아이소프렌을 생물학적으로 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

아이소프렌의 생물학적 생성을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF ISOPRENE}
서열 목록에 관한 진술
본원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되고, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 200206_411WO_SEQUENCE_LISTING.txt.이다. 텍스트 파일은 58.5KB이고, 2014년 3월 4일에 작성되었으며, EFS 웹을 통해 전자로 제출되었다.
기술 분야
본 개시내용은 아이소프렌을 생물학적으로 제조하기 위한, 더 구체적으로, 탄소 기질, 예컨대 메탄 또는 천연 가스로부터 아이소프렌을 제조하기 위해 메탄영양 박테리아(methanotrophic bacteria)를 이용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
2-메틸-1,3-뷰타다이엔으로도 공지된 아이소프렌은 휘발성 5-탄소 탄화수소이다. 아이소프렌은 미생물, 식물 및 동물 종을 포함하는 다양한 유기체에 의해 생성된다(Kuzuyama, 2002, Biosci Biotechnol. Biochem. 66:1619-1627). 메발로네이트(MVA) 경로 및 비메발로네이트(또는 메발로네이트 독립적) 경로(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 경로로도 공지됨)의 아이소프렌 생합성에 대한 2개의 경로가 존재한다. MVA 경로는 진핵생물, 고세균 및 고등 식물의 시토졸에 존재한다(Kuzuyama, 2002, Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:1619-1627). DXP 경로는 대부분의 박테리아, 녹조류 및 고등 식물의 엽록체에서 발견된다(Kuzuyama, 2002, Biosci Biotechnol. Biochem. 66:1619-1627).
아이소프렌은 타이어 및 고무 산업에서 사용하기 위한 폴리아이소프렌; 신발류, 의학 공급품, 라텍스, 스포츠 용품에서 사용하기 위한 엘라스토머; 접착제; 및 약제를 위한 아이소프레노이드의 생성을 위한 중요한 플랫폼 화학물질이다. 아이소프렌은 또한 대안적인 연료로서 사용될 수 있다. 아이소프렌은 알켄을 만들기 위해 촉매를 사용하여 이합체(10개 탄소) 및 삼합체(15개 탄소) 탄화수소로 화학적으로 개질될 수 있다(Clement et al., 2008, Chem. Eur. J. 14:7408-7420; Gordillo et al., 2009, Adv. Synth. Catal. 351:325-330). 이 분자는, 장쇄, 분지 알칸을 만들기 위해 수소화된 후, 디젤 또는 제트 연료 대체물로서 사용하기에 적합할 수 있다.
현재, 아이소프렌의 산업 용도는 이의 엄격한 공급에 의해 제한된다. 대부분의 합성 고무는 아이소프렌보다 실질적으로 더 독성인 뷰타다이엔 중합체에 기초한다. 천연 고무는 중앙아메리카, 남아메리카 및 아프리카 우림지대로부터의 고무 나무 또는 식물로부터 얻어진다. 아이소프렌은 또한, 가장 흔히 정련 석유의 나프타 부분에 존재하는 탄화수소를 크래킹함으로써, 석유로부터 제조될 수 있다. 화석 기반 아이소프렌의 1 갤런을 만들기 위해 약 7 갤런의 원유가 필요하다. 천연 생성 유기체로부터의 아이소프렌 수율은 상업적으로 매력적이지 않다.
풍부하고 비용 효과적인 재생 자원으로부터의 아이소프렌의 미생물 생성을 가능하게 하고 증대시키기 위한 노력이 증가하였다. 특히, 재조합 미생물, 예컨대 이. 콜라이, 조류 및 사이아노박테리아(cyanobacteria)는 바이오매스 유도 공급원료를 아이소프렌으로 전환하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 공급원료로서의 비교적 저렴한 셀룰로스 바이오매스의 사용에도 불구하고, 탄수화물 공급원료의 질량의 절반 이상이 산소로 이루어지고, 이는 전환 효율의 상당한 제한을 나타낸다. 아이소프렌 및 이의 유도체(예컨대, 아이소프레노이드)는 공급원료보다 산소 함량이 상당히 더 낮고, 산소가 폐기물로서 제거되어야 하므로, 이것은 이론적 수율을 제한한다. 따라서, 탄수화물 공급원료로부터의 아이소프렌 및 이의 유도체의 생성의 경제력은 엄청나게 비싸다.
아이소프렌 및 관련 화합물의 생성에 대한 탄수화물 기반 발효 방법과 관련된 제한의 견지에서, 당해 분야에서 아이소프렌을 제조하기 위한 대안적이고 비용 효과적이며 환경 친화적인 방법에 대한 수요가 있다. 본 개시내용은 이러한 수요를 만족시키고, 다른 관련 이점을 추가로 제공한다.
간단히 말하면, 본 개시내용은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 제공하고, 메탄영양 박테리아는 탄소 공급원료를 아이소프렌으로 전환시킬 수 있다.
아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산은 내인성 아이소프렌 신타제를 함유하는 임의의 유기체, 예컨대 포풀루스 알바(Populus alba), 포풀루스 트리초카르파(Populus trichocarpa), 포풀루스 트레물로이데스(Populus tremuloides), 포풀루스 니그라(Populus nigra), 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라(Populus tremula), 포풀루스 x 카네센스(canescens), 푸에라리아 몬타나(Pueraria montana), 푸에라리아 로바타(Pueraria lobata), 쿼커스 로부르(Quercus robur), 파보이데아에(Faboideae), 살릭스 디스컬라(Salix discolor), 살릭스 글라브라(Salix glabra), 살릭스 펜탄드라(Salix pentandra) 또는 살릭스 세르필리폴리아(Salix serpyllifolia)로부터 유래할 수 있다. IspS를 코딩하는 외인성 핵산은 추가로 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 아이소프렌 신타제는 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 아이소프렌 신타제는 또한 N-말단 색소체 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산은 서열 번호 14 내지 19 중 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산은 추가로 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 조절 서열은 추가로 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스-6-포스페이트 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸 전환효소 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노전환효소 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 및 Trc 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터일 수 있다.
비천연 발생 메탄영양 박테리아는 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 DXP 경로 효소를 과발현하거나, DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되거나, 이들의 조합인 메탄영양 박테리아를 추가로 포함할 수 있다. DXP 경로 효소는 DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 이들의 조합일 수 있다. 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 형질전환된 외인성 핵산을 발현하는 메탄영양 박테리아를 추가로 포함할 수 있다. 메발로네이트 경로 효소는 아세토아세틸-CoA 티올라제, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타제, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소, 메발로네이트 키나제, 포포메발로네이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제, 아이소펜테닐 다이포스페이트 아이소머라제 또는 이들의 조합일 수 있다. 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 변이체 DXP 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 변이체 DXP 경로 효소는 돌연변이체 피루베이트 탈수소효소(PDH) 및 돌연변이체 3,4 다이하이드록시-2-뷰타논 4-포스페이트 신타제(DHBPS)를 포함할 수 있다.
메탄영양 박테리아는 추가로 약 1㎎/ℓ 내지 약 500g/ℓ의 아이소프렌을 생성할 수 있다.
아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산을 메탄영양 박테리아, 예컨대 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로셀라(Methylocella), 메틸로카프사(Methylocapsa)로 도입할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 메탄영양 박테리아는 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰((Methylococcus capsulatus Bath) 균주, 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica) 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시누스 스포륨(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캅술라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테륨 오가노필룸(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris)(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라에(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나(Methylocystis daltona) 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila), 메틸로카프사 아우레아(Methylocapsa aurea) KYG, 메틸아시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸아시디필룸 푸마리올리쿰(Methylacidiphilum fumariolicum), 메틸로아시다 캄차트켄시스(Methyloacida kamchatkensis), 메틸리븀 페트롤레이필룸(Methylibium petroleiphilum) 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum)이다.
소정의 실시형태에서, 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 천연 가스 또는 비전통 천연 가스이다.
아이소프렌을 생성하기에 충분한 조건 하에 탄소 공급원료의 존재 하에 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는 아이소프렌을 생성하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 상기 방법은 비천연 발생 메탄영양 박테리아에 대해 기재된 다양한 실시형태의 사용을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 발효 배출가스로부터 생성된 아이소프렌을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 회수된 아이소프렌은 이합체(10-탄소) 탄화수소, 삼합체(15-탄소) 탄화수소 또는 이들의 조합으로 추가로 개질될 수 있다. 이합체 탄화수소, 삼합체 탄화수소 또는 이들의 조합은 장쇄 분지 알칸으로 추가로 수소화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 회수된 아이소프렌은 아이소프레노이드 생성물로 추가로 개질될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 a) 메탄영양 박테리아를 뮤타젠에 노출시켜 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 생성하는 단계; b) 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는 단계; 및 c) 성장에 충분한 조건 하에 단계 b)로부터의 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법을 제공하고; 뮤타젠에 노출되지 않고 GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환된 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 돌연변이체 메탄영양 박테리아는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 아이소프렌 전구체 합성의 증가를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 뮤타젠은 방사선, 화학물질, 플라스미드 또는 전이인자(transposon)이다. 소정의 실시형태에서, 적색 착색이 증가한 돌연변이체 메탄영양 박테리아 또는 이의 클론 세포는 IspS를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환된다. 추가의 실시형태에서, GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 적색 착색이 증가한 돌연변이체 메탄영양 박테리아로부터 제거되거나 이 박테리아에서 불활화된다.
훨씬 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 a) 메탄영양 박테리아를 ⅰ) 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산; ⅱ) 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는 단계; 및 b) 성장에 충분한 조건 하에 단계 a)로부터의 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공하고; GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고 적어도 하나의 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하지 않는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 형질전환된 메탄영양 박테리아는, 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산이 아이소프렌 전구체 합성의 증가를 부여한다는 것을 나타낸다. 아이소프렌 경로 효소는 DXP 경로 효소 또는 메발로네이트 경로 효소를 포함한다. 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 이종성 또는 동종성 핵산을 포함할 수 있다. 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 숙주 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 동종성 핵산은 메탄영양 박테리아에서 과발현될 수 있다. 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 비천연 발생 변이체를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 아이소프렌 조성물을 제공하고, 아이소프렌은 약 -30‰ 내지 약 -50‰ 범위의 δ13C 분포를 갖는다.
도 1은 아이소프렌 합성에 대한 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 경로를 나타낸다. 사용된 약어: DXS = 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 신타제; DXR = 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 리덕토아이소머라제(또한 IspC로 공지됨); IspD = 4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨(CDP-ME) 신타제; IspE = 4-다이스포포사이티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨(CDP-ME) 키나제; IspF = 2-C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-사이클로다이포스페이트(ME-cPP) 신타제; IspG = 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-뷰테닐 4-다이포스페이트(HMBPP) 신타제; IspH = 1-하이드록시-2-메틸-뷰테닐 4-다이포스페이트(HMBPP) 환원효소; IDI = 아이소펜테닐 다이포스페이트(IPP) 아이소머라제(또한 IPI로 공지됨); IspS = 아이소프렌 신타제.
도 2는 아이소프렌 합성에 대한 메발로네이트(MVA) 경로를 나타낸다. 사용된 약어: AACT = 아세토아세틸-CoA 티올라제; HMGS = 하이드록시메틸글루타릴-CoA(HMG) 신타제; HMGR = 하이드록시메틸글루타릴-CoA(HMG) 환원효소; MK = 메발로네이트(MVA) 키나제; PMK = 포스포메발로네이트 키나제; MPD = 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제(또한 다이스포스포메발로네이트 데카복실라제(DPMDC)로 공지됨); IDI = 아이소펜테닐 다이포스페이트(IPP) 아이소머라제; IspS = 아이소프렌 신타제.
도 3은 IspS를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 메탄영양세균을 형질전환시킴으로써 아이소프렌 생성을 위해, 본 개시내용에 제공된 바와 같은 메탄영양 박테리아가 저급 알칸(메탄, 에탄, 프로판, 뷰탄)을 어떻게 이용할 수 있는지를 예의 방식으로 나타낸다.
도 4는 다양한 탄소원의 δ13C 분포를 나타낸다.
도 5는 (A) pMS3 벡터; 및 (B) pMS3 [Pmdh+살릭스 종 IspS]에 의해 형질전환된 엠. 캅술라투스 바쓰 균주의 밀폐 배양물로부터 유래한 두부 샘플의 GC/MS 크로마토그래피를 나타낸다. 화살표는 아이소프렌에 상응하는 피크를 나타낸다. A에서의 피크 면적의 정량화를 통한 아이소프렌 수율은 검출 한계보다 낮다. B에서의 아이소프렌 수율은 약 10㎎/ℓ이다.
도 6은 메탄영양 숙주 박테리아로 형질전환될 수 있고, 아이소프렌 전구체 대사물의 생성의 개선을 위해 돌연변이체 박테리아 균주를 스크리닝하기 위해 사용된, 라이코펜 경로의 하부 부분을 나타낸다. 사용된 약어: GGPPS = 게라닐게라닐 다이포스페이트(GGPP) 신타제.
도 7a 및 도 7b는 pLacIq-푸에라리아 몬타나 ispS를 함유하고 IPTG의 존재 또는 부재 하에 성장한 발현 벡터에 의해 형질전환된 엠. 캅술라투스 바쓰 균주의 밀폐 배양물로부터의 두부 샘플에서의 GC/MS 크로마토그래피에 의해 검출된 아이소프렌의 양을 나타낸다.
본 개시내용은 천연 가스, 예컨대 저급 알칸(메탄, 에탄, 프로판 및 뷰탄)에서 발견되는 탄소 공급원료로부터 아이소프렌의 생합성을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 메탄영양 박테리아는 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고, 탄소 공급원료(예를 들어, 천연 가스)와 배양되어 아이소프렌을 생성한다. 재조합 메탄영양 박테리아 및 본 명세서에 기재된 관련 방법은 타이어 또는 고무 산업, 의약품에서의 사용 또는 대안 연료로서의 사용을 위해 탄소 공급원료의 아이소프렌으로의 메탄영양세균 생물전환을 허용한다.
배경의 방식에 의해, 특히 천연 가스 형태의 메탄은 값싸고 풍부한 천연 자원을 대표한다. 이전에 기재된 바대로, 탄수화물계 공급원료는 산소에서 이의 질량의 절반 이상을 함유하고, 아이소프렌이 임의의 산소 분자를 함유하지 않고, 아이소프레노이드가 이러한 공급원료보다 훨씬 더 적은 산소 함량을 가지므로, 이는 전환 효율에서의 상당한 제한이다. 현재의 생합성 시스템의 제한에 대한 해결책은 전환을 위한 공급원료로서 천연 가스에서 메탄 또는 다른 저급 알칸을 사용하는 것이다. 천연 가스로부터의 메탄 및 다른 저급 알칸(예를 들어, 에탄, 프로판 및 뷰탄)은 산소를 갖지 않아서, 전환 효율의 상당한 개선을 허용한다. 더욱이, 천연 가스는 탄수화물 공급원료와 비교하여 값싸고 풍부하여, 아이소프렌 생성의 경제의 개선에 기여한다.
본 개시내용에서, 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 숙주 메탄영양 박테리아로 도입함으로써 탄소 공급원료의 아이소프렌으로의 생물전환을 성취한다. 부가적으로, 아이소프렌 전구체를 증가시키기 위해 아이소프렌 경로와 연관된 네이티브 또는 외인성 유전자(예를 들어, DXS, DXR, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 IDI)를 과발현시킴으로써, 숙주 메탄영양 박테리아의 대사 조작은 아이소프렌 수율을 증가시키도록 이용될 수 있다. 비색 판독을 제공하기 위해 라이코펜 경로를 박테리아로 조작함으로써, 아이소프렌 전구체 생성의 증가를 위해 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다.
더 자세히 본 개시내용을 기재하기 전에, 본 명세서에 사용하고자 하는 소정의 용어의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 부가적인 정의가 본 개시내용에 걸쳐 기재되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "약"은, 달리 기재되지 않은 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의±20%를 의미한다. 용어 "실질적으로 이루어지는"은 특정한 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 새로운 특징에 중요하게 영향을 미치지 않는 것에 청구의 범위를 제한한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "일" 및 "하나"는 열거된 성분의 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 임의의 이들의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "함유한다" 및 "갖는다"는 동의어로 사용되고, 이 용어 및 이의 변형어는 비제한으로 해석되도록 의도된다. 용어 "포함한다"는 청구항에서 언급되는 기재된 피처(feature), 정수, 단계 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 피처, 정수, 단계 또는 성분 또는 이의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, "2-메틸-1,3-뷰타다이엔"으로도 공지된 용어 "아이소프렌"은 식 CH2=C(CH3)CH=CH2를 갖는 유기 화합물을 의미한다. 아이소프렌은 다양한 식물, 미생물 및 동물 종에 의해 생성된 무색의, 소수성, 휘발성 액체이다. 아이소프렌은 합성 고무를 포함하는 다양한 합성 중합체에 대한 중요한 출발 물질이고, 연료에 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "아이소프렌 합성 경로", "아이소프렌 생합성 경로" 또는 "아이소프렌 경로"는 아이소프렌을 생성하기 위한 임의의 생합성 경로를 의미한다. 아이소프렌 생합성은 일반적으로 메발로네이트(MVA) 경로(진핵생물, 고세균 및 고등 식물의 시토졸에서 발견됨) 및 비메발로네이트 경로(메틸-에리쓰리톨-4-포스페이트(MEP) 또는 (1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트) DXP 경로로도 공지되어 있고, 원핵생물 기원이거나 식물 색소체로부터 유래할 수 있음)의 2개의 경로를 통해 성취된다. 아이소프렌 경로는 공지된 생합성 경로 또는 조작된 생합성 경로의 경로 변경 또는 변형을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "아이소프레노이드"는 아이소프렌 단위(5개의 탄소 분지쇄 아이소프렌 구조)로부터 합성되거나 이를 함유하는 임의의 화합물을 의미한다. 아이소프레노이드는 테르펜, 징코라이드, 스테롤 및 카로테노이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "메발로네이트 경로" 또는 "MVA 경로"는 진핵생물 및 고세균에서 일반적으로 발견되는 아이소프렌 생합성 경로를 의미한다. 메발로네이트 경로는 도 2에 도시된 바와 같은 전통적인 경로 및 변형 MVA 경로(예컨대, 포포메발로네이트 데카복실라제(PMDC)를 통해 메발로네이트 포스페이트를 아이소펜테닐 포스페이트(이것은 아이소펜테닐 포스페이트 키나제(IPK)를 통해 아이소펜테닐 다이포스페이트로 전환됨)로 전환시키는 것) 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "비메발로네이트 경로" 또는 "1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 경로"는 박테리아 및 식물 색소체에서 일반적으로 발견되는 아이소프렌 생합성 경로를 의미한다. 예시적인 DXP 경로는 도 1에 도시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "DXP"는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 의미한다. 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제(DXS)는 DXP(이것은 DXP 경로에서 아이소프렌에 대한 전구체 분자임)를 형성하기 위해 글라이세르알데하이드 및 피루베이트의 축합을 촉매화한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "아이소프렌 신타제"(예를 들어, IspS)는 아이소프렌로의 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)의 전환을 촉매화하는 효소를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "라이코펜 경로"는 라이코펜을 생성하기 위한 생합성 경로를 의미한다. 라이코펜은 토마토 및 다른 붉은 과일 및 야채에서 보통 발견되는 선홍색의 카로테노이드 색소이다. 라이코펜 경로의 예는 도 6에 도시되어 있다. 일반적으로, 진핵생물 식물 및 원핵생물에서의 라이코펜 생합성은 메발론산(이것은 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)로 전환됨)으로 시작되면서 유사하다. 다이메틸알릴 다이포스페이트는 게라닐게라닐 피로포스페이트(GGPP)를 생성하기 위해 IPP의 3개의 분자와 축합된다. GGPP의 2개의 분자는 꼬리 대 꼬리 방식으로 축합하여 피토엔을 생성시키고, 이것은 몇몇 불포화 단계를 거쳐 라이코펜을 생성한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "숙주"는 탄소 기질 공급원료(예를 들어, 메탄, 천연, 저급 알칸)를 아이소프렌으로 전환시키기 위해 아이소프렌 생합성 경로 성분(예를 들어, IspS)에 의해 유전자 변형될 수 있는 미생물(예를 들어, 메탄영양 박테리아)를 의미한다. 숙주 세포는 아이소프렌 전구체 합성(예를 들어, DMAPP 또는 IPP)에 대한 내인성 경로를 함유할 수 있거나, 전구체 생성을 허용하거나 이를 증대시키도록 유전자 변형될 수 있다. 부가적으로, 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 아이소프렌 생합성 경로에 관련되지 않은 원하는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형을 이미 보유할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 고성장을 부여하는 유전자 변형, 특정한 배양 조건 또는 오염물질의 관용성, 부가적인 탄소 기질을 대사시키는 능력, 또는 바람직한 생성물 또는 중간체를 합성하는 능력을 보유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "메탄영양세균", "메탄영양 박테륨" 또는 "메탄영양 박테리아"는 주요 또는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 C1 기질, 예컨대 메탄 또는 비전통 천연 가스를 이용할 수 있는 메틸영양(methylotrophic) 박테리아를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바대로, "메탄영양 박테리아"는 탄소원 및 에너지원으로서 C1 기질만을 이용할 수 있는 "편성(obligate) 메탄영양 박테리아" 및 이의 주요 또는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 C1 기질 이외에 다중 탄소 기질, 예컨대 아세테이트, 피루베이트, 숙시네이트, 말레에이트 또는 에탄올을 천연으로 이용할 수 있는 "통성(facultative) 메탄영양 박테리아"를 포함한다. 통성 메탄영양세균은 메틸로셀라, 메틸로시스티스 및 메틸로카프사(예를 들어, 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스, 메틸로셀라 툰드라에, 메틸로시스티스 달토나 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라 및 메틸로카프사 아우레아 KYG) 및 메틸로박테륨 오가노필룸(ATCC 27,886)의 몇몇 종을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "C1 기질" 또는 "C1 공급원료"는 탄소-탄소 결합이 결여된 임의의 탄소 함유 분자를 의미한다. 예는 메탄, 메탄올, 폼알데하이드, 폼산, 포메이트, 메틸화 아민(예를 들어, 모노-, 다이- 및 트라이-메틸 아민), 메틸화 티올 및 이산화탄소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "저급 알칸"은 메탄, 에탄, 프로판 또는 뷰탄, 또는 임의의 이들의 조합을 의미한다. 저급 알칸은 실질적으로 정제된 조성물, 예컨대 "파이프라인 품질 천연 가스" 또는 "건식 천연 가스"(95-98%의 메탄임), 또는 비정제 조성물, 예컨대 "습식 천연 가스"(여기서, 다른 탄화수소(예를 들어, 에탄, 프로판 및 뷰탄)가 아직 제거되지 않고, 메탄은 60% 초과의 조성물을 포함함)를 포함할 수 있다. 저급 알칸은 또한 "천연 가스 관련 탄화수소"로도 공지된 "천연 가스 액체"로서 제공될 수 있고, 이것은 파이프라인 품질 건식 천연 가스를 생성하는 가공 동안 습식 천연 가스로부터 분리된 다양한 탄화수소(예를 들어, 에탄, 프로판, 뷰탄)를 의미한다. "습식 천연 가스의 부분적으로 분리된 유도체"는 천연 가스 액체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 용어 "천연 가스"는, 하나 이상의 다른 탄화수소(예를 들어, 에탄, 프로판 및 뷰탄), 이산화탄소, 질소 및 황화수소를 가질 수 있는, 주로 메탄으로 이루어진 천연 발생 탄화수소 가스 혼합물을 의미한다. 천연 가스는 종래의 천연 가스 및 비전통 천연 가스(예를 들어, 치밀 가스(tight gas sand), 세일 가스, 가스 수화물 및 석탄층 메탄)를 포함한다. 천연 가스는 건식 천연 가스(또는 파이프라인 품질 천연 가스) 또는 습식 (비가공) 천연 가스를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, "재조합" 또는 "형질전환"으로도 공지된 용어 "비천연 발생"은, 미생물을 언급하면서 사용될 때, 미생물이 언급된 종의 야생형 균주을 포함하여 언급된 종의 천연 발생 균주에서 보통 발견되지 않는 적어도 하나의 유전자 변경을 갖는다는 것을 의미한다. 유전자 변경은 예를 들어 단백질을 코딩하는 발현 가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 다른 핵산 부가, 핵산 결실, 핵산 치환, 또는 박테리아의 유전자 물질의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어 언급된 종에 대한 이종성 또는 동종성 폴리펩타이드에 대한 코딩 구역 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 부가적인 변형은 예를 들어 비코딩 조절 구역(여기서, 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시킴)을 포함한다. 예시적인 단백질은 아이소프렌 경로(예를 들어, IspS) 내의 단백질을 포함한다. 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 기능성 단편에 대한 유전자 변형은 생화학 반응 능력 또는 대사 경로 능력 또는 이의 천연 발생 상태로부터 변경된 비천연 발생 미생물에 대한 이러한 능력의 개선을 부여할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, "외인성"은 언급된 분자(예를 들어, 핵산) 또는 언급된 활성(예를 들어, 아이소프렌 신타제 활성)이 숙주 미생물로 도입된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 숙주 유전자 물질로의 핵산의 도입, 예컨대 숙주 염색체로의 통합 또는 예컨대 플라스미드 상의 비염색체 유전자 물질로서의 핵산의 도입에 의해 분자를 도입할 수 있다. 상기 용어가 코딩 핵산의 발현을 언급하면서 사용될 때, 이 용어는 발현 가능한 형태의 코딩 핵산의 숙주 미생물로의 도입을 의미한다. 효소 또는 단백질 활성을 언급하면서 사용될 때, 이 용어는 숙주 기준 미생물로 도입된 활성을 의미한다. 따라서, 용어 "내인성" 또는 "네이티브"는 숙주 미생물에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 의미한다. 용어 "키메라"는, 핵산을 언급하면서 사용될 때, 자연에서 함께 발견되지 않는 서열을 포함하는, 내인성이 아닌 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 키메라 핵산은 상이한 공급원으로부터 유래한 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래하지만, 천연에서 발견되는 것과 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 용어 "이종성"은 언급된 종 또는 균주와 다른 공급원으로부터 유래한 분자 또는 활성을 의미하지만, "동종성"은 숙주 미생물로부터 유래한 분자 또는 활성을 의미한다. 따라서, 본 개시내용에서 제공된 외인성 핵산을 포함하는 미생물은 이종성 또는 동종성 핵산 둘 다를 이용할 수 있다.
외인성 핵산이 미생물에 포함될 때, 외인성 핵산이 상기 기재된 바와 같은 언급된 코딩 핵산 또는 단백질 활성을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 외인성 핵산이 별개의 핵산 분자, 폴리시스트론(polycistronic) 핵산 분자, 융합 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자, 또는 이들의 조합 상의 숙주 미생물로 도입될 수 있고, 하나 초과의 외인성 핵산으로 여전히 고려될 수 있는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바대로, 미생물은 아이소프렌 경로로부터의 효소(예를 들어, 아이소프렌 신타제)를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 변형될 수 있다. 아이소프렌 경로로부터의 효소를 코딩하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물로 도입될 때, 2개의 외인성 핵산이 예를 들어 단일 플라스미드 상에 단일 핵산 분자로서 도입될 수 있고, 별개의 플라스미드 상에, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체로 통합될 수 있고, 2개의 외인성 핵산으로 여전히 고려될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 2개 초과의 외인성 핵산 분자가 임의의 원하는 조합으로 예를 들어 단일 플라스미드 상에 숙주 미생물로 도입될 수 있고, 별개의 플라스미드 상에, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체로 통합될 수 있고, 2개 이상의 외인성 핵산으로 여전히 고려될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 언급된 외인성 핵산 또는 효소 활성의 수는, 숙주 미생물로 도입된 별개의 핵산 분자의 수가 아니라, 코딩 핵산의 수 또는 단백질 활성의 수를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, 폴리뉴클레오타이드로도 공지된 "핵산"은 뉴클레오타이드라 불리는 공유 결합된 아단위로 이루어진 중합체 화합물을 의미한다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA), 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하고, 이들 둘 다 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바대로, "과발현된"은, 유전자 또는 단백질을 언급하면서 사용될 때, 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 증가를 의미한다. 발현 또는 활성의 증가는 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 야생형(유전적으로 조작되지 않은) 대조군 또는 기준 미생물의 수준보다 높이 증가할 때를 포함한다. 보통으로 발현되지 않거나 활성이 아닌 발현 또는 활성이 미생물에 있는 경우 유전자 또는 단백질이 과발현된다. 야생형 대조군 또는 기준 미생물에서보다 긴 기간 동안 발현 또는 활성이 미생물에 존재하는 경우 유전자 또는 단백질이 과발현된다.
숙주 메탄영양 박테리아
형질전환은 유전적으로 안정한 유전을 발생시키는 숙주 미생물의 게놈으로의 핵산(예를 들어, 외인성 핵산)의 전달을 의미한다. 형질전환된 핵산을 함유하는 숙주 미생물은 "비천연 발생" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 또는 "형질전환" 미생물라 칭해진다. 숙주 미생물은, 탄소원 및 에너지원으로서 메탄을 산화시키는 능력을 갖는 박테리아를 일반적으로 포함하는, 메탄영양 박테리아로부터 선택되거나 이로부터 생성된 비천연 발생 미생물일 수 있다.
메탄영양 박테리아는 이의 탄소 동화 경로 및 내부 막 구조에 기초하여 I형(감마 프로테오박테리아), II형(알파 프로테오박테리아 및 X형(감마 프로테오박테리아)의 3개의 그룹으로 분류된다. I형 메탄영양세균은 탄소 동화를 위해 리불로스 모노포스페이트(RuMP) 경로를 이용하지만, II형 메탄영양세균은 세린 경로를 이용한다. X형 메탄영양세균은 RuMP 경로를 이용하지만 또한 세린 경로의 낮은 수준의 효소를 발현한다. 메탄영양 박테리아는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시스티스, 메틸로시누스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스 및 메틸로셀라의 몇몇 속으로 그룹화된다.
메탄영양 박테리아는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 몇몇 다중 탄소 기질을 이용하는 능력을 천연으로 갖는 편성 메탄영양세균 및 통성 메탄영양세균을 포함한다. 통성 메탄영양세균은 메틸로셀라, 메틸로시스티스 및 메틸로카프사(예를 들어, 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스, 메틸로셀라 툰드라에, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라 및 메틸로카프사 아우레아 KYG)의 몇몇 종을 포함한다. 예시적인 메탄영양 박테리아 종은 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주, 메틸로모나스 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시누스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캅술라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테륨 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라에, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로카프사 아우레아 KYG, 메틸아시디필룸 인페르노룸, 메틸아시디필룸 푸마리올리쿰, 메틸로아시다 캄차트켄시스, 메틸리븀 페트롤레이필룸 및 메틸로마이크로븀 알칼리필룸을 포함한다.
선택된 메탄영양 숙주 박테리아는 생성을 위해 개선된 특성을 갖는 변이체를 확인하기 위해 선택적 조건 하에 균주 적응으로 또한 처리될 수 있다. 특성의 개선은 가능한 프로세스 오염물질의 관용성, 원하는 생성물의 수율 및 성장 속도의 증가를 포함할 수 있다(예를 들어, U.S. 제6,689,601호 참조). 특정한 실시형태에서, 고성장 변이체 메탄영양 박테리아는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 메탄 상에 성장할 수 있는 유기체이고, 이의 모, 기준 또는 야생형 박테리아보다 빠른(즉, 더 짧은 배가 시간) 대수기 성장 속도를 보유한다.
아이소프렌 합성 경로, 핵산 및 폴리펩타이드
본 개시내용은 아이소프렌을 생성하는 능력을 갖도록 조작된 메탄영양 박테리아를 제공한다. DXP 경로의 상부 부분을 포함하는 효소는 많은 메탄영양 박테리아에 존재한다. 그러나, 아이소프렌테닐 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)로의 (E)-4-하이드록시-3-메틸뷰트-2-엔일-다이포스페이트(HMBPP)의 전환 이후에, 현재 공지된 메탄영양세균은 DMAPP를 아이소프렌로 전환시키기 위한 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)가 결여된다. 대신에, 메탄영양세균은 게라닐 전환효소 및 파르네실 다이스포스페이트 신타제(IspA)를 통해 DMAPP를 파르네실 다이포스페이트로 전환시키고, 이것은 이후 카로테노이드로 전환된다(예를 들어, U.S. 제7,105,634호 참조).
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 제공하고, 메탄영양 박테리아는 탄소 공급원료를 아이소프렌으로 전환시킬 수 있다. 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환된 메탄영양 박테리아는 일반적으로 도 1에 도시된 DXP 경로를 이용하여 피루베이트 및 글라이세르알데하이드-3-포스페이트를 아이소프렌으로 전환시킬 수 있다.
아이소프렌 신타제 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 아이소프렌 신타제를 천연으로 처리하는 임의의 유기체로부터 얻어질 수 있다. IspS 유전자는 예를 들어, 포플러, 아스펜 및 칡을 포함하는 수많은 식물로부터 단리되고 클로닝된다. 수많은 박테리아는 DXP 경로를 보유하지만, 원핵생물로부터의 ispS 유전자의 서열이 현재 임의의 데이터베이스에서 이용 가능하지 않다(예를 들어, 문헌[Xue et al., 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:2399-2405] 참조). 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산은 포풀루스 알바, 포풀루스 트리초카르파, 포풀루스 트레물로이데스, 포풀루스 니그라, 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라, 포풀루스 x 카네센스, 푸에라리아 몬타나, 푸에라리아 로바타, 쿼커스 로부르, 파보이데아에, 살릭스 디스컬라, 살릭스 글라브라, 살릭스 펜탄드라 또는 살릭스 세르필리폴리아로부터 유래한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 아이소프렌 신타제에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB198180(포풀루스 알바), AY341431(포풀루스 트레물로이데스), AJ294819(포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라), AY316691(푸에라리아 몬타나 변이체 로바타), HQ684728(포풀루스 니그라) 및 EU693027(포풀루스 트리초카르파)을 포함한다. 아이소프렌 신타제 폴리펩타이드의 예는 표 1에 제공된다. 밑줄의 서열은 절두된 버전으로 제거된 N-말단 색소체 표적 서열을 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 아이소프렌 신타제 폴리펩타이드를 코딩한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 아이소프렌 신타제 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 용해도, 발현, 안정성, 촉매 활성 및 회전율(turnover rate)이 개선된 변이체를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,173,410호(본 명세서에 그 전문이 포함됨)는 용해도, 발현 및 활성이 증대된 특정한 아이소프렌 신타제 아미노산 치환을 개시한다.
소정의 실시형태에서, IPP 및 DMAPP 생성 및 아이소프렌 수율을 증대시키기 위해 내인성 DXP 경로 효소를 과발현시키거나, 외인성 DXP 경로 유전자를 숙주 메탄영양세균으로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 추가로 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 DXP 경로 효소를 과발현하거나, DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되거나, 둘 다이다. "내인성" 또는 "네이티브"는 숙주 메탄영양 박테리아에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 의미한다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 내인성 DXP 경로 효소를 과발현하거나; 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되거나; 임의의 이들의 조합이다. DXS와 같은 DXP 경로로부터의 내인성 효소의 과발현은 아이소프렌 생성을 증대시킬 수 있다(Xue and Ahring, 2011, Applied Environ. Microbiol. 77:2399-2405). 이론에 구속되고자 함이 없이, DXS의 양의 증가는 DXP 경로를 통해 탄소의 흐름을 증가시켜, 아이소프렌 생성을 증가시키는 것으로 생각된다. 소정의 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 질량 분광법을 이용한 대사물 프로파일링을 이용하여 과발현시키고자 하는 아이소프렌 합성 경로 및 효소에서 병목을 확인한다(예를 들어, 문헌[Pitera et al., 2007, Metabolic Engineering 9:193-207] 참조).
숙주 유기체에서 핵산을 과발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 내인성 DXP 경로 효소를 코딩하는 핵산의 카피 또는 DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성(예를 들어, 이종성) 핵산을 숙주 메탄영양 박테리아로 도입함으로써 과발현을 성취할 수 있다. 예의 방식으로, 내인성 DXS 효소를 코딩하는 핵산은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산과 함께 숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환될 수 있거나, 비숙주 메탄영양 종으로부터 유래한 DXS 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산과 함께 숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환될 수 있다. 전사를 증대시키는 프로모터 또는 조절 구역에 의해 내인성 프로모터 또는 조절 구역을 대체함으로써 내인성 DXP 경로 효소의 과발현을 또한 성취할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 숙주 메탄영양 박테리아에서 과발현된 DXP 경로 효소는 DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 메탄영양세균에서 과발현된 DXP 경로 효소는 DXS, IDI, IspD, IspF 또는 이들의 조합이다.
DXP 경로 효소의 공급원은 당해 분야에 공지되어 있고, 매우 다양한 식물 및 박테리아 종을 포함하는, DXP 경로를 천연으로 처리하는 임의의 유기체 유래일 수 있다. 예를 들어, DXP 경로 효소는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 마이코박테륨 마리늄(Mycobacterium marinum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 클람마이디아 무리다룸(Chlamydia muridarum), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클람마이디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 클람마이도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 시네초시스티스(Synechocystis), 메틸아시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum) V4, 메틸로시스티스 종 SC2, 메틸로모나스 균주 16A, 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주, 몇몇 단세포 조류, 예컨대 세네데스무스 올리쿠스(Scenedesmus oliquus), 및 대부분의 식물 종의 색소체, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 포풀루스 알바, 포풀루스 트리초카르파, 포풀루스 트레물로이데스, 포풀루스 니그라, 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라, 포풀루스 x 카네센스, 푸에라리아 몬타나, 푸에라리아 로바타, 쿼커스 로부르, 파보이데아에, 살릭스 디스컬라, 살릭스 글라브라, 살릭스 펜탄드라 또는 살릭스 세르필리폴리아에서 발견될 수 있다.
NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 DXS에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AF035440(에스체리치아 콜라이); Y18874(시네초코커스 PCC6301); AB026631(스트렙토마이세스 종 CL190); AB042821(스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스(Streptomyces griseolosporeus)); AF11814(플라스모듐 팔시파룸); AF143812(라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)); AJ279019(나르시수스 슈도나르시수스(Narcissus pseudonarcissus)); AJ291721(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); AX398484.1(메틸로모나스 균주 16A); NC_010794.1(구역 1435594..1437486, 보체)(메틸아시디필룸 인페르노룸 V4); 및 NC_018485.1(구역 2374620..2376548)(메틸로시스티스 종 SC2)을 포함한다.
NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 DXR에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB013300(에스체리치아 콜라이); AB049187(스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스); AF111813(플라스모듐 팔시파룸); AF116825(멘타 x 피페리타(Mentha x piperita)); AF148852(아라비돕시스 탈리아나); AF182287(아르테미시아 안누아(Artemisia annua)); AF250235(칸타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)); AF282879(슈도모나스 아에루기노사); AJ242588(아라비돕시스 탈리아나); AJ250714(자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주 ZM4); AJ292312(클레브시엘라 뉴모니아에); AJ297566(제아 메이스(Zea mays)); 및 AX398486.1(메틸로모나스 균주 16A)을 포함한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IspD에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB037876(아라비돕시스 탈리아나); AF109075(클로스트라이듐 디피실); AF230736(이. 콜라이); AF230737(아라비돕시스 탈리아나); 및 AX398490.1(메틸로모나스 균주 16A)을 포함한다.
NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IspE에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AF216300(에스체리치아 콜라이); AF263101(라이코페르시콘 에스쿨렌툼); AF288615(아라비돕시스 탈리아나); 및 AX398496.1(메틸로모나스 균주 16A)을 포함한다.
NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IspF에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AF230738(에스체리치아 콜라이); AB038256(에스체리치아 콜라이); AF250236(칸타란투스 로세우스); AF279661(플라스모듐 팔시파룸); AF321531(아라비돕시스 탈리아나); 및 AX398488.1(메틸로모나스 균주 16A)을 포함한다.
NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IspG에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AY033515(에스체리치아 콜라이) YP_005646(테르무스 테르모필루스) 및 YP_475776.1(시네초코커스 종)을 포함한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IspH에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AY062212(에스체리치아 콜라이), YP_233819.1(슈도모나스 시린가에) 및 YP_729527.1(시네초코커스 종)을 포함한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 IDI에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AF119715(이. 콜라이), P61615(설폴로부스 시바타에(Sulfolobus shibatae)) 및 O42641(파피아 로도자임(Phaffia rhodozyme))을 포함한다.
다양한 실시형태에서 사용될 수 있는 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주(ATCC 33009)로부터의 DXP 경로 효소에 대한 아미노산 서열은 표 2에 제공된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
당해 분야의 당업자는 숙주 메탄영양 박테리아로 도입되는 각각의 DXP 경로 효소의 공급원이 동일할 수 있거나, 숙주 메탄영양 박테리아로 도입된 2개 이상의 DXP 경로 효소의 공급원이 동일할 수 있거나, 숙주 메탄영양 박테리아로 도입된 각각의 DXP 경로 효소의 공급원이 서로 다를 수 있다는 것을 이해한다. DXP 경로 효소의 공급원(들)이 IspS의 공급원과 동일하거나 이와 다를 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 생성을 증대시키기 위해 2개 이상의 공급원으로부터 유래한 핵산을 갖는 하이브리드 경로가 이용된다(예를 들어, 문헌[Yang et al., 2012, PLoS ONE 7:e33509] 참조).
교대하는 경로를 통해 아이소프렌 전구체 DMAPP 및 IPP의 합성을 증가시킴으로써 아이소프렌 생성을 증대시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예의 방식으로, 메발로네이트 경로를 통해 DMAPP 및 IPP가 또한 합성될 수 있다(도 2 참조). 이론에 구속되고자 함이 없이, 세포에서의 DMAPP 및 IPP 폴리펩타이드의 양의 증가가 생성된 아이소프렌의 양을 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다. 현재, 내인성 메발로네이트 경로는 완전히 서열분석된 아주 적은 메탄영양 박테리아에서 아직 확인되지 않았다. 그러나, 메발로네이트 경로는 약간의 박테리아 종에서 확인되었다. 메발로네이트 경로가 숙주 메탄영양세균에 존재하지 않는 경우, DMAPP 및 IPP 전구체의 생성을 위한 메발로네이트 경로를 구축하는 데 필요한 유전자를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 메발로네이트 경로가 숙주 메탄영양세균에 존재하는 경우, DMAPP 및 IPP의 생성을 증대시키기 위해 소정의 메발로네이트 경로 유전자를 도입하거나 과발현시킬 수 있는 것이 또한 바람직할 수 있다. 소정의 실시형태에서, IspS를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 네이티브 메발로네이트 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 메발로네이트 경로 효소를 과발현하거나, 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 형질전환된 외인성 핵산을 발현하거나, 이들의 조합이다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 IspS를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 각각의 내인성 메발로네이트 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 내인성 메발로네이트 경로 효소를 과발현하거나; 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되거나; 또는 둘 다이다.
메탄영양세균으로의 메발로네이트 경로의 조작 또는 내인성 메발로네이트 경로의 증대는 DMAPP 및 IPP 전구체의 공급을 증가시킴으로써 아이소프렌 생성을 증대시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Martin et al., 2003, Nature Biotechnol. 21:796-802] 참조). 소정의 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 질량 분광법을 이용한 대사물 프로파일링을 이용하여 과발현시키고자 하는 아이소프렌 합성 경로 및 효소에서 병목을 확인한다(예를 들어, 문헌[Pitera et al., 2007, Metabolic Engineering 9:193-207] 참조). 내인성 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 핵산 또는 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 외인성(즉, 이종성) 핵산을 숙주 메탄영양 박테리아로 도입함으로써 과발현을 성취할 수 있다. 예의 방식으로, 내인성 메발로네이트 효소를 코딩하는 핵산의 카피는 IspS를 코딩하는 외인성 핵산과 함께 숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환될 수 있거나, 비숙주 메탄영양 종으로부터 유래한 메발로네이트 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 IspS를 코딩하는 외인성 핵산과 함께 숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환될 수 있다. 전사를 증대시키는 프로모터 또는 조절 구역에 의해 내인성 프로모터 또는 조절 구역을 대체함으로써 내인성 메발로네이트 경로 효소의 과발현을 또한 성취할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 숙주 메탄영양 박테리아에서 과발현된 메발로네이트 경로 효소는 AACT, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IDI 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시형태에서, (반응 속도를 증가시키는) Ala110Gly 치환을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 돌연변이체 HMGS 핵산은 숙주 메탄영양 박테리아로 도입된다(Steussy et al., 2006, Biochem. 45:14407-14).
메발로네이트 경로 효소의 공급원은 당해 분야에 공지되어 있고, 매우 다양한 식물, 동물, 진균, 고세균 및 박테리아 종을 포함하는 메발로네이트 경로를 자연에서 보유하는 임의의 유기체 유래일 수 있다. 예를 들어, 메발로네이트 경로 효소는 칼다리엘라 아시도필루스(Caldariella acidophilus), 할로박테륨 쿠티루브룸(Halobacterium cutirubrum), 믹소코커스 풀부스(Myxococcus fulvus), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 카에노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 아라비돕시스 탈리아나, 락토바실러스 플란타룸, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 카르노수스, 스타필로코커스 헤몰리티무스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니아에, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토마이세스 에리오우비퍼(Streptomyces aeriouvifer), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 클로로슈도모나스 에틸리카(Chloropseudomonas ethylica), 믹소코커스 풀부스, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에슘(Enterococcus faecium), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 메타노박테리아 테르모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 메타노코커스 야나스치(Methanococcus jannaschii), 호모 사피엔스, 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum), 엔테로코커스 카셀리플라부스(Enterococcus casseliflavus), 리스테리아 그라위(Listeria grayi), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노코코이데스 부로니(Methanococcoides buronii), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 및 스트렙토마이세스 CL190에서 발견될 수 있다. 당해 분야의 당업자는 메탄영양 숙주 박테리아로 도입된 각각의 메발로네이트 경로 효소의 공급원이 동일할 수 있거나, 2개 이상의 메발로네이트 경로 효소의 공급원이 동일할 수 있거나, 각각의 메발로네이트 경로 효소의 공급원이 서로 다를 수 있다는 것을 이해한다. 메발로네이트 경로 효소의 공급원(들)은 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)의 공급원과 동일하거나 다를 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 생성을 증대시키기 위해 2개 이상의 공급원으로부터 유래한 핵산을 갖는 하이브리드 경로를 이용한다(Yang et al., 2012, PLoS ONE 7:e33509).
소정의 실시형태에서, IspS를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 DXP 및 메발로네이트 경로를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 DXP 경로 효소를 과발현하거나, DXP 경로 효소를 코딩하는 형질전환된 외인성 핵산을 발현하거나, 둘 다일 수 있고; 네이티브 메발로네이트 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 메발로네이트 경로 효소를 과발현하거나, 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 형질전환된 외인성 핵산을 발현하거나, 둘 다일 수 있거나; 임의의 이들의 조합일 수 있다. 이전에 기재된 바대로, 모든 DXP 및 메발로네이트 경로 효소의 공급원은 동일할 수 있거나, 몇몇 DXP 또는 메발로네이트 경로 효소의 공급원은 동일할 수 있거나, DXP 및 메발로네이트 경로 효소의 공급원은 모두 서로 다를 수 있다.
본 개시내용의 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 변이체 아이소프렌 생합성 경로 또는 효소를 포함하도록 또한 조작될 수 있다. 아이소프렌 합성 경로의 변경은 경로의 하나 이상의 개별 단계에서 발생하거나 전부 새로운 경로를 포함할 수 있다. 특정한 경로 반응은 공지된 아이소프렌 효소와 서열, 구조 또는 촉매 유사성을 갖지 않을 수 있는 다른 종류의 효소에 의해 촉매화될 수 있다. 예를 들어, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 2308은 DXR을 제외하고 DXP 경로에 대한 유전자를 함유한다. 대신에, 브루셀라 아보르투스 2308은 DXP로부터 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트(MEP)의 형성을 촉매화하도록 DXR 유사 유전자(DRL)를 이용한다(Sangari et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:14081-14086). 또 다른 예에서, 각각 DXS 결함 돌연변이체 박테리아를 구조할 수 있고 변이체 DXP 경로를 통해 DXP를 생성하는, 각각 피루베이트 탈수소효소 및 3,4-다이하이드록시-2-뷰타논 4-포스페이트 신타제의 촉매 E 아단위를 코딩하는, 돌연변이체 aceE 및 ribE 유전자가 확인되었다(Perez-Gil et al., 2012, PLoS ONE 7:e43775). 훨씬 또 다른 예에서, 다양한 유형의 아이소펜테닐 다이스포스페이트 아이소머라제가 또한 확인되었다(Kaneda et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:932-7; Laupitz et al., 2004, Eur. J. Biochem. 271:2658-69). DXP 및 메발로네이트 경로 이외의 대안적인 아이소프렌 합성 경로가 또한 존재할 수 있다(문헌[Poliquin et al., 2004, J. Bacteriol. 186:4685-4693; Ershov et al., 2002, J Bacteriol. 184:5045-5051] 참조). 소정의 실시형태에서, 특정한 경로 반응은 변이체 또는 대안적인 아이소프렌 효소, 예컨대 DRL, 피루베이트 탈수소효소의 촉매 E 아단위, 3,4-다이하이드록시-2-뷰타논 4-포스페이트 신타제, 변이체 아이소펜테닐 다이스포스페이트 아이소머라제 또는 임의의 이들의 조합에 의해 촉매화된다.
아이소프렌 경로 성분을 코딩하는 핵산(예를 들어, 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 핵산)은, 코딩된 아이소프렌 경로 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성(예를 들어, DMAPP를 아이소프렌으로 전환시키는 능력)을 갖는, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 단편, 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 기질을 생성물로 전환시키는 폴리펩타이드의 능력을 측정함으로써 폴리펩타이드가 특정한 활성을 갖는지를 결정하기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Silver et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:13010-13016] 참조).
수백 개의 유기체에 이용 가능한 완전한 게놈 서열에 의해, 예를 들어 동족체, 오솔로그, 파라로그 등을 포함하는 관련 종 또는 먼 종에서의 아이소프렌 신타제 및 다른 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 유전자의 확인은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 특정한 유기체로부터 특정한 핵산과 관련하여 본 명세서에 기재된 아이소프렌 신타제, DXS, DXR, IDI 등을 코딩하는 외인성 핵산은 다른 유기체로부터 다른 아이소프렌 신타제, DXS, DXR, IDI 등을 코딩하는 핵산을 용이하게 포함할 수 있다.
아이소프렌 신타제 및 다른 아이소프렌 경로 효소와 같은, 본 명세서에 기재된 단백질, 단백질 도메인 및 이의 단편에 대한 폴리펩타이드 서열 및 코딩 핵산은 천연으로 및 재조합으로 조작된 변이체를 포함할 수 있다. 핵산 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실, 삽입을 함유할 수 있거나, 기준 핵산의 단편(들)이거나 이를 포함할 수 있는 핵산을 의미한다. 기준 핵산은 특정한 아이소프렌 경로 효소(예를 들어, IspS)를 코딩하는 선택된 야생형 또는 모 핵산을 의미한다. 변이체 핵산이 이의 필수적인 기능 또는 생물학적 활성을 여전히 수행할 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 한(예를 들어, IspS의 경우, DMAPP를 아이소프렌으로 전환시킴), 변이체 핵산은 기준 핵산과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 폴리펩타이드가 이의 필수적인 기능 또는 생물학적 활성을 여전히 수행할 수 있는 한(예를 들어, IspS의 경우, DMAPP를 아이소프렌으로 전환시킴), 변이체 폴리펩타이드는 기준 단백질과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 비천연 발생 메탄영양 박테리아로 도입된 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)는 서열 번호 1 내지 6에 제공된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이 변이체는 모(또는 야생형) 단백질보다 개선된 기능 및 생물학적 활성(예를 들어, 더 높은 효소 활성, 기질에 대한 개선된 특이성 또는 더 높은 회전율)을 가질 수 있다. 유전자 코드의 중복으로 인해, 핵산 변이체는 아미노산 서열에 영향을 미치거나 미치지 않을 수 있다.
핵산 변이체는 기준 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 치환을 포함하는 아미노산 서열을 또한 코딩할 수 있다. 보존적 치환은 폴리펩타이드(예를 들어, 천연 발생 유전자 변이체)에서 천연으로 존재할 수 있거나, 폴리펩타이드가 재조합으로 생성될 때 도입될 수 있다. 보존적 치환은 1개의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환된 것이어서, 당해 분야의 당업자는 실질적으로 변경되지 않은 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치요법 성질(hydropathic nature)을 예상할 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수화도 또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있다.
널리 공지되고 일상적으로 실행된 돌연변이유발 방법을 이용하여 아미노산 치환, 결실 및 부가는 폴리펩타이드로 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning :　 A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001] 참조). 원하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정한 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오타이드를 제공하기 위해 올리고뉴클레오타이드-지정 부위-특이적(또는 분절 특이적) 돌연변이유발 절차를 이용할 수 있다. 원하는 결실에 인접한 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 이용함으로써 단백질의 결실 또는 절두 변이체를 또한 작제할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드 변이체를 제조하기 위해 무작위 돌연변이유발 기법, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 실수 유발 중합효소 사슬 반응 돌연변이유발 및 올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이유발을 이용할 수 있다(예를 들어, 상기 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 참조).
시험된 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된, 동일성을 결정하기 위해 공지된 방법에 의해 야생형(또는 모 또는 기준) 핵산 또는 폴리펩타이드와 이의 변이체 사이의 차이를 결정할 수 있다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 공중에게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로부터 적용될 수 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하는 컴퓨터 프로그램 방법은 디폴트 매개변수를 이용한 예를 들어 BLASTP, BLASTN(Altschul, S.F. et al., J. Mol . Biol . 215: 403-410 (1990)) 및 FASTA(Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))를 포함한다.
폴리펩타이드 변이체가 비변이체 폴리펩타이드 또는 단편과 필적하는 입체구성으로 폴딩하는지를 결정하는 검정은, 예를 들어, 네이티브 또는 비폴딩된 에피토프에 특이적인 단일클론 또는 다중클론 항체와 작용하는 단백질의 능력, 리간드 결합 기능의 보유, (적용 가능한 경우) 효소 활성의 보유, 및 프로테아제에 의한 분해에 대한 돌연변이체 단백질의 감수성 또는 내성(상기 샘브룩 등의 문헌 참조)을 포함한다. 생성된 단백질 분자의 생물학적 활성을 변경함이 없이(즉, 통계학적으로 유의적이거나 생물학적으로 유의적인 방식으로 하나 이상의 기능적 활성을 변경함이 없이) 폴리펩타이드, 이의 변이체 및 단편을 제조할 수 있다. 예를 들어, 아미노산을 동일한 그룹, 예컨대 극성 잔기, 하전 잔기, 소수성 잔기 또는 작은 잔기 등의 그룹 내에 포함된 또 다른 아미노산과 상호변경시킴으로써 이러한 치환을 일반적으로 만든다. 생물학적 검정에서 작용하거나, 동족 리간드 또는 표적 분자에 결합하는 능력에 대해 생성된 변형된 단백질을 시험함으로써 임의의 아미노산 치환의 효과를 경험적으로 결정할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 숙주 메탄영양 박테리아로 도입된 IspS 또는 다른 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 N-말단 색소체 표적화 서열을 포함하지 않는다. 일반적으로, 엽록체 단백질, 예컨대 많은 식물 아이소프렌 신타제 및 다른 아이소프렌 경로 효소는 핵에서 코딩되고, 전구체로서 시토졸에서 합성된다. 신호 펩타이드 또는 통과(transit) 펩타이드로도 공지된 N-말단 색소체 표적화 서열은 엽록체 봉입체에 표적화하기 위해 필요한 신호를 코딩하고, 이 봉입체는 엽록체 수입 후에 펩티다제에 의해 개열된다. N-말단 표적화 서열의 제거는 이종성 핵산의 발현을 증대시킬 수 있다. ChloroP(Emannuelsson et al., 1999, Protein Sci. 8:978-984); PLCR(Schein et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:e82); MultiP(http://sbi.postech.ac.kr/MultiP/)를 포함하는, 당해 분야에 공지된 예측 프로그램을 이용하여 N-말단 색소체 표적화 서열을 결정할 수 있다. N-말단 색소체 표적화 서열은 메탄영양 박테리아로의 도입 전에 재조합 수단에 의해 핵산으로부터 제거될 수 있다. 소정의 실시형태에서, N-말단 색소체 표적화 서열이 결여된 IspS를 위한 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6 중 어느 하나에 제공된다. 다른 실시형태에서, 숙주 메탄영양 박테리아로 도입된 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS) 또는 다른 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 다른 소기관, 예를 들어, 에피코플라스트(apicoplast) 또는 소포체에 대한 표적화 서열을 포함하지 않는다.
소정의 실시형태에서, 아이소프렌 신타제 또는 다른 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 발현 조절 서열은 이것이 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터(예를 들어, 구성적, 누수성(leaky) 또는 유도성) 또는 인핸서를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 발현 조절 서열은 메탄올 탈수소효소 프로모터(MDH), 헥술로스 6-포스페이트 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸 전환효소 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노전환효소 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 및 Trc 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터이다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스 6-포스페이트 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸 전환효소 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노전환효소 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 및 Trc 프로모터는 메탄영양 박테리아에서 이종성 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 프로모터의 다양한 강도를 제공한다.
소정의 실시형태에서, IspS를 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터 시스템은 당해 분야에 공지되어 있고, 테트라사이클린 유도성 프로모터 시스템; IPTG/lac 오페론 유도성 프로모터 시스템, 열 쇼크 유도성 프로모터 시스템; 금속 반응성 프로모터 시스템; 질산염 유도성 프로모터 시스템; 광 유도성 프로모터 시스템; 에크디손 유도성 프로모터 시스템 등을 포함한다. 예를 들어, 비천연 발생 메탄영양세균은 lacO 오퍼레이터 서열에 의해 플랭킹된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있고, 구성적 프로모터(예를 들어, 헥술로스-6-포스페이트 신타제 프로모터)에 작동 가능하게 lacI 리프레서 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 또한 포함할 수 있다. LacI 리프레서 단백질은 IspS 프로모터를 플랭킹하는 lacO 오퍼레이터 서열에 결합하여, 전사를 방지한다. IPTG는 lacI 리프레서에 결합하고, 이것을 lacO 서열로부터 방출시켜, 전사를 허용한다. 유도성 프로모터 시스템을 이용함으로써, 인듀서의 부가에 의해 아이소프렌 합성을 조절할 수 있다. IspS 또는 다른 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 핵산은 또한 다른 핵산 서열, 폴리아데닐화 신호, 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 조합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, DXP 경로 효소 및 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS) 또는 메발로네이트 경로 효소 및 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)의 발현의 강도 및 시기는 아이소프렌 생성을 개선하기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 다양한 프로모터 강도 또는 유전자 카피 수를 이용하여 발현 수준을 조절할 수 있다. 또 다른 예에서, 배열된 유전자 순서를 갖는 폴리시스트론 오페론 또는 유도성 프로모터 시스템을 사용함으로써 발현의 시기를 조절할 수 있다. 예를 들어, DXP 경로 효소 및 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS) 또는 메발로네이트 경로 효소 및 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)의 발현은 배양의 성장상 및 고정상 동안 또는 오직 고정상 동안 발현될 수 있다. 또 다른 예에서, 아이소프렌 DXP 경로 효소 및 IspS 또는 메발로네이트 경로 효소 및 IspS는 순서화 동시발현을 겪을 수 있다. 다양한 DXP 경로 효소를 코딩하는 핵산의 순서화 동시발현은 아이소프렌 생성을 증대시키는 것으로 밝혀졌다(Lv et al., 2012, Appl. Microbiol. Biotechnol., "Significantly enhanced production of isoprene by ordered coexpression of genes dxs, dxr, and idi in Escherichia coli,," 2012년 11월 10일에 온라인에 공개).
코돈 최적화
재조합 단백질의 발현은 대개 이의 원래 숙주 밖에서 어렵다. 예를 들어, 코돈 사용빈도 바이어스의 변이가 박테리아의 상이한 종에 걸쳐 관찰되었다(Sharp et al., 2005, Nucl. Acids. Res. 33:1141-1153). 심지어 네이티브 숙주 내의 재조합 단백질의 과발현이 또한 어려울 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 본 발명의 미생물로 도입하고자 하는 핵산(예를 들어, 아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산)은 단백질 발현을 증대시키도록 코돈 최적화를 겪을 수 있다. 코돈 최적화는, DNA가 코딩하는 폴리펩타이드를 변경함이 없이 숙주 유기체의 통상적인 코돈 사용빈도를 반영하기 위한 유기체의 형질전환을 위한, 핵산의 유전자 또는 코딩 구역에서의 코돈의 변경을 의미한다. 소정의 실시형태에서, IspS, 다른 아이소프렌 경로 성분 또는 라이코펜 경로 성분을 코딩하는 외인성 핵산은 숙주 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화된다. 이종성 유기체에서의 최적 유전자 발현을 위한 코돈 최적화 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이전에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Welch et al., 2009, PLoS One 4:e7002; Gustafsson et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:346-353; Wu et al., 2007, Nucl. Acids Res. 35:D76-79; Villalobos et al., 2006, BMC Bioinformatics 7:285]; 미국 특허 공보 제2011/0111413호; 및 미국 특허 공보 제2008/0292918호 참조).
메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS) 폴리뉴클레오타이드 서열의 예는 표 3에 제공된다. 서열 번호 15, 서열 번호 17 및 서열 번호 19는, 이의 N-말단 색소체 표적화 서열이 없는, 각각 포풀루스 알바, 푸에라리아 몬타나 및 살릭스로부터의 절두된 IspS 서열이다. 서열 번호 14, 서열 번호 16 및 서열 번호 18은 각각 포풀루스 알바, 푸에라리아 몬타나 및 살릭스로부터의 전장 IspS 서열(N-말단 색소체 표적화 서열을 가짐)이다.
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메탄영양세균의 예시적인 배양
당해 분야에 널리 공지된 물질 및 방법을 이용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 숙주 메탄영양 세포로 도입된 하나 이상의 핵산(예를 들어, IspS)의 발현을 허용하는 조건 하에 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양한다.
전통적인 배취(batch) 배양 방법은 매질의 조성이 배양의 시작 시 설정되고 배양 과정 동안 외부 변경에 처하지 않는 밀폐 시스템이다. 따라서, 배양 과정의 시작 시, 배지를 원하는 유기체 또는 유기체와 접종하고, 성장 또는 대사 활성은 시스템에 어떤 것도 첨가함이 없이 발생하도록 허용된다. 그러나, 통상적으로, "배취" 배양은 탄소원의 첨가와 관련된 배취이고, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 조절하는 시도가 대개 이루어진다. 배취 시스템에서, 시스템의 대사물 및 바이오매스 조성은 배양이 종료되는 시점까지 끊임없이 변한다. 배취 배양 내에서, 세포는 정적 유도기를 거쳐 고성장 로그기 및 마지막으로 고정상(여기서, 성장 속도는 감소하거나 중지됨)으로 완화한다. 비처리되면, 고정상에서의 세포는 결국 사망할 것이다. 대수기에서의 세포는 대개 몇몇 시스템에서 최종 생성물 또는 중간체의 벌크 생성을 책임진다. 고정상 또는 대수기 후 다른 시스템에서 생성이 얻어질 수 있다.
유가 시스템은 표준 배취 시스템의 변경이다. 유가 배양 과정은 배양이 진행되면서 기질이 증분으로 첨가되는 변형을 갖는 통상적인 배취 시스템을 포함한다. 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해하려고 할 때 및 배지 중의 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우 유가 시스템이 유용하다. 유가 시스템에서의 실제 기질 농도의 측정은 어렵고, 따라서 측정 가능한 인자, 예컨대 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압의 변화에 기초하여 예측된다. 배취 및 유가 배양 방법은 흔하고 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, 1992, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227](그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조).
연속 배양은 한정 배양 배지가 생물반응기에 연속하여 첨가되고, 동일 양의 조건 배지가 처리를 위해 동시에 제거되는 "개방" 시스템이다. 연속 배양은 세포가 주로 로그기 성장에 있는 일정한 높은 액상 밀도에서 세포를 일반적으로 유지시킨다. 대안적으로, 연속 배양은 탄소 및 영양소가 연속하여 첨가되고 귀중한 생성물, 부산물 및 폐기 생성물이 연속하여 세포 덩어리로부터 제거되는 부동화 세포에 의해 수행될 수 있다. 천연 또는 합성 물질로 이루어진 광범위의 고체 지지체를 사용하여 세포 부동화를 수행할 수 있다.
연속 또는 반연속 배양은 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 방법은 고정된 비율로 제한된 영양소, 예컨대 탄소원 또는 질소 수준을 유지하고, 모든 다른 매개변수가 조절되게 한다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자가 연속하여 변경될 수 있지만, 배지 불투명도에 의해 측정된 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 정지상 성장 조건을 유지시키도록 노력하고, 따라서 빠져나가는 배지로 인한 세포 손실은 배양에서의 세포 성장 속도에 대해 균형되어야 한다. 연속 배양 과정을 위해 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법, 및 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다양한 방법은 상기 브룩(Brock)에 의해 기재되어 있다.
메탄영양 박테리아는 또한 전체 세포 촉매로서 고체 기질에 부동화되고, 아이소프렌 생성을 위한 발효 조건으로 처리될 수 있다.
단리된 순수한 배양물이, 성장을 보조할 수 있는 이종성 비메탄영양 유기체(들) 또는 메탄영양 박테리아의 하나 이상의 상이한 균주 및/또는 종과 함께 조합되어 혼합 배양물을 생성할 수 있으므로, 본 개시내용에 제공된 메탄영양 박테리아를 성장시킬 수 있다.
탄소 공급원료로도 공지된 메탄영양 박테리아에 의해 대사될 수 있는 탄소 함유 화합물인 임의의 탄소원은 본 명세서에 기재된 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 탄소 공급원료는 생육성을 유지시키거나, 메탄영양 박테리아를 성장시키기 위해 사용되거나, 아이소프렌으로 전환될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아이소프렌 경로 효소에 의해 유전적으로 조작된 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 탄소 공급원료를 아이소프렌으로 전환시킬 수 있고, 탄소 공급원료는 C1 기질이다. C1 기질은 메탄, 메탄올, 천연 가스 및 비전통 천연 가스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 또한 비-C1 기질, 예컨대 다중 탄소 기질을 아이소프렌으로 전환시킬 수 있다. 아이소프렌 생합성 능력이 박테리아로 도입되면, 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 내인성으로 다중 탄소 기질, 예컨대 저급 알칸(에탄, 프로판 및 뷰탄)을 아이소프렌으로 전환시키는 능력을 가질 수 있다(도 3 참조). 대안적으로, 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 대안적인 탄소 공급원료를 사용하기 위해 부가적인 유전자 조작을 요할 수 있고(예를 들어, 미국 가출원 제61/718,024호(2012년 10월 24일 출원), "Engineering of Multi-Carbon Substrate Utilization Pathways in Methanotrophic Bacteria"(그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조), 이 탄소 공급원료는 이후 본 개시내용에 따라 아이소프렌으로 전환될 수 있다. 메탄영양 박테리아는 단일 탄소 기질, 예컨대 메탄 또는 건식 천연 가스를 대부분 포함하는 순수한 또는 비교적 순수한 탄소 공급원료가 제공될 수 있다. 메탄영양 박테리아는 메탄 및 저급 알칸을 포함하는 혼합 탄소 공급원료, 예컨대 습식 천연 가스가 또한 제공될 수 있다.
비천연 발생 메탄영양 박테리아의 작제
본 명세서에 사용된 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에 기재되어 있다.
메탄영양 박테리아에서 이종성 핵산을 도입하기 위한 재조합 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 메탄영양 박테리아에서 이종성 핵산의 발현에 유용한 발현 시스템 및 발현 벡터가 공지되어 있다. 메탄영양 박테리아의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트가 공지되어 있다.
C1 대사 박테리아의 전기천공은 문헌[Toyama et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 166:1-7(메틸로박테륨 엑스토르?스); Kim and Wood, 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:105-108(메틸로필루스 메틸로트로푸스 AS1); Yoshida et al., 2001, Biotechnol. Lett. 23:787-791(메틸로바실러스 종 균주 12S) 및 US2008/0026005(메틸로박테륨 엑스토르?스)]에 이전에 기재되어 있다.
공여자 및 수혜자 세포의 직접 접촉을 포함하는 특정한 유형의 형질전환을 의미하는, 박테리아 접합은 메탄영양 박테리아로의 핵산의 전달을 위해 더욱 흔히 사용된다. 박테리아 접합은 "공여자" 및 "수혜자" 세포를 서로 밀접한 접촉으로 함께 혼합하는 것을 포함한다. 수혜자 세포로의 새로 합성된 공여자 핵산의 단방향 전달에 의해, 공여자 박테리아와 수혜자 박테리아 사이의 세포질 연결의 형성에 의해 접합이 발생한다. 접합 반응에서의 수혜자는 공여자 박테리아로부터 수평 전달을 통해 핵산을 수용할 수 있는 임의의 세포이다. 접합 반응에서의 공여자는 접합적 플라스미드, 접합적 전이인자 또는 동원된 플라스미드를 함유하는 박테리아이다. 자가 전달 가능한 플라스미드를 통해 또는 "헬퍼" 플라스미드의 도움으로 공여자 플라스미드의 물리적 전달이 발생할 수 있다. 메탄영양 박테리아를 포함하는 C1 대사 박테리아를 포함하는 접합이 문헌[Stolyar et al., 1995, Mikrobiologiya 64:686-691; Martin and Murrell, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 127:243-248; Motoyama et al., 1994, Appl. Micro. Biotech. 42:67-72; Lloyd et al., 1999, Archives of Microbiology 171:364-370; 및 Odom et al., PCT Publication WO 02/18617; Ali et al., 2006, Microbiol. 152:2931-2942]에 이전에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바대로, 생성을 증대시키기 위해 다양한 업스트림 아이소프렌 경로 유전자를 과발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 다중 카피 플라스미드 또는 강한 프로모터를 사용하여 내인성 또는 이종성 핵산의 과발현을 성취할 수 있다. 메탄영양세균에서의 다중 카피 발현 시스템의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cardy and Murrell, 1990 J. Gen. Microbiol. 136:343-352; Sharpe et al., 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73:1721-1728] 참조). 예를 들어, 메틸로박테륨에서의 이종성 유전자의 전이인자 기반 다중 카피 발현이 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 공보 2008/0026005 참조). 외인성 핵산의 고발현을 위한 적합한 동종성 또는 이종성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,098,005호는 메탄영양 박테리아에서의 이종성 유전자 발현을 위해 메탄 또는 메탄올의 존재 하의 고도로 발현된 프로모터의 용도를 기재한다. 사용될 수 있는 부가적인 프로모터는 데옥시-자일룰로스 포스페이트 신타제 메탄올 탈수소효소 오페론 프로모터(Springer et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 160:119-124); PHA 합성을 위한 프로모터(Foellner et al. 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:284-291); 또는 메틸영양체에서 네이티브 플라스미드로부터 확인된 프로모터(EP296484)를 포함한다. 사용될 수 있는 비네이티브 프로모터는 lac 오페론 Plac 프로모터(Toyama et al., 1997, Microbiology 143:595-602) 또는 하이브리드 프로모터, 예컨대 Ptrc(Brosius et al., 1984, Gene 27:161-172)를 포함한다. 사용될 수 있는 부가적인 프로모터는 누수성 프로모터 또는 유도성 프로모터 시스템을 포함한다. 예를 들어, 메틸영양세균 및 메탄영양 박테리아에서의 재조합 단백질 발현의 리프레서/오퍼레이터 시스템은 미국 특허 제8,216,821호에 기재되어 있다.
대안적으로, 경쟁하는 에너지 또는 탄소 싱크를 제거하거나, 아이소프렌 경로 전구체의 축적을 증대시키거나, 아이소프렌의 추가의 대사를 방지하기 위해 소정의 유전자의 파괴가 바람직할 수 있다. 파괴를 위한 유전자의 선택은 경험적 증거에 기초하여 결정될 수 있다. 파괴를 위한 후보 유전자는 IspA를 포함할 수 있다. 메탄영양 박테리아는 아이소프렌 전구체 DMAPP 및 IPP와 경쟁할 수 있는 카로테노이드 생합성 경로를 보유하는 것으로 공지되어 있다(미국 특허 제6,969,595호 참조). IspA는, 게라닐 다이포스페이트(GPP), 파르네실 다이포스페이트(FPP) 및 게라닐게라닐 다이포스페이트(GGPP)가 DMAPP 및 IPP로부터 형성되는 3개의 프레닐전환효소 반응의 순서를 촉매화하는, 게라닐전환효소 또는 파르네실 다이포스페이트 신타제 효소를 의미한다. 메탄영양 박테리아에서 내인성 유전자 기능을 하향조절하거나 불활화시키거나 넉아웃시키거나 결실시키기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 표적화된 유전자 파괴는, 전사를 파괴하기 위해 외래 DNA가 구조적 유전자로 삽입된, 유전자 하향조절을 위한 효과적인 방법이다. 파괴시키고자 하는 표적 숙주 유전자의 부분에 높은 정도의 상동성을 갖는 서열에 의해 플랭킹된 외래 삽입 DNA를 포함하는 유전자 카세트(보통 유전자 마커)를 숙주 메탄영양 박테리아로 도입한다. 외래 DNA는 네이티브 DNA 복제 기전을 통해 표적 숙주 유전자를 파괴한다. 메탄영양 박테리아를 포함하는 C1 대사 박테리아에서 결실/삽입 돌연변이체를 작제하기 위한 대립유전자 교환이 문헌[Toyama and Lidstrom, 1998, Microbiol. 144:183-191; Stolyar et al., 1999, Microbiol. 145:1235-1244; Ali et al., 2006, Microbiology 152:2931-2942; Van Dien et al., 2003, Microbiol. 149:601-609; Martin and Murrell, 2006, FEMS Microbiol. Lett. 127:243-248]에 기재되어 있다.
숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환된 핵산, 예컨대 IspS, DXP 경로 효소, 메발로네이트 경로 효소 또는 라이코펜 경로 효소를 코딩하는 핵산은 폴리시스트론 핵산 분자, 융합 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자 또는 이들의 조합 상에 별개의 핵산 분자로서 도입될 수 있다. 하나 초과의 핵산 분자가 숙주 메탄영양 박테리아로 도입될 때, 이것은 관련 대사 경로에 따라 무작위 순서 또는 순차적 순서를 포함하는 다양한 순서로 도입될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 선택된 생합성 경로로부터 다수의 효소를 코딩하는 다수의 핵산이 숙주 메탄영양 박테리아로 형질전환될 때, 이것은 선택된 생합성 경로의 것과 일치하는 순차적 순서를 보유하는 방식으로 형질전환된다.
아이소프렌을 생성하는 방법
아이소프렌을 생성하기에 충분한 조건 하에 탄소 공급원료의 존재 하에 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는 아이소프렌을 생성하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 메탄영양 박테리아 배양물의 성장 및 유지를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 아이소프렌을 생성하는 방법에서 본 명세서에 기재된 비천연 발생 메탄영양 박테리아의 다양한 실시형태를 이용할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 아이소프렌은 세포 성장의 특정 단계(예를 들어, 유도기, 대수기, 고정상 또는 사멸기) 동안 생성된다. 메탄영양 박테리아의 성장 및 유지보다는 공급원료로부터의 탄소가 아이소프렌으로 전환되게 하는 것이 바람직할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 낮거나 중간의 세포 밀도(OD600)로 배양되고, 이후 아이소프렌의 생성이 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 아이소프렌이 생성되지만, 메탄영양 박테리아는 더 이상 분할하지 않거나 매우 느리게 분할한다. 몇몇 실시형태에서, 아이소프렌이 오직 고정상 동안 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 아이소프렌은 대수기 및 고정상 동안 생성된다.
본 명세서에 제공된 비천연 발생 메탄영양 박테리아에 의해 생성된 아이소프렌을 포함하는 발효기 배출가스는 생물학적 발효 과정과 연관된 다른 유기 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 발효의 생물학적 부산물은 알콜, 에폭사이드, 알데하이드, 케톤 및 에스터 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 발효기 배출가스는 메탄올, 에탄올, 뷰탄올 또는 프로판올의 알콜 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 발효기 배출가스는 에틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드 또는 뷰텐 옥사이드의 에폭사이드 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 다른 화합물, 예컨대 H2O, CO, CO2, CO N2, H2, O2, 및 이용되지 않은 탄소 공급원료, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판 및 뷰탄이 발효기 배출가스에 또한 존재할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비천연 발생 메탄영양 박테리아는 배양물 1ℓ당 약 0.001g 내지 약 500g의 아이소프렌을 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 생성된 아이소프렌의 양은 배양물 1ℓ당 약 1g 내지 약 100g이다. 몇몇 실시형태에서, 생성된 아이소프렌의 양은 약 0.001g/ℓ, 0.01g/ℓ, 0.025g/ℓ, 0.05g/ℓ, 0.1g/ℓ, 0.15g/ℓ, 0.2g/ℓ, 0.25g/ℓ, 0.3g/ℓ, 0.4g/ℓ, 0.5g/ℓ, 0.6g/ℓ, 0.7g/ℓ, 0.8g/ℓ, 0.9g/ℓ, 1g/ℓ, 2.5g/ℓ, 5g/ℓ, 7.5g/ℓ, 10g/ℓ, 12.5g/ℓ, 15g/ℓ, 20g/ℓ, 25g/ℓ, 30g/ℓ, 35g/ℓ, 40g/ℓ, 45g/ℓ, 50g/ℓ, 60g/ℓ, 70g/ℓ, 80g/ℓ, 90g/ℓ, 100g/ℓ, 125g/ℓ, 150g/ℓ, 175g/ℓ, 200g/ℓ, 225g/ℓ, 250g/ℓ, 275g/ℓ, 300g/ℓ, 325g/ℓ, 350g/ℓ, 375g/ℓ, 400g/ℓ, 425g/ℓ, 450g/ℓ, 475g/ℓ 또는 500g/ℓ이다.
본 명세서에 제공된 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 아이소프렌은 석유화학물질로부터 생성된 아이소프렌 또는 탄소 핑거 프린팅(finger-printing)에 의해 비메탄영양 박테리아로부터 생합성된 아이소프렌과 구별될 수 있다. 배경의 방식으로, 안정한 동위원소 측정 및 질량 균형 접근법은 글로벌 공급원 및 메탄의 싱크를 평가하기 위해 널리 이용된다(문헌[Whiticar and Faber, Org. Geochem. 10:759, 1986; Whiticar, Org . Geochem . 16: 531, 1990] 참조). 잔류 메탄의 동위원소 서명(즉, 안정한 동위원소 13C:12C의 비율) 값을 측정함으로써 메탄의 미생물 산화에 의해 발생한 탄소 동위원소 분별화의 정도의 측정을 결정할 수 있다. 예를 들어, 호기성 메탄영양세균은 특이적 효소, 메탄 모녹시게나제(MMO)를 통해 메탄을 대사시킬 수 있다. 메탄영양세균은 메탄을 메탄올 및 후속하여 폼알데하이드로 전환시킨다. 폼알데하이드는 환원 등가물(NADH)의 형태로 세포에 에너지를 제공하도록 CO2로 추가로 산화될 수 있거나, 광합성 유기체에서 탄소 동화 경로와 직접적으로 유사한, RuMP 또는 세린 사이클을 통해 바이오매스로 도입될 수 있다(Hanson and Hanson, Microbiol. Rev. 60:439, 1996). 더 구체적으로, I형 메탄영양세균은 바이오매스 합성을 위해 RuMP 경로를 이용하고, 전부 CH4로부터 바이오매스를 생성하지만, II형 메탄영양세균은 CH4로부터 세포 탄소의 50% 내지 70%, 및 CO2로부터 30% 내지 50%를 동화시키는 세린 경로를 이용한다(Hanson and Hanson, 1996). 탄소 동위원소 조성물을 측정하는 방법은 예를 들어 문헌[Templeton et al. (Geochim . Cosmochim . Acta 70:1739, 2006]에 제공되어 있고, 이 방법은 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다. 아이소프렌의 13C/12C 안정한 탄소 동위원소 비율(천분율로 δ13C 값으로 보고됨)은 사용된 C1 기질의 공급원 및 순도에 따라 변한다(예를 들어, 도 4 참조).
예를 들어, 석유로부터 유래한 아이소프렌은 약 -22‰ 내지 약 -24‰의 δ13C 분포를 갖는다. 옥수수 유래 글루코스로부터 주로 생합성된 아이소프렌(δ13C -10.73‰)은 약 -14.66‰ 내지 -14.85‰의 δ13C를 갖는다. 재생 가능 탄소원으로부터 생합성된 아이소프렌은 석유로부터 유래한 아이소프렌보다 덜 음수인 δ13C 값을 갖는 것으로 예상된다. 그러나, 천연 가스로부터의 메탄의 δ13C 분포는, 미정제 석유보다 더 음수인 δ13C 분포에 의해, 대부분의 탄소원과 구별된다. 메탄영양 박테리아는 12C를 이용하고, 과도한 메탄의 조건 하의 13C의 이의 유입을 감소시키는 것(δ13C 값의 추가의 음수의 이동을 발생시킴)에 대한 선호도를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 메탄영양 박테리아에 의해 생성된 아이소프렌은 약 -30‰ 내지 약 -50‰ 범위의 미정제 석유 또는 재생 가능 탄소원으로부터 아이소프렌보다 더 음수인 δ13C 분포를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 조성물은 약 -30‰, -40‰ 또는 -50‰ 미만의 δ13C 분포를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 조성물은 약 -30‰ 내지 약 -40‰, 또는 약 -40‰ 내지 약 -50‰의 δ13C 분포를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 아이소프렌 조성물은 약 -30‰, -40‰ 또는 -50‰ 미만의 δ13C 분포를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 조성물은 약 -30‰ 내지 약 -40‰, 또는 약 -40‰ 내지 약 -50‰의 δ13C 분포를 갖는다. 추가의 실시형태에서, 아이소프렌 조성물은 -30‰ 미만, -31‰ 미만, -32‰ 미만, -33‰ 미만, -34‰ 미만, -35‰ 미만, -36‰ 미만, -37‰ 미만, -38‰ 미만, -39‰ 미만, -40‰ 미만, -41‰ 미만, -42‰ 미만, -43‰ 미만, -44‰ 미만, -45‰ 미만, -46‰ 미만, -47‰ 미만, -48‰ 미만, -49‰ 미만, -50‰ 미만, -51‰ 미만, -52‰ 미만, -53‰ 미만, -54‰ 미만, -55‰ 미만, -56‰ 미만, -57‰ 미만, -58‰ 미만, -59‰ 미만, -60‰ 미만, -61‰ 미만, -62‰ 미만, -63‰ 미만, -64‰ 미만, -65‰ 미만, -66‰ 미만, -67‰ 미만, -68‰ 미만, -69‰ 미만, 또는 -70‰ 미만의 δ13C를 갖는다.
아이소프렌 생성의 측정
당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 아이소프렌 생성을 측정할 수 있다. 단쇄 탄화수소를 검출하기 위해 선택된 불꽃 이온화 검출기 및 칼럼이 구비된, 가스 크로마토그래피에 의해, 예를 들어 발효기 가스의 배출가스로부터의 샘플을 분석할 수 있다(Lindberg et al., 2010, Metabolic Eng. 12:70-79). 생성된 아이소프렌의 양은 순수한 아이소프렌 표준품과의 비교에 의해 추정될 수 있다. 문헌[Silver et al., J. Biol.Chem. 270:13010, 1995], 미국 특허 제5,849,970호 및 이들 문헌에 인용된 참조문헌은 산화수은 가스 검출기에 의해 가스 크로마토그래피를 이용하여 아이소프렌 생성을 측정하는 방법을 기재하고, 이 방법은 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.
아이소프렌의 회수 및 정제
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 숙주 메탄영양 박테리아에 의해 생성된 아이소프렌을 회수하거나 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하기 기재된 예시적인 회수 및 정제 방법이 아이소프렌을 언급하지만, 이들은 또한 아이소프레노이드 또는 아이소프렌으로부터 유래한 다른 화합물에 적용될 수 있다.
본 개시내용에 제공된 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 아이소프렌은 아이소프렌 생성 메탄영양세균의 배양을 통해 가스 스트림(예를 들어, 질소, 공기)을 버블링함으로써 발효 시스템으로부터 회수될 수 있다. 발효 배출가스에서 아이소프렌의 농도를 증대시키기 위해 발효 배지의 가스 스파징 속도를 변경하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 아이소프렌은 당해 분야에 공지된 기법, 예컨대 가스 스트리핑, 증류, 중합체 막 증대 분리, 분별화, 투과증발, 흡착/탈착(예를 들어, 실리카 겔, 탄소 카트리지), 고상으로부터의 아이소프렌의 열 또는 진공 탈착, 또는 용매에 의한 고상에 부동화되거나 흡착된 아이소프렌의 추출을 이용하여 추가로 회수되거나 정제된다(예를 들어, 미국 특허 제4,703,007호, 미국 특허 제4,570,029호, 미국 특허 제4,147,848호, 미국 특허 제5,035,794호, PCT 공보 WO2011/075534(이들 각각의 방법은 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨) 참조). 알콜(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이들의 조합)에 의한 추출 증류는 아이소프렌을 회수하도록 이용될 수 있다. 아이소프렌 회수는 액체 형태의 아이소프렌의 단리를 포함할 수 있다(예를 들어, 아이소프렌의 온전한 용액, 또는 용매를 갖는 아이소프렌의 용액). 가스 형태의 아이소프렌의 회수는 가스 스트리핑을 포함할 수 있고, 발효 배출가스로부터의 아이소프렌 증기는 연속 방식으로 제거된다. 예를 들어, 고상에 대한 흡착, 액상으로의 분배, 또는 직접 응축을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 가스 스트리핑을 성취할 수 있다. 액체 아이소프렌을 응축시키도록 증기의 이슬점을 초과한 희석 아이소프렌 증기 스트림의 막 농후화를 또한 이용할 수 있다. 아이소프렌 가스를 또한 압축하고 응축할 수 있다.
아이소프렌의 회수 및 정제는 하나의 단계 또는 다수의 단계를 포함할 수 있다. 회수 및 정제 방법은 고순도 아이소프렌을 얻기 위해 개별적으로 또는 조합하여 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발효 배출가스로부터의 아이소프렌 가스의 제거 및 액상으로의 전환을 동시에 수행한다. 예를 들어, 아이소프렌은 배출가스 스트림으로부터 액체로 직접적으로 응축될 수 있다. 다른 실시형태에서, 발효 배출가스로부터의 아이소프렌 가스의 제거 및 액상의 전환이 순차적으로 수행된다(예를 들어, 아이소프렌은 고상으로 흡착되고, 이후 용매에 의해 추출될 수 있다).
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 배양 시스템으로부터 제거된 아이소프렌은 추가의 정제(예를 들어, 아이소프렌 생성 동안 아이소프렌 액체 또는 증기에 존재하는 하나 이상의 비아이소프렌 성분으로부터의 분리)를 겪는다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌은 실질적으로 정제된 액체이다. 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 추출 증류 및 크로마토그래피를 포함하고, 순도는 칼럼 크로마토그래피, HPLC 또는 GC-MS 분석과 같은 방법에 의해 평가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌은 적어도 20중량%, 25중량%, 30중량%, 35중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량%, 55중량%, 60중량%, 65중량%, 70중량%, 75중량%, 80중량%, 85중량%, 90중량%, 95중량% 또는 99중량%의 순도를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 아이소프렌 회수의 하나 이상의 단계 후 남은 기상의 적어도 일부는 발효 시스템으로 다시 재순환된다.
아이소프렌의 추가의 가공
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 아이소프렌은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 다른 고부가 생성물로 추가로 처리될 수 있다. 회수 또는 정제 후, 아이소프렌은 다양한 촉매를 사용하여 중합되어 다양한 폴리아이소프렌 이성질체를 형성할 수 있다(Senyek, "Isoprene Polymers", Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 2002, John Wiley & Sons, Inc.). 아이소프렌은 또한 스타이렌 또는 뷰타다이엔에 의해 중합되어 다양한 엘라스토머를 형성할 수 있다. 과산화수소에 의해 개시된 아이소프렌의 광화학 중합은 감압 접착제로서 사용될 수 있는 하이드록실 말단 폴리아이소프렌을 형성한다. 아이소프렌 텔로머화 생성물은 또한 연료로서 유용하다(Clement et al., 2008, Chem. Eur. J. 14:7408-7420; Jackstell et al., 2007, J. Organometallic Chem. 692:4737-4744). 아이소프렌은 또한 촉매를 사용하여 이합체(10-탄소) 및 삼합체(15-탄소) 탄화수소 알켄으로 화학적으로 개질될 수 있다(Clement et al., 2008, Chem. Eur. J. 14:7408-7420; Gordillo et al., 2009, Adv. Synth. Catal. 351:325-330). 알켄은 수소화되어 장쇄 분지 알칸을 형성할 수 있고, 이 장쇄 분지 알칸은 연료 또는 용매로서 사용될 수 있다. 아이소프렌은 아이소프레노이드 화합물, 예컨대 테르펜, 징코라이드, 스테롤 또는 카로테노이드로 전환될 수 있다. 아이소프렌은 또한 아이소프레노이드계 생물연료, 예컨대 파르네산, 비사볼란, 피넨, 아이소펜탄올 또는 임의의 이들의 조합으로 전환될 수 있다(Peralta-Yahya et al., 2012, Nature 488:320-328).
증가한 아이소프렌 경로 전구체에 의한 돌연변이체에 대한 스크리닝 방법
게놈 또는 유전자 특이적 돌연변이는, 아이소프렌 전구체의 생성을 개선하기 위한 노력으로, 숙주 메탄영양 박테리아에서 유도될 수 있다. 게놈 돌연변이를 유발하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, 1992, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227] 참조), 예를 들어, UV 조사, 화학 돌연변이유발(예를 들어, 아크리딘 염료, HNO2, NH2OH) 및 전이인자 돌연변이유발(예를 들어, Ty1, Tn7, Tn5)을 포함한다. 무작위 돌연변이유발 기법, 예를 들어 실수 유발 PCR, 회전 환 실수 유발 PCR, 또는 뮤테이터 균주는 특이적 유전자 또는 유전자 세트의 무작위 돌연변이체 라이브러리를 생성하도록 사용될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발은 또한 특이적 유전자 또는 유전자 세트의 돌연변이체 라이브러리를 생성하도록 사용될 수 있다.
본 개시내용은, 메탄영양 박테리아로 라이코펜 경로를 조작함으로써, 아이소프렌 전구체의 생성이 개선된, 돌연변이체 메탄영양 균주를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 라이코펜 및 아이소프렌 합성 경로는 동일한 보편적 전구체, 아이소펜테닐 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 사용하고(도 1 및 도 6 참조); 라이코펜 및 아이소프렌 생합성은 대부분의 DXP 경로를 공유한다. 박테리아의 적색 착색의 증가로 측정되는, 라이코프렌 생성의 개선을 발생시키는, 유리한 게놈 돌연변이는, 돌연변이가 중첩하는 경로 성분에 영향을 미치는 경우, IPP 및 DMAPP 생성을 증가시킴으로써 아이소프렌 합성을 또한 개선할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법은 (a) 메탄영양 박테리아를 뮤타젠에 노출시켜 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 생성하는 단계; (b) 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는 단계; 및 (c) 성장에 충분한 조건 하에 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고; GGPPS, CRTB 및 CRTI에 의해 형질전환되고, 뮤타젠에 노출되지 않는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 돌연변이체 메탄영양 박테리아가, 적색 착색이 증가한 돌연변이체 메탄영양 박테리아가 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 아이소프렌 전구체의 합성의 증가를 나타낸다는 것을 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 전구체는 IPP 또는 DMAPP이다. 몇몇 실시형태에서, 뮤타젠은 방사선, 화학물질, 플라스미드 또는 전이인자이다. 증가한 라이코펜 경로 활성을 통해 증가한 아이소프렌 전구체 생성을 갖는 것으로 확인된 돌연변이체 메탄영양 박테리아는 이후 본 명세서에 기재된 아이소프렌 생합성 경로에 의해 조작될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적색 착색이 증가한 돌연변이체 메탄영양 박테리아 또는 이의 클론 세포는 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환된다. 소정의 실시형태에서, 적어도 1개, 2개 또는 모든 라이코펜 경로 유전자(GGPPS, CRTB 및 CRTI)는, IspS를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환되기 전에 또는 형질전환된 후에, 증가한 아이소프렌 전구체 생성을 갖는 것으로 확인된 돌연변이체 메탄영양 박테리아로부터 제거되거나 불활화된다. 기능적 라이코펜 경로와 기능적 아이소프렌 경로와의 동시발현은 공유된 전구체 DMAPP 및 IPP에 대해 경쟁할 것이고, 아이소프렌 생성을 낮출 수 있다. 본 명세서에 기재된 스크리닝 방법을 통해 확인된 돌연변이체 메탄영양 박테리아에서의 아이소프렌 생성을 이후 아이소프렌 생합성 능력을 갖는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여, 증가한 아이소프렌 수준을 확인할 수 있다. 클론 박테리아 스톡이 후속하는 사용에 대한 방법 동안 각각의 단계에서 저장될 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에게 명확하다. 예를 들어, 적색 착색이 증가한 것으로 확인된 특정한 박테리아의 경우, 라이코펜 경로에 의한 형질전환 전에 저장된 이 박테리아(즉, 외인성 라이코펜 경로 없이 라이코펜 스크리닝에 의해 확인된 아이소프렌 합성에 대한 가능하게 유리한 돌연변이를 갖는 박테리아)의 클론 스톡이 아이소프렌 신타제(예를 들어, IspS)에 의해 형질전환될 수 있다.
메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법이 본 개시내용에 또한 제공된다. 이 스크리닝 방법은 비색 판독으로서 라이코펜 경로를 메탄영양 박테리아로 조작함으로써 아이소프렌 전구체 DMAPP 및 IPP의 합성을 증가시키는 아이소프렌 경로 유전자를 확인하도록 사용될 수 있다. 라이코펜 및 아이소프렌 합성 경로는 동일한 보편적 전구체, IPP 및 DMAPP를 사용한다(도 1 및 도 6 참조). 메탄영양 박테리아는 이종성 아이소프렌 경로 유전자, 동종성 아이소프렌 경로 유전자의 과발현, 변이체 아이소프렌 경로 유전자 또는 임의의 이들의 조합에 의해 변형되어, 박테리아의 증가한 적색 착색에 의해 측정된, 개선된 라이코펜 생성을 갖는 박테리아를 확인할 수 있다. 라이코펜 생성이 증가한 것으로 확인된 박테리아는 또한 증가한 IPP 및 DMAPP 생성 때문에 개선된 아이소프렌 합성을 나타낼 수 있다.
소정의 실시형태에서, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법은 (a) 메탄영양 박테리아를 (ⅰ) 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산; (ⅱ) 게라닐게라닐 다이스포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는 단계; 및 (b) 성장에 충분한 조건 하에 단계 (a)로부터의 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고; GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고, 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 함유하지 않는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 형질전환된 메탄영양 박테리아는, 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산이 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 증가한 아이소프렌 전구체 합성을 부여한다는 것을 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 아이소프렌 경로 효소는 DXP 경로 효소(예를 들어, DXS, DXR, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 IDI) 또는 메발로네이트 경로 효소(예를 들어, AACT, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD 또는 IDI)이다. 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 이종성 핵산 또는 동종성 핵산일 수 있다. 이종성 핵산은 숙주 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 동종성 핵산은 메탄영양 박테리아에서 과발현된다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에서, 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 비천연 발생 변이체일 수 있다. 비천연 발생 변이체는 무작위 돌연변이유발, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성되거나, (전체적으로 또는 부분적으로) 합성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 비천연 발생 변이체는 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 기준 핵산과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
라이코펜 경로 효소의 공급원은 당해 분야에 공지되어 있고, 식물, 광합성 박테리아, 진균 및 조류의 종을 포함하는, 라이코펜 경로를 천연으로 보유하는 임의의 유기체일 수 있다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB000835(아라비돕시스 탈리아나); AB016043(호모 사피엔스); AB019036(호모 사피엔스); AB016044(무스 무스쿨루스); AB027705(다쿠스 카로타(Dacus carota)); AB034249(크로톤 수블리라투스(Croton sublyratus)); AB034250(스코파리아 둘시스(Scoparia dulcis)); AF049659(드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)); AF139916(브레비박테륨 리넨스(Brevibacterium linens)); AF279807(페니실룸 팍실리(Penicillum paxilli)); AJ010302(로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)); AJ133724(마이코박테륨 아우룸(Mycobacterium aurum)); L25813(아라비돕시스 탈리아나); U44876(아라비돕시스 탈리아나); 및 U15778(루피누스 알부스(Lupinus albus))을 포함한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 피토엔 신타제에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB001284(스피룰리나 플라텐시스); AB032797(다우쿠스 카로타); AB034704(루브릭비박스 겔라티노수스(Rubrivivax gelatinosus)); AB037975(시트러스 운수이(Citrus unshui)); AF009954(아라비돕시스 탈리아나); AF139916(브레비박테륨 리넨스); AF152892(시트러스 x 파라디스); AF218415(브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.) ORS278); AF220218(시트러스 운시우); AJ133724(마이코박테륨 아우룸); 및 AJ304825(헬리안투스 아누스(Helianthus annuus))를 포함한다. NCBI 데이터베이스에서 이용 가능한 피토엔 탈수소효소에 대한 핵산 서열의 예는 수탁 번호 AB046992(시트러스 운시우); AF139916(브레비박테륨 리넨스); AF218415(브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.) ORS278); AF251014(타게테스 에렉타(Tagetes erecta)); L16237(아라비돕시스 탈리아나); L39266(제아 메이스); M64704(글라이신 막스); AF364515(시트러스 x 파라디시); D83514(에리쓰로박터 롱거스(Erythrobacter longus)); M88683(라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)); 및 X55289(시네초코커스)를 포함한다.
실시예
실시예 1
메타노코커스 캅술라투스 바쓰 균주에서의 아이소프렌 신타제의 클로닝 및 발현
아이소프렌 생성 메탄영양 균주를 생성하기 위해, 아이소프렌 신타제(IspS)를 코딩하는 유전자를 함유하는 메탄영양 발현 벡터를 접합적 교배를 통해 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰, 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b 및 메틸로모나스 종 16A에 삽입하였다. 에피솜 발현 플라스미드(복제 기원, 전달 기원, 약물 내성 마커(카나마이신) 및 다수의 클로닝 부위를 코딩하는 서열을 함유)를, 메탄올 탈수소효소(MDH) 프로모터의 하류의, 코돈 최적화된 살릭스 종 IspS 폴리뉴클레오타이드 서열(메틸로코커스 캅술라투스 바쓰에 대해 서열 번호 19), 또는, IPTG-유도성(LacIq) 프로모터의 하류의, 푸에라리아 몬타나 코돈 최적화된 IspS 폴리뉴클레오타이드 서열(아미노 말단 엽록체 표적 서열이 제거됨)(메틸로코커스 캅술라투스 바쓰에 대한 서열 번호 17) 중 하나를 클로닝하도록 사용하였다. IspS 보유 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 균주(공여자 균주) 및 pRK2013 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이(ATCC)(헬퍼 균주)의 콜로니를 카나마이신 함유 액체 LB(30㎍/㎖)에서 접종하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 1부의 각각의 액체 공여자 배양물 및 헬퍼 배양물을 3-5시간 동안 100부의 새로운 카나마이신 함유 액체 LB(30㎍/㎖)에 접종한 후, 이들을 수혜자 메탄영양 균주와 교배하도록 사용하였다. 메탄영양(수혜자) 균주를 지수 성장상(약 0.3의 OD600)에 도달하기 전에 교배 전에 1-2일 동안 약 40㎖ 메탄과 액체 MM-W1 배지(Pieja et al., 2011, Microbial Ecology 62:564-573)에서 접종하였다.
일정 용적으로 수혜자, 공여자 및 헬퍼 균주를 제조함으로써 삼친 교배를 수행하여서, OD600 비율은 2:1:1이었다(예를 들어, 1.5의 OD600를 갖는 1㎖의 메탄영양세균, 0.75의 OD600을 갖는 1㎖의 공여자 및 0.75의 OD600을 갖는 1㎖의 헬퍼). 이들 세포를 이후 5,300rpm에서 25℃에서 7분 동안 원심분리에 의해 수확하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 500㎕의 MM-W1 중에 온화하게 재현탁시켰다. 이. 콜라이 공여자 및 헬퍼 균주의 경우, 원심분리 및 재현탁액을 2회 초과 반복하여 항생제의 제거를 보장하였다. 동일 용적의 수혜자, 공여자 및 헬퍼 균주의 재현탁된 세포를 이후 합하고 온화한 피펫팅에 의해 혼합하였다. 교배 조성물을 30-60초 동안 13.2k rpm에서 스피닝하고, 상청액을 가능한 많이 제거하였다. 세포 펠렛을 이후 온화하게 혼합하고, 교배 한천에 액적으로 침착시켰다(무균 0.5% 효모 추출물을 함유하는 완전한 MM-W1 배지). 수혜자로서 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b 또는 메틸로모나스 종 16A를 사용하는 경우에 30℃에서 또는 수혜자 균주로서 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰를 사용하는 경우에 37℃에서 교배 플레이트를 메탄 및 공기를 함유하는 옥소이드(oxoid) 챔버에서 48시간 동안 항온처리하였다. 48시간 항온처리 기간 후, 1㎖의 MM-W1 배지를 플레이트에 첨가하고 현탁된 세포를 2㎖의 에펜도르프 관에 옮김으로써 교배 플레이트로부터 세포를 수집하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 100㎕의 새로운 MM-W1에 의해 재현탁한 후, 선택 플레이트(카나마이신 10㎍/㎖를 함유하는 완전한 MM-W1 한천 배지)에 플레이팅하여, 작제물을 안정하게 유지시키는 세포를 선택하였다. 메탄-공기 혼합물을 함유하는 옥소이드 챔버에서 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주에 대해 42℃에서의 약 1주 항온처리 또는 메틸로모나스 16a 및 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b에 대해 30℃에서의 약 1주 항온처리 후, 플라스미드 보유 메탄영양세균이 이 플레이트에 나타났다. 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주 클론을 이후 1㎖의 액체 배지 중에 배양하고 아이소프렌 생성에 대해 분석하였다.
실시예 2
메타노코커스 캅술라투스 바쓰 균주에 의한 아이소프렌의 생성
구성적 MDH 프로모터-살릭스 종 IspS를 함유하는 벡터 또는 (0.1-10mM IPTG의 존재 또는 부재 하에 성장한) IPTG-유도성(LacIq) 프로모터-푸에라리아 몬타나 IspS를 함유하는 벡터 중 어느 하나를 함유하는 엠. 캅술라투스 바쓰 균주의 밤새 성장된 밀폐된 5㎖의 배양물로부터의 두부 가스 샘플(250㎕)을 얻었다. 가스 샘플을 불꽃 이온화 검출기(휴렛 패커드(Hewlett Packard) 5890)가 구비된 가스 크로마토그래피에 주입하였다. 크로마토그래피 조건은 애질런트 CP-PoraBOND U(25m×0.32㎜ i.d.) 칼럼, 오븐 프로그램 50℃, 1.5분; 25℃, 1분; 300℃, 10분을 포함한다. 용리된 피크를 불꽃 이온화에 의해 검출하고, 아이소프렌 표준품(탈이온수에 용해된 순수한 아이소프렌)과 비교에 의해 적분 피크를 정량화하였다.
엠. 캅술라투스 바쓰는 살릭스 종 IspS의 발현과 비교하여 푸에라리아 몬타나 IspS를 발현할 때 더 많은 아이소프렌을 생성하였다. 또한, 푸에라리아 몬타나 IspS를 발현하는 엠. 캅술라투스 바쓰에서 생성된 아이소프렌의 양은 IPTG에 의한 LacIq 프로모터의 유도와 직접적으로 상관된다(도 7a 참조). 도 5 및 도 7b는 각각 살릭스 종으로부터의 두부 샘플 및 푸에라리아 몬타나 변이체 샘플의 GC/MS 크로마토그래피를 나타낸다. 도 5에서, 샘플 A는 비형질전환된 세포로부터의 두부로부터의 배경 신호를 나타내는 음성 대조군이다. 도 5의 샘플 B에서의 아이소프렌 수율은 약 10㎎/ℓ이었다. 도 7b는 생성된 아이소프렌의 실질적인 양을 나타낸다.
실시예 3
개선된 아이소프렌 생성을 갖는 DXP 경로의 조작
아이소프렌의 헌신적인 전구체의 합성을 위한 효소(IPP 및 DMAPP)의 개선을 전체적으로 발생시키는 경로 내에 새로운 유전자 서열 또는 조절 구성요소를 생성할 목적으로, DXP 경로 오페론(즉, DXS-DXR-IspD-IspE-IspF-IspG-IspH)에서 무작위 돌연변이를 도입하였다. 개선된 DXP 경로를 단리하기 위한 손쉬운 고속 스크리닝 방법을 구축하기 위해, ggpps , crtB 및 crtI을 포함하는 라이코펜 합성 경로를 비색 리포터로서 사용하였다. DXP 경로의 무작위 돌연변이유발 라이브러리는 진모프(GENEMORPH)(등록상표) II 무작위 돌연변이유발 키트(스트라타진(Stratagene))를 사용하여 낮은, 중간 및 높은 돌연변이율에서 실수 유발 PCR에서 생성되었다. 이후, 라이브러리를 ggpps, crtB 및 crtI 유전자 서열을 함유하는 메탄영양 발현 플라스미드로 클로닝하고, 이로써 이의 폴리시스트론 발현은 강한 메탄영양 프로모터 서열(예를 들어, 메탄올 탈수소효소 프로모터)에 의해 추진된다. 이후, 플라스미드를 함유하는 라이브러리의 풀을 이. 콜라이 DH10B의 대략 106개 초과의 형질전환체로부터 단리하였다. 이후, 플라스미드 라이브러리를 사용하여 메탄영양 균주를 형질전환시켰다. (MM-WI 플레이트에서 가시화된 것처럼) 연장된 항온처리 기간 후 선홍색을 나타낸 콜로니를 단리하였다. 플라스미드 추출 및 서열분석 후, 돌연변이체 DXP 경로 유전자를 실수 유발 PCR의 다음 회차에서 풀로서 사용하였다. ggpps, crtB, crtI을 함유하는 플라스미드와 함께, 야생형 DXP 경로 유전자를 함유하는 메탄영양 균주는 돌연변이체 DXP 경로 유전자를 단리하기 위한 라이코펜 형성의 기준 비교로서 작용한다. 증가한 적색 색상을 나타내는 부가적인 콜로니가 확인되지 않은 후 돌연변이 및 스크리닝의 반복을 중단하였다. 이후, 새로운 DXP 경로 유전자를 보유하는 플라스미드를 메탄영양 숙주로부터 단리하였다. 이후, 이 새로운 DXP 경로 유전자를 메탄영양 숙주 박테리아에서 IspS와 동시발현시켜 아이소프렌 생성의 개선을 확인하였다.
실시예 4
C 1 대사 미생물에서의 안정한 탄소 동위원소 분포
이소프라임(IsoPrime)100 IRMS(이소프라임, 영국 치들)와 커플링된 CHNOS 원소 분석기(바리오 이소토프 큐브(vario ISOTOPE cube), 엘레멘타(Elementar), 독일 하나우)를 사용하여 원소 분석기/연속 흐름 동위원소 비율 질량 분광법을 통해 탄소 및 질소 함량(건조 중량(%)) 및 탄소(13C) 및 질소(15N) 안정한 동위원소 비율에 대해 엠. 트리초스포륨 바이오매스의 건조 샘플을 분석하였다. 발효기 또는 혈청 병에서 배양된 메탄영양세균 바이오매스의 샘플을 원심분리하고, 탈이온수 중에 재현탁시키고, 0.2-2㎎의 탄소(약 0.5-5㎎의 건조 세포 중량)에 상응하는 용적을 5×9㎜의 주석 캡슐(Costech Analytical Technologies, Inc., 캘리포니아주 발렌시아)로 옮기고, 80℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 0.1㎎의 탄소를 함유하는 표준품은 신뢰할만한 δ13C 값을 제공하였다.
동위원소 비율은 "델타" 표시(‰)로 표현되고, 100 편차 기준마다 표준품에 대한 물질의 동위원소 조성물은 δ13C(또는 δ15N) = (R샘플/R표준품-1)×1,000(여기서, R은 무거운 동위원소 형태에 대한 가벼운 동위원소 형태의 분자 비율임)으로 제공된다. 탄소에 대한 표준품은 비엔나 피 디 벨렘나이트(Vienna Pee Dee Belemnite)(V-PDB)이고, 질소에 대한 표준품은 공기이다. NIST(국립 표준품 협회: National Institute of Standards and Technology)는 SRM(표준 기준 물질: Standard Reference Material) 1547호 복숭아 잎을 제안하고, 보정 표준품으로서 사용되었다. 모든 동위원소 분석을 버클리의 캘리포니아 대학교(University of California)에서의 안정한 동위원소 생물지구화학 센터(Center for Stable Isotope Biogeochemistry)에서 수행하였다. C 및 N 동위원소 분석에 대한 장기간 외부 정확성은 각각 0.10‰ 및 0.15‰이다.
엠. 트리초스포륨 균주 OB3b를 3개의 상이한 발효 배취에서 메탄에서 성장시키고, 엠. 캅술라투스 바쓰를 2개의 상이한 발효 배취에서 메탄에서 성장시키고, 메틸로모나스 종 16A를 단일 발효 배취에서 메탄에서 성장시켰다. 3개의 배양물의 각각으로부터의 바이오매스를 안정한 탄소 동위원소 분포에 대해 분석하였다(δ13C 값; 표 4 참조).
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 5
안정한 탄소 동위원소 분포에 대한 메탄 공급원 및 순도의 영향
천연 가스 성분을 함유하는 메탄에서의 메탄영양세균 성장을 조사하기 위해, 100㎖의 한정 배지 MMS1.0을 함유하는 일련의 0.5리터 혈청 병을, 1:1(v/v)의 메탄과 공기의 혼합물이 공급된 동일한 배지에서 성장한 혈청 병 배취 배양물(5% v/v)로부터의 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b 또는 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰와 접종하였다. 배지 MMS1.0의 조성은 하기와 같다: 0.8mM MgSO4×7H2O, 30mM NaNO3, 0.14mM CaCl2, 1.2mM NaHCO3, 2.35mM KH2PO4, 3.4mM K2HPO4, 20.7μM Na2MoO4×2H2O, 6μM CuSO4×5H2O, 10μM FeIII-Na-EDTA, 및 미량 금속 용액의 리터당 1㎖(1ℓ당, 500㎎ FeSO4×7H2O, 400㎎ ZnSO4×7H2O, 20㎎ MnCl2×7H2O, 50㎎ CoCl2×6H2O, 10㎎ NiCl2×6H2O, 15㎎ H3BO3, 250㎎ EDTA 함유). 배지를 오토클레이빙하고 냉각시킨 후, 인산염, 중탄산염 및 FeIII-Na-EDTA를 첨가하였다. 배지의 최종 pH는 7.0±0.1이었다.
접종된 배지를 고무 슬리브 스토퍼로 밀봉하고, 무균 0.45㎛ 필터 및 무균 27G 바늘을 통해 주사기로 첨가된 60㎖의 메탄 가스로 주입하였다. 이중 배양물을 각각 60㎖의 용적의 (A) 99% 순도의 메탄(등급 2.0, 알리안스 가스(Alliance Gas)(캘리포니아주 샌 카를로스)를 통한 프락스에어(Praxair)), (B) 천연 가스 표준품을 나타내는 70% 순도의 메탄(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 또한 9% 에탄, 6% 프로판, 3% 메틸프로판, 3% 뷰탄 및 다른 소량의 탄화수소 성분을 함유), (C) 1:1의 메탄 공급원 A와 B의 혼합물로 전달된 85% 순도의 메탄; 및 (D) >93% 메탄(등급 1.3, 스페셜티 케미컬 프로덕츠(Specialty Chemical Products)(텍사스 사우스 휴스톤); 인하우스 분석은 조성 >99% 메탄을 나타냄)으로 주입하였다. 배양물을 250rpm에서 회전 진탕시키면서 30℃(엠. 트리초스포륨 균주 OB3b) 또는 42℃(엠. 캅술라투스 바쓰)에서 항온처리하고, 1㎖의 샘플을 배출시키면서 대략 12시간 간격으로 성장을 측정하여 OD600을 결정하였다. 이때, 병을 배기시키고, 두부를 60㎖의 각각의 메탄 공급원(A, B, C 또는 D) 및 60㎖의 농축 산소(적어도 85% 순도)로 대체하였다. 약 24시간 간격으로, 5㎖의 샘플을 제거하고, 세포를 원심분리(8,000rpm, 10분)에 의해 회수하고, 이후 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
엠. 트리초스포륨 균주 OB3b 및 엠. 캅술라투스 바쓰로부터 유도된 메탄영양세균 바이오매스에 대한, 탄소 및 질소 함량(건조 중량(%)) 및 탄소(13C) 및 질소(15N) 안정한 동위원소 비율의 분석을 실시예 4에 기재된 바대로 수행하였다. 표 5는 병 배양물의 다양한 배취에서 상이한 순도 수준을 갖는 메탄에서 성장한 엠. 캅술라투스 바쓰로부터의 바이오매스 샘플에 대한 안정한 탄소 동위원소 분석의 결과를 나타낸다.
Figure pct00013
메탄(A, 99%)의 공급원에서 성장한 엠. 캅술라투스 바쓰에 대한 평균 δ13C는 -41.2±1.2이고, 메탄(B, 70%)의 상이한 공급원에서 성장한 엠. 캅술라투스 바쓰에 대한 평균 δ13C는 -44.2±1.2이었다. 메탄 공급원 A 및 B가 혼합될 때, -43.8±2.4의 중간 평균 δ13C가 관찰되었다. 이 데이터는 메탄 공급원 A 및 B에서 성장한 세포 물질의 δ13C가 유입 메탄의 δ13C의 차이로 인해 서로 유의적으로 다르다는 것을 나타낸다. 그러나, 2개의 가스의 혼합물에서 성장한 세포는 12C를 우선적으로 이용하고, 따라서, 더 음성인 δ13C 값에 대한 경향을 나타낸다.
병 배양물의 다양한 배취에서 상이한 메탄 공급원에서 성장한 2개의 상이한 메탄영양세균, 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 및 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b가 δ13C 분포의 차이를 나타내는지를 조사하기 위해 유사한 실험을 수행하였다(표 6 참조).
Figure pct00014
제1 메탄 공급원(A)에서 성장한 엠. 캅술라투스에 대한 평균 δ13C는 -44.5±8.8이고, 동일한 메탄 공급원에서 성장한 엠. 트리초스포륨에 대한 평균 δ13C는 -47.8±2.0이었다. 제2 메탄 공급원(B)에서 성장한 엠. 캅술라투스에 대한 평균 δ13C는 -37.9±0.4이고, 엠. 트리초스포륨에 대한 평균 δ13C는 -39.8±4.5이었다. 이 데이터는 메탄 공급원에서 성장한 세포 물질의 δ13C가 메탄의 동일한 공급원에서 성장한 상이한 균주로부터의 세포 물질의 δ13C와 매우 유사하다는 것을 나타낸다. 따라서, 세포 물질의 관찰된 δ13C는 연구된 특정한 박테리아 균주의 특성보다 유입 가스의 조성에 따라 주로 달라지는 것으로 보인다.
상기 기재된 다양한 실시형태는 추가의 실시형태를 제공하도록 조합될 수 있다. 미국 특허 출원 제61/774,342호 및 미국 특허 출원 제61/928,333호(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는, 본 명세서에서 언급되거나 출원 데이터 시트에 기재된, 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 (본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 다른 추가의 실시형태를 제공하도록, 필요한 경우, 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 이용하도록 실시형태의 양상이 변형될 수 있다.
상기 자세한 설명의 견지에서 이들 변화 및 다른 변화가 실시형태에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시형태에 대한 청구를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하지만, 이러한 청구범위가 권한 부여한 등가물의 완전 범위와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Calysta, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF ISOPRENE <130> WO2014/138419 <140> PCT/US2014/021258 <141> 2014-03-06 <150> US 61/928,333 <151> 2014-01-16 <150> US 61/774,342 <151> 2013-03-07 <160> 19 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 595 <212> PRT <213> Populus alba <400> 1 Met Ala Thr Glu Leu Leu Cys Leu His Arg Pro Ile Ser Leu Thr His 1 5 10 15 Lys Leu Phe Arg Asn Pro Leu Pro Lys Val Ile Gln Ala Thr Pro Leu 20 25 30 Thr Leu Lys Leu Arg Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser Phe Thr 35 40 45 Glu Thr Glu Thr Glu Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser 50 55 60 Trp Asp Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu 65 70 75 80 Val Tyr Lys Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu 85 90 95 Ile Asn Asn Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp 100 105 110 Asn Val Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg 115 120 125 Gly Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Ala Val Thr 130 135 140 Lys Thr Ser Leu His Gly Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln 145 150 155 160 His Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln 165 170 175 Asn Gly Asn Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Ile Lys Ala Ile Leu 180 185 190 Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Lys Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu 210 215 220 Glu Lys Ile Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu 225 230 235 240 Leu Pro Leu His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile 245 250 255 Glu Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu 260 265 270 Ala Ile Leu Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu 275 280 285 Arg Glu Thr Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu 290 295 300 His Phe Ala Arg Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly 305 310 315 320 Val Ala Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys 325 330 335 Met Phe Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly 340 345 350 Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp 355 360 365 Val Asn Ala Ile Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu 370 375 380 Ala Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp 385 390 395 400 Lys Gly Glu Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu 405 410 415 Cys Asn Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr 420 425 430 Pro Thr Phe Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly 435 440 445 Pro Leu Gln Leu Val Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys 450 455 460 Lys Glu Glu Ile Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Thr Ile Ser Arg 465 470 475 480 Pro Ser His Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala 485 490 495 Glu Ile Ala Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg 500 505 510 Thr Lys Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu 515 520 525 Ile Asp Glu Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser 530 535 540 Leu Phe Ala Lys Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln 545 550 555 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aaagaactgc aggacttgtc ccggtggtgg 900 accgaaatgg gactggcgtc caagcttgac ttcgtccgcg atcgcctcat ggaagtgtac 960 ttttgggccc tcggaatggc accggacccg cagttcggcg agtgccgcaa agcagttacc 1020 aagatgttcg gcctggtcac cattatcgac gatgtctacg acgtatacgg gacgttggat 1080 gagctgcaac tgttcacgga cgccgtggag cggtgggacg tcaacgccat caacacgctc 1140 cccgactata tgaagctctg cttcctggca ttgtacaata ccgtgaacga cacctcgtat 1200 tccattctga aagaaaaagg acacaataac ctgtcctatc tgaccaagtc ctggcgtgag 1260 ctgtgcaagg cgttcctgca agaagccaag tggagcaata acaagatcat ccccgcgttc 1320 tcgaagtatc ttgagaacgc atccgtgtcg agcagcgggg tcgccctgct ggccccgtcg 1380 tacttcagcg tatgtcagca gcaggaagat atctcggacc acgcgctgcg tagccttacg 1440 gacttccatg gcctcgtccg gtcgagctgc gtgatcttcc gtttgtgcaa cgacctggcg 1500 acctcggccg cagaactgga gcggggtgaa accaccaaca gcatcatctc gtacatgcac 1560 gagaacgatg gcacgtcgga agagcaggca cgcgaagagc tgcgtaagct gatcgacgcc 1620 gagtggaaga aaatgaaccg cgaacgcgtc agcgactcca ccctgctgcc gaaggccttc 1680 atggaaatcg ccgtgaacat ggcacgtgtg 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tcagctgctt ctggagctcg ccaagttgga cttcaacatg 720 gtccagacct tgcaccagaa agaactgcag gacttgtccc ggtggtggac cgaaatggga 780 ctggcgtcca agcttgactt cgtccgcgat cgcctcatgg aagtgtactt ttgggccctc 840 ggaatggcac cggacccgca gttcggcgag tgccgcaaag cagttaccaa gatgttcggc 900 ctggtcacca ttatcgacga tgtctacgac gtatacggga cgttggatga gctgcaactg 960 ttcacggacg ccgtggagcg gtgggacgtc aacgccatca acacgctccc cgactatatg 1020 aagctctgct tcctggcatt gtacaatacc gtgaacgaca cctcgtattc cattctgaaa 1080 gaaaaaggac acaataacct gtcctatctg accaagtcct ggcgtgagct gtgcaaggcg 1140 ttcctgcaag aagccaagtg gagcaataac aagatcatcc ccgcgttctc gaagtatctt 1200 gagaacgcat ccgtgtcgag cagcggggtc gccctgctgg ccccgtcgta cttcagcgta 1260 tgtcagcagc aggaagatat ctcggaccac gcgctgcgta gccttacgga cttccatggc 1320 ctcgtccggt cgagctgcgt gatcttccgt ttgtgcaacg acctggcgac ctcggccgca 1380 gaactggagc ggggtgaaac caccaacagc atcatctcgt acatgcacga gaacgatggc 1440 acgtcggaag agcaggcacg cgaagagctg cgtaagctga tcgacgccga gtggaagaaa 1500 atgaaccgcg aacgcgtcag cgactccacc ctgctgccga aggccttcat ggaaatcgcc 1560 gtgaacatgg cacgtgtgtc ccattgtact tatcagtacg gcgatggcct gggtcgcccc 1620 gactatgcca cggagaaccg gatcaagctc ctgttgatcg atccgttccc gatcaaccag 1680 ctgatgtacg tgtaa 1695 <210> 18 <211> 1788 <212> DNA <213> Salix sp. <400> 18 atggccactg aacttctgtg cttgcaccgt cccatttcgc tcacccctaa actgttccgc 60 aacccgctcc cgaaggtaat cctggcgacg ccgctgaccc tgaagctgcg gtgcagcgta 120 tccaccgaaa acgtgagctt tactgaaacc gaaaccgaaa cgcgtcgctc ggcgaactac 180 gaacccaatt cctgggatta tgactacctt ctgtcgtccg acacggacga gtcgatcgag 240 gtgtataagg ataaggccaa gaagcttgag gcggaagtcc gtcgggagat caacaacgag 300 aaggcggagt tcctgacgct gctcgaactg attgacaacg tccagcgcct cggcctgggc 360 tatcgcttcg agtccgatat ccgtcgcgca ctcgaccgct tcgtttcgtc cggtggcttc 420 gacgcagtga cgaaaacctc gctgcatgcc accgcgctgt cgttccgctt cctgcgccag 480 cacggattcg aggtcagcca ggaagcgttc ggcgggttca aggaccagaa cgggaatttc 540 ctggaaaatc tgaaagaaga tatcaaagcc atcttgtcgc tgtacgaggc gtcgtttctc 600 gcgctcgaag gcgagaacat tctcgacgaa gcgaaggtgt 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gatcgcacgg 1500 ggcgaaacgg ccaactcggt gagctgctac atgcgcacca agggcatctc ggaagaactt 1560 gcgacggagt ccgtcatgaa cttgatcgac gaaacctgga agaaaatgaa taaagagaaa 1620 ctcggcggca gcctgttccc gaagccattc gtcgaaaccg ccatcaacct ggcgcgtcag 1680 tcgcattgca cctaccataa tggcgatgcc catacgtcgc cggatgaact gacccgtaag 1740 cgggtcctgt ccgtcatcac cgagccgatt ctgccgttcg agcgctaa 1788 <210> 19 <211> 1680 <212> DNA <213> Salix sp. <400> 19 atgtgcagcg tatccaccga aaacgtgagc tttactgaaa ccgaaaccga aacgcgtcgc 60 tcggcgaact acgaacccaa ttcctgggat tatgactacc ttctgtcgtc cgacacggac 120 gagtcgatcg aggtgtataa ggataaggcc aagaagcttg aggcggaagt ccgtcgggag 180 atcaacaacg agaaggcgga gttcctgacg ctgctcgaac tgattgacaa cgtccagcgc 240 ctcggcctgg gctatcgctt cgagtccgat atccgtcgcg cactcgaccg cttcgtttcg 300 tccggtggct tcgacgcagt gacgaaaacc tcgctgcatg ccaccgcgct gtcgttccgc 360 ttcctgcgcc agcacggatt cgaggtcagc caggaagcgt tcggcgggtt caaggaccag 420 aacgggaatt tcctggaaaa tctgaaagaa gatatcaaag ccatcttgtc gctgtacgag 480 gcgtcgtttc tcgcgctcga aggcgagaac attctcgacg aagcgaaggt gttcgccatc 540 tcgcacctga aagagctctc cgaagagaag atcggcaaag acttggccga gcaagtcaat 600 cacgccctgg agttgcccct gcatcgccgc acccagcgct tggaagccgt ttggagcatt 660 gaagcctatc gtaagaaaga ggacgccaac caagtcctgc tggagctggc catcctggac 720 tacaacatga tccagtccgt gtaccagcgg gacttgcgcg aaaccagccg gtggtggcgt 780 cgcgtcggcc tcgccaccaa gctgcacttc gcacgcgacc gcctgatcga gtccttctac 840 tgggccgtgg gcgtcgcatt cgagccgcaa tatagcgact gccggaacag cgtggcaaag 900 atgttcagct tcgtgaccat catcgacgat atctatgacg tgtatgggac gcttgacgaa 960 ctggagctgt ttacggatgc cgtcgagcgg tgggacgtca atgccatcaa cgatttgccg 1020 gactacatga agctgtgctt cctggccttg tataacacta tcaacgagat cgcctacgat 1080 aacctgaaag aaaagggtga gaacatcctg ccctacctca ccaaggcctg ggccgacctg 1140 tgtaacgcct ttctgcagga agccaagtgg ctctacaaca agtccacccc aaccttcgac 1200 gattacttcg gaaatgcctg gaagagcagc tccggacctc tccagctggt gttcgcatac 1260 ttcgccgtcg tgcagaacat caagaaagaa gagatcgaaa acttgcagaa gtaccacgat 1320 atcatcagcc gtccctcgca catcttccgg ctctgcaacg accttgcaag cgcgtccgcg 1380 gagatcgcac ggggcgaaac ggccaactcg gtgagctgct acatgcgcac caagggcatc 1440 tcggaagaac ttgcgacgga gtccgtcatg aacttgatcg acgaaacctg gaagaaaatg 1500 aataaagaga aactcggcgg cagcctgttc ccgaagccat tcgtcgaaac cgccatcaac 1560 ctggcgcgtc agtcgcattg cacctaccat aatggcgatg cccatacgtc gccggatgaa 1620 ctgacccgta agcgggtcct gtccgtcatc accgagccga ttctgccgtt cgagcgctaa 1680

Claims (59)

  1. 아이소프렌 신타제(isoprene synthase)를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아(methanotrophic bacterium)로서, 상기 메탄영양 박테리아는 탄소 공급원료를 아이소프렌으로 전환시킬 수 있는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산은 포풀루스 알바(Populus alba), 포풀루스 트리초카르파(Populus trichocarpa), 포풀루스 트레물로이데스(Populus tremuloides), 포풀루스 니그라(Populus nigra), 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라(Populus tremula), 포풀루스 x 카네센스(canescens), 푸에라리아 몬타나(Pueraria montana), 푸에라리아 로바타(Pueraria lobata), 쿼커스 로부르(Quercus robur), 파보이데아에(Faboideae), 살릭스 디스컬라(Salix discolor), 살릭스 글라브라(Salix glabra), 살릭스 펜탄드라(Salix pentandra) 또는 살릭스 세르필리폴리아(Salix serpyllifolia)로부터 유래하는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산 서열은 상기 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화된, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제는 N-말단 색소체 표적화 서열을 포함하지 않는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  5. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  6. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 14 내지 19 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  8. 제7항에 있어서, 상기 발현 조절 서열은 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스 6-포스페이트 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸 전환효소 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노전환효소 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 및 Trc 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  9. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 모 메탄영양 박테리아에 의한 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 DXP 경로 효소를 과발현할 수 있거나, DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고 이를 발현할 수 있거나, 이들의 조합인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  10. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 모 메탄영양 박테리아에 의한 내인성 메발로네이트 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 메발로네이트 경로 효소를 과발현할 수 있거나, 메발로네이트 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고 이를 발현할 수 있거나, 이들의 조합인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  11. 제9항에 있어서, 상기 DXP 경로 효소는 DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 이들의 조합인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  12. 제10항에 있어서, 상기 메발로네이트 경로 효소는 아세토아세틸-CoA 티올라제, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타제, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소, 메발로네이트 키나제, 포포메발로네이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제, 아이소펜테닐 다이포스페이트 아이소머라제 또는 이들의 조합인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 변이체 DXP 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산에 의해 형질전환된, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이체 DXP 경로 효소는 2개의 변이체 DXP 경로 효소를 포함하고, 상기 2개의 변이체 DXP 경로 효소는 돌연변이체 피루베이트 탈수소효소(PDH) 및 돌연변이체 3,4 다이하이드록시-2-뷰타논 4-포스페이트 신타제(DHBPS)를 포함하는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 약 1㎎/ℓ 내지 약 500g/ℓ의 아이소프렌을 생성할 수 있는, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로셀라(Methylocella), 메틸로카프사(Methylocapsa)인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰((Methylococcus capsulatus Bath) 균주, 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica) 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시누스 스포륨(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캅술라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테륨 오가노필룸(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris)(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라에(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나(Methylocystis daltona) 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila), 메틸로카프사 아우레아(Methylocapsa aurea) KYG, 메틸아시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸아시디필룸 푸마리올리쿰(Methylacidiphilum fumariolicum), 메틸로아시다 캄차트켄시스(Methyloacida kamchatkensis), 메틸리븀 페트롤레이필룸(Methylibium petroleiphilum) 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum)인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 천연 가스 또는 비전통 천연 가스인, 비천연 발생 메탄영양 박테리아.
  19. 아이소프렌을 제조하는 방법으로서, 아이소프렌을 생성하기에 충분한 조건 하에 탄소 공급원료의 존재 하에 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 발생 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 핵산은 포풀루스 알바, 포풀루스 트리초카르파, 포풀루스 트레물로이데스, 포풀루스 니그라, 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라, 포풀루스 x 카네센스, 푸에라리아 몬타나, 푸에라리아 로바타, 쿼커스 로부르, 파보이데아에, 살릭스 디스컬라, 살릭스 글라브라, 살릭스 펜탄드라 또는 살릭스 세르필리폴리아로부터 유래하는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산 서열은 숙주 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산은 N-말단 색소체 표적화 서열을 포함하지 않는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 외인성 아미노산 서열을 코딩하는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 서열 번호 14 내지 19 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 발현 조절 서열은 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스 6-포스페이트 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, T5 프로모터 및 Trc 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 모 메탄영양 박테리아에 의한 내인성 DXP 경로 효소의 정상 발현 수준과 비교하여 내인성 DXP 경로 효소를 과발현할 수 있거나, DXP 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환되고 이를 발현할 수 있거나, 이들의 조합인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 DXP 경로 효소는 DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 또는 이들의 조합인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 변이체 DXP 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산에 의해 형질전환된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이체 DXP 경로 효소는 2개의 변이체 DXP 경로 효소를 포함하고, 상기 2개의 변이체 DXP 경로 효소는 돌연변이체 피루베이트 탈수소효소(PDH) 및 돌연변이체 3,4 다이하이드록시-2-뷰타논 4-포스페이트 신타제(DHBPS)를 포함하는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시누스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로셀라, 메틸로카프사인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 메틸로코커스 캅술라투스 바쓰 균주, 메틸로모나스 메타니카 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시누스 트리초스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시누스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캅술라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테륨 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라에, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로카프사 아우레아 KYG, 메틸아시디필룸 인페르노룸, 메틸아시디필룸 푸마리올리쿰, 메틸로아시다 캄차트켄시스, 메틸리븀 페트롤레이필룸 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 천연 가스 또는 비전통 천연 가스인, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 약 1g/ℓ 내지 약 500g/ℓ의 아이소프렌을 생성할 수 있는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메탄영양 박테리아는 발효에 의해 배양되고, 발효로부터 생성된 아이소프렌은 배출가스로서 회수되는, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 회수된 아이소프렌은 이합체(10-탄소) 탄화수소, 삼합체(15-탄소) 탄화수소 또는 이들의 조합으로 추가로 개질된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 이합체 탄화수소, 삼합체 탄화수소 또는 이들의 조합은 장쇄 분지 알칸으로 수소화된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 회수된 아이소프렌은 아이소프레노이드 생성물로 추가로 개질된, 아이소프렌을 제조하는 방법.
  39. 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 상기 메탄영양 박테리아를 뮤타젠에 노출시켜 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 생성하는 단계;
    (b) 상기 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는 단계; 및
    (c) 성장에 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하되,
    GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 기준 메탄영양 박테리아와 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 돌연변이체 메탄영양 박테리아는 아이소프렌 전구체 합성의 증가를 나타내는, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 뮤타젠은 방사선, 화학물질, 플라스미드 또는 전이인자(transposon)인, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 단계 (b)를 단계 (a) 전에 수행하고, 이후 상기 형질전환된 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 성장에 충분한 조건 하에 배양하는, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적색 착색이 증가한 돌연변이체 메탄영양 박테리아 또는 이의 클론 세포를 아이소프렌 신타제를 코딩하는 외인성 핵산에 의해 형질전환시키는, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 핵산 중 적어도 하나는 상기 돌연변이체 메탄영양 박테리아로부터 제거되거나 상기 돌연변이체 메탄영양 박테리아에서 불활화된, 돌연변이체 메탄영양 박테리아를 스크리닝하는 방법.
  44. 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 상기 메탄영양 박테리아를,
    (ⅰ) 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산;
    (ⅱ) 게라닐게라닐 다이포스페이트 신타제(GGPPS), 피토엔 신타제(CRTB) 및 피토엔 탈수소효소(CRTI)를 코딩하는 외인성 핵산
    에 의해 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 성장에 충분한 조건 하에 단계 (a)로부터의 상기 메탄영양 박테리아를 배양하는 단계를 포함하되;
    GGPPS, CRTB 및 CRTI를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하지 않는 기준 메탄영양세균과 비교하여 적색 착색의 증가를 나타내는 형질전환된 메탄영양 박테리아는 아이소프렌 전구체 합성의 증가를 나타내는, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 아이소프렌 경로 효소는 DXP 경로 효소 또는 메발로네이트 경로 효소인, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 이종성 핵산인, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 상기 숙주 메탄영양 박테리아에서 발현에 대해 코돈 최적화된, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  48. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 동종성 핵산인, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 동종성 핵산은 상기 메탄영양 박테리아에서 과발현된, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 비천연 발생 변이체인, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 비천연 발생 변이체는 무작위 돌연변이유발, 부위 지정 돌연변이유발 또는 이들의 조합에 의해 생성된, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 비천연 발생 변이체는 합성된, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 비천연 발생 변이체는 아이소프렌 경로 효소를 코딩하는 기준 핵산과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 메탄영양 박테리아에서 아이소프렌 경로 유전자를 스크리닝하는 방법.
  54. 아이소프렌 조성물로서, 상기 아이소프렌은 약 -30‰ 미만의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
  55. 제53항에 있어서, 상기 아이소프렌은 약 -40‰ 미만의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
  56. 제53항에 있어서, 상기 아이소프렌은 약 -50‰ 미만의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
  57. 제53항에 있어서, 상기 아이소프렌은 약 -30‰ 내지 약 -50‰ 범위의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
  58. 제53항에 있어서, 상기 아이소프렌은 약 -30‰ 내지 약 -40‰ 범위의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
  59. 제53항에 있어서, 상기 아이소프렌은 약 -40‰ 내지 약 -50‰ 범위의 δ13C 분포를 갖는, 아이소프렌 조성물.
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