JP4280627B2 - 改善されたイソプレノイド産生法 - Google Patents
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Description
アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
アルギニン(R)、リシン(K);
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。(例えば、Creighton、Proteins (1984)参照)。
(1)下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:43の残基1〜340位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:43の第68〜97位に対応するアミノ酸配列;
(b)配列番号:45の残基1〜349位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:45の第1〜30位に対応するアミノ酸配列;
(c)配列番号:47の残基1〜388位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:47の第269〜298位に対応するアミノ酸配列;
(d)配列番号:49の残基1〜378位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:49の第109〜138位に対応するアミノ酸配列;
(e)配列番号:51の残基1〜305位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:51の第198〜227位に対応するアミノ酸配列;
(f)配列番号:53の残基1〜332位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号:53の第81〜110位に対応するアミノ酸配列;
(g)配列番号:43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも30の隣接アミノ酸残基を有する断片;
(h)配列番号:43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列;
(i)配列番号:42または配列番号:42の相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列;ならびに
(j)配列番号:43、45、47、49、51、または53の保存的に改変された変種。
(2)下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:159の残基1〜287位として示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:159の少なくとも30の隣接アミノ酸残基;
(c)配列番号:159の断片のアミノ酸配列であって、断片がファルネシル二リン酸シンターゼ(FPPシンターゼ)の活性を有するアミノ酸配列;
(d)配列番号:157の第295〜1158位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがFPPシンターゼの活性を有するアミノ酸配列;および
(e)配列番号:159の保存的に改変された変種。
(3)下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:160の残基1〜142位として示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:160の少なくとも30の隣接アミノ酸残基;
(c)配列番号:160の断片のアミノ酸配列であって、断片が1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ(DXPS)の活性を有するアミノ酸配列;
(d)配列番号:157の第1185〜1610位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがDXPSの活性を有するアミノ酸配列;
(e)配列番号:160の保存的に改変された変種。
(4)下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:178の残基1〜390位として示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:178の少なくとも30の隣接アミノ酸残基;
(c)配列番号:178のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列;
(d)配列番号:177の第1〜1170位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列;および
(e)配列番号:178の保存的に改変された変種。
(5)下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:179の残基1〜240位として示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:179の少なくとも30の隣接アミノ酸残基;
(c)配列番号:179のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列;
(d)配列番号:177の第1258〜1980位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列;および
(e)配列番号:179の保存的に改変された変種。
(6)配列番号:42、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:42の変種、配列番号:42の断片(これらはヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする)からなる群より選択されるヌクレオチド配列、ならびにヌクレオチド配列が配列番号:42、または配列番号:42の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列;特に
(a)配列番号:42のヌクレオチド2622〜3644位、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基2622〜3644位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがHMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド2622〜3644位からなるポリヌクレオチド配列;
(b)配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基3641〜4690位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列;
(c)配列番号:42のヌクレオチド4687〜5853位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、HMG-CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基4687〜5853位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがHMG-CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列;
(d)配列番号:42のヌクレオチド5834〜6970位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、メバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基5834〜6970位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列;
(e)配列番号:42のヌクレオチド6970〜7887位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、ホスホメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基6970〜7887位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがホスホメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列;または
(f)配列番号:42のヌクレオチド7880〜8878位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:42の残基7880〜8878位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:42のヌクレオチド7880〜8878位からなるポリヌクレオチド、特に配列番号:42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列;
(7)配列番号:157のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:157の変種、配列番号:157の断片(これらはファルネシル二リン酸(FPP)シンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、またはXseBの活性を有するポリペプチドをコードする)、ならびにヌクレオチド配列が配列番号:157、または配列番号:157の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性、およびXseBの活性からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に
(a)配列番号:157の第59〜292位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含むその変種、XseBの機能を有するポリペプチドをコードする配列番号:157の第59〜292位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:157の第59〜292位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがXseBの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:157のヌクレオチド59〜292位からなる単離ポリヌクレオチド;
(b)配列番号:157の第295〜1158位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:157の第295〜1158位のヌクレオチド配列の変種、FPPシンターゼ活性をコードする配列番号:157の第295〜1158位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:157の第295〜1158位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:157のヌクレオチド295〜1158位からなる単離ポリヌクレオチド;
(c)配列番号:157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列の変種、1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:157の第1185〜1610位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドが1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:157のヌクレオチド1185〜1610位からなる単離ポリヌクレオチド;
(8)配列番号:177のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:177の変種、配列番号:177の断片(これらはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする)、ならびにヌクレオチド配列が配列番号:177、または配列番号:177の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に
(a)配列番号:177のヌクレオチド1〜1170位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:177の変種、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:177の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:177の残基1〜1170位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:177のヌクレオチド1〜1170位からなる単離ポリヌクレオチド配列;
(b)配列番号:177のヌクレオチド1258〜1980位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表(表14)に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号:177の変種、アセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:177の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号:177の残基1258〜1980位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号:177のヌクレオチド1258〜1980位からなる単離ポリヌクレオチド配列;
(9)配列番号:42、配列番号:157、配列番号:177、およびその組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列;
(10)(6)(a)〜(6)(f)、(7)(a)〜(7)(c)、(8)(a)、(8)(b)、または(9)の任意の一つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結された発現ベクター、例えば、カロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む発現ベクター、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結された配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター;
(11)pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター、特に
(a)pBBR-K-mev-op16-1およびpBBR-K-mev-opl6-2からなる群より選択される発現ベクター、
(b)pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、およびpBBR-K-Zea4-下流からなる群より選択される発現ベクター;
(c)pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター;
(d)pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3である発現ベクター;
(e)pDS-His-phaAである発現ベクター;または
(f)pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、およびpBBR-K-PcrtE-crtZWからなる群より選択される発現ベクター;
(12)(6)(a)〜(f)、(7)(a)〜(c)、(8)(a)、(8)(b)もしくは(9)の任意の一つのポリヌクレオチド配列、または(10)もしくは(11)の発現ベクターを含む培養細胞、またはその細胞の子孫であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞、特に下記から選択される特性によってさらに特徴づけられる細胞:
(a)カロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むこと、特にカロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列が配列番号:180、182、および184からなる群より選択される培養細胞、またはその細胞の子孫であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞、ならびに
(b)酵母、真菌、細菌、および藻類、特にパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、または枯草菌からなる群より選択される細菌、特にパラコッカス、特にR-1506、R-1512、R1534、およびR114からなる群より選択されるパラコッカスから選択される群のメンバーであること;
(13)カロテノイドの産生法であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で(12)の細胞を培養する段階、および細胞または細胞の培地からカロテノイドを単離する段階とを含む方法;
(14)カロテノイド産生細胞の作製法であって、
(a)細胞内で発現されるメバロン酸経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に導入する段階;および
(b)ポリヌクレオチド配列導入前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.1〜1,000倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階(a)のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択する段階を含む方法、
特に下記から選択される特性によって特徴づけられる方法から選択される方法:
(i)選択段階がポリヌクレオチド配列を導入する前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.5〜500倍、特に約100倍、または少なくとも約10倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階(a)のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択することを含むこと;
(ii)細胞が約1mg/L〜約10g/Lのカロテノイドを産生すること;
(iii)細胞が酵母、真菌、細菌、および藻類からなる群より選択され、特にパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、および枯草菌からなる群より選択され、特にパラコッカスから選択されること;
(iv)段階(a)の細胞が突然変異細胞である、特にR114およびR1534からなる群より選択され、特に突然変異細胞がその非突然変異親細胞と比較して約1.1〜1,000倍、特に1.5〜500倍、特に少なくとも約100倍、または少なくとも約10倍のレベルのカロテノイドを産生すること;
(v)ポリヌクレオチド配列が、(6)(a)〜(f)、(7)(a)〜(c)、(8)(a)、(8)(b)および(9)のポリヌクレオチド配列から選択され、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結されている;
(vi)ポリヌクレオチド配列が(10)または(11)の発現ベクターであること;
(vii)導入段階が、形質転換、形質導入、形質移入、リポフェクション、電気穿孔法、接合、およびバイオリスティクスからなる群より選択されること;
(viii)カロテノイドがフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせからなる群より選択され、特にカロテノイドがゼアキサンチンであること;
(15)イソプレノイド化合物を産生するための細菌の操作法であって、
(a)イソプレノイド化合物の発現を可能にする条件下、培地中で親細菌を培養し、親細菌の約1.1〜1,000倍のイソプレノイド化合物を産生する突然変異菌を培地から選択する段階;
(b)発現制御配列に機能的に連結された配列番号:42で表されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを突然変異菌に導入する段階;および
(c)発現ベクターを含み、段階(a)の突然変異体の少なくとも約1.1倍のイソプレノイド化合物を産生する細菌を選択する段階を含む方法、特に
(i)突然変異を突然変異菌に導入する段階をさらに含む方法であって、
特に突然変異が下記の少なくとも一つから選択される効果を引き起こす方法:
ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)経路を不活化する、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高める、ファルネシル二リン酸(FPP)シンターゼの発現を高める、カロテノイド経路の酵素の発現を高める、イソペンテニル二リン酸(IPP)をジメチルアリル二リン酸(DMAPP)に変換する酵素の発現を高める、
特に、PHA経路の不活化が、phaB(配列番号:177のヌクレオチド第1258〜1980位)によってコードされるポリペプチドを発現しない突然変異菌を選択すること、または配列番号:177もしくはその断片を用いた同種組換えにより野生型phaB遺伝子の発現を妨害することを含む方法、または
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号:175もしくは配列番号:177のヌクレオチド第1〜1170位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法、または
FPPシンターゼの発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号:157のヌクレオチド第295〜1158位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法、または
カロテノイド経路の酵素の発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号:180、182、および184からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法;
(b)イソプレノイドがイソペンテニル二リン酸(IPP)である方法;
(c)イソプレノイドがカロテノイドである方法であって、特にカロテノイドがフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせからなる群より選択される方法;
(d)親細菌がパラコッカス、特にR-1512もしくはR-1506、またはR1534もしくはR114であり、特に突然変異体がR114である方法;
(16)下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物:
(i)微生物がパラコッカス属菌種(MBIC3966)ではないとの条件で、
配列番号:12との配列類似性が、GeneCompar v. 2.0ソフトウェアをギャップペナルティ0%で用いた相同性計算から得られた類似性行列を用いて>97%である;
菌株R-1512、R1534、R114、またはR-1506との相同性が、81.5℃でのDNA:DNAハイブリダイゼーションを用いて>70%である;
ゲノムDNAのG+C含有率の、R114、R-1512、R1534、およびR-1506のゲノムDNAのG+C含有率からの変動が1%未満である;および
平均DNAフィンガープリントが、実施例2のAFLP法を用いて菌株R-1512、R1534、R114およびR-1506との類似性約58%に集まる;
(ii)微生物がパラコッカス属菌種(MBIC3966)ではないとの条件で、
18:1w7cが細胞膜の全脂肪酸の少なくとも約75%を構成する;
増殖のための炭素源としてアドニトール、i-エリトリトール、ゲンチオビオース、β-メチルグルコシド、D-ソルビトール、キシリトール、およびキニン酸を用いることができない;ならびに
増殖のための炭素源としてL-アスパラギンおよびL-アスパラギン酸を用いることができる;または
(iii)微生物がパラコッカス属菌種(MBIC3966)ではないとの条件で、
40℃で増殖することができる;
8%NaClを含む培地中で増殖することができる;
pH9.1の培地中で増殖することができる;および
コロニーが黄橙色に着色。
(a)カロテノイドの分析
試料調製
ジメチルスルホキシド(DMSO)およびテトラヒドロフラン(THF)1:1の溶媒混合物をまず調製した。この溶媒混合物を、ブチルヒドロキシトルエン(BHT、溶媒混合物中0.5g/l)を加えることにより安定化した。安定化DMSO/THF混合物4mlを、使い捨ての15mlポリプロピレン遠心管内の細菌培養物0.4mlに加えた(最終希釈率1/11)。チューブに栓をし、ボルテックスミキサーを用いてそれぞれ10秒間混合した。次いで、試料をBrinkmann Vibramix振盪機上に20分間置いた。チューブを室温、4000rpmで4分間遠心分離し、澄明な黄橙色上清の一定分量を褐色ガラスバイアルに移して、高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)分析にかけた。
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、およびリコペンの同時定量のために、逆相HPLC法を開発した。この方法はゼアキサンチンの主要なシス異性体を分離することもできた。クロマトグラフィは、サーモスタット付きの自動試料採取器およびダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100 HPLC装置を用いて実施した。この方法のパラメーターは下記のとおりであった:
カラム:YMCカロテノイドC30カラム、粒径5ミクロン
250*4.6mm(内径)、スチール製
(YMC、部品No.CT99S052546WT)
ガードカラム:Pelliguard LC-18カートリッジ、20mm
(SUPELCO、部品No.59654)
移動相:メタノール(MeOH)/メチルtert-ブチルエーテル(TBME)勾配
泳動時間:28分;典型的カラム圧:開始時90bar;流速:1.0ml/分;検出:UV 450nm;注入量:10μl;カラム温度:15℃
メタノールおよびTBMEはHPLC等級で、それぞれEM ScienceおよびJ.T. Bakerから入手した。DMSO(Omnisolve)はEM Scienceから購入した。THF(HPLC溶媒)はBurdick and Jacksonから入手した。
定量分析をは外部標準(Hoffmann-La Roche、スイス、バーゼルより提供)を用いて二段階較正により行った。計算はピーク面積に基づいていた。
方法の選択性は、関連するカロテノイド基準化合物の標準溶液を注入することによって検証した。標的化合物(全トランス-カロテノイド)は完全に分離され、干渉は認められなかった。少量のシス異性体が共溶出されることもあるが、これらの干渉の可能性がある異性体はまれで、通常の分析では考慮する必要はない。化合物の保持時間を表1に示す。
全トランス-ゼアキサンチン(25mg)をDMSO/THF混合物(50ml)に溶解した(最終ゼアキサンチン濃度500μg/ml)。一連の希釈液を調製し(最終ゼアキサンチン濃度250、100、50、10、5、1、および0.1μg/ml)、前述のHPLC法で分析した。直線範囲は0.1μg/ml〜250μg/mlと判明した。相関係数は0.9998であった。
この方法によるゼアキサンチンの検出の下限は60μg/lと判定された。注入量を多くし、積分パラメーターを最適化することにより、検出限界を約5μg/lまで下げることができた。
全トランス-ゼアキサンチンの保持時間は非常に安定していた(相対標準偏差(RSD)、0.2%)。ピーク面積再現性は、同じ培養試料の10回の反復分析に基づき、RSDは全トランス-ゼアキサンチンでは0.17%、クリプトキサンチンでは1.0%と判定された。
粗抽出物の調製
パラコッカスおよび大腸菌の粗抽出物を、洗浄した細胞ペレットを1mlの抽出緩衝液(緩衝液はアッセイする酵素に応じて用いた−組成は下記の各酵素アッセイ法と共に明記する)に再懸濁することにより調製した。細胞懸濁液を2mlのプラスティック製バイアルに入れ、Mini Bead Beater 8(Biospec Products、米国オクラホマ州バートルズビル)を用いてガラスビーズと共に撹拌することにより破壊した。破壊は中等度撹拌設定を用いて4℃で実施した。破壊調製物を4℃、21,000×gで20分間遠心分離して細胞片を沈降させ、上清を酵素アッセイ法に直接用いた。
粗抽出物中の蛋白質濃度を、Bio-Rad Protein Assay Reagent(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いてBradfordの方法[Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)]により定量した。標準曲線作成のためにウシ血清アルブミンを基準蛋白質として用いた。
粗抽出物を150mM EPPS(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペリジン-N'-[3-プロパンスルホン酸])緩衝液、pH8.0中で調製した。アッセイ法はSlaterら[J. Bacteriol. 180:1979-1987 (1998)]によって記載された方法に従って、チオリシスの方法に実施した。このアッセイ法はアセトアセチル-CoAの消失を304nmで分光光度的に測定する。反応混合物は150mM EPPS緩衝液(pH8.0)、50mM MgCl2、100μM CoA、40μMアセトアセチル-CoA、および粗抽出物を含んでいた。反応を30℃で行い、粗抽出物の添加によって開始した。304nmでのアセトアセチル-CoAの消失をSpectraMAX Plusプレート読み取り器(Molecular Devices Corp.、米国カリフォルニア州サニーベール)および石英マイクロタイタープレートを用いてモニターした(いかなる標準的な分光光度計も用いることができる)。活性(U/mg蛋白質で表す)を、アセトアセチル-CoAで作成した標準曲線を用いて計算した(活性1ユニット=1分あたりに消費されるアセトアセチル-CoA 1μmol)。アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性の検出下限は0.006U/mgであった。
HMG-CoAシンターゼをHondaら[Hepatology 27:154-159 (1998)]の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法において、アセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAからのHMG-CoAの形成を、反応生成物と基質とをHPLCで分離することにより直接測定した。粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)中で調製した。反応混合物(0.1ml)は50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)、0.1mM EDTA、20mM MgCl2、0.1mMアセトアセチル-CoA、0.8mMアセチル-CoA、および粗抽出物を含んでいた。粗抽出物を加える前に反応物を30℃で2分間予備インキュベートした。30℃で5分間の反応後、0.2mlの200mMリン酸テトラブチルアンモニウム(TBAP、メタノール-水(3:2)に溶解(最終pHは5.5)、内部回収標準として0.2mMプロピオニル-CoAを含む)の添加によって反応を停止した。次いで混合物を4℃、21,000×gで3分間遠心分離した後、逆相イオン対HPLCによって分析するまで氷上に置いた。HMG-CoAおよびプロピオニル-CoAをアセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAからNova-Pak C18カラム(3.9×150mm、Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミロード)を用いて分離した。注入量は20μlで、移動相はメタノール-水(1:1)に溶解した50mM TBAP(最終pHは5.5)、流速は1.0ml/分であった。HMG-CoAおよびプロピオニル-CoAを254nmの吸収により検出した。反応で生成したHMG-CoAを、基準HMG-CoAを用いて作成した標準曲線との比較により定量した。活性はU/mg蛋白質と定義した。活性1ユニット=1分あたりに生成されるHMG-CoA 1nmol。HMG-CoAシンターゼの検出下限は約1U/mgであった。
粗抽出物を、50mM KC1、1mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス、カタログ#P-2714)を含む25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)中で調製した。アッセイ法はTakahashiら[J. Bacteriol. 181:1256-1263 (1999)]の方法に従って実施した。このアッセイ法はNADPHのHMG-CoA依存性酸化を340nmで分光光度的に測定する。反応混合物は25mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.2)、50mM KC1、1mM EDTA、5mMジチオスレイトール、0.3mM NADPH、0.3mM R,S-HMG-CoA、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で行い、HMG-CoAの添加により開始した。NADPHのHMG-CoA依存性酸化はSpectraMAX Plusプレート読み取り器(Molecular Devices Corp.、米国カリフォルニア州サニーベール)および石英マイクロタイタープレートを用いて340nmでモニターした(いかなる標準的な分光光度計も用いることができる)。活性(U/mg蛋白質で表す)を、NADPHで作成した標準曲線を用いて計算した(活性1ユニット=1分あたりに酸化されるNADPH 1μmol)。HMG-CoAレダクターゼ活性の検出下限は0.03U/mgであった。
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの基質調製およびアッセイ法はPopjak[Methods Enzymol. 15:393-425 (1969)]によって詳細に記載されている。すべてのアッセイ法で、酵素活性1ユニットは1分あたりに生成される生成物1μmolと定義されている。これらの分光光度法およびラジオクロマトグラフィによるアッセイ法に加えて、代替法、例えば反応基質と生成物のHPLC分離を用いた方法を用いることもできる。メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの検出下限は典型的には約0.001U/mg蛋白質である。
粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)中で調製した。アッセイ法はSpurgeonら[Arch. Biochem. Biophys. 230:445-454 (1984)]の方法を用いて実施した。このアッセイ法はIPPおよびDMAPPの酸不安定性の差に基づいている。反応混合物(最終容量0.1ml)は50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で15分間行い、濃HCl:メタノール(4:1)の混合物0.3mlを添加し、37℃で20分間さらにインキュベートすることによって停止した。ヘキサン(0.9ml)を加え、チューブを混合した(ボルテックスミキサーを用いて10秒間を4回)。遠心分離(21,000×g、5分間)後、ヘキサン層0.6mlをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を加え、放射能を計数した。活性はU/mg蛋白質で表す。活性1ユニット=1分あたりに酸不安定性の生成物に取り込まれる[1-14C]-IPP 1pmol。IPPイソメラーゼ活性の検出下限は1U/mgであった。
粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)中で調製した。FPPシンターゼアッセイ法は前述のIPPイソメラーゼアッセイ法とほぼ同様で、IPPおよびFPPの酸不安定性の差に基づいていた(Spurgeonら、上記)。反応混合物(最終容量0.1ml)は50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、25μM GPP(ゲラニルピロリン酸)、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で15分間行い、濃HCl:メタノール(4:1)の混合物0.3mlを添加し、37℃で20分間さらにインキュベートすることによって停止した。ヘキサン(0.9ml)を加え、チューブを混合した(ボルテックスミキサーを用いて4×10秒間)。遠心分離(21,000×g、5分間)後、ヘキサン層0.6mlをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を加え、放射能を計数した。酵素活性ユニットおよび検出下限はIPPイソメラーゼに対する前述の定義と同じであった。高いIPPイソメラーゼ活性がFPPシンターゼ活性の測定を妨害する場合には、粗抽出物を5mMヨードアセトアミド存在下で5分間予備インキュベートして、IPPイソメラーゼ活性を阻害してもよい。
粗抽出物を2mMジチオスレイトールを含む50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)中で調製した。GGPPシンターゼはKuzuguchiら[J. Biol. Chem. 274:5888-5894 (1999)]の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法はFPPシンターゼについて前述したものと同じ原理に基づいている。反応混合物(最終容量0.1ml)は50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.0)、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、25μM FPP、および粗抽出物を含んでいた。反応条件およびその後のシンチレーション計数のための試料の処理はすべて、FPPシンターゼについて前述したものと同じであった。IPPイソメラーゼ活性を阻害するための抽出物のヨードアセトアミド処理も、前述のとおり用いることができる。酵素活性ユニットおよび検出下限はIPPイソメラーゼに対する前述の定義と同じであった。
粗抽出物を50mM KClおよび5mMジチオスレイトールを含む50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)中で調製した。アセトアセチル-CoAレダクターゼはChohanおよびCopeland[Appl. Environ. Microbiol. 64:2859-2863 (1998)]の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法はNADPHのアセトアセチル-CoA依存性酸化を340nmで分光光度的に測定する。反応混合物(1ml)は50mMトリス-HCl緩衝液(pH8.5)、15mM MgCl2、250μM NADPH、および100μMアセトアセチル-CoAを含んでいた。反応は石英キュベット内、30℃で行い、アセトアセチル-CoAの添加により開始した。活性(U/mg蛋白質で表す)を、NADPHで作成した標準曲線を用いて計算した(活性1ユニット=1分あたりに酸化されるNADPH 1μmol)。アセトアセチル-CoAレダクターゼ活性の検出下限は約0.01U/mgであった。
本実施例は以前にフラボバクテリウム属菌種R-1512株(ATCC21588)と命名されたゼアキサンチン産生菌のパラコッカス属菌種R-1512株(ATCC21588)としての分類学的再分類について記載する。包括的なゲノムおよび生化学/生理学的分析を、Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (BCCM(商標)/LMG)により、細菌分類の科学的標準として現在認められている最新の方法を用いて実施した。パラコッカス属菌種R-1512株の他に、パラコッカス属に属するいくつかの他の細菌を試験に含めた(表2にまとめている)。
(1)R1534およびR114株の細胞膜の脂肪酸分析により、二つの菌株が高度に類似していることが判明し、これらの菌株のパラコッカス デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)およびロドバクタ カプスラトゥス(Rhodobacter capsulatus)に対する分類学的関連性が示された。
(2)細胞蛋白質の一次元ゲル電気泳動により、R1534およびR114の間の高度な類似性(種内レベルの関連性)が示されたが、プロファイルによりこれらの菌株のR. カプスラトゥスまたはP. デニトリフィカンスのいずれかへの割り当ては正当化されなかった。
(3)R1534とR. カプスラトゥス LMG2962TおよびP. デニトリフィカンス LMG4218Tとの間のDNA:DNAハイブリダイゼーションにより、R1534株はR. カプスラトゥスでもP. デニトリフィカンスでもないことが確認された。
(4)R1534およびR114株由来の16S rDNA遺伝子の塩基配列決定により、これらの生物はパラコッカス属に属するが、これらは新しい種であることが判明した。パラコッカス属菌種MBIC3966、MBIC4020、およびMBIC3024株の16S rDNA遺伝子と最も高度の配列類似性が観察された。
(5)Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP(商標))を用いたR1534およびR-1512株のDNAフィンガープリントにより、二つの菌株由来のゲノムDNAの全体にわたる高い類似性が明らかとなり、種内の関連性が示された(すなわち、AFLP(商標)は同じ種の2メンバー間を区別することができる)。
表2に示した細菌をLMG培地185(必要に応じて1.5%Difco Bacto寒天を補足した(TSA)BBL 11768)中で培養した。ゲノムDNAをNiemannら[J. Appl. Microbiol. 82:477-484 (1997)]のプロトコルに従って調製した。16S rDNAをコードする遺伝子を、R-1512、R1534、R114、およびR-1506株由来のゲノムDNAから、表3に示すプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。
aF、順方向プライマー;R、逆方向プライマー。順方向プライマー16F27(別名:PA)はR1534およびR-1506株に用い、順方向プライマー16F38(別名:ARI C/T)はR-1512およびR114株に用いた。逆方向プライマー16R1522(別名:PH)はすべての菌株に用いた。
b大腸菌16S rDNA遺伝子配列の番号を基準にしたハイブリダイゼーション位置。
aF、順方向プライマー;R、逆方向プライマー。
b大腸菌16S rDNA遺伝子配列の番号を基準にしたハイブリダイゼーション位置。
表5に示した細菌をLMG培地185中で培養した。ゲノムDNAをWilson[Ausabelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 2.4.1-2.4.5 (1987)]のプロトコルに従って調製した。DNAのG+C含有率はMesbachら[Int. J. Syst. Bacteriol. 39:159-167 (1989)]に従い、Loganら[Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50:1741-1753 (2000)]の改変のように、HPLCによって定量した。報告値は同じDNA試料でのこれらの測定の平均である。DNA:DNAハイブリダイゼーションはDe Leyら[Eur. J. Biochem. 12:133-142 (1970)]によって記載された初期復元速度法(initial renaturation rate method)を用いて実施した。ハイブリダイゼーション温度は81.5℃であった。この方法では、Vauterinら[Int. J. Syst. Bacteriol. 45:472-489 (1995)]により+/-5.8%の平均偏差が報告されている。細菌DNAのG+C含有率およびDNAハイブリダイゼーション実験の結果を表6にまとめている。
AFLP(商標)は、制限断片の選択的増幅および選択的視覚化を介した全ゲノムDNAフィンガープリントのためのPCRに基づいた技術である[Vosら、Nucleic Acids Research 23:4407-4414 (1995);Janssenら、上記]。この分析において、パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966株、およびパラコッカス マルクシ DSM 11574Tを比較して種内関連性を評価した。これらの細菌をLMG培地185中で培養した。これらの各細菌由来のゲノムDNAをWilson(上記)のプロトコルに従って調製した。精製DNAを二つの制限酵素、4-塩基切断酵素(4-base cutter)および6-塩基切断酵素(6-base cutter)で消化した。この方法で、二つの異なる末端を持ち、効率的なPCRに適したサイズの、限られた数の断片を得た。一つの互換末端(compatible end)を含むアダプター(15〜20bpの小さい二本鎖DNA分子)を制限断片の適当な「粘着」末端に連結した。両方のアダプターは制限酵素に半分の部位特異的で、異なる配列を有している。これらのアダpターはPCRプライマーの結合部位として役立つ。ここで、用いた制限酵素はApaI(6塩基切断酵素、認識配列GGGCC/C)およびTaqI(4塩基切断酵素、認識配列T/GCA)であった。制限酵素による切断で生じた粘着末端にライゲートしたアダプターの配列を表7に示す(配列番号:13〜22)。PCRを制限断片の選択的増幅に用いた。PCRプライマーは制限断片のアダプター末端に特異的にアニールした。プライマーは3'末端に一つのいわゆる「選択的塩基」を含み、これは制限部位を越えて断片中へ伸長するため、制限部位に隣接する適当な相補的配列を有する制限断片だけが増幅された。用いたPCRプライマーの6つの組み合わせの配列も表7に示す。
パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966株の細胞膜の脂肪酸組成を、基準菌株P.マルクシ DSM 11574T、P. カロチニファシエンス E-396T、およびP. ソルヴェンティヴォランス DSM 6637Tと比較した。細菌をLMG培地185中、28℃で24時間培養した。脂肪酸組成を、市販の装置MIDI(Microbial Identification System, Inc.、米国デラウェア州)を用いてガスクロマトグラフィにより定量した。脂肪酸の抽出および分析は、MIDI装置の推奨に従って行った。表8に試験したすべての菌株の結果をまとめている。新しいパラコッカス属種の5つの菌株(R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966)について、平均プロファイルを計算した。8つの微生物はすべて同等の細胞膜脂肪酸組成を示し、18:1 w7cが主な化合物であった。脂肪酸組成における小さい相違が、新しいパラコッカス属菌と三つの基準菌株との間に見られたにすぎなかった。
炭素源の好気的利用を試験するために、95の基質を含むBIOLOG-SF-N Microplateマイクロタイタープレート(Biolog Inc.、米国カリフォルニア州ヘイワード)を用いたが、例外としてウェルE6の基質は通常のD,L-乳酸ナトリウム塩の代わりにD,L-乳酸メチルエステルであった。表9に同定した各菌株からの細胞をLMG培地12(海洋寒天、Difco 0979)中、28℃で24時間培養した。滅菌蒸留水中で密度が0.5マックファーランド単位(McFarland unit)の細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から、18滴をAUX培地21ml(API 20NE、bioMerieux、フランス)に移し、ゆっくり撹拌した。懸濁液0.1mlをBIOLOG MicroPlateの各ウェルに移し、プレートを30℃でインキュベートした。ウェルを48時間後および6日後に増殖について目視検査した。また、6日の時点でBIOLOGプレート読み取り器を用いてマイクロタイタープレートを読み取ることにより、目視評点を確認した。
aND、未検出
選択した生化学的特徴を、API 20NEストリップ(bioMerieux、フランス)を用いて試験した。表10に同定した各菌株からの細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。細胞懸濁液を調製し、ストリップに製造者の指示に従って接種した。ストリップを28℃でインキュベートし、24および48時間後に結果を調べた。結果を表10にまとめている。試験した9の特徴のうち、一つ(ウレアーゼ活性)のみが新しいパラコッカス属種の5菌株で変動性の反応を示した。これら9つの試験では、新しいパラコッカス属種とP.マルクシ DSM 11574TおよびP. カロチニファシエンス E-396Tとの間の区別はされなかった。
GalNAc:N-アセチル-D-ガラクトサミン;GlucNAc:N-アセチル-D-グルコサミン;β-Methylgluc:β-メチルグルコシド;MMSucc:モノ-メチルスクシネート;GalAlactone:D-ガラクトン酸ラクトン;GalacturonicA: D-ガラクツロン酸;GlucosaminicA:D-グルコサミン酸;GlucuronicA:D-グルクロン酸;AHBA:α-ヒドロキシ酪酸;BHBA:β-ヒドロキシ酪酸;GHBA:γ-ヒドロキシ酪酸;PHPAA:p-ヒドロキシフェニル酢酸;AKBA:α-ケト酪酸;AKGA:α-ケトグルタル酸;AKVA:α-ケト吉草酸;LAME:D,L-乳酸メチルエステル;SaccA:D-糖酸;BromosuccA:ブロモコハク酸;GAA:グリシル-L-アスパラギン酸;GGA:グリシル-L-グルタミン酸;HydPro:ヒドロキシ-L-プロリン;PyroGluA:L-ピログルタミン酸;GABA:γ-アミノ酪酸;PEA:フェニルエチルアミン;GlycP:D,L-α-グリセロリン酸;Gluc-1-P:グルコース-1-リン酸;Gluc-6-P:グルコース-6-リン酸
a:β-グルコシダーゼ;b:プロテアーゼ;S/+5:遅い+5日
いくつかの生理学的および形態学的試験を、新しいパラコッカス属種の5菌株、ならびにパラコッカス マルクシ DSM 11574T、パラコッカス カロチニファシエンス E-396T、およびパラコッカス ソルヴェンティヴォランス DSM 6637Tに対して行った。各試験に用いた方法は下記のとおりであった。
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴をLMG培地12の寒天表面上に移した。1滴を画線することにより希釈し、他の2滴は妨害せずにそのまま置いた。プレートを好気的条件下、10℃、25℃、30℃、33℃、37℃、および40℃でインキュベートし、24時間、48時間、および5日後に増殖をチェックした。増殖は、視覚的増殖(液滴中のコンフルエントおよび希釈接種物による画線中のコロニー)として、30℃での増殖(すなわち「対照」)と比較して判定した。判定は次のとおりに行った(対照プレートに対して);
括弧内の結果は、画線中の増殖結果が未妨害の液滴中のコンフルエント増殖と異なる場合には、画線中の結果である。
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴を、NaClを最終濃度3%、6%、および8%に達するまで補足したLMG培地12の寒天表面上に移した。1滴を画線することにより希釈し、他の2滴は妨害せずにそのまま置いた。プレートを好気的条件下、28℃でインキュベートし、24時間、48時間、および5日後に増殖をチェックした。増殖は、視覚的増殖(液滴中のコンフルエントおよび希釈接種物による画線中のコロニー)として、NaClを添加しない増殖(対照)と比較して判定した。判定は次のとおりに行った(対照プレートに対して);
括弧内の結果は、画線中の増殖結果が未妨害の液滴中のコンフルエント増殖と異なる場合には、画線中の結果である。
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴を、pHを変更し、オートクレーブ後に最終pH値がpH6.1、pH6.3、pH7.0、pH7.7、pH8.1、およびpH9.1とした液体LMG培地12(10ml)を含むチューブに移した。培養液を28℃で好気的に(振盪しながら)インキュベートした。増殖を24時間、48時間、3日、および6日後にチェックした。増殖は濁度の増大(BIOLOG濁度計を用いて透過の割合(%)で測定)として、pH7.0での増殖(対照)と比較して判定した。判定は次のとおりに行った(対照に対して);
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、0.2%可溶性デンプンを補足したLMG培地12の寒天表面上に1画線として移した。次いで、プレートを好気的条件下、28℃でインキュベートした。菌株が良好に増殖した時点(48時間後)で、プレートにルゴール溶液(蒸留水中0.5%I2および1%KI)を注いだ。加水分解を増殖に沿った澄明領域(デンプンが加水分解されていない寒天の青色と対比)として判定した。
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、1%KNO3を補足した半固体(0.1%寒天)LMG培地12を含むチューブに穿刺した。プレートを28℃で5日間インキュベートした。脱窒素作用(硝酸塩からN2)を穿刺部位に沿ったガス生成で判定した。
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、LMG培地12の寒天表面上に画線した。寒天プレートを嫌気性条件(約10%CO2+約90%N2)下、30℃でインキュベートした。24時間後および5日後にプレートを増殖についてチェックした。増殖は目視により判定し、好気性(対照)条件と比較した。判定は次のとおりに行った(対照に対して);
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、HughおよびLeifsonの塩基性寒天培地[J. Bacteriol. 66:24-26 (1953)]を含むチューブに穿刺した。培地の上面にパラフィン油を加え、チューブを30℃でインキュベートした。48時間後および5日後にチューブを増殖および酸の生成についてチェックした。増殖は目視により判定した。判定は次のとおりに行った;
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、0.1%KNO3を補足したLMG培地12の寒天表面上に画線した。プレートを嫌気性条件(約10%CO2+約90%N2)下、30℃でインキュベートし、3日後に増殖についてチェックした。増殖は好気性(対照)条件と比較した目視による増殖で判定した。判定は次のとおりに行った(対照に対して);
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。カタラーゼ活性の陽性結果はコロニーを1滴の10%H2O2に懸濁した後の気泡生成であった。オキシダーゼ活性の陽性結果は1%テトラメチルパラフェニレンに浸けたろ紙上にコロニーをこすりつけた後の赤紫色の発色であった。
細胞をLMG培地12上、28℃で5日間培養した。コロニーの色を目視観察した。
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。細胞懸濁液を滅菌食塩水中で作製した。細胞の形態および運動性を、位相差光学を備えたOlympus光学顕微鏡(倍率1000×)を用いて顕微鏡で観察した。
R-1512、R1534、R114、およびR-1506株をME培地中で培養した。ME培地は以下を含む(蒸留水1リットルあたり):グルコース5g、酵母抽出物10g、トリプトン10g、NaCl 30gおよびMgSO4・7H2O 5g。培地のpHを5N NaOHで7.2に調節した後、オートクレーブにより滅菌した。培養物はすべて(プラスティック製のフタが付いた250mlのバッフル付き三角フラスコ中、25mlの量)を200rpmで振盪しながら28℃で培養した。種培養物を凍結グリセロール化保存液から接種し、終夜培養した。一定量を実験フラスコに移して、660nmでの初期光学密度(OD660)0.16とした。次いで、培養物を200rpmで振盪しながら28℃で培養した。増殖を培養中ならびに6、10(またはR114株については15)、および24時間の時点でモニターし、実施例1に記載の方法によるカロテノイドの分析のために培養物の一定量を取り出した。
Y-O:黄橙色;O-P:橙桃色;PY:淡黄色;SからC:短い桿状から球状;S:短い桿状;C:球状
パラコッカス属菌種R114株におけるイソプレノイド前駆体の生合成の起源を(すなわち、メバロン酸またはDXP経路)を決定するために、「逆生合成」アプローチを[EisenreichおよびBacher:Setlow(編)、Genetic Engineering, Principles and Methods, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York 22:121-153 (2000)]を用いた。このデータ解析のための予測的アプローチにより、単一の下流天然生成物の解析から、グルコース異化作用の明確な評価が可能となる。本研究において、これは非標識グルコースおよび特異的な13C-標識グルコースの様々な2成分混合物を含む培地中での細菌増殖、続く産生されたゼアキサンチンの精製およびNMR分光法による標識パターンの解析を含む。用いた方法の詳細および実験結果を下記に示す。
非標識D-グルコース一水和物はFluka(米国ウィスコンシン州ミルウォーキー)から購入した。[U-13C6]-D-グルコースはIsotec(米国オハイオ州マイアミズバーグ)から購入し、[1-l3C1]D-グルコース、[2-l3C1]D-グルコース、および[6-l3C1]D-グルコースはCambridge Isotope Laboratories(米国マサチューセッツ州アンドーバー)から購入した。酵母抽出物およびペプトン(カゼイン由来、膵臓で消化)はEM Science(米国ニュージャージー州ギブズタウン)から購入した。他の塩および溶媒はすべて分析等級で、標準的化学物質供給元から購入した。
培養終了時に、培養物を15℃に冷却した。培養物1リットルあたり無水エタノール500mlを加え、100rpmで20分間撹拌を続けた。処理した培養物を5000×gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、湿ペレットを5倍量のTHFで撹拌しながら20分間抽出した。抽出混合物を遠心分離し、上清は取っておき、得られたペレットを同じ条件下、1倍量のTHFで二回目の抽出を行い、再度遠心分離した。上清(抽出物)を合わせ、ロータリーエバポレーターにより50mlまで濃縮した。ヘキサン5mlを濃縮THF溶液に加えた。混合後、系は乳濁液を形成し、これは遠心分離によって分離することができた。水相を回収し、等量の飽和NaCl溶液で希釈し、ジクロロメタンで再抽出した。ジクロロメタン相を回収し、THF/ヘキサン相と合わせた。有機抽出物の混合物をロータリーエバポレーターで再度濃縮し、ジクロロメタンを除去した。次いで、溶液をシリカゲルカラムにかけ、n-ヘキサンおよびエーテルの混合物(1:1)で溶出した。小さい淡黄色のバンドが最初に溶出し、廃棄した。主要なゼアキサンチン生成物は、カラム内でゆっくり移動する広いバンドで溶出された。主要バンドを完全に溶出するには、約2リットルの溶媒を必要とした。溶出液を丸底フラスコに回収し、溶媒を40℃のロータリーエバポレーターで除去した。残渣を少量のジクロロエタンに40℃で溶解し、次いで溶液をゆっくり冷却した。混合物にヘキサンを濁りが認められるまで滴加した。結晶化は4℃で48時間以内に完了した。結晶をろ紙上で回収し、冷メタノールで洗浄し、減圧下で乾燥した。
ゼアキサンチンをNMR分光法で解析した。参考のために、ゼアキサンチンの化学構造を以下の式で例示する:
1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルは、Bruker DRX 500分光計によりそれぞれ500.13MHzおよび125.6MHzで記録した。一次元実験および二次元INADEQUATE実験用の取得および処理パラメーターは標準的なBrukerソフトウェア(XWINNMR)に従った。溶媒は重水素化クロロホルムであった。化学シフトは溶媒シグナルを基準とした。
培養条件
パラコッカス属菌種R114株をF培地(10g/lトリプトン、10g/l 酵母抽出液、30g/l NaCl、10g/l D-グルコース、5g/l MgSO4・7H2O、pH7.0)または上の実施例3に記載の予備培養培地中、28℃で培養した。液体培養物を回転振盪機内、200rpmで培養した。
パラコッカス属菌種R114株の培養物600mlを4℃、10,000×gで10分間遠心分離し、ペレットを溶解緩衝液(0.1M NaCl、50mM EDTA、10mMトリス-HCl、pH7.5)200mlで1回、および溶解緩衝液100mlで1回洗浄した。最終ペレットを、リゾチーム50mgおよびRNアーゼA(DNアーゼを含まない)1mgを含む溶解緩衝液20ml中に再懸濁した。37℃で15分間のインキュベーション後、20%N-ラウロイル-サルコシン酸ナトリウム1.5mlおよびプロテイナーゼK 2.25mgを加えた。50℃で30〜60分間のインキュベーション後、溶解産物を1倍量の緩衝液飽和フェノール(pH7.5〜7.8)(LifeTechnologies、米国メリーランド州ロックビル)で、ゆっくりであるが完全に混合することにより抽出した。乳濁液を30,000×gで20分間遠心分離し、水相をフェノールで再抽出した。前と同様に相を分離し、水相を1倍量のフェノール:クロロホルム(1:1)で2回抽出した。この段階で、相をうまく分離するために、スイングバケットローター内、3,200×gで20分間の遠心分離で十分であった。1倍量のクロロホルムで最終抽出を行った後、0.1倍量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)を加え、溶液に2倍量の氷冷エタノールをのせた。沈殿したDNAをガラス棒で巻き取り、70%エタノールに5分間浸漬し、クロロホルムで洗浄し、次いで5〜10分間風乾した。DNAをTE(10mMトリス-HCl、pH7.5、1mM EDTA)5mlに終夜再懸濁した。溶液は微量のゼアキサンチンが原因で黄色を呈したため、有機抽出および巻き取りを上のとおりに繰り返し、澄明な調製物を得た。
Qiagen Lambda Kit(登録商標)(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)を製造者の指示に従って用いた。
オリゴヌクレオチドはLifeTechnologies(米国メリーランド州ロックビル)から購入した。PCRをGeneAmp(登録商標) PCR装置9700(PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)で、GCを多く含むPCR系(Roche Molecular Biochemicals、ドイツ、マンハイム)を製造者の指示に従って用いて行った。典型的には、用いたMgCl2濃度は1.5mMで、反応溶液(resolution solution)を最終濃度1Mまで加えた。
DNA標識および検出のために、それぞれPCR DIG Probe Synthesis KitおよびDIG Luminescent Detection Kitを用いた(いずれも、Roche Molecular Biochemicals、ドイツ、マンハイムから入手)。
塩基配列決定反応をBigDye(登録商標)DNA塩基配列決定キット(PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)を製造者の指示に従って用いて実施した。塩基配列決定反応物をDyeEx(商標)スピンカラム(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)上で精製し、断片の分離および検出をABI Prism(商標)310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)で行った。
ラムダFIX(登録商標)II中、Sau3AIで部分消化したパラコッカス属菌種R114株DNAによる受注生産ライブラリをStratagene(米国カリフォルニア州ラホイヤ)から購入した。
メバロン酸経路の酵素の一つ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼはいくつかのアミノ酸にわたる高度に保存された領域を含む。すべての入手可能な真正細菌のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの整列から三つのそのような領域を選択し、パラコッカス属菌種R1534株のカロテノイド遺伝子クラスターにおいて見いだされた好ましいコドン使用(表14)を用いてオリゴヌクレオチドを設計した。
a:配列番号:
1パラコッカス属菌種R1534株の好ましいコドンを使用、表1参照
2いくつかの酵素に存在する別のアミノ酸
S=CまたはG;R=AまたはG;Y=CまたはT;B=CまたはGまたはT;V=AまたはCまたはG
大腸菌におけるメバロン酸オペロンのクローニングと発現
パラコッカス属菌種R114株λライブラリからのクローン16と呼ばれるλクローン(実施例4参照)を、全メバロン酸オペロンのPCR増幅のための鋳型に用いた。プライマーMevop-2020およびMevop-9027(表16)をPCRに用いた。
パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸オペロン遺伝子のコーディング領域を、表18に示したプライマーを用いてPCRにより増幅した。プライマーは、ATG開始コドンがNdeI部位(切断認識部位CATATG)の後半を構成し、BamHI部位(GGATCC)が停止コドンの直後に導入されるように設計した。すべてのPCR産物を登録pCR(商標)2.1-TOPOベクター中でクローニングした。得られたベクターの名称を表19に示す。メバロン酸キナーゼ遺伝子を除いて、すべての遺伝子はBamHI、NdeI、またはEcoRIの制限部位を含んでおり、これらは後のクローニング段階を促進するために除去しなければならなかった。これらの部位はQuikChange(商標)部位指向性突然変異誘発キット(Stratagene、米国カリフォルニア州ラホイヤ)および表20に示したオリゴヌクレオチドを用いて沈黙突然変異を導入することにより除去した。突然変異が誘発されたコーディング領域をTOPO-プラスミドからBamHIおよびNdeIで切り出し、BamHI-NdeI切断発現ベクターpDS-HisおよびpDSと連結した。これらの発現ベクターは、欧州特許第821,063号の実施例2に記載のpDSNdeHisに由来した。プラスミドpDS-Hisは、沈黙クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する857bpのNheIおよびXbaI断片を欠失させることにより、pDSNdeHisから構築した。プラスミドpDSは、小さいEcoRI-BamHI断片をアニールしたプライマーS/D-1
およびS/D-2
で置換することにより、pDS-Hisから構築した。
1第二のコドンTCAをAGCに変更した(沈黙突然変異−いずれのコドンもセリンをコードする)。
2最後のコドンGGCをGGAに変更した(沈黙突然変異−いずれのコドンもグリシンをコードする)。
pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流およびpBBR-K-Zea4-下流の構築、ならびにこれらのプラスミドのパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生に対する効果
パラコッカス属菌種R1534株のカロテノイド(crt)遺伝子クラスターを、8.3kbのBamHI-EcoRI断片としてプラスミドpZea-4[Pasamontesら、Gene 185:35-41 (1997)]から切り出した。このcrt遺伝子クラスターを含む断片をBamHIおよびEcoRI切断ベクターpBBR1MCS-2(GenBankアクセッション番号U23751)に連結して、pBBR-K-Zea4を得た。プラスミドpBBR-K-Zea4をパラコッカス属菌種R114株に接合により導入し、改善されたゼアキサンチン産生について試験した。対照R114株、およびR114/pBBR-K-Zea4株の二つの独立した単離株を振盪フラスコ培養におけるゼアキサンチン産生について試験した(362F/2培地を使用、実施例11参照)。表23のデータは、プラスミドpBBR-K-Zea4を有する両方の組換え菌株がR114よりも有意に高いレベルのゼアキサンチンを産生し、より高い特異的生成率(ゼアキサンチンmg/OD660)を有していたことを示している。これは、pBBR-K-Zea4におけるクローニングされた挿入断片内の遺伝子が、パラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生を制限する一つまたは複数の酵素をコードすることを示唆していた。
ベクターpBBR1MCS-2をBstXIおよびBsu36Iで切断し、大きい方の断片をアニールしたオリゴヌクレオチドMCS-2 上流
およびMCS-2 下流
に連結し、ベクターpBBR-K-Ndeを得た。リボソーム結合部位およびcrtE開始コドンを含む推定crtEプロモーター(PcrtE)(Pasamontesら、上記)を含む、パラコッカス属菌種R114株由来のカロテノイド遺伝子クラスターにおけるcrtE遺伝子上流の270bp領域を、パラコッカス属菌種R114株DNAから、プライマーcrtE-上流
およびcrtE-下流
を用いたPCRによって増幅した。PCR産物をEcoRIおよびNdeIで切断し、pBBR-K-NdeのEcoRI-NdeI切断バックボーンに挿入して、プラスミドpBBR-K-PcrtEを得た。NdeI部位はcrtEのATG開始コドンを含み、プライマーcrtE-下流に含まれていた。したがって、NdeI部位に埋め込まれた開始コドンを有する、導入されたいかなるコーディング領域も、crtEのリボソーム結合部位を用いて発現されると考えられる。プラスミドpBBR-K-PcrtEをBamHIで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドpha-t-上流
およびpha-t-下流
を挿入した。挿入を塩基配列決定により検証し、PcrtEプロモーターにより近いBamHI部位を再構成する方向に挿入されたオリゴを有する型のプラスミドをpBBR-tK-PcrtEと命名した。挿入された配列はパラコッカス属菌種R114株phaAとphaB遺伝子との間で見いだされる推定転写終結シグナルを有し(実施例10参照)、したがって、PcrtEプロモーターから開始された転写物の適当な転写終結を確実にする。
パラコッカス属菌種R114株宿主におけるcrtE遺伝子発現を高めるための多コピープラスミドを構築するために、crtE遺伝子をプラスミドp59-2(Pasamontesら、上記)から、プライマーcrtE-Nde
およびcrtE-Bam
を用いたPCRによって増幅した。増幅断片をpCR(登録商標)2.1-TOPOベクター中でクローニングし、プラスミドTOPO-crtEを得た。TOPO-crtEからのNdeI-BamHI断片をNdeI-BamHI消化プラスミドpBBR-K-PcrtE中でサブクローニングし、pBBR-K-PcrtE-crtEを得た。最後に、pBBR-K-PcrtE-crtE-3を、pBBR-K-PcrtE-crtEからの小さい方のBglII断片をpBBR-K-Zea4-上流からの小さい方のBglII断片で置換することにより構築した。プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtE-3を電気穿孔によりパラコッカス属菌種R114株に導入した。実施例1に記載の方法を用いて、粗抽出物のGGPPシンターゼ活性はR114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3株ではR114株よりも2.9倍高かった。この活性上昇の程度はR114/pBBR-K-Zea4-上流で観察された程度とほぼ同等であった。表25は、R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3株によるゼアキサンチン産生はR114/pBBR-K-Zea4-上流株と基本的に等しかったことを示している。
パラコッカス属菌種R114株宿主におけるパラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンの個々のクローニングされた遺伝子の発現
TOPO-プラスミドにおけるメバロン酸オペロン遺伝子の突然変異が誘発されたコーディング領域(実施例5参照)をBamHIおよびNdeIで切り出し、BamHI-NdeI切断ベクターpBBR-tK-PcrtE(実施例6参照)と連結した。得られたプラスミドpBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、およびpBBR-tK-PcrtE-mvdを電気穿孔によりパラコッカス属菌種R114株に導入した。形質転換体を50mg/lのカナマイシンを含む寒天培地上で選択し、PCRで検証した。
プラスミド構築
実施例6に示したとおり、プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtE-3のパラコッカス属菌種R114株への導入により、ゼアキサンチンの産生が増大し、GGPPシンターゼ活性がR114株におけるゼアキサンチン生合成の律速因子であることが示された。実施例7はさらに、メバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子が天然宿主パラコッカス属菌種R114株において過剰発現される可能性があり、コードされる酵素の活性上昇を引き起こすことを示した。しかしながら、メバロン酸オペロンのそれぞれ個別の遺伝子を含むプラスミドを担持するパラコッカス属菌種R114株の組換え菌株で、R114株と比較してゼアキサンチン産生の増大を示すものはなかった。パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸オペロン遺伝子の過剰発現の利点は、ゼアキサンチン経路における下流の「ボトルネック」(GGPPシンターゼ)によって遮蔽されている可能性がある。各メバロン酸経路遺伝子(またはおそらくはこれらの遺伝子の組み合わせ)と、crtEとの同時過剰発現を可能にするプラスミドの作製によって、ゼアキサンチン生合成経路全体のすべての律速因子を軽減することができ、それによってゼアキサンチン産生が改善されると考えられる。次の項では、crtEとメバロン酸経路の5つの酵素をコードする各遺伝子との共同過剰発現を可能にするよう設計された「ミニオペロン」の構築を記載する。
FPPシンターゼはパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン生合成の中心経路にあるため、ispA遺伝子の量を増加することによってこの酵素の活性を高めることは、ゼアキサンチン産生を改善する可能性がある。このため、パラコッカス属菌種R114株由来のispA遺伝子を下記のとおりにクローニングし、塩基配列決定した。6つの細菌FPPシンターゼのアミノ酸配列を公的データベースから入手した。これらの配列はいくつかの高度に保存された領域を有している。二つのそのような領域、およびPCRのために用いたオリゴヌクレオチドを表27に示す。パラコッカス属菌種R114株DNAを鋳型として用いた、オリゴヌクレオチドGTT-1およびGTT-2によるPCRで、予想されたサイズの生成物を得た。PCR産物をベクターpCR(登録商標)2.1-TOPO中でクローニングし、塩基配列決定した。クローニングした断片をプローブに用いてパラコッカス属菌種R114株DNAのサザン分析を行い、約1.9kbのBamHI-NcoI断片にハイブリダイズすることが明らかとなった。パラコッカス属菌種R114株DNAをBamHIおよびNcoIで切断し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。1.5から2.1kbの間の領域を単離し、クローニングベクターのBamHIおよびNcoI部位でクローニングした。この部分ライブラリを次いでispA-PCR断片をプローブに用いてスクリーニングし、二つの陽性クローンを単離した。塩基配列決定により両方のクローンのプラスミドがispA遺伝子を含むことが確認された。ispAの上流(配列番号:159)はエキソヌクレアーゼVIIの小さいサブユニット、XseB(配列番号:158)の遺伝子で、下流は1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼをコードするdxs遺伝子(配列番号:160)である。これは大腸菌で見られるのと同じ遺伝子の配置である。NcoI-BamHI断片の配列を配列番号:157に示し、XseB、IspA、およびDxsのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:158、配列番号:159、および配列番号:160に示す。ispAの開始コドンはGTGまたはATGであると考えられ、天然IspAのアミノ末端にそれぞれ複数のメチオニン残基を与える。
IPP生合成の最初の関係づけられた段階は、HMG-CoAシンターゼによるアセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)への縮合である。基質アセトアセチル-CoAは酵素アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(アセトアセチル-CoAチオラーゼまたはβ-ケトチオラーゼとしても知られている)により、アセチル-CoAの二つの分子の縮合によって生成される。この反応は中枢代謝(アセチル-CoAでの)をメバロン酸経路を介してイソプレノイド生合成に連結するため、遺伝子増幅によるアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性増大はカロテノイドおよび他のイソプレノイドへのインビボでの炭素の流れを増大する可能性を有している。パラコッカス属菌種R114株には、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも二つの遺伝子、atoBおよびphaAがある。atoB遺伝子の末端はパラコッカス属菌種R1534株(米国特許第6,087,157)およびR114株(本試験)におけるcrtEの開始の上流にある165ヌクレオチドである。パラコッカス属菌種R1534株由来のatoB遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:175および配列番号:176に示す。
リコペンはR-1512株ならびにその突然変異誘導体R1534およびR114によって代表される新しいパラコッカス属種におけるゼアキサンチン生合成の中間体である赤色カロテノイドである。リコペン自体は大きな商業的可能性を有するため、工業的発酵によりリコペンを産生するための新しいパラコッカス属種の可能性を試験することに興味が持たれた。リコペンを蓄積する、ゼアキサンチン生合成において遮断された突然変異体を得るために、パラコッカス属菌種R114株を紫外(UV)線にによる突然変異誘発にかけた後、赤色コロニーをスクリーニングした。UV突然変異誘発は下記のとおりに実施した。R114株の終夜培養物をME培地中で増殖させた(実施例2参照)。その終夜培養物を新鮮ME培地中に継代培養し(初期OD610=0.1)、28℃で3時間インキュベートした。この培養物の一定量を遠心分離し、ペレットを20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)で洗浄した。二回目の遠心分離後、ペレットを最終OD610が0.1になるまで再懸濁した。細胞懸濁液の一定量(10ml)を滅菌100mlガラスビーカーに入れた。細胞懸濁液の薄層にUV光を1450μW/cm2の束であらかじめ決められた最適な時間照射した。照射中、ビーカー内の紙用クリップおよびマグネチックスターラにより細胞懸濁液を混合した。突然変異を誘発した細胞懸濁液(および非突然変異対照)を362/F2寒天培地上に播種した(表28)。突然変異誘発の前後に、懸濁液の生存プレート数算定を三回ずつ行った(薄暗い室内光で)。プレートを28℃で4〜5日間インキュベートし、コロニーを評価した。いくつかの赤色コロニー(推定リコペン産生細胞)を再度線条培養することにより同定し、精製した。UV7-1と名付けた一つの突然変異体を、リコペン産生についてさらに評価した。
アスタキサンチンは主に水産養殖産業において用いられる商業的に重要なカロテノイドである。欧州特許第872,554号は、パラコッカス属菌種R1534株およびパラコッカス カロチニファシエンス E-396T由来のクローニングされたカロテノイド(crt)遺伝子の組み合わせを含むプラスミドを導入することによりアスタキサンチン産生が大腸菌内で達成可能であることを示した。また、クローニングされたcrt遺伝子(crtEBIYZ)およびcrtW(β-カロテンβ-4オキシゲナーゼ)は、ゼアキサンチンを通じてFPPからアスタキサンチンへの全生合成経路をコードした。P. カロチニファシエンス E-396 crtW、パラコッカス属菌種R1534 crtZ、およびパラコッカス属菌種R1534 crtE遺伝子、およびコードされるポリペプチドの配列を(配列番号:180および181(crtW);182および184(crtZ);ならびに184および185(crtE))に示す。しかしながら、アスタキサンチン産生がパラコッカス属菌種R114株宿主ファミリーにおいて達成可能であることは示されなかった。R114菌株由来の組換え菌株のアスタキサンチン産生における有用性を示すために、クローニングされたcrtW遺伝子(配列番号:180)を下記のとおりにR114株中に導入した。
aZXN、ゼアキサンチン;AND、アドニキサンチン;CXN、カンタキサンチン;AXN、アスタキサンチン。
bmg/l(全カロテノイド)/OD660で表した特異的生成。
パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸経路の遺伝子の過剰発現は、メバロン酸経路を通じての炭素の流れの増大につながる。プラスミドpBBR-K-mev-op16-2の作製は実施例5に記載した。プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4を下記のとおりに作製した。mvaA遺伝子のほとんどを含むDNA断片ならびに全idiおよびhcs遺伝子を、パラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンを含むλ-クローンの部分消化後、3.1kbのSmaI-SalI断片上で得た(実施例4参照)。この断片をpUC19中でサブクローニングし、プラスミドpUC19mev-op-上流'を得た。サブクローニングを容易にするために、メバロン酸遺伝子を含むpUC19mev-op-上流'のKpnI-HindIII断片をベクターpBluescriptKS+中で再クローニングし、プラスミドpBluKSp-mev-op-上流'を得た。pUC19mev-op-上流'からの1.7kbのSalI断片を、次にパラコッカス属菌種R114株由来のクローニングされたsalI-EcoRI断片Mを含むpUC19由来プラスミドであるプラスミド2ES2-1のSalI部位でクローニングした(実施例4参照)。これによりプラスミドpUC19mev-op-上流-2を得た。次いでプラスミドpUCmev-op-上流-3を、メバロン酸オペロンの始まり部分を有するpUC19mev-op-上流-2からのBbsI-BsaI断片と、idiおよびhcsを含むpBluKSp-mev-op-上流'からのBbsI-BsaI断片とを結合することによって得た。これとは別に、特有のMluI部位を、ベクターpBBR1MCS-2(実施例5参照)のNsiIとKpnI部位との間にMluI制限部位を含むアニールしたプライマーを挿入することにより導入した。得られた新しいクローニングベクターpBBR-K-MluをMluIおよびKpnIで切断し、メバロン酸オペロンの最初の三つの遺伝子を含むpUCmev-op-上流-3からのMluI-KpnI断片を挿入して、プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-3を得た。次いで、プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4を、mvk遺伝子のほとんど、およびpmkの5'末端を含むプラスミド16SB3からのSmaI断片挿入によって作製した(プラスミド16SB3はパラコッカス属菌種R114株SalI-BamHI断片Aを含むpUC19由来プラスミドである;実施例4参照)。プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4の挿入断片は推定メバロン酸オペロンプロモーター領域、メバロン酸オペロンの最初の四つの遺伝子、およびpmkの5'末端を含む。
Claims (5)
- 下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド:
(a)配列番号:43の残基1〜340位として示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:45の残基1〜349位として示されるアミノ酸配列;
(c)配列番号:47の残基1〜388位として示されるアミノ酸配列;
(d)配列番号:49の残基1〜378位として示されるアミノ酸配列;
(e)配列番号:51の残基1〜305位として示されるアミノ酸配列;
(f)配列番号:53の残基1〜332位として示されるアミノ酸配列。 - 配列番号:42または配列番号:42の相補体で表されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は請求項2記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項3記載の発現ベクターを含む培養細胞、または該細胞の子孫であって、請求項1に記載のポリペプチドもしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞。
- ATCCにおいて、寄託名称PTA−3335を有するパラコッカス(Paracoccus)属の微生物。
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