JP2005058216A - 新規微生物及びカロテノイドの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】カロテノイド、とりわけアスタキサンチンを大量に生産することができる、海洋性微生物を提供する。
【解決手段】カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−14023として寄託されている)の育種により得られる、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌。具体例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19416として寄託された菌株TSUG1C11、およびFERM P−19746として寄託された菌株TSN18E7をあげることができる。
【選択図】 選択図なし
【解決手段】カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−14023として寄託されている)の育種により得られる、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌。具体例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19416として寄託された菌株TSUG1C11、およびFERM P−19746として寄託された菌株TSN18E7をあげることができる。
【選択図】 選択図なし
Description
本発明は飼料・食品用色素、抗酸化剤として有用なカロテノイド、特にアスタキサンチンを産生する微生物に関するものである。
アスタキサンチンは従来よりサケ・マス・マダイなどの養殖魚類の色揚げに用いられており、また近年ではその抗酸化作用から健康食品などへの利用が検討されている化合物である。南極オキアミ等の甲殻類から抽出、或いは酵母や微細藻類などの培養により天然から得られるが、供給の安定性やコストの問題から現在では化学合成品が広く用いられている。しかしながら化学合成品には製法由来の不純物、とくに合成反応に用いられる劇薬類の混入の不安があり、安全性の面から天然品の供給が望まれている。一方で天然品には先に延べた供給の安定性やコストの問題があり、特に酵母や微細藻類の培養によって得られたものには副産物として脂肪酸エステル体が混在する問題があり、また細胞壁が硬いため、抽出に複雑な工程を経る必要があるという問題があった。
その改良として海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106(FERM P−14023号)の培養により得る方法が開示されている(例えば特許文献1参照)。当該発明によれば、この海洋性細菌を培養した後の菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にアスタキサンチンを抽出できるという利点がある。しかしながら当該細菌を培養して得られるアスタキサンチンは培養液1リットルあたり0.1mg程度であり、製造量の向上が望まれていた。また細菌の培養によるアスタキサンチンの製法としては土壌細菌を用いた製造法の記述があり、当該発明では1リットルあたり128mgの製造例が報告されている(例えば特許文献2参照)。しかしながら、マスやマダイなど海産物の養殖に使用するためには、それらが生育する環境から得られた微生物を用いることが安全性の面から好ましいと考えられ、前述の海洋性微生物による製造法の改良が望まれていた。
本発明は、カロテノイド、特にアスタキサンチンを大量に生産することができる海洋性微生物を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106株の育種により得られることを特徴とする、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌である。また本発明は、そのようなカロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明の微生物は海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106株の育種により誘導された新規な微生物である。N−81106株は海洋バイオテクノロジー研究所により発見された微生物であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−14023号として寄託されている。N−81106株は細胞中にアスタキサンチンを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、3−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、3’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積することも知られている(Yokoyama & Miki (1995)FEMS Microbiology Letters 128、139−144)。
本発明の微生物は、N−81106株の育種により誘導されカロテノイド生産性が向上したものであるが、育種の方法としては自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちに生産性が向上した菌株を選別していく方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法など様々な方法を行なうことが出来る。特に変異原物質や紫外線を用いる方法は短期間に有用な菌株を得る方法として好ましく用いることが出来る。変異原物質としてはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を用いることができる。
一例をあげると、予め培養して得たN−81106株の菌体を変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に、遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去した後に平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は任意に多数のコロニーを選択、分離・液体培養を行ない、回収した菌体からカロテノイドを溶媒抽出し、抽出液の480nm付近の吸光度を測定することで行われる。この様にして一次選抜を行ない、次いで抽出液の組成をHPLCなどで分析してカロテノイド生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。
このようにして本発明では、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、とりわけアスタキサンチン生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、TSUG1C11を得た。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19416として寄託されている。
またカロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌としては、細胞内にカロテノイドを1.8重量%以上蓄積するものが好ましく、とりわけアスタキサンチン生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、細胞内にアスタキサンチンを0.9重量%以上蓄積するものが更に好ましい。本発明では、このような細菌としてTSN18E7を得た。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19746として寄託されている。
本発明では、上述の細菌を培養してカロテノイドを製造することができる。培養の条件については特に限定はないが、振とう培養や通気攪拌培養等の好気的な条件が好ましく、培養時間としては24時間〜200時間程度、培養温度としては15〜35℃付近が好ましく、pHとしては6〜9が好ましい。
用いられる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸1ナトリウム、リン酸2ナトリウム、リン酸1カリウム、リン酸2カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1鉄、硫酸第2鉄、塩化第1鉄、塩化第2鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・2水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
次に培養された菌体又は培養液からアスタキサンチンを回収する。回収の方法には特に限定はなく、アスタキサンチンが安定に効率よく回収されればいずれの方法でもよい。例えばアスタキサンチンを菌体から抽出する場合、抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等を用いればよい。更に高速液体クロマトグラフィーなどによる精製を行ってもよい。
本発明によれば、カロテノイド生産性、とりわけアスタキサンチン生産性に優れたアグロバクテリウム属細菌が得られる。従って養殖魚類の色揚げ用飼料などとして有用なアスタキサンチンを効率よく製造することが可能になる。
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
(実施例1) 菌株の取得
表1に示す培地40mlにN−81106株を植菌し、100ml容バッフル付き三角フラスコ中、25℃、100rpmで3日間振盪培養を行なった。この培養液のうち、0.5mlを1.5ml容エッペンドルフチューブに回収し、15000回転、10分間の遠心分離を行なって微生物菌体を回収した。この菌体をpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液(緩衝液A)0.5mlに懸濁し、次いで1.5mg/mlのN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以下NTGと略記する)水溶液10μlを加え、室温で10分間放置した。15000回転、10分間の遠心分離で菌体を回収し、緩衝液Aに再懸濁する操作を2回繰返してNTGを除去した。さらに0.5mlの緩衝液Aに菌体を懸濁し、表2に示す組成の平板培地上に塗布して、20℃で1週間静置培養を行なった。生じた微生物コロニーのうち赤色の強いものを選別し、表1に示す組成の培地で20℃、100rpmで5日間振盪培養を行なった。この培養液より経時的に培養液を採取して、その660nmの濁度及びアスタキサンチン量を定量し、アスタキサンチン生産性が向上した菌株の選定を行なった。
表1に示す培地40mlにN−81106株を植菌し、100ml容バッフル付き三角フラスコ中、25℃、100rpmで3日間振盪培養を行なった。この培養液のうち、0.5mlを1.5ml容エッペンドルフチューブに回収し、15000回転、10分間の遠心分離を行なって微生物菌体を回収した。この菌体をpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液(緩衝液A)0.5mlに懸濁し、次いで1.5mg/mlのN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以下NTGと略記する)水溶液10μlを加え、室温で10分間放置した。15000回転、10分間の遠心分離で菌体を回収し、緩衝液Aに再懸濁する操作を2回繰返してNTGを除去した。さらに0.5mlの緩衝液Aに菌体を懸濁し、表2に示す組成の平板培地上に塗布して、20℃で1週間静置培養を行なった。生じた微生物コロニーのうち赤色の強いものを選別し、表1に示す組成の培地で20℃、100rpmで5日間振盪培養を行なった。この培養液より経時的に培養液を採取して、その660nmの濁度及びアスタキサンチン量を定量し、アスタキサンチン生産性が向上した菌株の選定を行なった。
アスタキサンチンの定量は以下の様に行なった。まず培養液1mlを1.5ml容エッペンドルフチューブに回収し、トミーCR−15型遠心分離器で15000rpm、10分間遠心分離を行ない、菌体を得た。この菌体を20μlの純水に懸濁し、次いで200μlのジメチルホルムアミドを加えて振盪し、さらにアセトン500μlを加えてアスタキサンチンの抽出を行なった。抽出残渣をトミーCR−15型遠心分離器で15000rpm、10分間遠心分離を行なって除去した後、TSK gel−ODS80TMカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCと略記する)でアスタキサンチンを定量した。なお、アスタキサンチンの分離はA溶媒として純水とメチルアルコールの5対95の混合溶媒、B溶媒としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの7対3の混合溶媒を用い、1ml/minの流速でA溶媒を5分間カラムに通過させた後、同じ流速でAからBへ5分間の直線濃度勾配を行ない、さらにB溶媒を5分間通過させることにより行った。アスタキサンチン濃度は470nmの吸光度をモニターし、既知濃度のアスタキサンチン試薬(シグマ社製)で作成した検量線より濃度を算出した。
以上の操作で選定したアスタキサンチン生産性が向上した菌株に対し、二回目のNTG処理を実施した。NTG処理及び菌株の選定の方法は、NTG濃度を5μg/lとしたことのほかは、一回目の処理と同様に行なった。この操作で得られた菌株に対し、さらに紫外線処理を実施した。紫外線処理の方法は以下の通りである。すなわち、培養液約5mlをシャーレにとり、安全キャビネット中の滅菌ランプから40cm離れた位置に本シャーレを固定した。この状態で滅菌ランプを点灯し、1分間紫外線にさらした。その後、表2に示す平板培地に培養液を塗布し、以降NTG処理の際と同様に菌株を選定した。この操作で選別した菌株に対し再度同じ条件で紫外線処理を実施し、菌株の選定をもう一度実施した。この操作では平板培地として表3に示す組成の培地を利用したが、その他の操作は前回と同様に実施した。この操作によりカロテノイド生産性が向上した菌株TSUG1C11株を取得した。
表1に示す培地300mlにTSUG1C11株を植菌し、500ml容バッフル付き三角フラスコ25℃、100rpmで4日間振盪培養を行なった。培養終了後の菌体量は660nmの濁度測定により表した。培養終了後培養液1mlを1.5ml容エッペンドルフチューブに回収し、トミーCR−15型遠心分離器で15000rpm、10分間遠心分離を行ない沈澱した菌体を得た。回収した菌体からのアスタキサンチンの抽出及びHPLCによるアスタキサンチンの定量は実施例1と同様に実施した。結果を表4に示す。本菌株の菌体収量は比較例1に示す元株であるN−81106と同等であった。一方、培地1リットルあたり約19mgのアスタキサンチンを生産した。
(比較例1)
N−81106株を用い、培養温度を20℃、培養時間を5日とした他、実施例2と同様に培養及びアスタキサンチンの定量を行なった。その結果を表4に示した。実施例2に示す菌株の元株を用いたこの培養では実施例2とほぼ同等の菌体収量が得られたものの、アスタキサンチン生産量は培地1リットルあたり約1mgにすぎなかった。
N−81106株を用い、培養温度を20℃、培養時間を5日とした他、実施例2と同様に培養及びアスタキサンチンの定量を行なった。その結果を表4に示した。実施例2に示す菌株の元株を用いたこの培養では実施例2とほぼ同等の菌体収量が得られたものの、アスタキサンチン生産量は培地1リットルあたり約1mgにすぎなかった。
実施例1と同様にして2回目のNTG処理まで行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株を得た。このようにして得られた菌株に対して2回目と同様な条件にてさらに3回目のNTG処理を実施し、そのうちの約1000菌株について評価を行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株を得た。このようにして得られた菌株に対して2回目と同様な条件にてさらに4回目及び5回目のNTG処理を実施し、それぞれ約1000菌株について評価を行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株のうち、最も生産性に優れた菌株TSN18E7を取得した。
(実施例4) 新規微生物の培養およびカロテノイドの定量
表5に示した組成の培地300mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ121℃、20分間で滅菌後、TSN18E7を植菌、25℃で1日間、毎分100回転の振とう速度にて培養を行なった。次いで表6に示した組成の培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ121℃、20分間で滅菌、上記培養液5mlを植菌、25℃で約18時間、毎分100回転の振とう速度にて培養を行なった。さらに、表7に示す組成の培地約2.3Lを5Lの発酵槽に入れ、121℃、20分間で滅菌後、得られた上記培養液125mlを植菌、約144時間培養した。培養条件は温度が22℃、pH7.0〜7.2、溶存酸素は飽和の2%の濃度になるよう攪拌により制御、通気は空気を1VVMにて供給した。pHの制御はアルカリに15%アンモニア水、酸に2Nの塩酸を使用した。またグルコースは50%濃度を使用してアルカリのポンプと連動により供給し、6日間培養を行った。このようにして最終的には約21gの乾燥菌体を得た。
表5に示した組成の培地300mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ121℃、20分間で滅菌後、TSN18E7を植菌、25℃で1日間、毎分100回転の振とう速度にて培養を行なった。次いで表6に示した組成の培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ121℃、20分間で滅菌、上記培養液5mlを植菌、25℃で約18時間、毎分100回転の振とう速度にて培養を行なった。さらに、表7に示す組成の培地約2.3Lを5Lの発酵槽に入れ、121℃、20分間で滅菌後、得られた上記培養液125mlを植菌、約144時間培養した。培養条件は温度が22℃、pH7.0〜7.2、溶存酸素は飽和の2%の濃度になるよう攪拌により制御、通気は空気を1VVMにて供給した。pHの制御はアルカリに15%アンモニア水、酸に2Nの塩酸を使用した。またグルコースは50%濃度を使用してアルカリのポンプと連動により供給し、6日間培養を行った。このようにして最終的には約21gの乾燥菌体を得た。
菌体の一部からカロテノイドを抽出しHPLCにてカロテノイド量を定量し、結果を表8に示した。TSN18E7株は、菌体内にカロテノイドを1.90重量%、アスタキサンチンを1.04重量%蓄積した。
Claims (8)
- カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌N−81106株の育種により得られることを特徴とする、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌。
- 請求項1において、カロテノイドがアスタキサンチンであることを特徴とする細菌。
- 請求項1又は2において、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19416として寄託された菌株TSUG1C11であることを特徴とする細菌。
- 請求項1において、細胞内にカロテノイドを1.8重量%以上蓄積することを特徴とする微生物。
- 請求項1又は2において、細胞内にアスタキサンチンを0.9重量%以上蓄積することを特徴とする微生物。
- 請求項1,2,4,又は5において、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−19746として寄託された菌株TSN18E7であることを特徴とする細菌。
- 請求項1〜6いずれかに記載の細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法。
- 請求項7において、カロテノイドがアスタキサンチンであることを特徴とする方法。
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