WO2007049416A1 - カロテノイド合成微生物の作製方法およびカロテノイドの製造方法 - Google Patents

カロテノイド合成微生物の作製方法およびカロテノイドの製造方法 Download PDF

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WO2007049416A1
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paracoccus
dna
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Teruhiko Ide
Toru Tanaka
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Tosoh Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
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    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/179—Colouring agents, e.g. pigmenting or dyeing agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/40—Colouring or decolouring of foods
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    • A23L5/43—Addition of dyes or pigments, e.g. in combination with optical brighteners using naturally occurring organic dyes or pigments, their artificial duplicates or their derivatives
    • A23L5/44—Addition of dyes or pigments, e.g. in combination with optical brighteners using naturally occurring organic dyes or pigments, their artificial duplicates or their derivatives using carotenoids or xanthophylls
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a carotenoid synthesizing microorganism and a method for producing a carotenoid.
  • the present invention relates to carotenoids useful for coloration of cultured seafood such as Thailand, shrimp and salmon, chicken eggs, etc., and astaxanthin and the like used in foods as colorants and antioxidants.
  • the present invention relates to a DNA chain useful for the synthesis of carotenoids and a method for producing carotenoids such as wastaxanthin using a microorganism into which the DNA chain has been introduced.
  • carotenoids More than 600 different carotenoids have been identified in nature, such as plants and microorganisms. Although industrially useful carotenoids are mainly produced by chemical synthesis methods, there are concerns about the possibility of undesirable effects such as contamination of synthetic auxiliary materials. In addition, consumer preference tends to be suitable for carotenoids derived from natural products. On the other hand, there is a limit to extraction of plant natural power, which is a natural product, and it is difficult to say that an efficient industrial manufacturing method has been established. As a method for producing natural product carotenoids, several fermentation cases have been reported. However, sufficient amounts of carotenoids for production on an economical industrial scale have not been produced.
  • Non-patent Document 1 As a microorganism that produces useful carotenoids, Yokoyama et al. Reported a marine bacterium that was later reclassified as a bacterium belonging to the genus Paracoccus (Non-patent Document 1). . This strain is characterized by synthesizing a high content of axaxanthin, a functional carotenoid. As mentioned above, Paracoccus (Paracoccu) TSN18E7 strain (see JP 2005-58216) force FERM to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center
  • the biosynthetic pathway of carotenoids is composed of various enzyme forces, and many researchers have analyzed the genes encoding them.
  • carotenoids are synthesized by the isoprenoid biosynthetic pathway that is common to steroids and terpenoids starting from mevalonic acid, a basic metabolite.
  • C15 farnesyl pyrophosphate (FPP) generated by the isoprenoid basic biosynthetic system is condensed with C5 isopentayl diphosphate (IPP) to give C20 gera-lugelanyl diphosphate ( GGPP) is synthesized.
  • IPP isopentayl diphosphate
  • GGPP gera-lugelanyl diphosphate
  • the two molecules of GGPP are then condensed to synthesize the first carotenoid, colorless phytoene.
  • Phytoen is converted to lycopene by a series of unsaturated reactions, and this lycopene is converted to ⁇ -carotene by a cyclization reaction.
  • xanthophylls represented by various types of wastaxanthin are synthesized by introducing a hydroxyl group keto group into j8-carotene (Fig. 1).
  • Non-special reference 1 Yokoyama, A., H. Izumida, and W. iki. Procuction of astaxanthin an d 4— ketozeaxanthin by the marine bacterium. Agrobacaterium aurantiacum, Biosci. B iotechnol. Biochem., 58: 1842-1844 (1994 ).
  • Non-Patent Document 2 Norihiko Misawa, YoshikoSatomi, Keiji Kondo, Akihiro Yokoyama, Su sumu Kajiwara, Tochiko Saito, TakeshiOhtani, and Wataru Miki, Structure and lunct ional analysis of a marinebectarial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxant hin biosyntheticpathway proposed at the gene level, J. Bacateriology, 177: 6575-65 84 (1995).
  • Non-Patent Document 3 Eric A. Johnson, and William A. Schroeder, Microbial Carotenoids, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, 53: 119-178 (1995).
  • Non-Patent Document 4 P. C. Lee, and Schmidt- Dannert, Metabolic engineering towards biote chnological production of carotenoids in microorganism, 60: 1-11 (2002).
  • Non-Patent Document 5 Kovach, M. E. et al., GENE166, 175-176 (1995).
  • Non-Patent Document 6 R. Simon, U. Priefer'and A. Puhler, A broad host range mobilization s ystem for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacte ria, BIO / TECHNOLOFY, l: 784-791 (1983) .
  • Non-Patent Document 7 Cedric Y. Szpiper, Michel Faelen, and Martine Couturier, Mobilization lunction of the pBHRlplasmid, a derivative of the broad-host-range plasmid pBBRl, J. Bacteriology, 183: 2101-2110 (2001).
  • Patent Literature 1 Japanese Translation of Special Publication 2004-527265
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3403381
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application No. 2005-106045 Specification
  • An object of the present invention is to produce a microorganism capable of carotenoid production on an industrial production scale.
  • Sarakuko is to produce carotenoids using a new carotenoid production strain and to provide the carotenoids.
  • the present inventors have cloned a carotenoid synthesis gene of Paracoccus sp.
  • gene transfer techniques such as recombination and conjugation transfer into a plasmid vector
  • Paracoccus sp By using gene transfer techniques such as recombination and conjugation transfer into a plasmid vector, Paracoccus sp. Introduce a plasmid vector into which a carotenoid synthesis gene is inserted into a wild-type strain or a mutant strain or carotenoid synthesis tolerance strain whose carotenoid synthesis ability has been improved by mutation treatment, and express the carotenoid synthase encoded by the carotenoid synthesis gene And found that it improves the amount of rotenoid synthesis.
  • the present inventors have (a) a DNA chain (crtW) encoding a polypeptide having an enzymatic activity that converts the 4-position methylene group of the ⁇ -ionone ring into a keto group, (b) 4— Ketho DNA strand (crtZ) encoding a polypeptide with enzymatic activity that adds a hydroxyl group to the 3-position of the ⁇ -ionone ring and the 3-position of the ⁇ or ⁇ -ionone ring.
  • crtW DNA chain
  • crtZ 4— Ketho DNA strand
  • 8-Carote A DNA strand (crtY) that encodes a polypeptide having an enzymatic activity that converts it into a lycopene; (d) a DNA strand that encodes a polypeptide having an enzymatic activity that converts a phenyen into lycopene (crtl); A DNA strand (crtB) encoding a polypeptide having activity, (f) a DNA strand (crtE) encoding a polypeptide having a geranylgeral diphosphate synthase activity, a DNA strand selected from the group consisting of: Paracoccus sp.
  • polypeptide having carotenoid synthesis activity is the following polypeptide (i) or (ii):
  • the present invention also provides the following carotenoid production methods (3) to (4).
  • polypeptide having carotenoid synthesis activity is the following polypeptide (i) or (ii): (1) The method for producing carotenoids.
  • polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7 (ii) substantially in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7 A polypeptide having a homologous amino acid sequence.
  • the present invention also provides a DNA strand selected from the group (a), (b), (c), (d), (e), and (f), or the DNA strand inserted therein.
  • the present invention relates to a transformation method for introducing the prepared plasmid vector into a carotenoid-producing microorganism such as Paracoccus sp. Furthermore, the present invention is not affected by cell proliferation by introducing a plasmid vector, so that plasmid replication occurs in the cell and / or carotenoids produced by the carotenoid synthesis gene encoded by the plasmid.
  • the present invention relates to a microorganism in which carotenoid production is improved by introducing a plasmid into a cell.
  • a DNA strand that significantly improves the production amount thereof, and the introduction of the DNA strand into a carotenoid-producing microorganism to allow expression thereof, thereby allowing the carotenoid of the microorganism to be expressed.
  • a method is provided that can increase production several times.
  • FIG. 1 is a diagram showing a carotenoid biosynthesis pathway.
  • FIG. 2 is a diagram showing a carotenoid synthesis gene.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of a pUCCRT plasmid vector.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structures of pBBRlMCS2CRT and pBBRlMCS2CRTrv plasmid vectors.
  • FIG. 5 shows the structures of pBBRlMCS2CRTWZ and pBBRlMCS2CRTWZrv plasmid vectors.
  • FIG. 6 shows the structures of plasmid vectors pBBRlMCS2PcrtElcrtE and pBBRlMCS2PcrtE2crtE.
  • FIG. 7 shows the structure of the pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT plasmid vector.
  • FIG. 8 Bacteria recombined with pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT plasmid vector It is a figure which shows the effect of a carotenoid synthesis amount increase.
  • carotenoid biosynthesis gene such as a carotenoid-producing bacterium such as the marine bacterium Paracoccus sp. It produces useful carotenoids such as staxanthin, zeaxanthin, ⁇ -carotene and lycopene.
  • a carotenoid biosynthesis gene such as a carotenoid-producing bacterium such as the marine bacterium Paracoccus sp. It produces useful carotenoids such as staxanthin, zeaxanthin, ⁇ -carotene and lycopene.
  • A a DNA strand (crtW) that encodes a polypeptide having an enzymatic activity that converts the 4-position methylene group of the ⁇ -ionone ring into a keto group according to the present invention;
  • C Converts lycopene to
  • carotenoids particularly austaxanthin
  • austaxanthin which is one of the objects of the present invention in mind
  • the subsequent metabolic reaction does not proceed with the upstream gene alone and metabolism of ⁇ -carotene and the like. Intermediates accumulate and sufficient production cannot be obtained. That is, lycopene, j8-carotene, echenenone, -cryptoxanthin, 3'- It is important to increase the amount of wastaxanthin in the total amount of rotenoids such as drokishkinenone, zeaxanthin, 3-hydroxyecynenone, canthaxanthin, phenicoxanthine, 4-ketozeaxanthin and wastaxanthin.
  • the present inventors have made the above-mentioned (a), (b), (c), (d) It was found that by introducing a DNA strand selected from the group of (e) and (f), a sufficient amount of wastaxanthin without metabolic intermediate accumulation was synthesized in the expressed cells. Furthermore, the present inventors considered that introduction of the DNA strand of (f) is effective in increasing carotenoids.
  • geranyl gela is introduced by introducing a DNA chain that encodes gera-lugeranyl diphosphate synthase, which is considered to be an upstream synthase in the metabolic concept, in the same way as the increase in the expression level by the introduction of IPP isomerase.
  • the combination of (a) and (b) can be used, the oxidation reaction of ⁇ -carotene proceeds selectively, and efficient selective synthesis to istaxanthin is possible. Furthermore, in order to increase the amount of wastaxanthin produced, it can be achieved by a combination of (d), (e) and (f).
  • the combination of DNA strands may use each DNA strand independently. Forces may be connected in series by genetic engineering. The number of combinations to be connected may be such that the desired function is maximized in the combination. Use DNA strands independently If the
  • plasmid vector a suitable plasmid vector that functions in the host cell into which it is introduced may be used alone, or a plurality of plasmid vectors may be used as long as they are not limited in compatibility.
  • carotenoid includes Huiten, lycopene, 13-carotene, zeaxanthin, canthaxanthin, austaxanthin, adonixanthin, cryptoxanthin, equinenone, adrubin, and combinations thereof It is a combination. Preferably, it is xanthaxanthin.
  • the present invention has the property of increasing the production of carotenoids, particularly austaxanthin, and the amino acid sequence substantially converts the 4-position methylene group of the ⁇ -ionone ring to a keto group.
  • Encoding DNA strand (crtE) A DNA strand selected from the group consisting of a group, and introducing this DNA strand into a carotenoid-producing microorganism and culturing the transformed microorganism in a medium to increase the carotenoid content of the culture
  • the present invention provides a method for producing carotenoids.
  • Another embodiment of the present invention is a method for producing a carotenoid producing cell. This method involves introducing into the cell a DNA strand that encodes a series of carotenoid synthesis enzymes expressed in the cell, and the production level of the carotenoid produced by the cell prior to DNA strand introduction is about 1.1 to 1 This is a method of creating and selecting cells that produce carotenoids at a magnification of 1,000.
  • the DNA strand according to the present invention is the DNA strand described in (a), (b), (c), (d), (e), (f), Or a DNA strand that hybridizes under stringent conditions with them.
  • Neutralizing under stringent conditions means the ability of a probe to hybridize to its target sequence, typically in a complex mixture of nucleic acids, but not to other nucleic acids.
  • Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences specifically hybridize at higher temperatures.
  • highly stringent conditions are selected to be about 5-10 ° C. lower than the thermal melting temperature of the specific sequence at a defined ionic strength and pH.
  • Low stringency conditions are generally selected to be about 15-30 ° C below the melting temperature.
  • the melting temperature is the temperature at which 50% of the probe complementary to the target nucleic acid at a defined ionic strength, pH, nucleic acid sequence is occupied in equilibrium.
  • Nucleic acids that do not hybridize to each other under stringent conditions are substantially identical if the polypeptides they encode are substantially identical. This occurs, for example, when a copy of a nucleic acid is created using the maximum codon degeneracy permitted by the genetic code. In such cases, the nucleic acid is typically hybridized under moderately stringent neutralization conditions.
  • Substantially identical refers to the maximum correspondence in two comparison nucleic acids or polypeptides, measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual testing. By aligned, it means a sequence or subsequence that has at least 60%, preferably 80%, more preferably more than 90% nucleotide or amino acid residue identity. This definition also refers to a sequence in which the complement of that sequence hybridizes to the test sequence.
  • sequence comparison typically one sequence acts as a reference sequence, to which test sequences are compared.
  • a sequence comparison algorithm enter the test sequence and the reference sequence into the computer, specify the partial coordinates if necessary, and specify the parameters for the sequence algorithm program. You can use the program default values or specify alternative parameters. The ratio of the sequence identity of the test sequence to the reference sequence is then calculated based on the parameters of the sequence comparison algorithm power program.
  • Methods for sequence alignment for comparison are known in the art. For comparison The optimal sequence for this is, for example, the local homology algorithm of Smith and Watreman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981), Needleman and Wunsch, J.
  • PILEUP uses a continuous pairwise alignment to create multiple sequences of related sequence group powers, showing the relationship and percent sequence identity. P ILEUP also plots a tree or dendogram showing the cluster relationships used to create the alignment. Another example of a suitable algorithm for determining percent sequence identity and sequence similarity is the BLAST algorithm (Altschul et al., J.
  • This algorithm has a fixed word length: 3 for proteins and 11 for nucleic acids (3 when the sequence is translated in all six reading frames). This length is the minimum that can give a high word score to a sufficiently significant one and is not long enough to miss a short and significant pattern.
  • the BLAST algorithm also performs statistical analysis on the similarity of two sequences.
  • the polypeptide encoded by the DNA strand according to the present invention has a sequence in which the amino acid sequence is substantially selected from the group forces of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6 and 7.
  • the polypeptides encoded by these DNA strands may have deletions, substitutions, additions and the like for some of the amino acids as long as they have carotenoid increasing activity as described above. This corresponds to the fact that “the amino acid sequence substantially has a sequence selected from the group of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6 and 7.”
  • a polypeptide in which the first amino acid (Met) of these enzymes is deleted is also included in the polypeptide or enzyme due to this amino acid sequence change.
  • each polypeptide has the same nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, and 7, but is different only for degenerate codons. Including degenerate isomers encoding the polypeptide.
  • One of the methods for obtaining a DNA strand having a base sequence encoding the amino acid sequence of the aforementioned protein is to synthesize at least part of its length according to the method of nucleic acid synthesis.
  • genomic DNA such as Paracoccus sp. Is prepared rather than chemical synthesis and treated with an appropriate restriction enzyme such as Sau3A I. It is preferable to fragment into random fragments, prepare a library of coliforms by the cosmid method, and use the hybridase method with an appropriate probe.
  • PCR primers can be prepared, the prepared genomic DNA can be used as a saddle and the desired DNA strand can be amplified by PCR.
  • the DNA strand may be used as it is for transformation into an appropriate cell, but it can also be used by inserting it into a plasmid vector. Insertion into a plasmid vector can be done by genetic engineering at an appropriate position of the plasmid vector. The appropriate position should not destroy the replication function of the plasmid vector, the desired antibiotic marker, or the region involved in transmissibility.
  • the above-mentioned DNA strand may be inserted as it is by genetic engineering, or a DNA strand having a promoter function may be added.
  • a promoter refers to a DNA sequence capable of controlling the expression of a protein coding region or functional RNA, and examples thereof include a lac promoter and a trc promoter that function in E. coli.
  • a DNA strand is expressed in marine bacteria, there is no limitation as long as it is a DNA strand containing a promoter sequence that functions in cells.
  • a promoter derived from marine bacteria is preferred.
  • the gene encoding the inserted carotenoid synthase can be expressed preferably by using the promoter of SEQ ID NO: 19, 20, or 21.
  • a part of the polynucleotide of SEQ ID NO: 19, 20 or 21 may be used. Partial regions can be identified by comparing known promoter sequences.
  • bases may be inserted or substituted into these sequences.
  • a polynucleotide having improved promoter activity by randomly introducing mutations may be used.
  • coding regions such as enzyme proteins are located 3 'to the promoter sequence.
  • a commercial plasmid vector has a promoter sequence introduced in advance, and can be used as long as the promoter functions in marine bacteria. Further, the direction in which the DNA strand is inserted may be any direction in which the DNA strand to be inserted functions.
  • plasmid vector it exists stably in the cell to be transformed and can replicate. Any characteristic can be used. Examples of plasmid vectors include pUC systems, pBR systems, etc., used for transformation of E. coli, and shuttle vectors with plasmid vectors that can replicate in target cells. Details are described in the book (Barbara E. Funnell, PLASMID BI OLOGY, ASM press). In particular, plasmid vectors that are replicated for Paracoccus sp. In the present invention are known. Thus, if there is no established host vector system, a broad-host-range plasmid vector can be used. The vectors include RK2, R751, RSF1010, R1162, pCUl, R46, pSA, R388, RA1 (Barbara
  • E. Funnell, PLASMID BIOLOGY, ASM press can be used as a shuttle vector by inserting it into an appropriate plasmid vector using the replication region of the broad host range vector.
  • a shuttle vector that can use E. coli can be exemplified by inserting the replication region of Kuta into RK2 'at an appropriate position of the pUC vector.
  • pBBR-type plasmids that can replicate in a wide range of hosts and have a relatively small DNA size can be mentioned.
  • pBBR plasmids examples include pBBR122, pBBRlMCS, pBBRlMCS2, pBB R1MCS3, pBBRlMCS4, and pBBRlMCS5 (Non-patent Document 5). These plasmid vectors have different antibiotic markers and the like, and can be selected appropriately after evaluating the antibiotic resistance of the cells to be transformed. Furthermore, a plasmid possessed by a cell to be transformed may be used.
  • the carotenoid content can be increased by introducing the above-described DNA strand of the present invention or a DNA strand inserted into an appropriate plasmid vector into an appropriate carotenoid-producing microorganism.
  • the following expression vectors are included. That is, pBB R1MCS2CRT, pBBRlMCS2CRTrv, pBBRlMCS2CRTWZ, pBBRlMCS2CRTWZrv, pBBRlMCS2PcrtElcrtE, pBBRlMCS2PcrtE2crtE, pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT, and their combination. These vectors are defined by the examples below.
  • Suitable host cells are biological hosts that can be found extensively within the fungus or bacterial family and that grow in a wide range of temperatures, pH, and solvent tolerances.
  • any of bacteria, yeast, and filamentous fungi is a suitable host for expression of the DNA strand of the present invention.
  • Cell supply Because the DNA strand transcription, translation, and protein biosynthesis mechanisms are the same regardless of the material, the functional gene is expressed regardless of the carbon feedstock used to culture the culture. Large-scale microbial cultures and functional gene expression are available for a wide range of simple or complex carbohydrates, organic acids and alcohols, saturated hydrocarbons such as methane, or photosynthesis or chemical synthesis autotrophic hosts utilize diacid carbon can do.
  • functional genes can be regulated, suppressed or reduced by specific culture conditions that can include any micronutrient form and amount including nitrogen, phosphorus, sulfur, oxygen, carbon or minerals.
  • the regulation of functional genes can be achieved by certain regulators that are added to the culture medium and are not typically considered nutrient or energy sources.
  • hosts include Aspergillus, Trichoderma ( Trichoderma, Pichia, Candida, Hansenula, Saccharomyces, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Zymomonas (Agrob acterium), Erythrobacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus (Rhococcus) Streptomyces, Brevibacterium, Coryne Corynebacteria, Mycobacterium, Dinococcus, Escherichia, Enwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Sphingomonas (Methylomonas), Methylobacter, Methyloco ecus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenesis, Synechosis And microbial species such as Synechococcus
  • bacteria belonging to the genus Paracoccus which are 16S r If the DNA sequence encoding RNA is used as an index, those skilled in the art can easily identify it. More preferably, the production of carotenoid is Paracoccus sp. MBIC1143 strain. Paracoccus sp. MBIC1143 strain 16S
  • SEQ ID NO: 24 shows the nucleotide sequence of the DNA strand encoding 16S rRNA of Paracoccus sp. MBIC1143 strain. More preferred are TSN18E7 strain (see JP-A-2005-58216) and TSTT001 strain (see Japanese Patent Application No. 2005-314667) which are mutant strains derived from Paracoccus sp. MBIC1143 strain. In particular, it is a mutagenized strain that is not regulated by various metabolic systems involved in cell proliferation due to intracellular accumulation of carotenoids.
  • mutant strain whose regulation is released by mutation treatment or the like.
  • “Deregulation” is to disrupt the regulatory mechanism in the cell.
  • Mutation treatment may be carried out using a mutation treatment agent known to those skilled in the art, such as -trosoguanidine, ethylmethanesulfonic acid, ultraviolet ray, and radiation.
  • a strain that has been deregulated may be spontaneously mutated.
  • the mutant strain after mutation treatment and the spontaneous mutant strain may be separated and obtained using a selective medium using a metabolic analog of carotenoids.
  • Metabolic analogs refer to substances that are similar in chemical structure to carotenoids or exhibit physiological responses similar to carotenoids in various reaction systems in cells. Examples of metabolic analogs include j8 -ionone and ⁇ -yonone.
  • an E. coli conjugation transfer method can be mentioned as a method for introducing a gene under mild conditions.
  • the conjugation transfer method is a method in which a plasmid is introduced into a donor bacterium-receptor by conjugation between bacteria, and has the advantage that the recipient receives less damage.
  • the plasmid By coculturing with a recipient bacterium as a fungus, the plasmid can be introduced from the donor bacterium into the recipient bacterium by the action of tra (Non-patent Document 6). Furthermore, when a plasmid vector having a mob gene (Non-patent Document 7) (eg, pBBRlMCS described above) is used, the plasmid can be efficiently introduced into the recipient bacteria.
  • the three-parent transfer method is a method in which Escherichia coli holding a helper plasmid (eg, RK2) is mixed with Escherichia coli holding an appropriate plasmid vector and a bacterium to which the gene is introduced.
  • the cells are mixed on a membrane disk in a medium such as a buffer solution at a constant temperature, and then incubated on a filter for a certain period of time! .
  • a medium such as a buffer solution at a constant temperature
  • the temperature is usually 20 to 30 ° C, preferably 25 ° C.
  • the incubation time is generally several hours to several days.
  • the mixing ratio between E. coli and the bacteria to which the gene is introduced is not particularly limited. This is because if Escherichia coli and yeast to be conjugated are present, zygotes can be obtained even in trace amounts, and can be proliferated if they are separated and cultured.
  • the ratio of E. coli to the bacterium into which the gene is introduced may be 1: 1 or 0.1: 1.
  • the characteristics of the junction transmitter based on the transmission are used to distinguish it from other cells. Can be separated.
  • the antibiotic resistance inserted into the used plasmid vector can be used for isolation by growing only the conjugation transmitter carrying the plasmid vector. Both of these methods are well known to those skilled in the art.
  • the conjugation transmitter can be efficiently selected.
  • Antibiotics include carbenicillin, ampicillin, cefazolin, piperacillin, fosfomycin, gentamicin, streptomycin, neomycin , Amikacin, Tetracyclin, Erythromycin, Lincomycin, Rifampicin, Nalidixic acid
  • conjugate transmitter can be confirmed by plasmid extraction, PCR, etc. after culturing in an appropriate culture medium.
  • various carotenoids can be accumulated in the cells.
  • carotenoid-accumulating microorganisms are collected from the culture solution and extracted with an appropriate organic solvent.
  • the organic solvent is preferably methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, dichloromethane, chloroform, dimethylformamide, dimethylsulfoxide or the like. Acetone is preferred.
  • it can be separated with high purity using liquid chromatography or the like. Separation principles of liquid chromatography include ion exchange, hydrophobic interaction, molecular sieving, and the like. Reverse phase chromatography and normal phase chromatography are preferred.
  • Paracoccus bacterium MBIC1143 strain in OEG medium (2 g / L trypticase peptone, 1 g / L yeast extract, 8.8 g / L NaCl, 0.73 g / L magnesium sulfate heptahydrate, 3.6 g / L dipotassium phosphate 'anhydrous, 1.4 g / L monopotassium phosphate, 1
  • the Paracoccus genus MBIC1143 strain was acquired by Marine Biotechnology Research Institute.
  • Genomic DNA is a Gentra kit (Puregen Genomic
  • PCR primers (SEQ ID NO: 13: 5′-gcggatccggcgaccttgcggcgctg-3 ′ and SEQ ID NO: 14: 5, -cgggatcctgtcgcggtccctgggg-3,) were prepared with reference to Non-Patent Document 2. PCR is prepared DNA
  • PCR product was treated with phenol chloroform, 0.9% agarose electrophoresis was performed, and the target product (about 5.4 kbase) was extracted and purified (QIAgen Gel Extraction Kit manufactured by Qiagen).
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 8. Purified DNA (introduced restriction enzyme BamHI site with PCR primer) was treated with restriction enzyme BamHI, and purified by phenol chromatography and ethanol precipitation.
  • the plasmid vector pUCCRT was treated with the restriction enzyme BamHI to obtain a carotenoid synthesis gene fragment (about 5.4 kbase). Next, this fragment was inserted into the BamHI site of the broad host range vector pBBRlMCS2.
  • the gene was introduced into E. coli strain JM109 by the heat shock method, and transformation was carried out on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin. Arbitrary transformants that acquired kanamycin resistance were cultured in LB medium (37 ° C, 18 hours), and plasmid extraction was performed using a plasmid extraction kit (manufactured by Qiagen).
  • Each vector of PBBR1MCS2CRT and pBBRIM CS2CRTrv in which the carotenoid synthesis gene fragment was cloned was introduced into E. coli strain S17-1 by the heat shock method.
  • Transformation was performed on LB agar medium containing ⁇ g / ml kanamycin and 10 ⁇ g / ml streptomycin. Cultivate any transformant that has acquired kanamycin resistance in the same LB medium (37 ° C, 18 hours), and perform plasmid extraction using a plasmid extraction kit (Qiagen) to check whether the plasmid has been introduced. did.
  • the cells were cultured in an LB medium containing g / ml kanamycin and 10 g / ml streptomycin (37 ° C.) to obtain a culture solution containing cells in the logarithmic growth phase.
  • Turbidity (OD660) was measured and diluted with the same medium to 0.1.
  • Paracoccus bacteria were also cultured (25 ° C.) in the OEG medium of Example 1 to obtain a culture solution containing cells in the logarithmic growth phase.
  • the turbidity was measured and diluted with OEG medium so as to be 1.0. 1.0 each of these solutions
  • the solution in the syringe was collected on a membrane attached to a membrane holder (manufactured by Advantech). After collection, the membrane was removed from the holder, and placed on the OEG agar medium (the cell side facing upward), and cultured for conjugation transfer (25 ° C, 4 hours). After incubation, men
  • Plene was placed in 1.0 ml of OEG medium and vigorously stirred to separate the conjugation transfer completed body from the membrane filter. Dilute this solution to an appropriate concentration in OEG medium and add 50
  • Paracoccus bacteria carrying plasmids pBBRlMCS2CRT and pBBRlMCS2CRTrv were cultured in OEG medium containing 100 g / ml kanamycin (25 ° C.). Incubation was performed in a rotary shaker at 120 rpm with 60 ml of medium in a 100 ml baffled Erlenmeyer flask.
  • ODS-80 (manufactured by Tosoh Corporation) was used, and measurement was performed at a flow rate of 1.0 ml / min and a detection wavelength of 470 nm.
  • a standard curve was prepared using standard wastaxanthin (manufactured by Sigma), and the amount of produced staxanthin during culture was calculated.
  • a strain containing only the PBBR1MCS2 vector into which the carotenoid synthesis gene was not inserted was also prepared. As shown in Table 1, the amount of wastaxanthin produced by Paracoccus bacteria carrying the gene was significantly increased.
  • MBIC1143 a wild strain of the genus Paracoccus, was subjected to mutation treatment, and the gene was transferred by conjugation transfer to the TSN 18E7 strain with increased astaxanthin synthesis. As a result, as was the case with MBIC1143, astaxanthin production was significantly increased (Table 1).
  • the transgenic strain TSN18E7 into which the gene has been introduced is remarkable at 72 hours in culture.
  • the fact that astaxanthin, the final product of carotenoid synthesis, was synthesized in a short time indicates the effect of a plasmid vector prepared by inserting a carotenoid synthesis gene.
  • the Paracoccus bacterium TSN18E7 strain has been transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center.
  • Example 4 when the carotenoid synthesis gene fragment was inserted into the PBBR1MCS2 vector and homologous expression was attempted in bacteria of the genus Noracoccus, the production of astaxanthin, a kind of carotenoid, was significantly increased. Furthermore, the activity could be confirmed regardless of the direction of insertion into the vector. In other words, it means that the carotenoid synthesis gene was expressed without using the function of the lac promoter inserted in the PBBR1MCS2 vector. Therefore, a sequence in the upstream transcription direction of the amplified carotenoid synthesis gene (1 to 450 described in SEQ ID NO: 1).
  • Promoter analysis was performed.
  • commercially available software GENETYX manufactured by GENETYX
  • GENETYX manufactured by GENETYX
  • a sequence functioning as a promoter was found upstream of the crtW gene in the amplified DNA (Table 2).
  • CrtW remains from No. 1 described in SEQ ID NO: 19. It can be presumed that the base sequence up to the immediate vicinity of the gene is a base sequence having promoter activity in Paracoccus sp.
  • the promoter score in the table is a numerical value calculated by GENETYX software. The higher the value, the higher the promoter score.
  • PCR is SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15 ('5-cgggatccgcaggg cgatcagcccgttggcaagg
  • Figure 5 shows each structure.
  • PBBR1MCS2CRTWZ and pBBRlMCS2CRTWZrv were introduced into E. coli S17-1 strain in the same manner as in Example 3, and a mutant of Paracoccus sp. Was transformed by conjugation transfer. After 3 days of culture, carotenoids were quantified by HPLC. Table 3 shows the results. In the table, Ax represents wastaxanthin and TC represents total rotenoid.
  • Example 2 a genomic DNA of Paracoccus sp. was prepared. Subsequently, the geranyl gel diphosphate synthase gene (crtE) region was amplified by PCR. Since the promoter region considered to be in the upstream region of the crtE gene is unknown, two sets of PCR primers with different hybridizing regions were designed and used with reference to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 16 (5 '-ctagtctagatgcttgacaatccgggtgacgcgg- ⁇ ) and self sequence number 1 1 (5 -tgggagctcatcacgcctaggc gcgcgcggcgtag-3,), and the other is a combination of SEQ ID NO: 18 (5, -ctagtctagagccggtc cactgaccttgttggac-3 ′) and SEQ ID NO: 17.
  • the area to be amplified is about 1.2 for the former
  • PCR is a template.
  • PcrtE2 was prepared using the primers described in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, and then the plasmid vector PBBR1MCS2 into which the insert is inserted is a restriction enzyme B tsl
  • Escherichia coli JM109 was transformed with an LB agar medium containing ⁇ g / ml kanamycin to obtain a vector into which a double strand had been inserted. This was designated as pBBRlMCS2oligo. [0061] Next, pBBRlMCS2oligo was digested with restriction enzymes Sad and Xbal to align the insert insertion ends. Ligation each and 50
  • E. coli JM109 was transformed with an LB agar medium containing IX g / ml kanamycin. Pick up any colony, culture, and prepare plasmid
  • the product was manufactured and confirmed by electrophoresis to be a construct as designed.
  • the insert was long and the region construct was pBBRlMCS2PcrtElcrtE, and the short insert and region construct was pBBRlMCS2PcrtE2crtE.
  • Figure 6 shows each structure.
  • pBBRlMCS2PcrtElcrtE and pBBRlMCS2PcrtE2crtE were introduced in the same manner as in Example 3, and a mutant of Paracoccus sp. was transformed by conjugation transfer. Carotenoids were quantified after culturing for 5 days in the same manner as in Example 4. Table 4 shows the results.
  • the base was found to be a DNA strand having a promoter function.
  • the respective nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.
  • the mixture was smoothed with a Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), purified by phenol chloroform extraction and ethanol precipitation. Next, the restriction enzyme BamH prepared in Example 2 was used.
  • the carotenoid synthesis gene fragment digested with I was purified by blunting, phenol chloroform extraction, and ethanol precipitation. These were ligated, and E. coli JM109 was transformed with an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin. Arbitrary colonies were picked up, and after culture, plasmid preparation was performed, and it was confirmed by electrophoresis that the construct was as designed.
  • the base sequence of the prepared charged fragment is shown in SEQ ID NO: 12. This construct was designated pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT. Figure 7 shows the structure.
  • the function of a gene or a gene group that increases the amount of carotenoid production was clarified, and a natural microorganism having a carotenoid production ability was successfully improved. Therefore, by using the microorganism improved by the present invention, the productivity of carotenoid useful as feed or food can be greatly improved.

Description

明 細 書
カロテノイド合成微生物の作製方法およびカロテノイドの製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、カロテノイド合成微生物の作製方法およびカロテノイドの製造方法に関 するものである。
背景技術
[0002] 本発明は、タイ、ェビ、サケ等の養殖魚介類、鶏卵等の色揚げに有用であるカロテ ノイド、また、着色料ゃ抗酸化剤として食品に利用されるァスタキサンチン等のカロテ ノイドの合成に有用な DNA鎖、および、この DNA鎖を導入した微生物を利用したァス タキサンチン等のカロテノイドの製造法に関するものである。
[0003] 自然界においては植物、微生物等力 600以上の異なるカロテノイドが同定されて きた。産業上有用なカロテノイドは主に化学合成法によって製造されているが、化学 合成法では合成副原料の混入等好ましくない作用の可能性が危惧されている。また 、消費者の嗜好は天然物由来のカロテノイドに向く傾向がある。一方で、天然物であ る植物等力 の抽出には限界があり、必ずしも、効率的な工業製造法を確立している とはいい難い。天然物カロテノイドの製造法として、微生物による発酵法力^、くつかの 事例が報告されているが経済的工業規模の製造に十分な量のカロテノイドを生産し ていない。カロテノイドに限らず、一般に、微生物による機能性物質の生産を試みる 場合、広範なスクリーニングを経て発酵主体となる微生物を選定する。その後、多く の場合、カロテノイドを産生する野生の微生物では産生量が少ないため、古典的な 化学処理剤による変異育種を経て高生産株を分離し、製造研究等が行われる。
[0004] 有用カロテノイドを産生する微生物として、横山らによってァグロバタテリゥム属（後 に、パラコッカス (Paracoccus)属に属する細菌として再分類された)海洋細菌が報告 された (非特許文献 1)。同株は機能性カロテノイドであるァスタキサンチンを高含量 で合成することが特徴である。上述した様に、変異処理によりパラコッカス (Paracoccu 上した TSN18E7株 (特開 2005— 58216号公報参照）力 独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センターに FERM
P- 19746号として寄託されている。
[0005] カロテノイドの生合成経路は様々な酵素力 構成され、多くの研究者により、それら をコードする遺伝子が解析されてきた。代表的な経路を例示すると、カロテノイドは基 本代謝物であるメバロン酸を出発物質として、ステロイドやテルぺノイドと途中まで共 通なイソプレノイド生合成経路によって合成される。イソプレノイド基本生合成系によ つて生じた炭素数 C15のフアルネシルピロリン酸 (FPP)は、 C5のイソペンテ-ル 2リン 酸 (IPP)と縮合することにより、 C20のゲラ -ルゲラニル 2リン酸 (GGPP)が合成される 。次に、 2分子の GGPPが縮合して、最初のカロテノイドである無色のフイトェン (phyto ene)が合成される。フイトェンは、一連の不飽和反応により、リコペン (lycopene)に変 換され、さらに、このリコペンは環化反応により β -カロテン（β -carotene)に変換され る。次いで、 j8 -カロテンに水酸基ゃケト基が導入され種々のァスタキサンチンに代 表されるキサントフィルが合成されると考えられて ヽる（図 1)。
[0006] このような遺伝子レベルでの知見が得られたことから、遺伝子組換え技術を利用し てカロテノイド合成の向上を企図した研究例がある。例えば、 Chia-wei Wang et al., B iotechnol. Prog., 16: 922-926(2000); Claudia
Schmidt- Dannert et al., Nat. Biotechnol., 18: 750-753(2000); Daisuke Umeno et al., Appl. Environ. Microbiol, 69: 3573-3579(2003)である。これらの研究は宿主に力 ロテノイドを合成しない大腸菌を利用しており、カロテノイドの生産が低く工業生産に 利用することは困難であると考えられる。他方で、カロテノイドを産生する細菌にカロ テノイド遺伝子を導入することにより、力ロテノイド合成量の向上に成功したと 、う報告 がある（特許文献 1)。しカゝしながら、依然として、作製された遺伝子組換え株のカロテ ノイド合成量は低く工業生産に利用することは困難と考えられる。
非特干文献 1： Yokoyama, A., H.Izumida, and W. iki.Procuction of astaxanthin an d 4— ketozeaxanthin by the marine bacterium.Agrobacaterium aurantiacum, Biosci. B iotechnol. Biochem., 58: 1842-1844(1994).
非特許文献 2 : Norihiko Misawa, YoshikoSatomi, Keiji Kondo, Akihiro Yokoyama, Su sumu Kajiwara, Tochiko Saito, TakeshiOhtani, and Wataru Miki, Structure and lunct ional analysis of a marinebectarial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxant hin biosyntheticpathway proposed at the gene level, J. Bacateriology, 177: 6575—65 84(1995).
非特許文献 3 : Eric A. Johnson, andWilliam A. Schroeder, Microbial Carotenoids, Ad vances in BiochemicalEngineering Biotechnology, 53: 119-178(1995).
非特許文献 4 : P. C. Lee, andSchmidt- Dannert, Metabolic engineering towards biote chnological production ofcarotenoids in microorganism, 60: 1-11(2002).
非特許文献 5 : Kovach, M. E. et al.,GENE166, 175-176(1995).
非特許文献 6 : R. Simon, U. Priefer'and A. Puhler, A broad host range mobilization s ystem for in vivo geneticengineering: transposon mutagenesis in gram negative bacte ria, BIO/TECHNOLOFY,l: 784-791(1983).
非特許文献 7： Cedric Y. Szpiper, Michel Faelen, and Martine Couturier, Mobilization lunction of the pBHRlplasmid, a derivative of the broad-host-range plasmid pBBRl , J. Bacteriology, 183: 2101—2110(2001).
特許文献 1：特表 2004-527265号公報
特許文献 2：特許第 3403381号公報
特許文献 3：特願 2005-106045号明細書
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は工業生産規模においてカロテノイド生産を行うことができる微生物 を作製することである。さら〖こは、新規カロテノイド生産株を利用してカロテノイド生産 を行い、該カロテノイド類を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、カロテノイド合 成細菌であるパラコッカス（Paracoccus) sp. MBICl 143株のカロテノイド合成遺伝子を クロー-ングし、適当なプラスミドベクターに組換え、接合伝達等の遺伝子導入技術 により、ノ ラコッカス (Paracoccus) sp. 野生株、あるいは変異処理によりカロテノイド合成能が向上した変異株若しくはカロ テノイド合成寛容株に、カロテノイド合成遺伝子が挿入されたプラスミドベクターを導 入し、カロテノイド合成遺伝子にコードされているカロテノイド合成酵素を発現させ、力 ロテノイド合成量を向上させることを見出した。
[0009] すなわち、本発明者らは、 (a) β -ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に変換する 酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtW)、 （b) 4—ケトー βーィオノ ン環の 3位および Ζまたは βーィオノン環の 3位の炭素に一つの水酸基を付加する 酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtZ)、 （c)リコペンを |8—カロテ ンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtY)、 (d)フイトェ ンをリコペンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtl)、 (e )プレフイトェン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtB)、 (f)ゲ ラニルゲラ-ル 2リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtE )力 なる群より選択される DNA鎖を、パラコッカス（Paracoccus) sp.
MBIC1143株に導入すると、ァスタキサンチン等のカロテノイド含量が飛躍的に増量 することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] (1)上記 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)の群力も選択される DNA鎖をパラコッカス (P aracoccus) sp.等のカロテノイド産生微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培 養することを特徴とする、カロテノイドの生成増大方法。
(2)カロテノイド合成活性を有するポリペプチドが以下の（i)または (ii)のポリペプチド である（1)のカロテノイド生成増大方法。
(i)配列番号 2、 3、 4、 5、 6又は 7に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド。（ii)配 列番号 2、 3、 4、 5、 6又は 7に示したアミノ酸配列において実質的に相同なアミノ酸 配列を有するポリペプチド。
[0011] 本発明はまた、下記（3)から (4)のカロテノイド製造方法。
(3)上記 (a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 （f)の群力も選択される DNA鎖をパラコッカス (Pa racoccus) sp.等のカロテノイド産生微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培 養することを特徴とする、カロテノイドの製造方法。
(4)カロテノイド合成活性を有するポリペプチドが以下の（i)または (ii)のポリペプチド である（1)のカロテノイド製造方法。
(i)配列番号 2、 3、 4、 5、 6又は 7に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド (ii)配列 番号 2、 3、 4、 5、 6又は 7に示したアミノ酸配列において実質的に相同なアミノ酸配 列を有するポリペプチド。
[0012] 本発明はまた、上記 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)の群から選択される DNA鎖、若 しくは、該 DNA鎖が挿入されたプラスミドベクターをパラコッカス（Paracoccus) sp.等の カロテノイド産生微生物に導入する形質転換方法に関するものである。さらに、本発 明はプラスミドベクターを導入することにより、細胞内で起こるプラスミドの複製、かつ/ あるいは、プラスミドにコードされるカロテノイド合成遺伝子により生産されるカロテノィ ド類により、細胞増殖の影響を受けない細胞にプラスミドを導入することにより、カロテ ノイド生産が向上する微生物に関するものである。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、微生物によるカロテノイドの生合成において、その生産量を有意 に向上させる DNA鎖、ならびに該 DNA鎖をカロテノイド生産微生物に導入し、発現さ せることにより、その微生物のカロテノイド生産量を数倍上げることができる方法が提 供される。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]カロテノイド生合成経路を示す図である。
[図 2]カロテノイド合成遺伝子を示す図である。
[図 3]pUCCRTプラスミドベクターの構造を示す図である。
[図 4]pBBRlMCS2CRTおよび pBBRlMCS2CRTrvプラスミドベクターの構造を 示す図である。
[図 5]pBBRlMCS2CRTWZおよび pBBRlMCS2CRTWZrvプラスミドベクターの 構造を示す図である。
[図 6]pBBRlMCS2PcrtElcrtEおよび pBBRlMCS2PcrtE2crtEプラスミドべク ターの構造を示す図である。
[図 7]pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTプラスミドベクターの構造を示す図である。
[図 8]pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTプラスミドベクターにより組換えられた細菌の カロテノイド合成量増大の効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0016] 「従来の技術」の項で詳しく述べたように、海洋細菌パラコッカス（Paracoccus) sp.等 のカロテノイド産生細菌などのカロテノイド生合成遺伝子を導入することにより、大腸 菌などの微生物は、ァスタキサンチン、ゼアキサンチン、 β -カロテン、リコペンなどの 有用カロテノイドを生産するようになる。一方、価格的に有機合成法に競合するため には、カロテノイドの生産量をできるだけ増大させる必要がある。本発明による（a) β - ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコ ードする DNA鎖（crtW)、 （b) 4—ケトー βーィオノン環の 3位および Ζまたは j8—ィォ ノン環の 3位の炭素に一つの水酸基を付加する酵素活性を有するポリペプチドをコ ードする DNA鎖 (crtZ)、 （c)リコペンを |8—カロテンに転換する酵素活性を有するポリ ペプチドをコードする DNA鎖 (crtY)、 (d)フイトェンをリコペンに転換する酵素活性を 有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtl)、 (e)プレフイトェン合成酵素活性を有 するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtB)、 (f)ゲラニルゲラ-ル 2リン酸合成酵素 活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtE)力 なる群より選択される DNA 鎖は、このカロテノイド、特にァスタキサンチンの生産量の増量に極めて有用である。 現在の進んだ遺伝子工学技術により、酵素等の遺伝子の発現レベルを上げることに より、その遺伝子がコードする蛋白質の生産量を上げることは比較的容易である。代 謝概念上、カロテノイド合成系の上流に位置する IPPイソメラーゼ遺伝子の導入により 発現細胞においてカロテノイド生産が有意に増大したという報告がある (特許文献 2) 。 IPPイソメラーゼ遺伝子を導入することによりカロテノイド生産量の増大に成功したの は、そのことにより FPPまでの上流の代謝経路（図 1)が太くなり、結果的に FPPの供給 量が増えることによりカロテノイドの増量に結びつ 、たとされて 、る。
[0017] し力しながら、本発明の目的の一つであるカロテノイド、特に、ァスタキサンチンの製 造を念頭に置くと、上流遺伝子のみではその後の代謝反応が進まず β -カロテン等 の代謝中間体が蓄積し、充分な生産量を得られない。すなわち、ァスタキサンチン合 成の中間体であるリコペン、 j8 -カロテン、ェキネノン、 -クリプトキサンチン、 3 '—ヒ ドロキシェキネノン、ゼアキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノン、カンタキサンチン、フ ェニコキサンチン、 4 ケトゼアキサンチンおよびァスタキサンチン等の総力ロテノイド 量に占めるァスタキサンチン量を増加させることが肝要である。本発明者らは、ァスタ キサンチン代謝中間体に留まることなぐァスタキサンチンを充分に生産させるため、 I PPイソメラーゼの利用とは異なり、上記 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)および (f)の群から 選択される DNA鎖を導入することにより、発現細胞中で代謝中間体の蓄積なぐァス タキサンチンが充分量合成されることを見出した。さらに、本発明者らは、（f)の DNA 鎖を導入することがカロテノイドの増大に効果的であると考察した。すなわち、 IPPイソ メラーゼの導入による発現量の増大と同様な思想で、代謝概念上の上流合成酵素と 考えられるゲラ -ルゲラニル 2リン酸合成酵素をコードする DNA鎖を導入することによ り、ゲラニルゲラ-ル 2リン酸合成酵素の発現量が増大し、生産物であるゲラ-ルゲラ -ル 2リン酸がカロテノイド代謝系に供給され、一連のカロテノイド合成酵素により総 カロテノイド量が増大することを見出した。これにより（a)、（b)、（c)、（d)、（e)の DNA 鎖と (f)の DNA鎖を組合わせることでァスタキサンチン合成量が飛躍的に向上する。 さらには、（a)、（b)、（c)、（d)、（e)および (f)の DNA鎖を組合わせることで所望の力 ロテノイドを選択的に合成しうることを見出した。例えば、 j8 -カロテンを選択的に合成 するためには (c)、（d)、（e)の組み合わせで行えばよぐさらに、生産量を増大させる には (f)を組合わせることで達成可能である。ゼアキサンチンを選択的に合成するた めには (b)、（c)、（d)、（e)の組み合わせで行えばよぐさらに、生産量を増大させる には (f)を組合わせることで達成可能である。リコペンを選択的に合成するためには（ d)、（e)の組み合わせで行えばよぐさらに、生産量を増大させるには (f)を組合わせ ることで達成可能である。（a)、（b)の組み合わせを用いることができれば、 β -カロテ ンの酸化反応が選択的に進み、ァスタキサンチンへの効率的な選択合成が可能で ある。さらに、ァスタキサンチンの生産量を増大させるためには（d)、（e)、（f)の組合 わせで達成可能である。
本発明において DNA鎖の組合わせとは、それぞれの DNA鎖を独立に用いても良い 力 遺伝子工学的に直列に連結させてもよい。連結させる組み合わせ数は、その組 合わせにおいて、所望する機能が最大となる様に行えばよい。 DNA鎖を独立に用い る場合は、適当なブラ
スミドベクターに挿入してもよい。プラスミドベクターは導入される宿主細胞内で機能 すればよぐ適当なプラスミドベクターを単独でも、和合性の制限を受けない限り複数 種用いてもよい。
[0019] 本発明にお 、て、「カロテノイド」には、フイトェン、リコペン、 13 -カロテン、ゼアキサ ンチン、カンタキサンチン、ァスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、 ェキネノン、アド-ルビン、およびその組合わせである。好ましくは、ァスタキサンチン である。
[0020] すなわち、本発明は、カロテノイド、特にァスタキサンチンの生産量を増大させる特 性を有していてアミノ酸配列が実質的に、 β -ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基 に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtW)、 4ーケトー /3 ーィォ
ノン環の 3位および Zまたは βーィオノン環の 3位の炭素に一つの水酸基を付加する 酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖（crtZ)、リコペンを |8—力口テンに 転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtY)、フイトェンをリコ ペン
に転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtl)、プレフイトェン 合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtB)、ゲラ -ルゲラニル 2リ ン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA鎖 (crtE)カゝらなる群より選 択される DNA鎖、およびこの DNA鎖をカロテノイド産生微生物に導入して該形質転換 微生物を培地で培養し、培養物のカロテノイド含量を増量することを特徴とする、カロ テノイドの製造法を提供するものである。
[0021] 本発明のもう一つの態様は、カロテノイド産生細胞の作製方法である。この方法は 細胞内で発現する一連のカロテノイド合成に関する酵素をコードする DNA鎖を細胞 に導入する段階、および、 DNA鎖導入前の細胞によって産生されるカロテノイドの産 生レベルが約 1. 1から 1, 000倍でカロテノイドを産生する細胞を作製、選択する方 法である。
[0022] 本発明による DNA鎖は、前記 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)に記載される DNA鎖、 またはそれらとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする DNA鎖である。
ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするとは、プローブが典型的には核酸の 複雑な混合物中で、その標的配列にハイブリダィズする力 他の核酸にはハイブリダ ィズしない条件を意味する。ストリンジ ントな条件は配列依存性であり、異なる環境 においては異なることになる。より長い配列では、特異的に、より高温でハイブリダィ ズする。一般に、高度にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度および pHで、特 異的配列の熱融解温度よりも約 5〜10°C低くなるように選択される。低ストリンジェント な条件は一般的には、融解温度よりも約 15〜30°C低くなるように選択される。融解 温度は、規定のイオン強度、 pH、核酸配列で標的核酸に対して相補的なプローブ において 50%が平衡状態で占有される温度である。ストリンジェントな条件下で互い にハイブリダィズしな 、核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一で あれば、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号によって許 容される最大コドン縮重を用いて作製される場合に起こる。そのような場合、核酸は 典型的に中程度にストリンジェントなノヽイブリダィゼーシヨン条件下でノヽイブリダィズ する。
[0023] 「実質的同一」とは、二つの核酸またはポリペプチドに関して、下記の配列比較アル ゴリズムの一つを用いて、または手動整列および目視試験により測定し、比較ウィン ドウにおいて、最大対応で整列化させた場合に、少なくとも 60%、好ましくは 80%、 より好ましくは 90%を超えるヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する配列また は部分配列を意味する。この定義は、その配列の相補体が試験配列にハイブリダィ ズする配列も意味する。
[0024] 配列比較のために、典型的には一つの配列が基準配列として働き、それに対して 試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および基準配 列をコンピューターに入力し、必要があれば部分座標を指定し、配列アルゴリズムプ ログラムのパラメータを指定する。プログラムのデフォルト値を用いてもよぐまたは代 わりのパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズム力 プロダラ ムのパラメータに基き、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する 。比較のための配列整列化の方法は当該技術分野において公知である。比較のた めの、最適配列は、例えば Smithおよび Watreman, Adv. Appl. Math., 2:482(1981)の 局所相同性アルゴリズム、 Needlemanおよび Wunsch、 J.
Mol. Biol, 48:443(1970)の相同性整列化アルゴリズム、 Personおよび Lipman、 Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 85:2444(1988)の類似性詮索法、これらのアルゴリズムのコンビ ユーターによる実施、または手動整列および目視試験により実施することができる。
[0025] 有用なアルゴリズムの一例は PILEUPである。 PILEUPは連続性のペアワイズァラィメ ントを用いて関連配列群力 多重配列を作製し、関係と配列同一性の割合を示す。 P ILEUPはァライメントを作製するために用いるクラスター関係を示すツリーまたはデン ドグラムもプロットする。配列同一性の割合および配列類似性を求めるのに適したァ ルゴリズムのもう一つの例は BLASTアルゴリズムである（Altschulら、 J.
Mol. Biol, 215: 403-410(1990))。このアルゴリズムではワード長は固定されており、 蛋白質では 3、核酸では 11 (配列が全 6通りの読み枠で翻訳されるときは 3)である。 この長さは、充分有意なものに対して高いワードスコア一を与えることのできる最小値 であり、短くて有意なパターンを見逃すほど長くない。また、 BLASTアルゴリズムは二 つの配列の類似性につ 、て統計学的解析も行う。
[0026] 本発明による DNA鎖がコードするポリペプチドは、アミノ酸配列が実質的に配列番 号 2、 3、 4、 5、 6および 7の群力も選択される配列を有するものである。本発明におい て、これらの DNA鎖によってコードされるポリペプチドは、前述のようなカロテノイド増 量活性を有する限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加等の変化があって もよい。このことは、「アミノ酸配列が実質的に配列番号 2、 3、 4、 5、 6および 7の群か ら選択される配列を有する」ということと対応している。例えば、これらの酵素の第一番 目のアミノ酸 (Met)が欠失して 、るものなどもこのアミノ酸配列の変化によるポリぺプ チドないしは酵素に包含される。なお、各ポリペプチドをコードする本発明 DNA鎖は、 配列番号 2、 3、 4、 5、 6、 7に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列をもつものの 他に、縮重コドンについてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体を 包含する。
[0027] 前述の蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DNA鎖を取得する方 法の一つの手段は核酸合成の方法に従って、その鎖長の少なくとも一部をィ匕学合成 することであるが、結合アミノ酸が多数であることを考慮すると、化学合成法よりもパラ コッカス（Paracoccus) sp.などのゲノム DNAを調製し、適当な制限酵素、例えば Sau3A Iにより制限酵素処理を行いランダムなフラグメントに断片化し、コスミド法による大腸 菌からなるライブラリーを作製し、適当なプローブによるハイブリダーゼシヨン法を用 いることが好ましいと言える。さらに、適当な PCRプライマーを作製できる場合には、 調製したゲノム DNAを铸型とし、 PCR法により所望の DNA鎖を増幅することができる。
[0028] DNA鎖はそのまま用いて適当な細胞に形質転換しても良いが、プラスミドベクター に挿入して利用することもできる。プラスミドベクターへの挿入は、そのプラスミドべク ターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入すればよ ヽ。適当な位置とはプラスミドべ クタ一の複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊 しなければよい。
[0029] プラスミドベクターに挿入する際は上述の DNA鎖をそのまま遺伝子工学的に挿入し ても良いが、プロモータ機能を有する DNA鎖を付加させても良い。プロモータとは、 蛋白質のコード領域または機能的 RNAの発現を制御することが可能な DNA配列を指 し、大腸菌で機能する lacプロモータ、 trcプロモータ等を例示することができる。 DNA 鎖を海洋細菌で発現させる場合において、細胞内において機能するプロモータ配列 を含む DNA鎖であれば何ら制限されない。好ましくは、海洋細菌由来のプロモータが 好ましい。さらに、好ましくは配列番号 19、 20または 21のプロモータを利用すること により、挿入されるカロテノイド合成酵素をコードする遺伝子を発現させることができる 。または、配列番号 19, 20または 21のポリヌクレオチドの一部を利用してもよい。部 分領域は知られているプロモータ配列を比較することにより特定することができる。さ らには、これらの配列に塩基を挿入、置換してもよい。さらには、ランダムに変異を導 入して、プロモータ活性が向上したポリヌクレオチドを利用してもよい。一般に、酵素 蛋白質等のコード領域はプロモータ配列に対して 3 '側に配置される。商業的なブラ スミドベクターは予めプロモータ配列が導入されており、海洋細菌内でそのプロモー タが機能するのであれば利用することもできる。また、 DNA鎖を挿入する方向も挿入 する DNA鎖が機能する方向であればよい。
[0030] プラスミドベクターとしては形質転換する細胞内で安定に存在し、複製することがで きる特性であれば良い。また、プラスミドベクターとしては大腸菌の形質転換に利用さ れる pUC系、 pBR系等、あるいは対象細胞内で複製可能なプラスミドベクターとのシ ャトルベクターを挙げることができる。詳しくは成書（Barbara E. Funnell, PLASMID BI OLOGY, ASM press)に記載されている。本発明におけるパラコッカス（Paracoccus ) sp. にお ヽては複製されるプラスミドベクターは特に知られて 、な 、。このように、確 立された宿主ベクター系が存在しな ヽ場合には広宿主域 (Broad-Host-Range)プラ スミドベクターを用いることができる。該ベクターとしては RK2、 R751、 RSF1010、 R 1162、 pCUl、 R46、 pSA、 R388、 RA1力ある（Barbara
E. Funnell, PLASMID BIOLOGY, ASM press)。さらには、広宿主域ベクターの複製 領域を利用して適当なプラスミドベクターに挿入し、シャトルベクターとして利用するこ ともできる。例えば、 RK2へ'、クタ一の複製領域を pUC系ベクターの適当な位置に挿 入し、大腸菌を利用することができるシャトルベクターを例示できる。また、広い宿主 で複製することができ DNAサイズが比較的小さい pBBR系プラスミドを挙げることも できる。 pBBR系プラスミドとしては pBBR122、 pBBRlMCS、 pBBRlMCS2、 pBB R1MCS3、 pBBRlMCS4、 pBBRlMCS5 (非特許文献 5)を挙げることができる。 これらのプラスミドベクターは抗生物質マーカ等が異なっており、形質転換する細胞 の抗生物質耐性を評価した後に適当に選択して利用すればよい。さらに、形質転換 対象となる細胞が保有するプラスミドを利用しても良い。
[0031] 上述の様な本発明 DNA鎖、あるいは適当なプラスミドベクターに挿入した DNA鎖 を、適当なカロテノイド産生微生物に導入することによりカロテノイド含量を増大させる ことができる。本発明においては、例えば、次の発現ベクターを含む。すなわち、 pBB R1MCS2CRT, pBBRlMCS2CRTrv、 pBBRlMCS2CRTWZ、 pBBRlMCS2CRTWZrv、 pBBRlMCS2PcrtElcrtE、 pBBRlMCS2PcrtE2crtE、 pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT、お よびその組合わせ。これらのベクターは後述の実施例により定義される。
[0032] 好適な宿主細胞は、菌類または細菌ファミリー内において広範に見出すことができ 、広範な範囲の温度、 pH、および溶媒耐性で増殖する生物宿主である。例えば、細 菌、酵母、および糸状菌のいずれかは、本発明の DNA鎖の発現に適切な宿主である 。細胞の供給材 料にかかわらず DNA鎖の転写、翻訳および蛋白質の生合成機構は同じであるため、 培養物の培養に使用される炭素供給材料にかかわらず、機能的遺伝子は発現され る。大量な大規模微生物の培養および機能的遺伝子発現は、広範な単純あるいは 複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、メタンなどの飽和炭化水素または光合 成若しくは化学合成独立栄養宿主は二酸ィ匕炭素を利用することができる。しかし、機 能的遺伝子は、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または無機物を含む任意の微量栄養 素の形態および量を含みうる特定の培養条件によって、調節、抑制または低下させ ることができる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養液に添加され、典型的には栄 養またはエネルギー源とみなされない特定の調節物質によって達成することができる 宿主の例としては、ァスペルギルス (Aspergillus)、トリコデルマ（Trichoderma)、 ピキア（Pichia)、キャンディダ (Candida)、ハンセヌラ（Hansenula)、サッカロマイセ ス（Saccharomyces)、サルモネラ（Salmonella)、バシラス（Bacillus)、ァシネトバ クタ一 (Acinetobacter)、ザィモモナス (Zymomonas)、ァグロノくクテリウム (Agrob acterium)、エリスロノくクタ一 (Erythrobacter)、クロロビゥム (Chlorobium)、クロ マチゥム（Chromatium)、フラボバタテリゥム（Flavobacterium)、サイトファーガ（C ytophaga)、ロドバクター (Rhodobacter)、ロドコッカス (Rhocdococcus)、ストレプ トマイセス（Streptomyces)、ブレビバタテリゥム（Brevibacterium)、コリネノ クテリ ァ (Corynebacteria)、マイコノ クテリゥム (Mycobacterium)、ディノコッカス (Dein ococcus)、大腸菌 (Escherichia)、エノレビ-ァ (Erwinia)、パン卜エア (Pantoea)、 シユードモナス (Pseudomonas)、スフインゴモナス（Sphingomonas)、メチロモナス (Methylomonas)、メチロノくクタ一 (Methylobacter)、メチロコッカス (Methyloco ecus)、メチロシヌス (Methylosinus)、メチロミクロビゥム (Methylomicrobium)、メ チロシスチス (Methylocystis)、アルカリジエネス（Alcaligenes)、シネコシスチス（S ynechocystis、シネココッカス (Synechococcus)、アナべナ (.Anabaena)、 クソ コッカス（Myxococcus)、チォバシラス（Thiobacillus)、メタノバクテリゥム（Methan obacterium)、パラコッカス（Paracoccus)およびクレブシーラ (Klebsiella)などの 微生物種が挙げられる。好ましくは Paracoccus属に属する細菌であり、これらは 16S r RNAをコードする DNA配列を指標にすれば当業者であれば簡便に同定することがで きる。より好ましくはカロテノイド産生量が報告されて 、るパラコッカス (Paracoccus) sp . MBIC1143株である。パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株の 16S
rRNAをコードする DNA塩基配列は公表されている。例えば、公的データベースであ る Nationalし enter for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のァクセシヨン番号 AB008114を参照す ればよい。パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株の 16S rRNAをコードする DNA 鎖の塩基配列を配列番号 24に示す。さらに好ましくはパラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株から誘導した変異株である TSN18E7株（特開 2005— 58216号公報参 照）、 TSTT001株 (特願 2005— 314667号明細書参照）である。特に、カロテノイド類 の細胞内蓄積により細胞増殖に関わる各種代謝系に調節を受けない変異誘導株で ある。すなわち、変異処理等により調節が解除された変異株である。細胞内において は、特定の代謝産物が蓄積された場合、その代謝産物によりフィードバック阻害等が 起こり、引き続きその代謝産物の合成が停止することがある。「調節の解除」とは、細 胞内における調節機構を分断することである。工業的にはアミノ酸のリジン発酵等に 成功例がある。変異処理については-トロソグァ-ジン、ェチルメタンスルホン酸、紫 外線、放射線等の当業者では周知の変異処理剤を利用して行えばよい。調節が解 除された株は自然突然変異でもよい。あるいは、変異処理後の変異株、自然突然変 異株をカロテノイド類の代謝アナログを利用した選択培地を利用して分離取得しても よい。代謝アナログとは、カロテノイドに対して化学構造的に類似あるいは細胞内に おける各種反応系のおいてカロテノイドと同様な生理反応をしめす物質をいう。代謝 アナログの一例として、 j8 -ョノン（ionone)、 α -ョノン（ionone)を例示することができる
。さら〖こは、宿主細胞の遺伝子発現チップを作製し、各種、培養条件下における発 現プロファイルを詳細に解析し、カロテノイドが高濃度に蓄積した環境下における遺 伝子発現プロファイルを基にして遺伝子ノックアウト、ノックイン株
を作製、禾 IJ用することもできる。
以下は、好ま 、微生物への遺伝子導入法の概要につ!、て記載したものである。 大腸菌等の微生物への外来遺伝子の導入および発現のための手順ないし方法は、 本発明にお 、て下記したところ以外のものにぉ 、ても、遺伝子工学の分野により慣 用されているものを含み、その手法ないし方法（たとえば、 "Vectors for cloning genes ，，， Method in Enzymology, 216, p.469 - 631,
1992, Academic Press,および、 "Other bacterial systems , Method in Enzymology, 204,
p.305-636, 1991, Academic Press)に準じて実施すればよい。具体的にはヒートショッ ク法、エレクト口ポレーシヨン法等を挙げることができる。
[0035] 本発明におけるパラコッカス（Paracoccus) sp.への遺伝子導入法につ!、ては確立 された技術は知られていない。こういった場合、温和な条件下で遺伝子を導入する 方法として大腸菌接合伝達法を挙げることができる。接合伝達法は、菌同士の接合 によってプラスミドを供与菌力 受容菌へ導入する方法であり、受容菌が受けるダメ ージが少な 、と 、う利点がある。大腸菌接合伝達法には二親伝達法と三親伝達法の 2種類があり、前者の二親伝達法では自己伝達能を担う tra領域が染色体に組み込 まれた大腸菌 S17-1株をプラスミド供与菌とし、受容菌と共培養することで、 traの働き によりプラスミドを供与菌から受容菌に導入することができる（非特許文献 6)。さらに、 mob遺伝子 (非特許文献 7)を有するプラスミドベクター（例、上述の pBBRlMCS)を 利用した場合、効率よく受容菌へプラスミドを導入することができる。三親伝達法はへ ルパープラスミド (例、 RK2)を保持させた大腸菌と適当なプラスミドベクターを保持さ せた大腸菌、遺伝子を導入する細菌を混合して接合する方法である。
[0036] V、ずれの方法にぉ 、ても、メンブランディスク上で、緩衝液等の媒質中に細胞を一 定温度で混合した後、フィルター上で一定時間インキュベートすると!/、うものである。 これらの接合条件は、限定的なものではないが、通常、温度は 20〜30°C、好ましくは 25°Cである。また、インキュベートする時間は、一般に、数時間から数日間である。大 腸菌と遺伝子を導入する細菌との混合比は特に限定されな ヽ。接合すべき大腸菌、 酵母が存在していれば例え微量でも接合体が得られ、それを分離、培養すれば増殖 できるからである。なお、効率的な接合を行うには、例えば、大腸菌と遺伝子を導入 する細菌との割合は 1:1あるいは 0.1： 1で行えばよい。
[0037] 接合伝達後は伝達されたことに基く接合伝達体の特性を利用して、他の細胞と分 離することができる。例えば、利用したプラスミドベクターに挿入された抗生物質耐性 を利用して、プラスミドベクターが伝達された接合伝達体だけを増殖させることにより 分離することもできる。これらの方法はいずれも当業者にとっては周知である。さらに 、接合伝達の供与体である大腸菌の増殖を抑える抗生物質の組合わせ利用すれば 、さらに、接合伝達体の効率的な選択が可能である。抗生物質はカルべ-シリン (Ca rbenicillin)、アンピシリン (Ampicillin)、セファゾリン（Cefazollin)、ピぺラシリン（Pipera cillin)、ホスホマイシン（Fosfomycin)、ゲンタマイシン（Gentamicin)、ストレプトマイシ ン（Streptomycin)、ネオマイシン（Neomycin)、アミカシン（Amikacin)、テトラサイクリン (Tetracyclin)、エリスロマイシン (Erythromycin)、リンコマイシン (Lincomycin)、リファ ンピシリン（Rifampicin)、ナリジク酸（Nalidixic
acid)、ノボピオシン（Novobiocin)を例示することができる。接合伝達体の分離の確認 は、適当な培養液で培養後、プラスミド抽出、 PCR等で確認することができる。
[0038] 上述した微生物への遺伝子導入および発現のための手法ないし方法によって、力 ロテノイド合成遺伝子群を導入し、発現させること〖こより多量の力ロテノイドを生産でき る微生物を得ることが可能となる。
[0039] これらの形質転 ·を用いて、適当な培養培地を使用することにより、各種カロテノ イドが細胞内に蓄積させることができる。カロテノイドを回収するためには培養液から カロテノイド蓄積微生物を集菌し、適当な有機溶媒により抽出すればよい。有機溶媒 はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルェチルケトン、メ チルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフオルム、ジメチルフオルムアミド、ジメチ ルスルフォキシド等がよい。好適にはアセトンである。さらには液体クロマトグラフィー 等を利用して高純度に分離することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理 としてはイオン交換、疎水相互作用、分子篩い等をあげることができる。好ましくは逆 相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。
[0040] 以下の実施例は、さらに本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明を限 定するものではない。なお、ここで用いられた通常の遺伝子糸且換え実験は特に言及 されていない場合は、標準的な方法に（Sambrook, J" Fritch, E. F.， Maniatis, T" " Molecular cloning 3rd edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ) ヽて ヽる。
実施例 1
[0041] パラコッカス属細菌（Paracoccus) MBIC1143株由来のゲノム DNAの調製 カロテノイド 合成遺伝子クローニング
パラコッカス属細菌 MBIC1143株を OEG培地（2 g/Lのトリプチケースペプトン、 1 g/Lの酵母抽出液、 8.8 g/Lの NaCl、 0.73 g/Lの硫酸マグネシウム · 7水和物、 3.6 g/L のリン酸二カリウム '無水、 1.4 g/Lのリン酸一カリウム、 1
g/Lの D-グルコース）を用いて 25°C (回転振とう 120 rpm)にて 3日間培養した。パラコ ッカス属細菌 MBIC1143株は株式会社海洋バイオテクノロジー研究所力 分譲を受 けた。
[0042] ゲノム DNAは Gentra社製キット（Puregen Genomic
DNA isolation kit)を使用して調製した（約 50 ng/ml)。この調製 DNAをテンプレートに し、 PCRによりカロテノイド合成遺伝子を増幅した。なお、パラコッカス属細菌（Paracoc cus) MBIC1143株のカロテノイド合成遺伝子群を構成している遺伝子（crtW, crtZ, crtY, crtl, crtB, crtE)の塩基配列は非特許文献 2および特許文献 3に記載さ れている。これらの公表データを参照し、上記遺伝子を含む塩基配列を作成した。配 列番号 1に、 7,029塩基の配列を示す。また、図 1に遺伝子クラスターの構成を示す。 PCRプライマー（配列番号 13： 5 ' -gcggatccggcgaccttgcggcgctg-3 'および配列番号 1 4 : 5， -cgggatcctgtcgcggtccctgggg-3， )は非特許文献 2を参考に作製した。 PCRは 調製 DNA
1.0 μ Lに、水 13.5 μ L、 2 X High GC緩衝液（タカラバイオ社製）を 25 μ Lをそれぞれ 添加し、 94°Cで 10分間加熱した。氷冷後、 dNTP 8 L、配列番号 8の 10
pmol/ μ Lのフォワードプライマー 1.0 μ 配列番号 9の 10 pmol/ μ Lリバースプライ マー 1.0 Lを添加し、最後に exTaqDNAポリメラーゼ
(タカラバイオ
社製） 0.5 μ Lを加えた。反応は 94°C、 30秒のステップ、次いで 60°C、 30秒の第 2のス テツプ、最後に 72°C、 4分の第 3ステップを 30サイクル行い、 72°C、 10 分間反応させた。得られた PCR産物をフエノールクロ口ホルム処理後、 0.9%のァガロ ース電気泳動を行 、、 目的産物 (約 5.4 kbase)抽出精製 (キアゲン社製 QIAgen Gel Extraction Kit)した。塩基配列を配列番号 8に示す。精製した DNA (PCRプライ マーにて制限酵素 BamHIサイトを導入）を制限酵素 BamHIで処理し、フエノールクロ口 ホルムおよびエタノール沈殿にて精製した
。次いで、この制限酵素処理 DNAを pUC19プラスミドベクター（タカラバイオ社製）の B amHIサイトにライゲーシヨン挿入し、ヒートショック法による遺伝子導入を経て、 100 μ g/mlのカルべ-シリンを含む LB (Luria- Bertani)寒天培地により大腸菌 JM 109株を 形質転換
した。
[0043] 任意の形質転換株を LB培地で培養し (37°C、 18時間）、プラスミド抽出キット (キア ゲン社製)を用いてプラスミド抽出を行った。プラスミドを制限酵素 BamHIで処理したと ころ、先のインサートを確認することができた。ノ ラコッカス属細菌のカロテノイド合成 遺伝子がクローユングされたプラスミドベクターを pUCCRTとした。作製したプラスミド の構造を図 3に示す。 pUCCRTは開示した特願 2005-106045の方法に従い、大腸菌 内にお 、てカロテノイド合成活性を示すことを確認した。
実施例 2
[0044] パラコッカス属細菌発現ベクターの作製
プラスミドベクター pUCCRTを制限酵素 BamHIで処理し、カロテノイド合成遺伝子断 片（約 5.4 kbase)を得た。次!ヽでこの断片を広宿主域ベクター pBBRlMCS2の BamHI サイトに挿入した。ヒートショック法により大腸菌 JM109株に遺伝子導入を行い、 50 μ g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地により形質転換を行った。カナマイシン耐 性を獲得した任意の形質転赚を LB培地で培養し (37°C、 18時間）、プラスミド抽出 キット (キアゲン社製)を用いてプラスミド抽出を行った。プラスミドを制限酵素 BamHI で処理したところ、先のインサートを確認することができた。インサート断片の挿入方 向は 2種類ある。すなわち、 pBBRlMCS2ベクター中の lacプロモータとインサート断片 の転写方向が正方向であるベクター（PBBR1MCS2CRT)および逆方向のベクター（p BBRlMCS2CRTrv)である。図 4に作製したベクターの構造を示す。 実施例 3
[0045] カロテノイド合成遣伝子のパラコッカス属細菌内での同種発現
カロテノイド合成遺伝子断片がクロー-ングされた PBBR1MCS2CRTおよび pBBRIM CS2CRTrvのそれぞれのベクターをヒートショック法により大腸菌 S17-1株に遺伝子導 入を行い、 50
μ g/mlのカナマイシン、 10 μ g/mlのストレプトマイシンを含む LB寒天培地により形質 転換を行った。カナマイシン耐性を獲得した任意の形質転換株を同 LB培地で培養し (37°C、 18時間）、プラスミド抽出キット (キアゲン社製)を用いてプラスミド抽出を行い 、プラスミドが導入された力どうか確認した。次いで、制限酵素 BamH
I処理を行い、大腸菌 S17-1株内でプラスミドが正しく複製された力どうか確認した。 2 種類のプラスミドベクターはそれぞれ大腸菌 S17-1株にて組換え等起こることなく複製 されていた。
[0046] カロテノイド合成遺伝子が挿入された PBBR1MCS2CRTプラスミドベクターを保持す る大腸菌 S17-1株を 50
g/mlのカナマイシン、 10 g/mlのストレプトマイシンを含む LB培地で培養し（37°C )、対数増殖期の菌体を含む培養液を得た。濁度 (OD660應)を測定し、 0.1になるよ うに同培地で希釈した。並行して、パラコッカス属細菌も実施例 1の OEG培地で培養 (25°C)し、対数増殖期の菌体を含む培養液を得た。同様に濁度を測定し、 1.0になる ように OEG培地で希釈した。これらの溶液をそれぞれ 1.0
mlずつ 5ml容のシリンジにとり、シリンジ内の溶液をメンブランホルダー（アドバンテック 社製）に装着されたメンブレン上に集菌した。集菌後、メンブレンをホルダー力 外し 、 OEG寒天培地上にのせ (菌体側を上向き）、接合伝達を行わせるための培養を行 つた (25°C、 4時間）。培養後、メン
プレンを 1.0 mlの OEG培地に入れ、激しく攪拌することにより接合伝達完了体をメン プレンフィルターから分離した。この溶液を OEG培地で適当な濃度になるように希釈 し、 50
μ g/mlのカナマイシン、 15 μ g/mlのアミカシン（シグマ社製）を含む OEG寒天培地に スプレ ッドし、 25°Cにて培養した。アミカシンの添カ卩は大腸菌の増殖を抑えるために行った。
[0047] 培養 3日目に現れるコロニーをピックアップし、 50 μ g/mlのカナマイシンを含む ΟΕ G培地で培養 (25°C)しプラスミドを抽出した。プラスミド抽出は大腸菌 JM109株と同様 にキアゲン社のプラスミド抽出キットを利用して行った。この抽出溶液を 0.9%のァガロ ース
による電気泳動を行ったところ、大腸菌 S17-1株に保持させた PBBR1MCS2CRTと同 一であり、大腸菌からパラコッカス属細菌へのプラスミド転移が成功したことがわかつ た。なお、 pBBRlMCS2CRTrvについても同様にして確認した。
実施例 4
[0048] 形皙転橼されたパラコッカス通細菌のァスタキサンチン 牛の定畺
pBBRlMCS2CRT、 pBBRlMCS2CRTrvのプラスミドを保持したパラコッカス属細菌を それぞれ 100 g/mlのカナマイシンを含む OEG培地で培養した（25°C)。培養は 100 ml容のバッフル付三角フラスコに 60mlの培地を入れ、 120rpmの回転振とう培養器で 行った。
[0049] 適当な時間でサンプリングを行い、遠心操作により集菌し、さらに、アセトンにより力 ロテノイド類を抽出'定量した。カロテノイドの定量は逆相カラムを用いた高速液体ク 口マトグラフィ一により測定し、以下の操作手順で行なった。すなわち培養液の一部 を遠心分離して菌体を回収し、適量の純水を加えチューブミキサーにて 10分間懸濁 させる。次いで純水に対して 9倍量のアセトンをカ卩えてチューブミキサーにて 30分間 攪拌後、 14,000回転 5分間遠心分離を行ない上清を回収し HPLCにより定量した。 HP LCカラムは TSKgel
ODS-80 (東ソ一社製)を使用し、流速 1.0 ml/min、 470 nmの検出波長で測定した。標 準ァスタキサンチン (シグマ社製)を用いて検量線を作成し、培養中の産生ァスタキ サンチン量を算出した。プラスミド導入株の対照としてカロテノイド合成遺伝子が挿入 されていない PBBR1MCS2ベクターのみの株も作製した。表 1の通り、遺伝子を保持し たパラコッカス属細菌のァスタキサンチン産生量を有意に増加した。
[0050] また、パラコッカス属細菌の野性株である MBIC1143株に変異処理を施し、ァスタ キサンチン合成量が向上した TSN 18E7株に同様に接合伝達で遺伝子導入を行つ たところ MBIC1143株と同様にァスタキサンチン産生量が有意に増加した (表 1)。
[0051] 特に、遺伝子導入された変異株 TSN18E7株においては、培養 72時間において顕 著である。カロテノイド合成の最終産物であるァスタキサンチンが短時間に合成され たことは、カロテノイド合成遺伝子を挿入して作製されたプラスミドベクターの効果を 示すものである。パラコッカス属細菌 TSN18E7株は独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センターに FERM
P-19746として寄託されて!ヽる。
[0052] [表 1]
表 1. 遺 β?導 λ/ ラコッカス eaffiのァスタキサンチン
Figure imgf000022_0001
実施例 5
[0053] 揷入力ロテノイド合成遣伝子のプロモータ配列解析
実施例 4の通り、カロテノイド合成遺伝子断片を PBBR1MCS2ベクターに挿入し、ノ ラコッカス属細菌で同種発現を試みたところ有意にカロテノイドの一種であるァスタキ サンチンの産生量が増加した。さらに、ベクターに対する挿入方向は関係なく活性向 上を確認することができた。すなわち、 PBBR1MCS2ベクター中に挿入されてい lacプ 口モータの機能を利用しないでカロテノイド合成遺伝子が発現したことを意味する。そ こで、増幅したカロテノイド合成遺伝子の転写上流方向の配列（配列番号 1記載の 1 から 450
番目まで）につ
V、てプロモータ解析を実施した。解析は市販のソフトウェアーである GENETYX (ゼネ テイクス社製)を利用した。解析結果、増幅 DNA中の crtW遺伝子の上流にプロモータ として機能する配列を見出すことができた (表 2)。配列番号 19記載の 1番から crtW遺 伝子の直近までの塩基配列はパラコッカス（Paracoccus) sp.内でプロモータ活性を有 する塩基配列であると推定できる。なお、表中のプロモータスコア一値は GENETYX ソフトウェアーが算出した数値で、高い値ほどプロモータ機能があると考えることがで きる。
[0054] [表 2]
表 2. 籠プロ ^タ酉洌
Figure imgf000023_0001
実施例 6
[0055] β一力口テン酸化酵素発現ベクターの作製
実施例 1と同様にパラコッカス（Paracoccus) sp.のゲノム DNAを調製した。次いで、 β - カロテン酸ィ匕酵素である遺伝子 crtWおよび crtZを含む領域を PCRにより増幅した。塩 基配列を配列番号 9に示す。 PCRは配列番号 13と配列番号 15 (' 5-cgggatccgcaggg cgatcagcccgttggcaagg
-3 ' )のプライマーを使用した。次いで、テンプレートとなる調製 DNA 1.0 μ Lに、水 16 .5 μ L、 2 X High GC緩衝液 (タカラバイオ社製）を 25 μ Lをそれぞれ添加し、 94°Cで 1 0
分間加熱した。氷冷後、 dNTP 5 L、配列番号 13 の 10 pmol/ μ Lのフォワードプラ イマ一 2.0 μ L、配列番号 15の 10 pmol/ μ Lのリバースプライマー 2.0
Lを添加し、最後に exTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製) 0.5 Lを加えた。 反応は 94°C、 30秒のステップ、次いで 60°C、 30秒の第 2のステップ、最後に 72°C、 2分 の第 3ステップを 30サイクル行い、最後に 72°C、 7
分間反応させた。増幅された断片をァガロース電気泳動で確認し、抽出精製 (キアゲ ン社製 QIAgen Gel Extraction Kit)した。プラスミドベクター pBBRlMCS2の BamHIサイ トに挿入するため、この精製 DNAを制限酵素 BamHIで消化した。これらをライゲーショ ン後、ヒートショック法により大腸菌 JM109株に遺伝子導入を行い、 50 g/mlのカナマ イシンを含む LB寒天培地により形質転換を行った。カナマイシン耐性を獲得した任 意の形質転換株を LB培地で培養し (37°C、 18時間）、プラスミド抽出キット (キアゲン 社製)を用いてプラスミド抽出を行った。プラスミドを制限酵素 BamHIで処理したところ 、先のインサートを確認することができた。インサート断片の挿入方向は 2種類ある。 すなわち、 PBBR1MCS2ベクター中の lacプロモータとインサート断片の
転写方向が正方向であるベクター（PBBR1MCS2CRTWZ)および逆方向のベクター（ pBBRlMCS2CRTWZrv)である。図 5にそれぞれの構造を示す。
実施例 7
[0056] β カロテン酸化酵素発現ベクターのパラコッカス（Paracoccus) SD.内での発現
PBBR1MCS2CRTWZおよび pBBRlMCS2CRTWZrvを実施例 3と同様に大腸菌 S17- 1 株導入し、接合伝達によりパラコッカス (Paracoccus) sp.の変異株を形質転換した。 3 日間培養後、カロテノイドを HPLCにより定量した。表 3に結果を示す。表中 Axはァス タキサンチン、 TCは総力ロテノイドを表す。
[0057] [表 3]
表 3. 遺 β?導 ラコッカス のカロテノイド ¾a
Figure imgf000024_0001
[0058] 表 3の通り、総力ロテノイド量の増加効果はないものの、導入した遺伝子コンストラタ トの効果、すなわち、 j8 -カロテンの酸ィ匕酵素の発現量の増大により、ァスタキサンチ ンへの合成が有意に増加した。
実施例 8
[0059] ゲラニルゲラエル 2リン酸合成遣伝子発現ベクターの作製
実施例 1と同様にパラコッカス（Paracoccus) sp.のゲノム DNAを調製した。次いで、ゲ ラニルゲラ-ル 2リン酸合成酵素遺伝子 (crtE)領域を PCRで増幅した。 crtE遺伝子の 上流域にあると考えられるプロモータ領域が不明のため、配列番号 1記載の塩基配 列を参考にし、ハイブリダィズ領域が異なる 2組の PCRプライマーを設計'使用した。 すなわち、配列番号 16 (5' - ctagtctagatgcttgacaatccgggtgacgcgg-ύ )と酉己列番号 1 1 (5 -tgggagctcatcacgcctaggc gcgcgcggcgtag-3， )記載の組合わせ、もう一つは配列番号 18 (5， - ctagtctagagccggtc cactgaccttgttggac-3 ' )と配列番号 17記載の組合わせである。増幅される領域は前者 が約 1.2
kbase,後者が 1.1 kbaseである。それぞれの塩基配列を配列番号 10と配列番号 11に 示す。また、増幅領域が長いものを PcrtElcrtE、短いものを PcrtE2crtEとした。 PcrtEl crtEについては、先ず、 PCRはテンプレートとなる調製 DNA
1.0 Lに、水 16.5 μ L、 2 X High GC緩衝液（タカラバイオ社製）を 25 μ Lをそれぞれ 添加し、 94°Cで 10分間加熱した。氷冷後、 dNTP 5 L、配列番号 16 の 10 pmol/ μ Lのフォワードプライマー 2.0 μ L、配列番号 17の 10 pmol/ μ Lのリバース プライマー 2.0 Lを添カ卩し、最後に exTaq DNAポリメラーゼ
(タカラバイオ社製) 0.5 μ Lをカ卩えた。反応は 94°C、 30秒のステップ、次いで 60°C、 30 秒の第 2のステップ、最後に 72°C、 2分の第 3ステップを 30サイクル行い、最後に 72°C 、 7
分間反応させた。増幅された断片をァガロース電気泳動で確認し、抽出精製 (キアゲ ン社製 QIAgen Gel Extraction Kit)した。さら〖こ、制限酵素 Xba
Iおよび Sadによって消化し、プラスミドベクターへの挿入末端を揃えた。同様にして、 PcrtE2については配列番号 17と配列番号 18記載のプライマーを使用して調製した 次いで、インサートが挿入されるプラスミドベクターである PBBR1MCS2は制限酵素 B tsl
および Bsu36Iにより消化し不要な DNA鎖を脱落させた。フエノールクロ口ホルム抽出 後、エタノール沈殿を行い精製した。さらに、配列番号 22 (5，- tcatctagaggtaccatatgaagcttgagctcct-3 )および 23 (5 - gagctcaagcttcatatggtacctcta ga-3，）に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドをァニールさせ、二本鎖として精製 DNA断 片にライゲーシヨンした。この二本鎖には制限酵素 Sadと Xbalのサイト設計'導入した 。ライゲーシヨン反応を行い、 50
μ g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地により大腸菌 JM109を形質転換し、二本鎖 が挿入されたベクターを取得した。これを pBBRlMCS2oligoとした。 [0061] 次いで pBBRlMCS2oligoを制限酵素 Sadおよび Xbalにより消化し、インサート挿入 末端を揃えた。それぞれライゲーシヨンし、 50
IX g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地により大腸菌 JM109を形質転換した。任意 のコロニーをピックアップし、培養後、プラスミド調
製を行い、設計通りのコンストラクトであることを電気泳動により確認した。インサート が長レ、領域のコンストラクトを pBBRlMCS2PcrtElcrtE、短レ、領域のコンストラクトを pB BRlMCS2PcrtE2crtEとした。図 6にそれぞれの構造を示す。
実施例 9
[0062] ゲラニルゲラニル 2リン酸合成酵素のパラコッカス（Paracoccus)属細菌内での発現
pBBRlMCS2PcrtElcrtEおよび pBBRlMCS2PcrtE2crtEを実施例 3と同様に大腸菌 S17- 1株導入し、接合伝達によりパラコッカス (Paracoccus) sp.の変異株を形質転換し た。実施例 4と同様に 5日間培養後、カロテノイドを定量した。表 4に結果を示す。
[0063] [表 4]
表 4. 遣 β?導 ラコッカス J¾ffl¾のカロテノイド;
Figure imgf000026_0002
[0064] 表 4の通り、これらの遺伝子コンストラクトを導入した変異株 TSN18E7株では溶菌が 起こり、カロテノイド合成量の向上を確認することはできな力 た。一方で、増殖能が 向上した変異株 TSTTOOl株においてはこれらのコンストラクトの効果、すなわち、ゲラ ニルゲラニル 2リン酸合成酵素の発現量同大に伴 、、生産物であるゲラニルゲラ-ル 2リン酸の供給量が高まり、パラコッカス（Paracoccus)の染色体にコードされていた一 連のカロテノイド合成酵素系によりカロテノイド合成量が向上した。なお、変異株 TST T001株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM
Figure imgf000026_0001
ヽる。
実施例 10
[0065] ゲラニルゲラニル 2リン酸合成遣伝子 h流のプロモータ西 P,列 実施例 7の通り、ゲラ -ルゲラニル 2リン酸合成酵素をコードしている領域 882 base に対して上流域の配列を付加することによりカロテノイド合成量が有意に増加すること がわかった。すなわち、ゲラ -ルゲラ-ル 2リン酸合成酵素 ORFの上流域の約 300 ba seの塩基配列、あるいは約 200
baseはプロモータ機能を有する DNA鎖であることが判明した。それぞれの塩基配列を 配列番号 20と配列番号 21に記載する。
実施例 11
[0066] ゲラニルゲラニル 2リン酸合成遣伝早 カロテノィ 合成遣伝早 合わせたプラスミ ドベクターの作製 実施例 7記載の pBBRlMCS2PcrtElcrtEを制限酵素 Xbalで消化した。切断末端を D NA
Blunting Kit (タカラバイオ社製）により平滑ィ匕し、フエノールクロ口ホルム抽出、ェタノ ール沈殿により精製した。次いで、実施例 2で調製した、制限酵素 BamH
Iで消化したカロテノイド合成遺伝子断片を同様に、平滑化、フエノールクロ口ホルム 抽出、エタノール沈殿により精製した。これらをライゲーシヨンし、 50 μ g/mlのカナマ イシンを含む LB寒天培地により大腸菌 JM109を形質転換した。任意のコロニーをピッ クアップし、培養後、プラスミド調製を行い、設計通りのコンストラクトであることを電気 泳動により確認した。作製した装入断片の塩基配列を配列番号 12に示す。また、こ のコンストラクトを pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTとした。図 7に構造を示す。
実施例 12
[0067] ゲラニルゲラニル 2リン酸合成遣伝早 カロテノィ 合成遣伝早 合わせたプラスミ ベクターの pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTを実施例 3と同様に大腸菌 S17-1株導入し、接合伝達 によりパラコッカス (Paracoccus) sp.の変異株を形質転換した。実施例 4と同様〖こ 5日 間培養後、カロテノイドを HPLCにより定量した。定量結果を表 5に結果を示す。表中 Axはァスタキサンチン、 TCは総力ロテノイドを表す。また、培養 3日目の TSTT001株 の HPLCのパターンを図 8に示す。
[0068] [表 5] 表 5. 遺 導 ΑΛ°ラコッカス) s«のカロテノイト ¾4*
Figure imgf000028_0001
[0069] 表 5の通り、コンストラクト pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTによりァスタキサンチンおよび カロテノイド産生量が有意に増加した。すなわち、ゲラ -ルゲラニル 2リン酸合成酵素 の発現によりカロテノイドの合成材料であるゲラ -ルゲラニル 2リン酸が高濃度に合成 され、次いで、一連のカロテノイド合成酵素が導入コンストラクトにより過剰に発現され ァスタキサンチンへ効率よく合成された。また、図 8の通り、培養 3日目において TSTT 001株では導入遺伝子である pBBRlMCS2PcrtElcrtECRTにより、ァスタキサンチンの 合成量が顕著に増大して 、ることがわ力る。
産業上の利用可能性
[0070] 本発明にお V、て、カロテノイド生産量を増大させる遺伝子若しくは遺伝子群の機能 を明らかにし、カロテノイド生産能を有する天然微生物の改良に成功した。従って、 本発明により改良した微生物を利用することにより飼料若しくは食料として有用なカロ テノイドの生産性を大幅に向上させることが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] (a)な 、し (f)に記載の DNA配列を含む DNA配列で形質転換された細胞、または (a) ないし (f)に記載の DNA配列を有するベクターで形質転換された細胞を、適当な培 養条件下で培養し、該細胞または培地力 カロテノイドを分離することにより、カロテノ イドを調製する方法。
(a)配列番号 2記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株の j8 -ィオノン環 の 4位のメチレン基をケト基に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする D NA配列または実質的に相同な DNA配列。
(b)配列番号 3記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株の 4ーケトー β ィオノン環の 3位および Ζまたは βーィオノン環の 3位の炭素に一つの水酸基を付カロ する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA配列または実質的に相同な DN Α配列。
(c)配列番号 4記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株のリコペンを j8— カロテンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA配列または実質 的に相同な DNA配列。
(d)配列番号 5記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株のフイトェンをリコ ペンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA配列または実質的 に相同な DNA配列。
(e)配列番号 6記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株のプレフイトェン 合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA配列または実質的に相同な DN A配列。
(f)配列番号 7記載の、パラコッカス（Paracoccus) sp. MBIC1143株のゲラ -ルゲラ- ル 2リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA配列または実質的に 相同な DNA配列。
[2] 配列番号 19記載の、海洋性細菌内でプロモータ活性を有する DNA鎖。
[3] 配列番号 20記載の、海洋性細菌内でプロモータ活性を有する DNA鎖。
[4] 配列番号 21記載の、海洋性細菌内でプロモータ活性を有する DNA鎖。
[5] 請求項 1記載の DNA鎖と請求項 2、 3または 4記載の DNA鎖の組合わせ力 なる群か ら選択される連続したオリゴヌクレオチド配列。
[6] 請求項 5記載のオリゴヌクレオチドを含むプラスミドベクター。
[7] 配列番号 8記載の DNA鎖配列が挿入されたプラスミドベクター。
[8] 配列番号 9記載の DNA鎖配列が挿入されたプラスミドベクター。
[9] 配列番号 10記載の DNA鎖配列が挿入されたプラスミドベクター。
[10] 配列番号 11記載の DNA鎖配列が挿入されたプラスミドベクター。
[11] pBBRlMCS2CRT、 pBBRlMCS2CRTrv、 pBBRlMCS2CRTWZ、 pBBRlMCS2CRTWZ rv、 pBBRlMCS2PcrtElcrtE、 pBBRlMCS2PcrtE2crtE、 pBBRlMCS2PcrtElcrtECRT 、およびその組み合わせ力 なる群より選択されるプラスミドベクター。
[12] 請求項 6な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の発現ベクターにより形質転換された細胞
[13] カロテノイドの産生であって、請求項 6ないし 11のいずれ力 1項に記載のポリヌクレオ チド配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する段 階、およびカロテノイドを細胞または細胞の培地力 単離する段階を含む方法。
[14] 形質転換された細胞が大腸菌、バチラス (Bacillus)のような原核宿主細胞でることを 特徴とする請求項 12または 13記載の方法。
[15] 形質転換された細胞がパラコッカス (Paracoccus) sp. のような海洋性細菌であること を特徴とする請求項 12または 13記載の方法。
[16] 配列番号 24記載の形質転換された細胞の 16SrRNAをコードする DNA塩基配列の 相同性が 97%以上の細菌であることを特徴とする請求項 12または 13記載の方法。
[17] 形質転換された細胞がパラコッカス（Paracoccus) sp.
MBIC1143株力も変異誘導された TSN18E7株であることを特徴とする請求項 12また は 13記載の方法。
[18] 形質転換された細胞がパラコッカス（Paracoccus) sp.
MBIC1143株力も変異誘導された TSTT001株であることを特徴とする請求項 12また は 13記載の方法。
[19] 大腸菌によりパラコッカス (Paracoccus) sp.のような海洋性細菌を形質転換する方法。
[20] 所望のカロテノイドまたはカロテノイド混合物を調製する方法であって、請求項 12な いし 18の何れか一項記載の細胞を、適切な培養条件下で培養し、その細胞または 培地力も所望のカロテノイドまたはカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテ ノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類力もそれを分 離することを特徴とする方法。
[21] 食料または飼料配合物を調製するための方法であって、請求項 20記載の方法を実 施した後に、そのカロテノイドまたはカロテノイド混合物を食料または飼料に添加する ことを特徴とする食料または飼料の調製方法。
[22] 大腸菌接合伝達方法であって、海洋性細菌の接合伝達体を選択的に分離するため に、抗生物質アミカシンを利用する方法。
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