JP4887764B2 - 新規微生物およびそれを用いたリコペンの製造法 - Google Patents

Description

本発明は飼料・食品用色素、抗酸化剤として有用なリコペンの製造に用いられる新規微生物およびそれを用いたリコペンの製造法に関する。

リコペンはトマトやスイカに含まれる赤色色素であり、天然の食用色素として有用な化合物である。近年では、その優れた抗酸化活性による発癌抑制効果が着目され、サプリメントなど健康食品への応用もなされている。リコペンの主な供給はトマト等農作物からの抽出であるが、これらの天然物はリコペンの含量が少ないため大量の原料が必要となり、また、生産コストがかかる。そこで、より効率的で安定供給可能な生産方法の確立が望まれている。

生産性の改良として藻類による生産（例えば特許文献１参照）やケカビによる生産（例えば特許文献２参照）が示されている。しかしながらこれらの微生物は通常の細菌と比べて発酵に時間がかかり、発酵法が複雑である。また細胞壁が硬いため抽出に複雑な工程を経る必要があるという問題がある。培養が容易で目的物の抽出がしやすい微生物での合成が望まれている。

また、今回産生細菌として用いたアグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０２３）はアドニキサンチンやアスタキサンチン、またはその配糖体などのカロテノイドを産生することが知られているが、代謝中間体であるリコペンは蓄積しない。またカロテノイド類の総生産量も培地１リットル当たり数ミリグラム程度であり、生産性も低い。よって、本細菌を用いてカロテノイド類の発酵生産を行うには更なる生産性の向上が望まれている。なお、この微生物は後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても登録され、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）より入手することができる（例えば、非特許文献１、２参照）。

特開平９−３１３１６７号公報 特開２００３−３０４８９５号公報 国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンクホームページ＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／＞ 米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎホームページ＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞

本発明は、リコペンを選択的に且つ大量に生産することができる微生物を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により得られる、リコペン生産性が向上したパラコッカス属細菌である。また、本発明は、そのような細菌を培養し、菌体又は培養液からリコペンを回収することを特徴とする、リコペンの製造法である。

従って本発明は、特許生物寄託センターに寄託されたＴＳＴＴ００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９６）を代表とする、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたリコペン生産性微生物である。

また本発明は、培地１Ｌあたり３９．６ｍｇ以上のリコペンを生産する微生物であり、さらに生産されるリコペン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、リコペンが前記カロテノイド類の合計量の９５重量％以上しめる微生物である。

また本発明は、上記の微生物を培養し、培養後の菌体又は培養液からリコペンを回収するリコペンの製造法である。以下本発明を詳細に説明する。

本発明の微生物は、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により誘導された新規な微生物であり、ＴＳＴＴ００３株を代表とする、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたリコペン生産性微生物である。

本発明の微生物は、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により誘導された新規な微生物であるが、前記Ｎ−８１１０６株は株式会社海洋バイオテクノロジー研究所により発見された微生物であり、海洋バイオテクノロジー研究所のカルチャーコレクション（ＭＢＩＣ）に公開されている。Ｎ−８１１０６株は細胞中にアスタキサンチンやアドニキサンチン、またはその配糖体をカロテノイドとして蓄積することが知られているが、リコペンは中間代謝物として速やかに次の代謝物に変換されるため、ＨＰＬＣなどでは検出できない。

本発明の微生物はＮ−８１１０６株の育種により誘導されるが、育種の方法としては自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちに生産性が向上した菌株を選別していく方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法など様々な方法を行なうことができる。特に変異原物質を用いる方法は短期間に有用な菌株を得る方法として好ましい。

変異原物質としてはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物が使用できる。

一例をあげると、予め培養して得たＮ−８１１０６株の菌体をこれらの化合物の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去した後に平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は任意に多数のコロニーを選択、分離後液体培養を行ない、回収した菌体からカロテノイドを溶媒抽出し、抽出液の４７０ｎｍ付近の吸光度を測定することで行われる。

この様にして一次選抜を行ない、次いで抽出液の組成をＨＰＬＣなどで分析してカロテノイド生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。また、種々の色調のコロニーを多数選択することにより、中には代謝中間体を蓄積する株を得ることができる。これはカロテノイドの代謝を担う酵素の活性低下または活性欠損によるものであり、本発明におけるリコペンを蓄積するＴＳＴＴ００３株はリコペンシクラーゼ（リコペンからβ−カロテンを合成する酵素）の活性が顕著に低下または失活しているものと考えられる。

本発明に用いる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。

本発明における培養の条件については、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであれば特に限定はないが、培養温度は１５〜３５℃が好ましく、ｐＨは６〜９が好ましく、培養時間は２４〜２００時間が好ましい。

さらに具体的には、本発明の微生物は、培地１Ｌあたり３９．６ｍｇ以上のリコペンを生産する微生物であり、さらに生産されるリコペン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、リコペンが前記カロテノイド類の合計量の９５重量％以上しめる微生物である。

本発明の微生物が特定のカロテノイド類を効率的に生産できるのは、その機序の詳細は不明であるものの、カロテノイドの代謝を担う酵素の活性低下または不活性化によるものであり、本発明におけるリコペンを蓄積するＴＳＴＴ００３株はリコペンシクラーゼ（リコペンからβ−カロテンを合成する酵素）の活性が顕著に低下または失活しているものと考えられる。

本発明は、上記の微生物を培養し、培養後の菌体又は培養液からリコペンを回収する、リコペンの製造法であり、リコペンを回収するためには培養液からリコペン蓄積微生物を集菌し、適当な有機溶媒等により抽出すればよい。

本発明におけるカロテノイドの分析方法は、菌体または培養液から安定に効率良く回収されれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。抽出されたカロテノイド類の定量は、定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。

本発明によれば、天然の食用色素として有用なリコペンを効率よく製造することが可能になる。

以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
菌株の取得
表１に示す培地５ｍｌにパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株を植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行なった。この培養液のうち１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００回転、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）１ｍｌに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍｌのＮ‐メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、３０〜６０分間静置した。

その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに、０．５ｍｌ緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表１に示す培地３ｍｌに植菌して４〜５時間培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表２に示す組成の平板培地上に塗布して２５℃で５日間保温した。生育したコロニーからランダムに選別・釣菌し、表１に示す組成の培地で２５℃、１００ｒｐｍで７日間振とう培養を行った。この培養液を分析し、リコペン生産性が向上した菌株の選定を行なった。

カロテノイドの定量は以下の様に行なった。まず培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１５，０００回転、５分間遠心分離して菌体ペレットを得た。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００μｌのジメチルフォルムアミドおよび５００μｌのアセトンを加え振とうしてカロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）で各種カロテノイドを定量した。

なおカロテノイドの分離はＡ液として純水とメチルアルコールの５：９５の混合溶媒、Ｂ液としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７：３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。

また、カロテノイド類の成分帰属は市販の試薬とのＨＰＬＣリテンションタイムの比較により行なった。カロテノイド濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のリコペン試薬（和光純薬製）で作成した検量線より濃度を算出した。

以上の操作を経て、リコペンを選択的に高生産する細菌ＴＳＴＴ００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９６）を得た。

（実施例２）
フラスコでの新規微生物の培養およびカロテノイドの定量
表３に示した組成の滅菌した培地５ｍｌにＴＳＴＴ００３株のグリセロール保存液５０μｌを植菌して２５℃で１日間、毎分１５０回転の振とう速度にて培養を行なった。次いで、表３に示した組成の滅菌した培地６０ｍｌを１００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、上記の培養液２ｍｌを植菌して２５℃で７日間、毎分１００回転の振とう速度にて培養を行なった。培養終了時の培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）は６．１であった。

培養終了後の菌体からカロテノイドを抽出してＨＰＬＣにてカロテノイド量を定量すると、培地１Ｌあたりリコペンは３９．６ｍｇ、総カロテノイドは４０．６ｍｇを生産した。よって、リコペンの総カロテノイドに対する割合は９５％以上であった。このときのカロテノイド生産パターン（ＨＰＬＣチャート）を図１に示す。

ＴＳＴＴ００３株から抽出したカロテノイド類のＨＰＬＣチャートであり、図中、Ｘ軸（横軸）は保持時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸）ＨＰＬＣピーク強度（単位はｍＶ（任意強度））を示す。

符号の説明

１：リコペンのピーク

Claims (2)

1. カロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたリコペン生産性微生物である、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９６）。
2. 請求項１に記載の微生物を培養し、培養後の菌体又は培養液からリコペンを回収することを特徴とする、リコペンの製造法。

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