PL231220B1 - Plazmid będący pochodnym plazmidu pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686 obejmujący funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów i sekwencję przedstawioną na SEKW NR ID: 1, nowe szczepy bakteryjne, ich zastosowania, sposoby wytwarzania nowych szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów oraz sposoby wytwarzania karotenoidów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku są plazmid, będący pochodnym plazmidu pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686, który obejmuje funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz w gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22 oraz marker selekcyjny, przy czym plazmid obejmuje sekwencję przedstawioną na SEKW NR ID: 1. Przedmiotem wynalazku są również plazmid pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1, nowe szczepy bakteryjne Paracoccus aminophilus CRT1 oraz Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowane w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolnospożywczego w Warszawie, odpowiednio jako Paracoccus aminophilus KKP 2053p i Paracoccus kondratievae KKP 2054p oraz ich zastosowania. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykorzystania szczepów do wytwarzania karotenoidów oraz sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji barwników karotenoidowych, jak i sposoby wytarzania różnych barwników karotenoidowych z wykorzystaniem nowych szczepów Paracoccus aminophilus KKP 2053p i Paracoccus kondratievae KKP 2054p.

Stan techniki

Karotenoidy należą do licznej grupy związków organicznych zwanych izoprenoidami. Są to związki hydrofobowe, zaliczane do węglowodorów nienasyconych, rozpuszczalne w tłuszczach i rozpuszczalnikach organicznych. Powstają one na drodze kondensacji aktywnych jednostek pięciowęglowych - pirofosforanu izopentynylu (IPP, ang. isopentenyl diphosphate) oraz jego izomeru - pirofosforanu dimetyloallilu (DMAPP, ang. dimethylallyl pyrophosphate). Karotenoidy to jedne z najczęściej spotykanych naturalnych barwników. Gama barw przez nie reprezentowanych jest bardzo bogata - od żółtej poprzez pomarańczową do czerwonej, a nawet purpurowej czy brunatnej. Obecnie znamy około 600 tych związków. Karotenoidy są wytwarzane przez wszystkie organizmy fotosyntetyzujące posiadające chlorofil, niektóre drożdże i grzyby oraz liczne bakterie, zarówno te fotosyntetyzujące (anoksygenowe i oksygenowe), jak i niezdolne do fotosyntezy.

Karotenoidy odgrywają znaczną rolę w funkcjonowaniu wszystkich organizmów, nie tylko tych, które są zdolne do ich produkcji. Będąc prekursorami witaminy A, są ważnym elementem diety człowieka. Witamina A powstaje poprzez przecięcie cząsteczki prowitaminy A, czyli karotenoidu zawierającego β-pierścienie (np. β-karotenu, γ-karotenu czy kryptoksantyny). Bierze ona udział w procesach widzenia, utrzymywaniu integralności błon, w rozwoju kości czy utrzymywaniu odpowiedniego stanu skóry, włosów i paznokci. Innym przykładem karotenoidów ważnych dla zdrowia człowieka są dicykliczne ksantofile - luteina i zeaksantyna, które stanowią pigment plamki żółtej znajdującej się w centrum ludzkiej siatkówki. Dużą wagę skupia się także na antyoksydacyjnych właściwościach barwników karotenoidowych, dzięki którym mogą one dezaktywować wolne rodniki powstające w czasie procesów metabolicznych. Wolne rodniki (czyli cząsteczki zawierające niesparowane elektrony) reagują z lipidami, białkami czy kwasami nukleinowymi prowadząc do zaburzeń funkcjonowania komórki i mutacji. Udowodniono, że stosowanie karotenoidów (suplementy diety, związki aktywne w farmaceutykach) prowadzi do znacznego zmniejszenia ryzyka lub opóźnia wystąpienie takich chorób, jak: miażdżyca, katarakta, zwyrodnienie plamki żółtej, stwardnienie rozsiane czy różne rodzaje nowotworów (Bhosale i Bernsein, 2005). W przypadku astaksantyny zauważono również, że jej działanie utrudnia kolonizację żołądka przez patogenną bakterię Helicobacter pylori, a także wspomaga i moduluje układ odpornościowy (Higuera-Ciapara i wsp., 2006).

Karotenoidy stosuje się w dużych ilościach w przetwórstwie spożywczym oraz przy produkcji kosmetyków. Stosowane są również jako dodatek do pasz oraz jako koloranty dodawane do akwakultur ryb łososiowatych i skorupiaków. Według organizacji Global Industry Analysts, Inc. (GIA), w 2015 r. wartość światowego rynku karotenoidów wyniesie 1,2 mld USD. Wciąż poszukiwane są alternatywne, a przede wszystkim tanie metody wytwarzania karotenoidów.

Obecnie firmy zajmujące się pozyskaniem barwników karotenoidowych stosują ich ekstrację z naturalnych źródeł i wieloetapową syntezę chemiczną (zeaksantyna, kantaksantyna, astaksantyna). Barwniki uzyskuje się z roślin, jednak ekstrakcja jest tu mniej wydajna niż np. w przypadku zastosowania grzybów. Próbuje się genetycznie modyfikować rośliny w celu zwiększeni a produkcji karotenoidów, jednak jest to trudne ze względu na brak wiedzy na temat następstw wprowadzenia in trans

PL 231 220 B1 „obcych” genów związanych z produkcją karotenoidów. Nie są znane też szlaki regulacji produkcji karotenoidów u roślin (Sandmann, 2001).

Znacznie łatwiejszym sposobem wytwarzania karotenoidów, a przede wszystkim ich ekstrakcji są metody mikrobiologiczne. Często próbuje się wykorzystywać w tym celu szczepy glonów, grzybów i bakterii naturalnie produkujące karotenoidy. Jednak, zwykle pojawia się tu problem natury technicznej, np. zbyt wolne tempo wzrostu lub zbyt niska wydajność procesu produkcyjnego. Rozwój metod przemysłowego otrzymywania karotenoidów opartych o tego typu naturalnych producentów, związany jedynie z optymalizacją składu pożywek, zwykle również nie daje pożądanego wzrostu produktywności. Obiecujące są zatem metody wykorzystujące organizmy genetycznie modyfikowane.

Najczęściej stosowanym gospodarzem do ekspresji heterologicznych genów kodujących enzymy niezbędne do biosyntezy karotenoidów i innych terpenoidów jest Eschericha coli. Zastosowanie tej bakterii wynika głównie z dobrej znajomości jej fizjologii i opracowanych procedur jej badania. Jednak zastosowanie E. coli pociąga za sobą pewne komplikacje wynikające z faktu, iż nadproduk cja karotenoidów w bakteriach niebędących ich naturalnymi producentami (dzikie szczepy E. coli nie prowadzą syntezy karotenoidów) często prowadzi do efektu toksycznego np. ze względu na ograniczone możliwości magazynowania karotenoidów (Sandmann, 2001). Dodatkowo, bezpośrednie wprowadzanie genów enzymów zaangażowanych w karotenogenezę do E. coli okazało się nieskutecznym sposobem konstrukcji szczepów, które mogłyby znaleźć zastosowanie w przemyśle, gdyż obserwowano niską wydajnością produkcji związków końcowych. Czynnikiem limitującym dla E. coli okazała się przede wszystkim niewydajna produkcja prekursorów (IPP, DMAPP) karotenoidów (Harada i Misawa, 2009).

Zastosowanie w procesie produkcyjnym innych bakterii, zwłaszcza naturalnie akumulujących duże ilości karotenoidów i ich prekursorów, mogłoby (mimo trudności w prowadzeniu manipulacji genetycznych) przynieść korzyści związane z wysoką wydajnością wytwarzania pożądanych związków. Dobrym kandydatem wydają się tu szczepy bakterii z rodzaju Paracoccus, wśród których zidentyfikowano licznych producentów karotenoidów np. P. carothinifaciens (Tsubokura i wsp., 1999) i P. haeundaensis (Lee i Kim, 2006a). W szczepach tych zidentyfikowano i opisano geny związane z produkcją karotenoidów.

Rodzaj Paracoccus spp. liczy aktualnie ponad 40 gatunków, z których około 25% wytwarza karotenoidy, nadające koloniom tych bakterii kolor od żółtego poprzez pomarańczowy do jaskrawoczerwonego. W przypadku kilku szczepów scharakteryzowano główne produkty biosyntezy karotenoidów. Wykazano, między innymi, że: (i) P. marinus NBRC 100637T wytwarza adoniksantynę, (ii) P. zeaxantinifaciens - zeaksantynę, natomiast (iii) P. haeundaensis LMG P-21903, P. carotinifaciens, P. marcusii DSM 11574, P. bogoriensis i Paracoccus sp. N81106 - astaksantynę (Lee i wsp., 2004; Choi i wsp., 2005; Khan i wsp., 2008).

Podejmowano próby wykorzystywania tych naturalnych producentów barwników, jednak niefortunnie są to szczepy bardzo wolno rosnące, co jest niekorzystne w perspektywie procesu produkcyjnego. Co więcej, na ich bazie skonstruowano wektor pCR-XR-TOPO-Crt-full vector, który umożliwiał produkcję astaksantyny w E. coli BL21(DE3) Codon Plus (Lee i Kim, 2006b). Dzięki zastosowaniu tego wektora uzyskano w warunkach laboratoryjnych dosyć wysoki poziom produkcji astaksantyny (max. 400 μg związku na 1 gram suchej masy), jednak niemożliwe było przekroczenie tego wyniku ze względu na ograniczenia opisane powyżej.

Jednym ze szczepów z rodzaju Paracoccus wytwarzających karotenoidy jest również P. marcusii OS22. Szczep ten tworzy kolonie o pomarańczowym zabarwieniu, jednak jego wzrost jest bardzo powolny. Trudne są też modyfikacje genetyczne z wykorzystaniem tego szczepu. Wyróżniono cztery główne grupy karotenoidów wytwarzane przez szczep P. marcusii OS22: (i) astaksantynę (główny produkt szlaku), (ii) adoniksantynę, (iii) zeaksantynę i (iv) β-karoten. Zidentyfikowano również inne związki, będące produktami pośrednimi w syntezie barwników karotenoidowych, m.in. likopen i fitoen.

Biosynteza karotenoidów jest procesem bardzo złożonym. Pierwsze etapy syntezy u bakterii (a także innych organizmów) są bardzo podobne, a enzymy, które je przeprowadzają są w dużym stopniu konserwowane. Polegają one na wytworzeniu uniwersalnego prekursora - pirofosforanu izopentylu (IPP) oraz jego izomeru - pirofosforanu dimetylallilu (DMAPP). Zasadnicze różnice dotyczą ostatnich części szlaku, związanych z modyfikacjami powstających barwników (patrz Fig. 1), tj.:

(i) syntezy bezpośredniego prekursora karotenoidów - geranylo geranylu (GGPP), z udziałem syntazy GGPP (kodowanej przez crtE u P. marcusii OS22). Enzym ten katalizuje połączenie pirofosforanu farnezylu (FPP) i pirofosforanu izopentylu (IPP) (Math i wsp., 1992, Lee i Kim, 2006a);

PL 231 220 B1 (ii) syntezy fitoenu w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek GGPP, przeprowadzonej przez syntazę fitoenu (crtB);

(iii) dehydrogenacji fitoenu do likopenu, polegającej na wprowadzeniu przez dehydrogenazę fitoenu (crtl) kolejnych wiązań podwójnych w obrębie łańcucha polienowego fitoenu;

(iv) cyklizacji likopenu, obejmującej przemiany enzymatyczne wprowadzające asymetrię w obrębie cząsteczek terpenoidów. Dzięki temu powstaje β-karoten. W genomie P. marcusii OS22 jest kodowana β-cyklaza należąca do rodziny CrtY odpowiedzialna za ten proces. W tym miejscu dochodzić może również do rozgałęzienia ścieżek syntezy, które przebiegają dalej w sposób specyficzny dla danego organizmu i prowadzą do wytworzenia różnego typu karotenów lub ksantofili;

(v) synteza astaksantyny i innych ksantofili - u niektórych bakterii może dochodzić do przekształcania karotenu poprzez przyłączenie różnych grup funkcyjnych zawierających tlen, co prowadzi do utworzenia ksantofili, wśród nich astaksantyny. Wytwarzanie astaksantyny jest wyłącznie domeną niektórych szczepów Alphaproteobacteria, m.in. Paracoccus ssp. Astaksantyna jest syntetyzowana z β-karotenu przez naprzemienne działanie dwóch enzymów: hydroksylazy β-karotenu (crtZ) oraz ketolazy β-karotenu (crtW). Misawa i wsp. (1995) zasugerowali, że enzymy CrtW i CrtZ Paracoccus sp. N81106 są bifunkcyjne. Onacza to, że hydroksylaza CrtZ rozpoznaje i przeprowadza modyfikacje nie tylko β-pierścienia, ale również 4-keto^-pierścienia, przekształcając je, odpowiednio, w 3-hydroksy^-pierścieniach i 3-hydroksy-4-keto^-pierścień CrtW rozpoznaje β- pierścień i 3-hydroksy^-pierścień grupy przekształcając je, odpowiednio, w 4-keto^-pierścień i 3-hydroksy-4-keto^-pierścień. Ta dowolność w doborze substratów może tłumaczyć dużą liczbę różnorodnych intermediatów syntezy astaksantyny, w tym: adoniksantyny, adonirubiny, kantaksantyny i 3-hydroksyechinenonu.

W świetle opisanego stanu wiedzy celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie plazmidu, sposobu konstrukcji plazmidu, nowych szczepów bakteryjnych oraz sposobów otrzymania i zastosowania stworzonych szczepów bakteryjnych do produkcji karotenoidów, a także sposobu wytwarzania karotenoidów z wykorzystaniem nowych szczepów bakteryjnych. Nowe szczepy, według wynalazku, zdolne są do produkcji dużych ilości różnych form karotenoidów, co wynika z ich uwarunkowań metabolicznych (wysoki poziom wytwarzanych prekursorów karotenoidów).

Istota niniejszego wynalazku opiera się na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że możliwe jest wykorzystanie genów crt (odpowiedzialnych za produkcję karotenoidów przez szczep Paracoccus marcusii OS22) sklonowanych w naturalnym plazmidzie pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686, do konstrukcji nowych szczepów bakterii z rodzaju Paracoccus zdolnych do wydajnej produkcji barwników karotenoidowych. Nieoczekiwanie stwierdzono, że plazmid (pochodna pAMI2 z genami crt) wprowadzony do innych gatunków bakterii z rodzaju Paracoccus jest w nich w pełni funkcjonalny, utrzymuje się w nich stabilnie oraz umożliwia takim bakteriom produkcję karotenoidów, przy czym rodzaj powstającego barwnika zależy od szczepu bakteryjnego. Ponadto nieoczekiwanie stwierdzono, że w odróżnieniu od szczepu P. marcusii OS22 nowe uzyskane szczepy zawierające plazmid według wynalazku szybciej tworzą dużą biomasę bakteryjną i produkują wydajnie karotenoidy, co jest istotne w procesie produkcyjnym.

Przedmiotem wynalazku jest więc plazmid, będący pochodnym plazmidu pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686, który obejmuje funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz w gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22 oraz marker selekcyjny, przy czym plazmid obejmuje sekwencję przedstawioną na SEKW NR ID: 1.

Korzystny plazmid jest plazmidem pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1.

Wynalazek dotyczy również nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa, Polska pod numerem KKP 2053p.

Wynalazek dotyczy również zastosowania nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2053p do wytwarzania β-karotenu, korzystnie β-karotenu czystego chemicznie, wolnego od a- i γ-karotenu.

PL 231 220 B1

Wynalazek dotyczy również nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Wynalazek dotyczy również zastosowania nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p do wytwarzania ksantofili, korzystnie kantaksantyny i/lub adonirubiny i/lub astaksantyny i/lub do wytwarzania karotenów, korzystnie echinenonu i/lub hydroksyechinenonu i/lub β-karotenu.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów, który obejmuje etapy:

a) uzyskanie szczepu biorcy;

b) wprowadzenie plazmidu obejmującego funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22 zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów, oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22, i system stabilizacyjny umożliwiający stabilne utrzymanie plazmidu w hodowli bez stosowania presji selekcyjnej, korzystniej system toksyna-antytoksyna typu tad-ata, oraz marker selekcyjny, do szczepu biorcy, przy czym plazmidem jest plazmid pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1 ;

c) selekcję otrzymanych hodowli na podstawie obecności dwóch cech: zabarwienia na kolor żółty, pomarańczowy, czerwony lub brązowy oraz obecności markera selekcyjnego.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów etap b) przeprowadza się przez koniugację trójrodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego wprowadzany plazmid i szczepu pomocniczego niosącego plazmid pomocniczy.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów szczepem biorcy jest szczep bakterii użyteczny w procesie produkcyjnym wytwarzania karotenoidów, korzystnie z rodziny Enterobacteriaceae lub klasy Alphaproteobacteria, a najkorzystniej szczep bakterii należący do rodzaju Paracoccus.

Wynalazek ponadto dotyczy nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy karotenoidów, otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów według wynalazku.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania plazmidu według wynalazku lub nowego szczepu bakteryjnego według wynalazku lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów według wynalazku do otrzymywania szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy karotenoidów.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania plazmidu według wynalazku lub nowego szczepu bakteryjengo według wynalazku lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów według wynalazku do wytwarzania karotenoidów.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania β-karotenu w hodowli bakteryjnej, który to obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2053p.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania astaksantyny w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania adonirubiny w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania kantaksantyny w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

PL 231 220 B1

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania echinenonu w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania hydroksyechinenonu w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania β-karotenu w hodowli bakteryjnej, który to obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.

Ujawniony został plazmid obejmujący funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz w gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22 oraz marker selekcyjny, korzystnie plazmidu, który jest wektorem mobilizowanym.

Korzystnie plazmid jest wektorem wahadłowym, obejmującym systemy replikacji dla przynajmniej dwóch gospodarzy bakteryjnych, korzystnie systemy replikacji dla gospodarzy bakteryjnych z rodziny Enterobacteriaceae lub klasy Alphaproteobacteria.

Równie korzystnie plazmid obejmuje przynajmniej jeden system stabilizacyjny umożliwiający stabilne utrzymanie plazmidu w hodowli bez stosowania presji selekcyjnej, korzystnie takim systemem jest system toksyna-antytoksyna typu tad-ata.

Korzystny ujawniony plazmid obejmuje:

- system replikacyjny z plazmidu pAMI2 (umożliwiający replikację w Alphaproteobacteria), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 607, do nukleotydu 2001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system stabilizacyjny (partycyjny) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 2002, do nukleotydu 3224 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system stabilizacyjny (system toksyna-antytoksyna tad-ata) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 3225, do nukleotydu 4001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ; i

- system stabilizacyjny (system rozdziału oligomerów) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 1, do nukleotydu 606 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ; i

- system mobilizacyjny, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 18577, do nukleotydu 19361 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system replikacyjny z plazmidu pABW1 (umożliwiający replikację w Enterobacteriaceae), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 28254, do nukleotydu 29703 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1.

Opisany został plazmid lub jego funkcjonalna pochodna, która obejmuje sekwencję przedstawioną na SEKW NR ID: 1. Najbardziej korzystnie plazmidem według wynalazku jest plazmid pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1.

Terminy „pochodna plazmidu” lub „funkcjonalna pochodna plazmidu” według wynalazku obejmują plazmidy o sekwencji nukleotydowej niosącej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające sekwencję homologiczną czyli wysoce identyczną lub wysoce podobną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez plazmid według wynalazku, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez plazmid według w ynalazku, tj. zdolności do produkcji karotenoidów. Sekwencja wysoce homologiczna oznacza, że sekwencja jest podobna, korzystniej identyczna w co najmniej 70%, korzystniej 80%, bardziej korzystnie 90%, najkorzystniej, w co najmniej 95%, jeszcze korzystniej w co najmniej 99%.

Ujawniony został również sposób konstrukcji plazmidu zapewniającego zdolność do syntezy karotenoidów, który to obejmuje klonowanie genów crt z Paracoccus marcusii OS22 do plazmidu pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686.

PL 231 220 B1

Opisano więc sposób konstrukcji plazmidu według wynalazku, z wykorzystaniem naturalnego plazmidu pAMI2 ze sklonowanymi genami crtWZYlBE i rfaG (obecny tylko fragment tego genu), które kodują enzymy odpowiedzialne za syntezę karotenoidów. Do identyfikacji i sklonowania genów crt P. marcusii OS22 wykorzystano zjawisko rekombinacji homologicznej i „odzyskiwanie” fragmentów DNA z chromosomu. Uzyskany fragment DNA (zawierający geny crt) sklonowano (w E. coli) w mobilizowalnym plazmidzie pABW1 (Bartosik i wsp., 1997), który następnie wprowadzono drogą koniugacji trójrodzicielskiej do P. aminophilus JCM 7686, gdzie doszło do integracji konstruktu z naturalnie występującym w tym szczepie plazmidem pAMI2. Zdarzenie to miało charakter całkowicie losowy i prawdopodobnie było wynikiem aktywności transpozycyjnej ISPam4 w szczepie biorcy. W ten sposób otrzymano plazmid pCRT01, który jest zaopatrzony w marker selekcyjny - taki jak na przykład gen oporności na kanamycynę, a ponadto korzystnie jest wahadłowym wektorem mobilizowalnym, dzięki czemu można go łatwo wprowadzać drogą koniugacji do różnych gospodarzy bakteryjnych (należących do rodziny Enterobacteriaceae - gdzie działa system replikacyjny plazmidu pABWI oraz klasy Alphaproteobacteria - gdzie działa system replikacyjny plazmidu pAMI2). Przewagą konstruktu plazmidowego skonstruowanego sposobem według wynalazku, korzystnie pCRT01 nad innymi tego typu wektorami, które próbuje się wykorzystywać w produkcji karotenoidów jest fakt, że jest to plazmid stabilnie utrzymywany w hodowli bakteryjnej dzięki obecności trzech systemów stabilizacyjnych kodowanych w plazmidzie pAMI2 [system rozdziału oligomerów, system toksyna-antytoksyna typu tad-ata oraz system partycyjny (Dziewit i wsp., 2007; Dziewit i wsp., 2011)], co umożliwia m.in. jego wykorzystanie w procesie produkcyjnym bez stosowania kanamycyny (jako presji selekcyjnej). Umożliwia to obniżenie kosztów i ułatwia produkcję barwników karotenoidowych. Ponadto, w plazmidzie skonstruowanym sposobem według wynalazku, korzystnie pCRT01, obecny jest pełen zestaw genów odpowiedzialnych za wytwarzanie różnych karotenoidów (karotenów i ksantofili) w zależności od zastosowanego szczepu bakteryjnego.

Plazmid skonstruowany sposobem według wynalazku, korzystnie pCRT01 (którego pełna sekwencja została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1.) stanowi gotową, ruchomą platformę genetyczną odpowiedzialną za produkcję karotenoidów. Jest on korzystnie mobilizowalny, więc można go łatwo wprowadzać drogą koniugacji do różnych gospodarzy bakteryjnych, które dzięki temu zaczynają wytwarzać karotenoidy. Plazmid skonstruowany sposobem według wynalazku, korzystnie pCRT 01, ma szeroki, choć ograniczony zakres gospodarzy bakteryjnych i może się swobodnie replikować oraz utrzymywać w formie autonomicznej w bakteriach z rodziny Enterobacteriaceae oraz bakteriach z klasy Alphaproteobacteria zaliczanych do rodzaju Paracoccus, Agrobacterium, Rhizobium, Ochrobactrum i Sinorhizobium. Plazmid skonstruowany sposobem według wynalazku, korzystnie pCRT 01, jest skonstruowany na bazie stabilnego plazmidu naturalnego pAMI2, który utrzymuje się w populacji bakteryjnej na poziomie 100% nawet po 120 generacjach wzrostu bez presji selekcyjnej. Dzięki temu zapewnia on stworzenie stabilnych szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów. Jak wykazano jest to przede wszystkim wynik obecności w plazmidzie pAMI2 aktywnego systemu toksyna-antytoksyna, który eliminuje z populacji komórki bezplazmidowe (Dziewit i wsp., 2007).

Opisany został również sposób konstrukcji plazmidu według wynalazku lub jego funkcjonalnej pochodnej, niosącego: (i) geny niezbędne do produkcji karotenoidów, (ii) moduły genetyczne zapewniające jego stabilne utrzymanie w komórkach gospodarza (system partycyjny odpowiedzialny za aktywny rozdział plazmidów do komórek potomnych, system rozdziału oligomerów oraz system toksynaantytoksyna) z plazmidu pAMI2 oraz (iii) geny kodujące dwa systemy replikacyjne (funkcjonalne w Enterobacteriaceae i Alphaproteobacteria).

Korzystny plazmid wytworzony opisanym sposobem będzie więc obejmował:

- system replikacyjny z plazmidu pAMI2 (umożliwiający replikację w Alphaproteobacteria), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 607, do nukleotydu 2001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system stabilizacyjny (partycyjny) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 2002, do nukleotydu 3224 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system stabilizacyjny (system toksyna-antytoksyna tad-ata) z plazmidu pAMI2 , który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 3225, do nukleotydu 4001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

PL 231 220 B1

- system stabilizacyjny (system rozdziału oligomerów) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 1, do nukleotydu 606 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system mobilizacyjny, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 18577, do nukleotydu 19361 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ; i

- system replikacyjny z plazmidu pABWI (umożliwiający replikację w Enterobacteriaceae), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 28254, do nukleotydu 29703 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1.

Plazmid według wynalazku, korzystnie pCRT01 został wprowadzony drogą koniugacji trójrodzicielskiej (mobilizacja przez plazmid pomocniczy z systemem transferu RK2) do różnych szczepów bakterii z rodzaju Paracoccus i nadał im zdolność do produkcji karotenoidów. Wśród otrzymanych szczepów dwa okazały się szczególnie interesujące ze względu na prezentowane przez nie właściwości. Są to: (i) szczep Paracoccus kondratievae CRT2, zdeponowany jako KKP 2054p w dniu 10 lutego 2014 w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie, Polska, który wydajnie wytwarza ksantofile (gł. kantaksantynę, adonirubinę i adoniksantynę), ale i karoteny (β-karoten, hydroksyechinenon i echinenon) oraz (ii) Paracoccus aminophilus CRT1, zdeponowany jako KKP 2053p w dniu 10 lutego 2014 w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie, Polska, produkujący głównie γ-karoten.

Opisane zostały również nowe szczepy Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowany pod nr KKP 2054p i Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowany pod nr KKP 2053p w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu RolnoSpożywczego w Warszawie oraz ich funkcjonalne warianty.

Przez termin „wariant” lub „funkcjonalny wariant” nowego szczepu lub szczepu wytworzonego sposobem według wynalazku należy rozumieć szczep mutanta lub szczep otrzymany przez hodowlę zdeponowanego szczepu lub szczepu wytworzonego sposobem według wynalazku jako materiału wyjściowego, który obejmuje plazmid według wynalazku, korzystnie plazmid pCRT01 przedstawiony na SEKW. ID. NR 1 lub jego funkcjonalną pochodną i jest zdolny do wytwarzania karotenoidów.

Wynalazek dotyczy również zastosowania nowego szczepu Paracoccus aminophilus KKP 2053p do wytwarzania β-karotenu, korzystnie β-karotenu czystego chemicznie, wolnego od (/.- i γ-karotenu.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania nowego szczepu Paracoccus kondratievae KKP 2054p do wytwarzania ksantofili, korzystnie kantaksantyny i/lub adonirubiny i/lub astaksantyny i/lub do wytwarzania karotenów, korzystnie echinenonu i/lub hydroksyechinenonu i/lub β -karotenu.

Opisany został również sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów obejmującego następujące etapy:

a) wybór uzyskanie szczepu biorcy,

b) wprowadzenie plazmidu obejmującego funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów, oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz w gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22, i przynajmniej jeden system stabilizacyjny umożliwiający stabilne utrzymanie plazmidu w hodowli bez stosowania presji selekcyjnej, korzystniej system toksyna-antytoksyna typu tad-ata, oraz marker selekcyjny, lub wprowadzenie funkcjonalnej pochodnej tego plazmidu do szczepu biorcy;

c) selekcje otrzymanych transkoniugantów (na podstawie obecności dwóch cech: zabarwienia na kolor żółty, pomarańczowy, czerwony lub brązowy oraz obecności markera selekcyjnego).

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do wytwarzania karotenoidów plazmid będzie więc obejmował:

- system replikacyjny z plazmidu pAMI2 (umożliwiający replikację w Alphaproteobacteria), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 607, do nukleotydu 2001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ; i

- system stabilizacyjny (partycyjny) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 2002, do nukleotydu 3224 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

PL 231 220 B1

- system stabilizacyjny (system toksyna-antytoksyna tad-ata) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 3225, do nukleotydu 4001 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ; i

- system stabilizacyjny (system rozdziału oligomerów) z plazmidu pAMI2, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 1, do nukleotydu 606 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1 ;i

- system mobilizacyjny, który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 18577, do nukleotydu 19361 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1; i

- system replikacyjny z plazmidu pABW1 (umożliwiający replikację w Enterobacteriaceae), który znajduje się w obrębie fragmentu DNA od nukleotydu 28254, do nukleotydu 29703 w odniesieniu do numeracji nukleotydów podanej na SEKW NR ID: 1.

W równie korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów plazmidem obejmującym funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22 jest plazmid pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów etap b) przeprowadza się przez koniugację trójrodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego wprowadzany plazmid i szczepu pomocniczego niosącego plazmid pomocniczy.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów szczepem biorcy jest szczep bakterii użyteczny w procesie produkcyjnym wytwarzania karotenoidów, korzystnie z rodziny Enterobacteriaceae lub klasy Alphaproteobacteria, a najkorzystniej szczep bakterii należący do rodzaju Paracoccus.

Wynalazek dotyczy również nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy karotenoidów, otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do wytwarzania karotenoidów według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nowych szczepów Paracoccus kondratievae KKP 2054p i Paracoccus aminophilus KKP 2053p, czy też szczepów bakteryjnych otrzymanych sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do produkcji karotenoidów według wynalazku zawierających skonstruowany plazmid według wynalazku (przykładowo pCRT01) oraz zastosowanie plazmidu według wynalazku, korzystnie plazmidu przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 , do otrzymywania szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy karotenoidów.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nowych szczepów Paracoccus kondratievae KKP 2054p i Paracoccus aminophilus KKP 2053p, jak i szczepów bakteryjnych otrzymanych sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do wytwarzania karotenoidów według wynalazku zawierających skonstruowany plazmid według wynalazku, korzystnie plazmidu pCRT01 przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 do wytwarzania karotenoidów.

Wynalazek dotyczy również zastosowania plazmidu według wynalazku, korzystnie plazmidu pCRT01 przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 do wytwarzania karotenoidów. Takie szczepy lub plazmid są przydatne w procesie wydajnej, taniej i łatwej produkcji karotenoidów.

Wykorzystując sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do wytwarzania karotenoidów według wynalazku uzyskano dwa nowe szczepy bakteryjne, które również są przedmiotem wynalazku, tj. P. kondratievae CRT2 zdeponowany jako KKP 2054p i P. aminophilus CRT1 zdeponowany jako KKP 2053p. Nieoczekiwanie okazało się, że oba szczepy według wynalazku wytwarzają różne karotenoidy: (i) P. kondratievae KKP 2054p wydajnie wytwarza zarówno ksantofile (gł. kantaksantynę, adonirubinę i astaksantynę) jak i karoteny (echinenon, hydroksyechinenon i β-karoten), zaś (ii) P. aminophilus KKP 2053p głównie wytwarza β-karoten. Dzięki temu mogą być one wykorzystane w różnych procesach produkcyjnych, w zależności od potrzeb producenta karotenoidów. Tak więc dzięki zastosowaniu plazmidu według wynalazku pCRT01 przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 można konstruować szczepy bakterii zdolne do syntezy karotenoidów, wychodząc od szczepów, które wyjściowo nie posiadały wszystkich genów niezbędnych do tego procesu.

Istotne było również stwierdzenie, że dwa szczepy bakteryjne według wynalazku P. kondratievae KKP 2054p i P. aminophilus KKP 2053p bardzo szybko się namnażają (24 h do osiągnięcia stacjonarnej fazy wzrostu), przez co wytwarzanie karotenoidów jest bardzo wydajne. Na zwiększoną wydajność wytwarzania karotenoidów w stosunku do szczepów bakteryjnych naturalnie produkujących te barwniki wpływa również fakt, iż zwykle geny crt występują w pojedynczej liczbie kopii w chromosomie bakteryjnym (tak jak ma to miejsce w szczepie z którego pozyskano geny crt wykorzystane

PL 231 220 B1 w plazmidzie pCRT01, tj. P. marcusii OS22), gdy tymczasem po sklonowaniu genów w plazmidzie ich liczba kopii jest automatycznie wyższa i zależy od liczby kopii plazmidu wdanym gospodarzu.

W wyniku przeprowadzonych analiz wykazano, że szczep P. kondratievae KKP 2054p produkuje 265,4 (+/-10) μg barwników karotenoidowych na 1 g suchej masy, a P. aminophilus KKP 2053p 452,5 (+/-138) μg na 1 g suchej masy. Dodatkowo analiza jakościowa składu wytwarzanych przez oba szczepy barwników wykazała, że P. aminophilus KKP 2053p produkuje β-karoten (szczególnie pożądany na rynku barwników), który jest czysty chemicznie, gdyż nie zawiera zanieczyszczeń formami a- i γ-karotenu. Dodatkowo, wykazano, że szczep. P. kondratievae KKP 2054p może wytwarzać różne barwniki karotenoidowe, reprezentujące zarówno grupę ksantofili (astaksantyna, adoniksantyna, adonirubina i kantaksantyna), jak i karotenów (echinenon, hydroksyechinenon i β-karoten).

Zaletą opisanego wynalazku jest także łatwość ekstrakcji barwników karotenoidowych z komórek bakteryjnych. Proces ten jest stosunkowo łatwy, a przede wszystkim bardzo wydajny (np. w porównaniu z ekstrakcją z tkanek roślinnych), gdyż ksantofile i karoten ulegają całkowitemu uwolnieniu z komórek bakteryjnych. Ponadto w komórkach bakteryjnych brak chlorofilu, który stanowi zanieczyszczenie podczas ekstrakcji karotenoidów z tkanek roślinnych.

Przedmiotem wynalazku jest więc również zastosowanie nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2053p według wynalazku do wytwarzania β-karotenu, korzystnie β-karotenu czystego chemicznie, wolnego od a- i γ-karotenu.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p według wynalazku do wytwarzania ksantofili, korzystnie kantaksantyny i/lub adonirubiny i/lub astaksantyny i/lub do wytwarzania karotenów, korzystnie echinenonu i/lub hydroksyechinenonu i/lub β-karotenu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania β-karotenu, korzystnie β-karotenu czystego chemicznie, wolnego od a- i γ-karotenu, w hodowli bakteryjnej, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus aminophilus KKP 2053p według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania astaksantyny i/lub adonirubiny i/lub kantakstantyny i/lub echineno nu i/lub hydroksyechinenon i/lub β-karotenu, który obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae KKP 2054p według wynalazku.

Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje. Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

Fig. 1. przedstawia ogólny schemat szlaku biosyntezy barwników karotenoidowych u bakterii. Na schemacie zaznaczono reakcje przeprowadzane przez poszczególne enzymy kodowane w genomie P. marcusii OS22 oraz w obrębie modułu genetycznego CRT z plazmidu pCRT01.

Fig. 2. przedstawia organizację genetyczną plazmidu pCRT01 Na schemacie opisano poszczególne moduły szkieletu plazmidu i regiony fenotypowe: REP - moduły replikacyjne, TA - system toksyna-antytoksyna, PAR - system partycyjny, MRS - system rozdziału oligomerów, MOB - moduły mobilizacji do transferu koniugacyjnego, CRT - moduł odpowiedzialny za syntezę karotenoidów, KM gen oporności na kanamycynę.

Fig. 3. przedstawia wykresy analizy jakościowej UPLC karotenoidów wytwarzanych przez szczepy P. aminophilus KKP 2053p (panel A) i P. kondratievae KKP 2054p (panel B) w odniesieniu do szczepów dzikich. Wskazano nazwy wytwarzanych karotenoidów.

Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.

W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. i D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.

PL 231 220 B1

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja i charakterystyka plazmidu pCRT01 oraz określenie jego pełnej sekwencji.

A. Klonowanie genów crt z P. marcusii OS22

Zgromadzone dane literaturowe wskazywały, że geny odpowiedzialne za biosyntezę barwników są zgrupowane w genomie P. marcusii OS22, a sekwencje genów występujące w genomach innych szczepów Paracoccus spp. są w dużym stopniu konserwowane (np. geny crt szczepu P. haeundaensis LMG P-21903 i P. marcusii DSM 11574; Lee i wsp., 2004, Harker i wsp., 1998). Najbardziej konserwowany w tych szczepach jest gen crtW, kodujący ketolazę β-karotenu - końcowy enzym szlaku biosyntezy astaksantyny (95% identyczności ma poziomie sekwencji nukleotydowej). Na podstawie wyników analiz porównawczych sekwencji zaprojektowano parę starterów CRTWL i CRTWR [CRTWL: 5’-tctagaGGCCAATGGTCGCAAGCAAC-3’ (SEKW NR ID: 2); CRTWR: 5'-tctagaGTGGCGACGA CGATCAGGAA-3' (SEKW NR ID: 3)], która posłużyła do amplifikacji genu crtW szczepu OS22. Zgodnie z oczekiwaniami, stosując te startery w reakcji PCR (wraz z matrycą, którą stanowił całkowity DNA szczepu OS22) uzyskano amplifikację fragmentu DNA o długości ok. 840 pz, którego sekwencja nukleotydowa wykazała 98% identyczności z sekwencją genu crtW P. marcusii DSM 11574. Fragment ten sklonowano (w E. coli TG1) w wektorze pABWI (Bartosik i ws., 1997), otrzymując plazmid pCRT1A.

Aby wyodrębnić z genomu OS22 segment DNA niosący zespół genów crt, wprowadzono plazmid pCRT1 A (niezdolny do replikacji w P. marcusii) do szczepu OS22 (koniugacja trójrodzicielska), a następnie wyselekcjonowano transkoniuganty niosące kointegrat (pCRT1A::chromosom), utworzony w wyniku rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomową i plazmidową kopią genu crtW. Z tego typu kointegratów możliwe jest odzyskanie wintegrowanego plazmidu (wraz z przyległymi regionami genomowego DNA - genami crt) poprzez: (i) strawienie odpowiednim enzymem restrykcyjnym całkowitego DNA szczepu zawierającego plazmid połączony z chromosomem, (ii) ligację DNA (w celu cyrkularyzacji liniowych fragmentów) oraz (iii) wprowadzenie mieszaniny ligacyjnej do bakterii, w której dany plazmid jest w pełni funkcjonalny.

W celu wyselekcjonowania kointegratów pCRT1 A::chromosom, samobójczy plazmid pCRT1A wprowadzono do szczepu OS22 (koniugacja trójrodzicielska), otrzymując nieliczne transkoniuganty o niezmienionym zabarwieniu kolonii (żaden z testowanych transkoniugantów nie zawierał autonomicznej formy pCRT1A). Z wybranego losowo transkoniuganta wyizolowano całkowity DNA, który strawiono enzymem EcoRI (brak miejsc rozpoznawanych w obrębie pCRT1 A), a następnie, po ligacji, mieszaninę ligacyjną wprowadzono do E. coli TOP10 (transformacja chemiczna). W rezultacie otrzymano transformanty o jasno pomarańczowym zabarwieniu kolonii, co sugerowało sklonowanie kompletnego (i funkcjonalnego w Gammaproteobacteria) zestawu genów crt. Z wyselekcjonowanych transformantów wyizolowano plazmidowy DNA, który poddano analizie elektroforetycznej. Zidentyfikowano w ten sposób ok. 11 kpz plazmid, nazwany pCRT 1B, zawierający ok. 7 kpz fragment genomu OS22.

Analizy sekwencji nukleotydowej tego regionu DNA wykazały, że w obrębie tego fragmentu znajdują się kompletne geny crtW, crtZ, crtY, crtl, crtB, crtE oraz część genu rfaG (Fig. 2).

IB. Konstrukcja plazmidu PCRT01

Plazmid pCRT1B został wprowadzony drogą koniugacji trójrodzicielskiej do szczepu P. aminophilus JCM 7686R. Doszło tu do integracji plazmidu pCRT1B z naturalnym plazmidem pAMI2 [poprzez losowe stworzenie kointegratu plazmidów przez ISPam4 (sekwencja insercyjna z rodziny IS5/grupy IS427)]. Nieoczywistym wynikiem tego zabiegu było stworzenie bardzo stabilnego, mobilizowanego plazmidu wahadłowego pCRT01 (funkcjonalnego w Alphaproteobacteria i Enterobacteriaceae) niosącego geny crt, kodujące enzymy odpowiedzialne za syntezę karotenoidów. Plazmid ten po wyizolowaniu z powstałego szczepu P. aminophilus CRT1 zdeponowanego jako KKP 2053p (metodą lizy alkalicznej) wprowadzono drogą transformacji chemicznej do szczepu E. coli TOP10. Szczep ten uzyskał lekko pomarańczowy kolor. Był on następnie wykorzystywany jako donor plazmidu do dalszych badań (sekwencjonowanie, konstrukcja szczepów zdolnych do produkcji karotenoidów) .

IC. Charakterystyka plazmidu pCRT01 i określenie jego pełnej sekwencji

W celu zsekwencjonowania plazmidu PCRT01 o wielkości 30,5 kpz wyizolowano go metodą lizy alkalicznej z 200 ml nocnej hodowli E. coli TOP10 niosącej ten plazmid. Plazmid pCRT01 zsekewencjonowano metodą pirosekwencjonowania stosując strategię typu „shotgun” na sekwenatorze GS FLX Titanium (454) (w pracowni Oligo pl.). Do konstrukcji biblioteki DNA wykorzystano ok. 5 gg DNA pCRT01 i zastosowano dostarczone przez producenta zestawy odczynników (GS FLX Titanium Library Preparation Kit, Roche). Skonstruowana biblioteka została zsekwencjonowana i poskła

PL 231 220 Β1 dana z wykorzystaniem programów z pakietu Newbler de novo assembler (Roche). Uzyskane sekwencje zostały następnie złożone w kontigi z wykorzystaniem programów Seqman z pakietu Lasergene package (DNAStar). Adnotację sekwencji plazmidu (wyróżnienie otwartych ramek odczytu i określenie ich potencjalnych funkcji) wykonano z wykorzystaniem programu Artemis oraz programów BLAST (z bazy NCBI).

Sekwencjonowanie plazmidu pCRTCU wykazało, że jest to kolista cząstka DNA o wielkości 30 498 pz i zawartości par GC 61,9%. W jej skład wchodzą 32 otwarte ramki odczytu (ORF), co stanowi 80,1% sekwencji plazmidu. Poniżej w Tabeli 1 przedstawiono szczegółowy opis wyróżnionych ORF w obrębie sekwencji plazmidu pCRTOI (SEKW. ID. NR 1).

Tabela 1

Wyznaczenie potencjalnych sekwencji kodujących plazmidu pCRTOI w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1. *Numery podane w sekwencji kodującej odpowiadają nr nukleotydówz SEKW. ID. NR 1.

ORF nr .	Region kodujący*	Orientacja genu		Funkcja		Najlepsze trafienia BLAST’ ' l·
Wielkość białka
% identycznoś ci	-i Organizm	Numer dostępu w GenBank
1	67-506		179	Resolwaza	100	Paracoccus aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_003208111
2	1126-2001		291	Białko replikacyjne RepA	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP-001965061
3	2230-2889		219	Białko partycyjne ParA	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid ρΑΜΙΞ)	YP_001965062
4	2886-3224		112	Białko partycyjne ParB	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP-001965063
5	3308-3685		125	Toksyna systemu addykcyjnego (Tad)	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_001965064
6	3666-4001		111	Antytoksyna systemu addvkcyineqo (Ata)	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP.001965065
Ί	4088-4657	-	189	Białko hipotetyczne	98	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_001965066
8	4695-5573	-	292	Białko koniugacyjne TraG	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_0032C8112
9	5835-6083		82	Białko hipotetyczne	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_003208113
10	6158-6514	•	118	Białko koniugacyjne MobC	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_003208114
11	6881-10474	-	1197	Białko koniugacyjne TraA	99	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid ρΑΜΙΞ)	YP_003208115
12	10501-11070	-	189	Białko hipotetyczne	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_003208116
13	11382-1220S		275	Tranpozaza ISPam3	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YPJJ032C8117
14	12206-12469	-	37	Tranpozaza ISPam3	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP 003208117
15	13541-15829	<-	762	N, N-dimetylo1ormamidaza, duża podjednostka (DmfA2)	99	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP-003208118
16	15825-16250	-	141	N, N-dimetylolorrnamidaza, mała podjednostka (DmfA1)	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP 003208119
17	16282-17316		344	Regulator transkrypcji DmfR	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMl2)	YP_003208120
18	17766-18299		177	Tranpozaza ISPam4	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_0032C8121
19	18205-18537	-	110	Tranpozaza ISPam4	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YPJTO3208121
20	18708-19079	-	123	Białko koniugacyjne TraJ	100	Bakteria niehodowana (plazmid pTB11)	YP_112412
21	19409-20014	4-	201	Tranpozaza IS903	99	Escherichia coli (plazmid plS2)	YP 001687821
22	20151-20966	-	271	Gen oporności na kanamycynę	100	Corynebacterium diphtheriae (plazmid pNGA2)	NP-478145
23	21667-22395	-	242	Oksygenaza beta-karotenu (CrtW)	99	Paracoccus marcusii MH1	CAB56059
24	22392-22880	-	162	Hydroksylaza beta-karotenu (CrtZ)	99	Paracoccus haeundaensis	AAY28418
25	22877-24037		386	Cyklaza likopenu (CrtY)	98	Paracoccus sp. N81106	P54974
26	24034-25539		501	Desaturaza fytoenu (Crtl)	99	Paracoccus haeundaensis	AAY28420
27	25536-26450		304	Syntaza 15-cis-fytoenu (CrtB)	99	Paracoccus sp. N81106	P54975
28	26447-27328	-	293	Syntaza difosforanu qeranylorjeranylu	99	Paracoccus sp. N81106	BAE47470
29	27494-28189	<	231	Glukozylotransferaza karotenoidów	99	Paracoccus sp. N81106	BAE47471
30	28936-29271	>	111	Białko hipotetyczne	100	Salmonella enterica G8430 (plazmid pU302S)	YP-194804
31	29704-30237	-	177	Tranpozaza ISPam4	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2)	YP_003208121
32	30143-30475	•	110	Tranpozaza ISPam4	100	P. aminophilus JCM 7686 (plazmid pAMI2}	YP_0032C8121

PL 231 220 B1

Ustalona organizacja genetyczna plazmidu PCRT01 została przedstawiona na Fig. 2. Uzyskana pełna sekwencja plazmidu PCRT01 została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1.

P r z y k ł a d 2. Wytworzenie szczepów P. aminophilus CRT1 zdeponowanego jako KKP 2053p i P. kondratievae CRT2 zdeponowanego jako KKP 2054p zdolnych do syntezy karotenoidów.

Aby wykazać, że plazmid PCRT01może być zastosowany do konstrukcji szczepów zdolnych do syntezy karotenoidów wprowadzono plazmid PCRT01 do dwóch szczepów należących do Alphaproteobacteria: Paracoccus aminophilus JCM 7686R oraz Paracoccuc kondratievae NCIMB13773R, niezdolnych do wydajnej produkcji karotenoidów. Jako metodę wprowadzania plazmido wego DNA zastosowano koniugację trójrodzicielską opisaną w Sambrook i Russel, 2001. Oba skonstruowane szczepy zostały zdeponowane w dniu 10 lutego 2014, w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa, Polska, pod numerami KKP 2053p (P. aminophilus CRT1) i KKP 2054p (P. kondratievae CRT2).

2A. Konstrukcja szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 (KKP 2053p)

Szczep został wytworzony równolegle z konstrukcją plazmidu PCRT01 (patrz Przykład 1B). W celu jego wytworzenia plazmid pCRT1B (otrzymany jak opisano w Przykładzie 1A; plazmid niezdolny do replikacji w tym gospodarzu) został wprowadzony drogą koniugacji trójrodzicielskiej do szczepu P. aminophilus JCM 7686R, który jest pochodną dzikiego szczepu JCM 7686, oporną na ryfampicynę (co umożliwia selekcję biorcy). Dzięki obecności sekwencji insercyjnej ISPam4 w naturalnym plazmidzie pAMI2 szczepu P. aminophilus JCM 7686R doszło do transpozycji, a następnie przypadkowej integracji plazmidu pCRUB z plazmidem pAMI2, co spowodowało całkowicie samoistne wytworzenie plazmidu wahadłowego PCRT01 niosącego geny crt, kodujące enzymy odpowiedzialne za syntezę karotenoidów. Zdarzenie to miało charakter losowy i wynikało prawdopodobnie z aktywności transpozycyjnej ISPam4 w szczepie biorcy. Co ciekawe, nie udało się potwierdzić aktywności ISPam4 znanymi technikami molekularnymi, co biorąc po uwagę ograniczenia wynikające z zastosowanych metod świadczy o bardzo niskiej częstości transpozycji (<10^-8) tej sekwencji insercyjnej i tym bardziej podkreśla losowość i unikatowość zaistniałego zdarzenia.

Uzyskanie plazmidu pCRT01 spowodowało jednocześnie wytworzenie szczepu bakterii zdolnego do produkcji karotenoidów, tj. Paracoccus aminophilus CRT1 (KKP 2053p), który to szczep uzyskał intensywny pomarańczowy kolor świadczący o wytwarzaniu barwników karotenoidowych.

2B. Konstrukcja szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 (KKP 2054p)

Plazmid pCRT01, po wyizolowaniu metodą lizy alkalicznej z P. aminophilus KKP 2053p (otrzymanego w 2A) wprowadzono drogą transformacji chemicznej do szczepu E. coli TOP10, skąd plazmid został wyizolowany i poddany analizom sekwencji nukleotydowej (sekwencjonowanie). Jednocześnie szczep ten stał się donorem plazmidu pCRT01 do konstrukcji innych szczepów zdolnych do produkcji karotenoidów.

Plazmid pCRT01 wprowadzono drogą koniugacji trójrodzicielskiej do szczepu Paracoccus kondratievae NCIMB13773R, który jest pochodną dzikiego szczepu NCIMB13773, oporną na ryfampicynę (co umożliwia selekcję biorcy). Kolonie ryfampicyno- i kanamycynoopornych transkoniugantów miały zabarwienie pomarańczowe. Obecność autonomicznej formy plazmidu pCRT01 w tych klonach potwierdzono poprzez liżę alkaliczną. Wybrany, pomarańczowy klon został poddany analizie składu wytwarzanych karotenoidów. Otrzymany szczep został nazwany Paracoccus kondratievae CRT2 i zdeponowany jako KKP 2054p.

P r z y k ł a d 3. Analiza ilościowa i jakościowa karotenoidów wytwarzanych przez szczepy P. aminophilus KKP 2053p i P. kondratievae KKP 2054p.

3A. Ekstrakcja karotenoidów z bakterii

W celu przeprowadzenia analiz ilościowych i jakościowych karotenoidów wytwarzanych dzięk i wprowadzeniu plazmidu pCRT01, jak opisano w Przykładzie 2, przeprowadzono ekstrakcję barwników karotenoidowych z bakterii wg następującej procedury. Do próby dodawano 1,5 ml mieszaniny aceton:metanol 8:2 (v/v), sonikowano w myjce ultradźwiękowej przez 5 min i ekstrahowano przez ok. 2 minuty bąbelkując roztwór argonem i intensywnie mieszając. Następnie dodawano 4,5 ml naargonowanego heksanu. Zamkniętą w obecności argonu probówkę wytrząsano intensywnie przez 30 minut w ciemności w temp. 2°C. Probówki odstawiano na 5 min. w celu rozdzielenia się faz. Pobierano górną fazę heksanową, zwracając uwagę aby nie pobrać dolnej fazy lub emulsji mogącej powstać pomiędzy fazami. Pobraną fazę przenoszono do erlenmajerki, argonowano, zamykano korkiem szlifowym, zostawiano w ciemności. Do pozostałego ekstraktu dodawano 4,5 ml naargonowanego heksanu oraz 1 ml propanolu. Wytrząsano 30 min jw. i pobierano warstwę górną, łączono z poprzednią,

PL 231 220 B1 argonowano i zamykano. Do próby dodawano 4,5 ml heksanu, wytrząsano jw., i wciąż argonując pobierano warstwę górną. Następnie fazę polarną przenoszono do szklanej probówki wirówkowej. Wirowano w 2°C przez 15-20 minut na najwyższych obrotach (4500 rpm). Supernatant łączono z pozostałymi fazami heksanu, osad odrzucano, zebrane frakcje nasycone argonem w erlenmajerce filtrowano przez mikrofiltr Milipor Millex-CV13 Filter Unit 0,22 μm do probówki Corex 50 ml. Odparowywano do sucha w atmosferze argonu w temperaturze ok. 30°C (ok. 0,5 godziny), wykorzystując blok grzejny. Odparowany osad zawieszano w 1 ml argonowanej mieszaniny metanol:propanol:heksan 6:1:3 (v/v/v). Tak wykonane ekstrakty, zawierające frakcję lipidów nieacylowach, w tym głównie ksantofili i karotenów, poddawano dalszym analizom.

3B. Analizy jakościowe składu karotenoidów wytwarzanych przez szczepy P. aminophilus KKP 2053p i P. kondratievae KKP 2054p

W celu przeprowadzenia analiz jakościowych wykonywano ekstrakcję wg procedury opisanej w 3A. Analizy wykonano z wykorzystaniem systemu ACQUITY UPLC system (Waters, USA). Separacja próbek była monitorowana w zakresie długości fali 200-700 nm. Na Fig. 3 zaprezentowano wyniki rozdziału chromatograficznego barwników.

Analiza jakościowa składu wytwarzanych przez oba szczepy barwników wykazała, że szczep P. aminophilus KKP 2053p produkuje głównie β-karoten, który jest bardzo czysty chemicznie, gdyż nie zawiera a- i γ karotenu. Dodatkowo, wykazano, że szczep. P. kondratievae KKP 2054p może wytwarzać zarówno ksantofile (astaksantyna, adoniksantyna, adonirubina i kantaksantyna), jak i karoteny (echinenon, hydroksyechinenon i β-karoten) (Fig. 3).

3C. Analizy ilościowe karotenoidów ze szczepów P. aminophilus KKP 2053p i P. kondratievae KKP 2054 p

W celu przeprowadzenia analiz ilościowych wykonywano ekstrakcję karotenoidów w 80% acetonie w połączeniu z 15 minutową sonikacją. Pomiar przeprowadzano przy długości fali 453 nm. Ilość wytwarzanych karotenoidów w trzech niezależnych próbach obliczano z wykorzystaniem prawa Lamberta-Beera z uśrednionym milimolowym współczynnikiem ekstyncji dla karotenoidów.

W wyniku przeprowadzonych analiz wykazano, że szczep P. kondratievaea KKP 2054 p wytwarza 265,4 (+/-10) μg barwników karotenoidowych na 1 g suchej masy, a P. aminophilus KKP 2053p 452,5 (+/-138) μg na 1 g suchej masy. P. aminophilus KKP 2053p wytwarza więc bardzo dużo β-karotenu i dodatkowo niemalże w homogennej frakcji.

Literatura powoływana w opisie, włączona niniejszym jako referencie:

Bartosik D., Białkowska A., Baj J., Włodarczyk M. 1997. Construction of mobilizable cloning vectors derived from pBGS18 and their application for analysis of replicator region of a pTAV202 miniderivative of Paracoccus versutus pTAV1 plasmid. Acta Microbiol. Polon. 46: 387-392.

Bhosale P., Bernstein P.S. 2005. Microbial xanthophylls. Appl Microbiol Biotechnol. 68: 445-455.

Dziewit L., Adamczuk M., Szuplewska M., Bartosik D. 2011. DIY series of genetic cassettes useful in construction of versatile vectors specific for Alphaproteobacteria. J. Microbiol. Methods 86: 166-174.

Dziewit L., Jazurek M., Drewniak L., Baj J., Bartosik D. 2007. The SXT conjugative element and linear prophage N15 encode toxin-antitoxin-stabilizing systems homologous to the tad-ata module of the Paracoccus aminophilus plasmid pAMI2. J. Bacteriol. 189: 1983-1997.

Harada H., Misawa N. 2009. Novel approaches and achievements in biosynthesis of functional isoprenoids in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 84: 1021-1031.

Harker M, Hirschberg J i Oren A (1998) Paracoccus marcusii sp. nov., an orange gram-negative coccus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 543-548.

Higuera-Ciapara I., Felix-Valenzuela L., Goycoolea F.M. 2006. Astaxanthin: a review of its chemistry and applications. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 46: 185-196.

Humbelin M., Thomas A., Lin J., Li J., Jore J., Berry A. 2002. Genetics of isoprenoid biosynthesis in Paracoccus zeaxanthinifaciens. Gene 297: 129-139.

Lee J.H., Kim Y.S., Choi T.J., Lee W.J., Kim Y.T. 2004. Paracoccus haeundaensis sp. nov., a Gram-negative, halophilic, astaxanthin-producing bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1699-1702.

Lee J.H., Kim Y.T. 2006a. Cloning and characterization of the astaxanthin biosynthesis gene cluster from the marine bacterium Paracoccus haeundaensis. Gene 370: 86-95.

PL 231 220 B1

Lee J.H., Kim Y.T. 2006b. Functional expression of the astaxanthin biosynthesis genes from a marine bacterium, Paracoccus haeundaensis. Biotechnol. Lett. 28: 1167-1173.

Math S.K., Hearst J.E., Poulter C.D. 1992. The crtE gene in Erwinia herbicola encodes geranylgeranyl diphosphate synthase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 6761-6764.

Misawa N., Satomi Y., Kondo K., Yokoyama A., Kajiwara S., Saito T., Ohtani T., Miki W. 1995. Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177: 6575-6584.

Muntendam R, Melillo E, Ryden A, Kayser O. 2009. Perspectives and limits of engineering the isoprenoid metabolism in heterologous hosts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 84: 1003-1019.

Sambrook J., Russel D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Sandmann G. 2001. Genetic manipulation of carotenoid biosynthesis: strategies, problems and achievements. Trends Plant Sei. 6: 14-17.

Tsubokura A., Yoneda H., Mizuta H. 1999. Paracoccus carotinifaciens sp. nov., a new aerobic gram-negative astaxanthin-producing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 277-282.

Umeno D., Tobias A.V., Arnold F.H. 2005. Diversifying carotenoid biosynthetic pathways by directed evolution. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 51 -78.

WYKAZ SEKWENCJI

SEKW NR ID: 1 - pełna sekwencja nukleotydowa plazmidu pCRT01

SEKW NR ID: 2 sekwencja nukleotydowa - Starter CRTWL

SEKW NR ID: 3 sekwencja nukleotydowa - Starter CRTWR

PL 231 220 Β1

SEQUENCE LISTING <110> Uniwersytet Warszawski <120> Plazmid pCRTOl i jego konstrukcja, nowe szczepy bakteryjne, ich zastosowania oraz sposoby wytwarzania karotenoidów <130> PK/2420/AGR <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 30498 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> pCRTOl plasmid <400> 1 ttttgatgct tgccccatga cgcgcggcgt cagcgcggtc acggtgacgc cggatcgggc acaccggcgg ttgatccatg ggtcgccccc acaagaagcc ctttagagcg ttctctattt tggcgagt cg agcgtgcgga ttgaccgcct tgaggtttta cggtcagggg ttatctacgc gtccgccgtc tacgcggccg tggacgcgct gcccatgagc ccccctgccc gaggggcgta gaaatctaca gtggcgctgg gagccgtcaa gcgctgaaga gggaacgagg ccggaaaagg cacagcgcgg cttgacgagc cttggtcgtg tatctaaaag ggagtgaacg tgatcggata tgctgacggc gccccgagct ggcttgatcg aggccgaggc gccgcatggt agcgcaccag tgccctgtcg gaccgagatt cgccgaccag ctcacgcaag aacccgagag aggccggatt gagggacgac tatcgaagcg tttctaaggt tagagcactc cttgtcgtca ctatcggctg acagcgccgg gccgcaacgg cacgctgccc tctggcggcc acgaggcggg acgtgctgcg tcaccacgat acctgcgggc ggcgcggccc cccggcagtt aacaggaagc tggcggtgtt ttgtgcagaa gtggaacata gtagtagctt tgcccgtgtc tgggtgcaag ggcgaggctg cttggcccga gggtttgcga gctgacgttc cgccggccgg accgagcaga gcccggctcc ggccactaga ggattgcaga caagttaaac cttgtgcagg gcgggcttgc aaacaaggga cgtcagacac tacttcgcaa tgtccttcaa cgcgcgcggg gcagctcacc cgcgggatcg gacgccggtt gacgacgcgc tttgcgccag gctgttcgtc catggatcgg gcatgggttc acaggtccag cctcgggcgg ccgcgcggcc cgaggctggc acgcgagtcc agcggtcgcc cagacggtga tcgaccgagg cgcgtgttcg ctggatcatt tcgacgcgcg tctctggccg tttgccggtg gcggccgcaa tcgcgcacgc tgggtgtgca ttttgtcgtc atctcgccat tggaaagcgt ctgatctgcc gagggcgtgc cataacgacg accgtagaaa ggttgattct aagaaggacg cacgcgcttg gacgacgagg gggcagtcgg cgccggcgca aaggacgtgc aagggcgagc aatctcatag ctgggccggt atcgactggc caggccagca ttcggcaagg gagctggacg gatagcccgc gataaccaga gctgttcggg gcatagcagc gccagaccct aggaaaaggc tgcagcccgg atcttctcga agccttgggc ttgccgagtt aggcgaaggg gcgccagctc tcgcgctacc cggccctaga ttaggttctt ccgaaacctg cggcgatctg gccgatcatc aaacccctga tggggccaaa tgcgaaagca agactatgtt atgaaatcat ccgggcagct cctttagcct gctatttcaa aggcgatcct gcagcggccc acttccgcac cgcgcgatac tgcggcgtta acgcctaccg ccccacccct cctacagaaa taggtcgggc ctgaatcccc ccgctttcgc gaaagcccct cgaccagcag atccggcgcg taacgtggtg catagccgaa cgatacgacg cgagcgcagc ggttcggttc atcgcggagg ctctatcggg aatagggctt catgtagaca cgtgcgcggc gtcgcggaga gaagaagcgt ccgctggtaa atcactcccc ggggagtttt gaggacgcac gcgggaggtc ttccacgcag ggtcatgccg gggccggtca gaaggcggcc gctaggatcg cggccgactt catcgtgagg cgaaccgacc cctgtccctg gcccgacgac gtccctgccc gctcgcagcc atctgatctt ggccctgcgg

120

180

240

300

360

420

480 54 0

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040

PL 231 220 Β1 cggttccggc gcagcacctg ttaacctgaa actgcaacca atcgcgacag ctcgacccgc gttgcctcga atggattggg aagcacgccg gaacctctaa ctcgtgcatc ttcaacctgt gccttgggta ggcctgttca aaaacatgag cgacagcgcc atagtccgca cccaccactt acgacaaagg tcgccaaata catgtaagca gttgagcatg gatggagctt cggcgagcag agtggttgag agcggtcttc ggaagacatg gaaaaatgcg ttgctgatct aaatcaccaa ggcttccgca gcaagctaat ccgctggtcc ttgcatgtca cgtgacgatg aggtttccat tctgcggaag gaatgctcgc ccttgtgctt ctgtagagag tcccatttcg cctcactcga gttcctggcg cggcctcgga gtggggaccg gcgagcttgg ggcaggttgc gagatccccg tgcccgagca aagacgccgg tgaacgtcct cgctctaccg gtttccggtt agccagcgcg ctgcgcttga ctgtcaagga gatttgccga tgcatgtctg ccgcacatag cggccaccct atcatgtaaa tgattacagt cacttgcggt agacgaacgc tccagcccgg tgttcataga acatggtgct agcggttgct cgaacgccgg cggtcgcgcc agaccccgca gct tcctttc ccgcaagccc agtagttccc ggcggccgga gccgccgacc caagcggatt caatttcccg tggtttcact ggtcaagacg ccggccgatg cacccagcgg aacgacgtgg gtgcttcatt gacgttatcc cacccgcatc ggtgttgccc ggctgtgcgg gccaaaggtg gga cgctctg ggtcgggcat tcatgttttc agcagggcct gagtctggcg gtgccgaacg cgttttgcgg cacggcgaca ccgcagggcc caggttcggg aaccctcggc cagatcggca aggatcgagg gcgcttacgc tcgcgatgac ggacctcatc atttgtcgga gatcggagat cgt tcgacag gcaggatggg gggccagatg tgtggggatc aataggtcga gatcggcgaa aatgggtatg ggtggcggtt cgatcagcgc gcgggccggt tcccgcttgc catgcttatc agcgttctgc tgccgcgcac cgtcaactgg cgctatacgg cacgcccggc gatcccgacc cgatatggca gggccgaa cg catccatatg ggagctggaa ggagcaggca tcgcttctgg gccgcgtccg acctatgttc tattgggaga acgcaggagc gtcgttcgag taaggcaatc aacgaacact tgcggagttt cgaaggtgct gcggcacata gcttccagaa gggcgaggct gttgatggga gacgctgaaa cggcttgatc tcgtcgcttc aaccgcctcg ctgacgcttg cattgcggct acaaaagcga ctatcgacaa ccgagacgcg attcgagagg gccgcgtccg gcaagattca cagggggctt cgaggatcag tggggttcca aacatgccct cggatcgaac aggccgttgc gggggtcagc atcgagcgcc caggcgggcg gaaggtgccc ccagagctgg gccgagggcg gcgggccatg gaggcgatcc gcggaaatcc acgctgcgcg tgcggcgcgg ggcgaaggct gtggcaccct ttagaattaa gggaagcatg acgcaaaagg ttggccggaa tttgaccggc cgctcgctgg aagatggaca caagcgcaga ggcaacccgc gccgacgatg tcgcgtctga ccgcaggggc agcatgtata ccgcagccat atgcgcccac cgccatcacg cgctggaaga ggctggtggc agggcaggga ggggttgaaa ggaatggatt catagggttc caaaggcttc ccgagctgtt aaagagcaag caaggtggcc tcgaggtcac agctgaaagt tcacgcagga tgcgcgggga gctatgacat ctgtcgcgtg ggatattgcc agtaatggct gcagacgatg cgcggcgatg gatagggaca gccctgcggc gccccggcgc tgagcctgtc cgattgcggc gttcttcatg ggggtgaggt agcccccgga ccggcgagga aggggccggg cggctcatgg ctgtcgtgat gccttt tgcc acgccgtagc gcaaactca t tcgagcaggc gggggcagga gaacggccaa gaggacagga gcgaccagcc gcgggcgcgc cagcaccaaa gcaagcggga tttgtttctt gcgggaccgg aaaaatcggc gtgaaggtga aagcctatcg gtgcctcgac tattcgcaat caaccttcgt ccgccgcgat aagcctatga gggcggcgca caggtaaaca taagacggtt cgaactgaag ggccaacaag actcagcttc cgaggcgctg gtgacaggaa ttatacctga ggcagtagct gcgttgcatt ggcggcgctg tatacggtca agcggcatcg gaggctctgg gaccacctcc gaaatctggc ggaagccggg tttcagtaac tgaaatcact atcgcatgat gaagccgctt gccgtccatg tgcgaatttg gaagaatccc atattccggt gaacgcgctt gtcagcgccg gcgcagctcc gtcaatgctg ctcgccaagg tccaattctc attctggatc acagcaactc cggtgtgttg tctggaacac cgttgacccc cataggtggc cggccatgag cgagcagata tttgcgtgac cgaggaacat gcacggcggt cgccggcggc cggcggcggc gggtgagata aatcccaccc agggtggcgc tacatgaagg caagacgaca gctgctcgac cgggccggac cggcctcggt cgaagcggcc cgacaccttg cgtcctgaat agccgaacgg ggatgcgccg ggaagtcgct tgaaagggtg gagcagccag cgggccgctc acggccaaga cgaacgcgcg aacctccttt accatgtttc acaggtatag acaaagactt tcgcgcagca gcgttctgga agtttgagga cca cgccgaa caaaggagat ggcaatgtat ctgatgatcg cggcgcatgg ctgtccgagc gtgcggccca gcaaacatga gatgcgcgag agatgatgga atgatgcatg gcgtgatcat gcgtggcgtg tcaaacagcg ggaccacttt gccgtcattt cgcttgagca atcacgaaca tgcggcaggg ggtataatag gacattctgc ctcgccatag gaccgtttcc gaagacctgc gcggagctgg gcccatggcg gaggaccggg cagcaggcgc cgaggcgttg catgcgcggg ctcgcggtcg cgtggatgcc gtcgcgcagg

2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 25Θ0 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 54 60 5520

PL 231 220 Β1 gtggcgagat agcgttccgc tgacgaggcg cgaccagccg accgagggac ggcgagaacg gttttcgcca cagcatgtcg ctttctgtcg ctcatcttcg ttcgcccagg ctgccggcgc gatcggcaaa gccactcgcg ccagcgcacc ttgcccgaag gcgccatggt gtaatgtcgc gtcgggtctg ttcatcatgg tcatatcatc agaagttgag ggctggcgga catgaagccg cggggaacgc tgtcgaacat ttcgaccttg tgagttcgag ggagctggca cccgcatgat ggtgacggat ggcgaacggt gatcgccaac tatggagcgc ggagcggcgc tgccgatctg cgtgttcgac ggagttccag ggagcgcatg ggtcgagatc tggcgtcgat cagcgccggg caccgggccg gctcgcggcg gtcggggaag gtcctggtcc gatcgacgag ggcgcgcggg cggtgcgccg tcggcagcgg cgaggggctg tgcgcgcggc aagggttgcg cacactacag ggacaccggc ccggatcgtg tgtcgagcgg agggcgtagc ttcgtcggcg ctcatcctgc tccacgcgct ggcaaggggg agggaggcga cggctcatgc ggaggtccgc atctgatcgt agccagatga gtaacaaagg aggaaggcgc gccgcccgtg gagggccttg caggcgtcgg gagcagcacc ggtggcgcgt ccggttctcc cggccttcct tccttcgttc atcggctgtt gtagcgacat aagggtgcac aggtggcgaa gtttcgcggg ctgaccaacg gcggagatcg tggaacgctg gttgccctgc caagagctgg gccagcgacg gagggcttgg ctggcgacga gagcatctgg gggcttgaga ggccttgatg atccgggaga cggcacgacg agcgcctttg aacccggaga gaatccggca cagcggcatg gatgcgtcgg gagcggattt gcgcgggagg gcggccgagg cgcggttggg gcgggcatgg gcgaagatcg ttccgggcga gtggactggc gcggcatacc gagatcgtgc atggcgcatc gacaggggtg gcgcgggttt ttccttgaga gtcgaggaag gtttctgtgc gtttcctcgc aaatcggtca tcgccgtcct cgggtgcgac tggcactggc ggtcagcgcc ccatttcgct cacagatata aatggcgcga catgacagtc gatagagctg gtcccggtgg tcggtttctc gcaaattcct ttgcggcggg tgtgcgtcca gctgtgcagg tgcggcggca tatcttcgga ctccttgaat tgacgagagc ttacgagtta acggtatcgg cgtcggggcg agcgcgacgg tcttgccgga cggagttttc cgcatgagct cgaaccgcta ttcgcaacca gcgacaagac ccgacatgca cgcgggccgg tcgtgccgac tggggcgcac agccggagca ttgcgcgggc ccaaggtgat cgggggaggt tgatcgagag tcgcgcgcgc ccgggctgtc ctgcggttgt catgggaggc ggttggagga agaacgaccg tggggagccg tccttgtggg tcacggaaga agcgcgaggc gcgagcgggg gcgattacct gccgggcgga agctggcccg tccagaccaa acaaccgcga gccggattgt cgatggacag gtgccgcgcg tgtctgtgcc cgatggtcgc cgctgccaga cgggacgcac gagcaggaag atgggtgaag gccgacgcct gtcgtgccgg ctgcgcgccg catggggtca tcggcgctgt gggtgaggaa catccttgcc tgtcgttggc gttcggccag gccttcaatc agagcggcgc atgtccctta cttcacccac gccataccga ctacgtaact agcctgttgc cagcgccgtc catcacgcat gggcgtcaag cgagaaacgg gaccgccgag cggcgcggcc ccatgcccat ctatcttgag gcttcgcgat gcatgatctt cgagcatatg gcggctggac ggtgctgacg gctgcatcgc ggcttccccg cgagcgggcg cgcgcagcgg catagagcgg ggacgagcag cggttttgcc cgagggctac atcttccggc gcaccagctt ccagctttct cgatcacgag aatcggccat ttccgttgac cgacattcgg tgccgaccgc tgtgcaggcg ggccagcgtg tgacgggcag ccttggcgtg cgccacgctg ctatcaggcc atccgccgcc ggtcgcggcc accaaggggg ggttccagcc ttttgtgcat gcggctgcga gcaatgcgat tcggggccga gagccgtaag gtaaagatgc ggcatcagca cgccggggca gtcgggcagc gttctcaagg gcgttcctgt cttctgt tca tcaggatcgc tggtctttcc tagctagatg atttcagcag gcgacgactg cagcgcgcca ttggcgatct gcctcgatgg gactacaccg gtcgattggg aaagacgccc cagcgacttg gtggattttg gttatgatga cgcgagaaca ctgcgccagt cggatcgacc ggcgtccatg gatgatgcgg atcatcaccg tacatcaacg gccctggtcg cggtattcca atgcacggca caggacgcgg cgccgggcta ggtgcgggca cgggtccatg atccagagtc ggccgcggcg cggttcgtga cagctacagg gccgagctgt ttcgccacgc ttcagcgaga gaggcgcggc atcaatgacg cccggcgagg cgcgagttcg aagaacgggg gacgggccag atcgaccacg catgcggcaa cttgagaggg atcatctttt ggacccgcag ccacaggcag tgccgtcgcg gcccggccag tctcgccggg tcgcctcgat aggtgcccgg ccgccttgcc ggggcgatca tcgcggcgca cgacggagga ttcccgagcc atcgtctttc ctcatcgggg cgtttgcgtc gtcgggtgtg aatattggcc agtgaaacga ccagcttgtg accatttcag cctatcgcgc ccaagcaggg cgcgggatcg gcgttgcccg aggccacgcg cgatccattc cgacgcggca aatggctgct cttgggaagg atcgctcgca ccacgcagat cgcagcgcaa gcgagaaaag acgacgcgca agcttcagcc cccgcgaaat gccgggatca cgatacagcg tcgggcatat agtccaccat gtgcggcctt gcacgctggc acgtgttcgt ccgaggccga ccatcggggc ccgaga ttcg atcgcacggc cgggcgaggg cagacggcac cgatccgcac gcgaaggcaa cgccgggcga ggcttgccac ccggtgcgga gctatgcgac

5580

5640

5700

5760

5820

5880

5940

6000

6060

612 0

6180

4 0

6300

6360

6420

6480

654 0

6600

6660

6720

8 0

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

3940

9000

PL 231 220 Β1 gacgatccac gatggaccgg tgcggcgcag gccgttcgag gggcgagcgg cgagatcggg tggcaccgag ccagcttgag cgattttgcc tccgcgcgag cgggcgggag tgcgcaggat tggtgcaggg cgacggcctc gccggaaagg cgcgcggccg ggttgaccag cgcggccggg cctggcgcat ccgtcaagtc ggccgggcgg ccggtatgat ccttgagcgc cgctgaggaa cggtccccgg atggtgcgca tccgacgatc ccggccgagg gcggaaatgg gccgcgccgg gcccgtcacc gcccgcgaaa ggctattcca cgggagcggg ggggtgttcc ataagttagg acgattttgt cgctcgatgc tctcaaaata ccggtaatcc tt catggcgg agccattcgg cattcgtggc ggctggatgt acgta ttcgg tggttcaggg ccctcgcgat cggtccgcca tcgggcttct cagtagatcc aggaagcaca gcgatcatct ccgaacgcgc aactcccggc cctgcatgct tcatctggct tcgcgctgct gt cgcagcac aaaaatcagg catctgacct gatgattttg cataaagacg cgcaccacat gagaagatcg acgcagcgca cgccggttgt gagcggcgcg gggcttgtcc caggccgagg cttcgcgcgg caggtcgagc aggctcaatg gaaagggagc ctgtcgccgc catatgcgcg cagcagctcg gatccgcgcg atcgacggta ttcgttgacc ggcgaggcgc gatccgcaga ccgcagcgcg cacagccggg ggacgatccg cggggcggtg cgttcgatgc cgattatccg aggattacaa tcgaagccgt tggcgctggc ccgatctgcg cgcggcaaaa ttaccctggt ctttcgcgca cgcgaaactt ccttcaaagg agcgagagtt tccccgtttt gtgtaacgcc tggcgatctg ggaccgtccg atgtcagggc ggccgttgtc agcggacgac tgaagtcgtc tgaaatccat cgcgcttcag ggtgaacccg gcccgaaccc cgttctcttc ggcacgccag gtcgagctgg cagatcggcg catcattgac gatcccatgc gcgcatgatc gcgcgacggt atgttgccat tcgaccggca gcaaccgccc ggggcgtgga ggcttcacca atgcctggaa cgcggtctgg ggatcgcgga gcgacggcgc gt cacgcggc ggtccggtgc gccagccaga ccggttcccg ggcagttgtc ttgaggcggc agggcctgcc atcaggtgag cggttcgggc tgaaacgcga gctggcagga gcgagaaggt tggagtccct agaagccagt ggcatagtct ggatattgtt ggatgatgac gctgcggcgc tcaaggcgtc gccccagctc cgagaagcta gggcaactcg ccagacgacc tctcgcgctc tctgctgtag cgacttttgc agtaattatg gagaactgcg tccatttctc aa cggggtgc gccgatgccc ctgcacctcc gttgtaacgc gatgccctgc gaccctgatc ccgttcggcg tagcacgttc cgaccagacc ccgtcgccgc cttgtggttc ccacgtcttg gtcgcgcctc cgcgatgctg ccgcgtcact aacatgcgtt acgtccatgc tcgcggcaca tgtgcctcgg ggaccgggcc gacccggcat ggcgggccgc gagctacttc cctggaacgc tatcggcgct ggtgcgcgat cgtcaaggaa aagccttggc ggcgctacgc ccgatccccg cgatacccgc gcaggccgcg cgagcgcggc ggcgccggtg cgtggaccgc ggttctcgac cgggggcctc catgaccgga aaacgcggcg cctgcaagag cgaggaccag tctgcggggt cgcccgcgag gtgacggcag gctggcaagg gagccgctgc aggatcgagg gagcgggcct gcccagatcg cctgttctcc ctggtgcggg cgcaccctct gccgttgccg cctgcgctaa gacagaaatt cgacaatggg atcggctgtg tcatggcatt gaccgtagaa atattcgggc tcgatggttt tcgacatagg ttctcggccc gccaggggct ggcagcgaga agaagccgga aggttcgggg ggcttgatgc cagacatgcc tggacattgg ggactgtagc acacccttcg tttttccaag tcagccgccg cgccatactt actcgcccac taaatctcgt tttgtcatgg cgcgacgggg ctggtcgagc gtgacgctgg gccatggccg acccccgtca gcccgcgacc accacgctcg atccgcagcg gcggacaggg cagaagatcc aaggatcagg ccgcgccgtc gcgcagccgg cccgagccgc tatgcgcggg atgcagaagc aaagacctga ctttccggcc ctggccgatc cagcaccggc ttgagcgaca cgccggcagg ctgcaaaccg gttttgagga tcacgtcgga cggaaccgga tgcagggcgc ttgaggaatt tgaagcagct ggcacgggcc aggccgccca ccgatctcat ccatcgccgg gtgtcgcaaa cccctgcaaa gttaaacaca cgcgttcaga gagctctgct ctcacgcggc gttcgttgtt caaagatgta cgttctgctg aggtcatcag ttccgcgcca agtcgacctc attgccgccc catccggcac gcaggttcag ccttcacgtt tcagccccac ggaaacaggt tcgccaccgc agcctctcga gttctcgtct cgcccgccac gggcataccg cttcttcatc cctcgggcac cgcagctcta atggggccgc aaggtgacaa aggcagcgcc ccctgccgga tggcctatga attatacccg agatcgaggt aggccccggc gcgaagatct cccccgatca gcagcatgtt aggcggggcg tggcggcgcg cgtatcagtc aggaattgcg tgcactcgac gggagcgcgt ccgccgtcag agctttatgg tgatccagag agcttggact atgtggaacg ggcggtggtg ggaaccggaa atccggtgat gcagctcgcg tgaccgcatg tggcgtcgtc ggattactac gaagatcgag cgaaggcgcg ggtcttcctc agttggtcgc attagcgccg aatatcggaa aactcccgcg cgccgatcgt cattttcagc gtaggtccat gaggtcgagc cggcttgccg cgtggaactg ttcgatgatc gatccccagg gtcggccaag ggccagttcc ctccagttcg ccgcaggtgg cagcaggtcg ctcgctgacg cttctcggcc agcaggtcgg tcgagcgcct ttatagaacg ccctcggcct agaatctcct

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11880 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 12420 12480

PL 231 220 Β1 cgtcgatcct tccttctctt cggttacgca acgaggatgg gaaaagacga atgaattcga gcgcttgcct tccttccaga tcggggatat tatgcaggtg acacgctgcc tgaaaataga ttccgtccga aacgccaagc gtcgaccggc cacaagccgg gcataagcct cgtcgatccg cgtctttcat tattccacga tggccgtgga ccgggtgcgg aactcgccag cgtatccgcc tgccgtccat cggaatggtc cacgcccgcg gagcttccca ggtgaaccga cggcgagata cggtgagcac ctgtcgcaac ccggaagctc gacgccgcca ggccatagta gaccggcaac ggtagctaaa gcacgaagaa cgctcttcag ggcagtcctc cgtgcccgtc gatgaccgtt ccgccgaaaa gcttcattgc cgttgaaatt cgattagcag tgtcggagtc tctggtggag cctcttgaaa tcgtaaagac cccaccgtga gaaccgagaa tgccaaactg actcctcctt cagcctcata gagcggcgct cgctgttcag tgcattgcct gccgagaaaa ctgcgttcgt gcagatcctc cgagtaaact tctggctcag gcgtgctgac ttcggtcaag aacgcttcat cgagcatcaa tccgtaatcg tctcgacgac aatgccgaat agagaattcc gcatccagtg gcacattccg atgatctcgc gatccagaac tggcgggcac gaactgcgta aaggctgccc gaagtaggtt aaacgacttg aagcagggta cgcacctccg aatccaggca gaacccgaag gaaccggccg cgcggtcacg gacgatccag gtcttcccat gacgttatag gtcgtaatcg ccagatggag tgaggtatac gtcgaggttt ggcttgcccg cgtgctggcc gggaatgtag cccgtcgggg gtggaaccac ccagttccac gcccgaaata gtcccagtgc ttcttcggaa ggcgatacac cgaggttctc gagtggcact cgagatcgtc tagcgggcgg cagccggcct aacaagccct cgcgccgtcg ggtgcgctga gtaacccggc tgagccatcg gagcctgtcg cctgcgacag cctcctcggt ttctacttcc aaaatcccgt ggtcaggccc ggagatcaag aacggcaaga cgtgtgttct cattcctgtc ctctgcgtag atgctcatgg gcgaataacc actagttccg ccgctccgcg ttttccgagc ccagacgggt cgatgacgta ggctggt cag atcaaggtcg atatgtttca agaacgttcc agccaggata atatccgccc tcgtccggaa tttggcgggg ccgacaagcc gcgcgcttgt ctgctcatcc ccgcgccggc ccgagctcct tacattccat gcgtcggcat cgacgaagca aacccgttgt ccaaatccct tggacgccgc cgatggagct atatccgcct agaacaagga tcctctgaat agggttattt aatgcgccgt ccggtggagc tcgacgacgt gcgagcctgg ctgagcgctc caggtccgcc gagtcgcccg acaagcccaa ttctggacgg tcgctgatga tcctctatcg tggcggcccc gccagcaatg aagcgcgccg cccgcgggat gacgtgtccg cagtaccccc ttcgttt cgg ggcgaagcta gcatcccctt gtcagctttg acgccacctt acgaagatct acctgtagta tgatccgcca gaataatctg cgatttccat agggcggcgt cgctccagcg cagatggcct atgagccggt agcaacgcgg tgcgacacgg ggcttcgaca ccgcgaacct gtgtgttcga agtaaagtcg tggtcatccg tcgacgatgt gcacgaacgg tgaccgtata ttccgagcga caccgtcccc cctgactgtc cggtgcccca cgttcgcgct tgcgaacctc tcgccgcaag tggcccatgt gatccacgcc gattgagcca gcctgtgctt gcccgtcgac cgacgtcgtt tgtgcatgat ttttagccgt cgccgtagcg caaagtcctt attgctgagg cgcgatccgg ggtcggtcgg accagggctc gtccgtaaag cgtcagccgc gcgaaacctg atcggctgtt ggtcgaagac cgcggttggt ccaggctcca gtcccggggt ctccgcttgc ggtagctccc tggtgtcgcc cactgacata tgattttgac acatcctcga tcatcggtga aaccatcggg ccgaataggt tgtacgcctg gagtttgacc taacgataca gagagccgaa tctgccagtt ccacctcctc catcccgcac cttgtgcgcg cgatatgggc gcataagcca caacgagaag gcagcattat ccgaaagcta ccggcactga atggaca atg ctagaccagc cgacacgttg gctgaacatg atgctctccg caccacgctg caggtcatag gatcctctcg gggcatctgt gatcttctgg gtagtgaCac catcacccag gtacattcct ctggtactcc ctgttcattg gtcgatcagg ggggcgaaga atgcccgtca ctcgttgagg ctgctcgttg tgcctttccg gatcttcatc gtcccaccga gcagtgaatg ctggtttacg aattccatcc cgccactgtt tttcggcgcg agccgcctct cgaaacggcg cgtcctgttg cgcagtcacc cgtgccgctc gccgcactga ggtcgaccat gtccggcacc gtcggccgca gtggatcaga gaagcgaatg cttttcaatt tccgcttcag gcaccggcag aggattaccg tgcataggcg caatccgacc agatgaactg aaatgtcgtg caatgggaat gaatcgcaac acccttccac cgtctggcgg gtcgtccaga taggagaaac atcgtcccgt aatgagggct tgccggggtc ccaagccccc aacgccaggc cccgccaggg ggcgcaggtt ttgtcgtagt ccgccgccat ccgttcatgc tgctcaaccg cgatccagct tcaggatcga acgaaataac gtagcccggg tcacccggtg ggtttctctg cgtccgccat ggatgagagc aggtcgtgct tgcaggtcag ttcaagatgg tatgtcgaaa acaggcgtat gcataggcta cggggcggaa gcgtagaagt cagtcgtcaa aaattttcct cactggccgt gggccaattc ccttccgcca tcgatcttgc cccaggccgg gaaacggtcg acgaccgact gaataccaca tcgtcgccaa cgttcgtcgt agaaacgtgt tccacgaagc gacttgaccg cggacgagct gtttcacccg tgcaatctcc gaacacggca cttgccgaac

12540

12600

12660

12720

12780

12840

12900

12960

13020

13080

13140

13200

13260

13320

13380

13440

13500

13560

13620

13680

13740

13800

13860

13920

13980

14040

14100

14160

14220

14280

14340

14400

14460

14520

14580

14640

14700

14760

14820

14880

14940

15000

15060

15120

15180

15240

15300

15360

15420

15480

15540

15600

15660

15720

15780

15840

15900

15960

PL 231 220 Β1 tcgcggatct ccgaacgttg tttcggtatc atctcgatga tcgggatacg tccgtgtcgg cgtggtggcg attttctatg actggtcagc cggcagatcc ctgatggatg atctatgccg gctcttcgca tgcggcgcac gacgaatgta atgtttcctg cagatagctc gcttttggaa aatccagcgg gtctgaatag aagcgacatg ttgttcgcag cgatggactg tggcctgatt aatgatctga cggtgtcaga cagcaatcac tcgtgcgtcc gggccggctg ggacccattg gggtgatgat tctttccgaa ttttcatcaa agacgctcta tggggctggc aggcgcaccg cgtctgatcg ataggccgcc gcggccttgc gccgactggc aagtcgcgcg gagatcatgt ccaaaggtct aagaatgagt cggtgatgta gcttggcaat ctcgggcgga gccagcaggg cagagtttca acgtgctcat gccgacaggc aggcagtaca cgcttgccct ttgagcaccg cctacttcac accctttggc ataatgaccc gtatatatga cggctatccg gctgcatcct cgaagggatt tttcctccct ccgatgggtc atcttgcttt gcgaggcgcg tgccggtcga cccagcgcgg gtggttccgt gtttcgtcgc cgagcgtttc cagcagctga tcgtcaggcc gccaaaaccg ctgtcggtgc gttgagccgc tagtcgaact taggcgggat ccggaggagg gccgcccatg gaatggcctt gtgtagtgcg accactgtgt gaaaatcaaa cgaaccggtg ccttccggta gctttcggcc cgacagggcg atttgcttga gagcaacctt gagccatggt ccgcaatggg caaccgctgg ctccgggggt tacggcttcg gtcgcacgaa cgatccgctt tggactgcct tccgggatgc gcaagcccat tcggcaggct tcctcgccgc cctgacccta cttcaccagc cacgcgcacc ccacgcccat cgaggatcgt gcaggccgcc agtccacgac tcatgccggc ccttgatagg catctgttac ccaggtgcga ctatcctgcc aaaatcctgt cgaagcaggg gtaaacttgg ataggagctc gaaatagttg tctttcatgc ccttttgcga ggaaacatag gttacccgtg caagcgctgc cggtccgagc acagggagca gcaccacgag aaggatgcca catatttctt aaccggggac tgaggtttcg gtgcgatgtc tggtgtggag cactgtatcc ccgtcgtttc caatcgacat cgattgaccg gcaccaggcg cggcggcgat cattgtcgat gtagatcaca atcgggcatg gccggaacag cttcaagacc gcggtctctc agctcggggc ggctgggcgg tactggctga cgtccacggg ttgcgttggt gtccgctgga ggtgaggaga agcctgcggg gggcggactg cttcatgacg gccggatgca cttgaaagac caagcacgac caaggactgg cgtcacactc gatccttttg tccgcgaagt ccccggccgt catgaccttg ggcatcaccg caggcggccc gcccgtgatt cgccgccgcc tgggctgccc gccggcggta ataagggaca cggctgacgc atatcgtgcg ttatgcagcg tctgacagtt cattcccgtt tggacgcgct tcgtcgatta tcgaaatatt ttttctctt c tgaaaggtaa ccggttgctt cgacagccga gacctcggcc ccacccccga gcaggcgaga gacgataccg tgcttgtata gagcagtgcc gtcgatgaac gttgccaata gccggggagc ccagttgaag gtagatgttg atgccgacgg gtgcagttcc ggaggcaatg tttcatctgt ctaaaaagtg gctgttcggc ccggaagccg gcgccagaga ggcgactgcg tgaaaggggc gttgcgtgat cggacgacca tcgatgaccg gtgatgctcc gccggatggg aggtcgtgat tcaaaaaggg aacaccaagt gcgggccagg gattggctga aaggggataa aagcgccgct cgccgcgttg gctgcaaccg gtccccgggg cgctcttctt tttagcggct ccaagctcgt aaccgcgccg aggtcgccat ttgtagccct ttttcctcaa ttcctggttg gccggccagc gtgaagaagg cgttggatac aaaaaggatg gaaaagatcc accaatgctt ctgtgtaaat gaaggtgcgg tctccggatg cgtaccagtc gttgattcat tcgctgagcc gcggcgatct aggaccgccg tgtctgacgg gtgcacatct ggcatgcgct caggccagtt tttccgtccc cgcggttcct tgcagggcgt tacctgttgc caccagttcc tacggtttgt tcgaggtagc gtgatcgggt tcgaggacca tttgacaaaa gctctccatc t cgcatgggt acaggttggc ccctggcttg tcatccggct gggcccgaag ctcgctgtcg tcaagctccc gatggagcgg gcgcgttctg gcccgagtac ggttttcgcc gatcgacgcg gggccgacga tgcacgcggt tcagcgacta t cgccgaccg agccctgcat acaaacggcg ccacccgcta tcatcttctg atcggtcttg gatggagcgc aaaaaagtca cctgcttctc tgcgcgggtc tgatgcgggc ggccgacggc t cgctcttcg gcttggtttc ctcgcagagc aacacccgct accaaggaaa gatataccga gtcgaccaaa aatcagtgag gtagtatttg acttgggtgg gctgtcgatg ggcgctcctg ttcattctcc tcattacacc tttcgaggat atatctgaga tgaggctgaa tgaattgaac ggccaaggac cgtggatctc ggtcgatgaa gccatatgtc cggtcgatgg tgcggctcgt gtgccgaaac tgctgcggac tgatggtttc catagacgga gcccgagcgc cccggcgctg ggatcgtgga aaacttaccc atggccaagg ggacgataac ggcgctcatg cggacccgga gctaggttca gaactgacgg ctgcggccct agtgggataa ggtccgccga cggatgatgg acgtatctca caagcgcggg cacggatgcc catcggtgcg tggctatgac ccccggccgg caaccggatc cgacaggtgc gctatgaaac ccttgctcgt atggggacgt tggctctgcc ttcgatcttc gtcggtgagc cagctcgcgg cagcaggtag ttcgtctgga atcagccatc aggattcccg cgcgggtggg gtctacacga aaaaatcgct tcaatctaaa gcacctatct

16020

16080

16140

16200

16260

16320

16380

16440

16500

16560

16620

16680

16740

16800

16860

16920

16980

17040

17100

17160

17220

17280

17340

17400

17460

17520

17580

17640

17700

17760

17820

17880

17940

18000

18060

18120

18180

18240

18300

18360

18420

18480

18540

18600

18660

18720

18780

18840

18900

18960

19020

19080

19140

19200

19260

19320

19380

19440

PL 231 220 Β1 cagcgatctg cgatacggga caccggctcc gtcctgcaac gtagttcgcc taaagccctg tgatggcaag accaggcctg ctttgttgta cgttgtcggg aaagccacgt catgaacaat ttcaacggga atgggtataa atgggaagcc atgttacaga tcaagcattt aaacagcatt tggcagtgtt atcgcgtatt gtgattttga aacttttgcc ttatttttga accgatacca agaaacggct atttgatgct gcattacgct gaaggatcag caaaatcacc ctggctggat cagacctcag caggctgacc tccgttgcgc gggcgatcgg aggcgattaa agtgccaagc gcaacgggga gacaagatga tcgggcggca gcggcggcgc ggacttttca gccaatgcgg atgatcgtca gaccatggcg gaggggctgc atgtacgtgg ggcacctggc tcgtcgcgga cacgaacacc ggggacaccg cggcctattc cccaccacga cggtgatcgc tcgccttggg atcagcgctg cccaccgcct atgcgccgcc aggcgcagga tctatttcgt gggcttacca agatttatca tttatccgcc agttaatagt cgcagcgcgc gtcagaatag aatcgcccca ggtggaccag aagatgcgtg tgtgtctcaa aaaactgtct aacgtcttgc atgggctcgc cgatgcgcca tgagatggtc tatccgtact ccaggtatta cctgcgccgg tcgtctcgct tgacgagcgt attctcaccg cgaggggaaa ggatcttgcc ttttcaaaaa cgatgagttt gacttgacgg atcacgcatc aactggtcca gatggggcga cgctattctg ctgcgcgctg tgcccggatt tgcgggcctc gttgggtaac ttgcatgcct tggaaaccgg gcgcacatgc tcatcgccgc atcccatcct tcatcgcgca cgatgggcca agcacatggc gcccggtccg tgctgcccgt tcttctggcc tgccgcaccg tcagcgaccc acctgcaccc catgaccaat cgtccaccgc ggaacacgac cacggtgctg catgaccgtc gccgttccgc gcaccatgcg ggtcgacaag gcgcacgtga tcatccatag tctggcccca gcaataaacc tccatccagt ttgcgcaacg agggtcagcc cgctgaggtc tcatccagcc ttggtgattt atctgatcct aatctctgat gcttacataa tcgaggccgc gataatgtcg gagttgtttc agactaaact cctgatgatg gaagaatatc ttgcattcga caggcgcaat aatggctggc gattcagtcg ttaataggtt atcctatgga tatggtattg ttctaatcag gacggcggct ttcccgacaa cctacaacaa ttcaggcctg accttgccat cgcagggctt acaggggcat ttcgctatta gccagggttt gcaggtcgac cgatgcggga cctgcccaag gtggctggcc ggcggtcgcg tgacgcgatg gctggtcctg ccatcaccgc ctggtacgcc catcgtgacg gctgccgtcg ccccggccac cgtgtcgctg gacggtgcct ttcctgatcg tggatcatgc cacgcgctgg ttcacggtgg tatgggctga tatgtcccgc gtcgagggac ctgaagcagg cccatgacgt ttgcctgact gtgctgcaat agccagccgg ctattaattg gaacattcat tgaatacgcg tgcctcgtga agaaagtgag tgaacttttg tcaactcagc gttacattgc acagtaatac gattaaattc ggcaatcagg tgaaacatgg ggctgacgga catggttact ctgattcagg ttcctgtttg cacgaatgaa ctgttgaaca tcactcatgg gtattgatgt actgcctcgg ataatcctga aattggttaa ttgttgaata cgcagaccgt agctctcatc gtatgagtca cacgactgtg tattgattcc tcgccattca cgccagctgg tcccagtcac tctagaggat ctgtagtctg gcagatctga ctgcatgtgc aatttcctgg catgggtcgg tggctgtatg catgccggaa cgcttcatcg ggctatgcgc atcctggcgt gacgcgttcc ctgacctgct tggtggcgcc tcgtcgccac acggccccct aaaagaacga gctggatctg tctatttcgt gcaagggcta gcgaccattg acctgaagac gctgctggca ccccgtcgtg gataccgcga aagggccgag ttgccgggaa cagtgtaaaa tttaatgacc agaaggtgtt ggagccacgg ctttgccacg aaaagttcga acaagataaa aaggggtgtt caacatggat tgcgacaatc caaaggtagc atttatgcct caccactgcg tgaaaatatt taattgtcct taacggtttg agtctggaaa tgatttctca tggacgagtc tgagttttct tatgaataaa ttggttgtaa aatcgaactt tccgtggcaa aaccgtggct gcaacacctt ctggtcatta atttttacac ggctgcgcaa cgaaaggggg gacgttgtaa ctagaggcca cgcggatcgc ccgccaccag atgcgctgtg ggctgacctg tcgtgccggg ccggattttc ccgacgacga gcacctattt tgatcctggg cgatccagct cggaccgcca ttcactttgg tgcccagcac cgtgctggtg aggctggggc cctgtacgga ggcgccggtc cctgcatgac tgcccgccgc cgtcagcttc gtcgggcgtg ggggcgggcc tagataacta gacccacgct cgcagaagtg gctagagtaa atggaatcaa agcacagtcg gctgactcat ttgatgagag gaacggtctg tttattcaac aatatatcat atgagccata gctgatttat tatcgattgt gttgccaatg cttccgacca atccccggaa gttgatgcgc tttaacagcg gttgatgcga gaaatgcata cttgataacc ggaatcgcag ccttcattac ttgcagtttc cactggcaga ttgctgagtt agcaaaagtt ccctcacttt cttcacgagg aacgcgtatt tgatgaatgt ctgttgggaa atgtgctgca aacgacggcc atggtcgcaa cggtccgggg cctgatcgtc gtttctggac gctgtcggtc gcgcccgcgc gtggcgcaag cccagatttc cggctggcgc ggatcgttgg gttcgtgttc caatgcgcgg cggttatcat ccgcaccaag atggagttga tggcacaagt ctggtctttg ctgtggtgga gggctggtgc ttgtatcagg ggcttcatct ctgcgggccg ttgcgaacgg

19500

19560

19620

19680

19740

19800

19860

19920

19980

20040

20100

20160

20220

20280

20340

20400

20460

20520

20580

20640

20/00

20760

20820

20880

20940

21000

21060

21120

21180

21240

21300

21360

21420

21480

21540

21600

21660

21720

2178 0

21840

21900

21960

22020

22080

22140

22200

22260

22320

22380

22440

22500

22560

22620

22680

22740

22800

22860

22920

PL 231 220 Β1 gctgatcgcc tgccgcggga ctggctggcg tccccgccat ggatgcggtg tgctcacggg gcggggcgcg gatcgagacc ccagcaggac cgaggacacg ccacgactat cctgcccatt tgtccccgtg tgcggcgcag gcgcggcgcc tttgaaccgg gttctaccgc ggatcagctg cctgcccgaa accgccatcg gcgggcatcg tggcacgatc ctgaaagagc gtgtcaccct gccgatcagc cgcttccgcg cccttcctga tacaagtccg ttttcgtatc ctgatccacg ctggtcgcgg aaggtcgccc cggtctttga ctgctgggcc tctatgtcgc cacaccatcc aagctggccg gcgcctccgg gagatcgatt gagcggctga gatttcgcca acgcaatccg gt cggcgcgg acggcccagg ccgaggcgat gcatccgcga acggtcaggc gcctgcgcgc cggcgctgcg tcgaaggctt aatattccta gcgacgatcc tcgcacgcga tggaccaggc tcctgcggct at ctgccgcc ggctccgcat ccgccaagat ctggcgctgc ccgtcagacg cggctgaagc gcccggcggc gtccggtcgg gcgacgctgt cagccgtcgc gaccgccccc gggtaccgct cgctattccg gcccgccagc gcgctggccc ggactgcgcg gtggcggacg atccgcgatt atgctgttcc atgccgcatg cgcatcgtca cgtcccctgc tgatcggcgc ccaccaccct agggacacgt tgtgggcgct tctatcggct tggagcgcca attacgcgga agctgggcca tccatgccaa acacgctgct cgctggagcg gcatggtcac ggatcgagac gggccgacat ataccgcccg tgttcgtgct tgttcggccc aggatttctc gcatgtccac gggcggtcga tcccgaacct gcgaactgaa cgtggttccg gcacccatcc tgatgctgtc cacccaaggg cgacacggtg cctgggcagc cgacacgctg cgcggtggcg tgcgatggat tcacgtcgca tgtcctggac cgtgatcgac gggcgcgcgg gctggatgcg gcgctgcgcc ccgcaagggc cgggctgctg gcgcggcgcg gccacacctg ccctgcgccg tggccaccgg gcgccgagat cctgcggcac ggcatctgac acggcgtgcc tcatctatct atggcggcga ggggctggac acgacgcggc cggggttctt tggtggcggg acgcgatcga gcggctgcgc gactgatcga ccggtaaacc tgaaggaaaa aggctttggc ggtcgaggcc cttcgacgca gaccgggcag ga tgtggccg gatcgcccag ggaggtgtac gatgctgaag ggtcgcgacc ggtgggcggg gcgcggcggg gctgttcgaa cgagggcgcg ggtcgccagc cgggcagagc gcatttcggt ccgctacaag gctgtacctg gcactacgta gggaccgcgc gcgcgccaac cgcccatcat gccgcataac gggcgcgggc cgacctggcg tcgcaaagct atgctctatg cgccccgagg gccgcgttgc cggaggcatg gtcgaggcgc ggcatcgtcg cgcgcctgcg gatgcgcgca atcgacgggc gcagaaccct tggtccatcg gggccggagg ggcatcgggg gcccgacctg gtcctgccac cgccaactgg ttacggctcg ccgctggaac ccggatcgag cgtgggtttc ccgcccgatg gctgcccttc tctggacgac cggggccgag gggcttctgg tcacccggtc cctgtccggg ccgggcacgc gcccgatcgg acgcttctat gcccattccc cgcatgaacg gggctggccc cgggacaagc ggtcccacgg gacatggcgc ggcgggaagg ttcaacccgg caggagggct gccgcgcccg ttcatcaagg aatcccttct gtctggtttg cggcttggcg cggaccacgg aacggcgacg cgcgcgaaat ctgcgcgagg gagctggtca cattcgccct ctggccccgg tatgccgacc ctgaccacga ggcagcgcct cgcgacaaga attccgggcg ggcgcatgag ttgccacggc cctggtgccg cggtgaacga agggcgacgg atttcccgca gcgactatcg gcgtgatgat acctggggct tcgggcggtg cggtgccgtc attacgcgtc ccgccgcgct cctatcgcca gctgggatgt cgggtgctgt gaccccgacc cccgaccagg ct.ggacgggg agcgacatcg gcgggcgcgg cagaaatttg atcatggacg tctccgacgc gacgcgctgg gtccggcgcg accgatcacg accggctatt ccgcccggca cgcgaccgct cgctataccc gctggccggc cttggcacgg cccattcgcc tggccatccg ccggcgggcg tcatcaccga gcgacgtgac tctttgatta acgatctgga acgtcaagct cgctgatgaa acccctatct cgaccagttc ccaagggcgg gtcagatgat gcgtcaccct tcatgcacaa cgctggaccg cgcccaagga acgagatctt gcacgaccga tgccgcatct gcatcctggc cgcgcatctt tctcggtcga cgatccgcaa tcgtgggctc cgatctggtc ggccaagctg ccacgcggat cccgcaggcg tccggtgacc ggcctggccc cacgctggat ggcccgcgtg ggcgttccag ctatctgccg gccggagctg ggcgcgggtg gcggatctat gcggatcagc cgcgcgatca tgctggacct tgttgccgga aggtgcgctt cggcgctggc ccctgctgga tcctggacgg tgggcgtcga cgaccgtcac gcatcctgat cggcggcgtc aacgcggcat cggcgggacc cgctgcccta ccgacgcgct ttctgcgcct tgctgcagcg tgagcgtggc ccatccgctg tgcggccaag cctgcagtcc cgcctatgtc ccccgatgcg gctgatgccg cgtaaa cgag gggataccgc gggcaccgtg gcttgaggcc gcggcaggcg gatctatgcg caccaaccag gctgaacgcc ggcggacggg ctatcgcgac caagcgctgg catcgcgcat caagggcccg tccggacatg gggccgcgcc gtccctggag cacgcccgcc gccgatcctg ctt eta tctg ggccaaggcc ctgacctcga atgccgccgg gacgtgatcg cggctggacg ccgccctttg atggacctga gatgtgctgg atgggcgtgc ctgaccaaca ggggactggc tacaccgtga ggtctggcgg cgcgccatcg acgtccaagg cgcctgccgg

22980

23040

23100

23160

23220

23280

23340

23400

23460

23520

23580

23640

23700

23760

23820

23880

23940

24000

24060

24120

24180

24240

24300

24360

24420

24480

24540

24600

24660

24720

24780

24840

24900

24960

25020

25080

25140

25200

25260

25320

25380

25440

25500

25560

25620

25680

25740

25800

25860

25920

25980

26040

26100

26160

622 0

26280

26340

6400

PL 231 220 Β1 gggcgggcgt cgtagggcag gcagcatcgc ctgacacggc tgccaagcgc ggcccagctg tcacggccag gttcgacccc cctgcggccc cgccacgcgc cggcacggct cgtccatgca aggcggcgtc gcatgccgcg gctgcgacac cgtggatcgg ggaaggtcag tggaacggtt ttgtccaaca ccggaaacac ggtcggccgc cgtcgtccat cggtgttcga tgacgaaggg catcgcgcgg tcatccgcag tggccaggat ggaattgcgg tgtctgcggg ggtcgcaatc ggctggcctg ggtcatagct ccggaagcat cgttgcgctc tcggccaacg acggtgaaaa atgccgggag cagccatgac tcagagcaga aggagaaaat gtcgttcggc gaatcagggg cgtaaaaagg aaaatcgacg ttccccctgg tgtccgcctt tcagttcggt ccgaccgctg tatcgccact ctacagagtt tctgcgctct aacaaaccac aaaaggatct aaactcacgt acccattgat gtgatgatga tttccgaaga ttcatcaacc gtcgcggcag aacccgttcc gtccagctgc cagaaggccg cgcctggtcg acggccaaag catctccagc cgcgccgttc cagggaccgc accggccagc ttcgccatgc gggcaggtcg gacgatcgtg gaaccgcttg ggcaccgaat gttgacgtct gccggggcgg cacgcccgat aggtcagtgg ccgcgccgca gtcacccgga gtcgacgatc tccgatcacc ctcggtgaaa gcgcatggcg ccaccagctg caccgtgtcg aaagccgcgc caggcgcagc gaccccatcg gaacagcgtc gtttcctgtg aaagtgtaaa actgcccgct cgcggggaga cctctgacac cagacaagcc ccagtcacgt ttgtactgag accgcatcag tgcggcgagc ataacgcagg ccgcgttgct ctcaagtcag aagctccctc tctcccttcg gtaggtcgtt cgccttatcc ggcagcagcc cttgaagtgg gctgaagcca cgctggtagc caagaagatc taagggattt ttgcttgagg gcaaccttta gccatggtcg gcaatgggtt ggcctctgga agcagggccg gcgcggctgg cgccgcgggc cccacgacgt tcgatcatct ccggcgatga ttggccgcgt gacaggatcc agggccattg gccacatggg tcgaagatca tcgcagaccc cccgacgaca ccctgggcga cgtctcatca caccccgtga tgcgagcctt accggcgcgc tcgtgatcgg ttgtccagca aggccgttct aggcatccgg tagacatgcg ttcacgtgga tcgccgcgcg aagtcgtcac aagggctcca cagtcgaaat ggcatcacgg gggcaccagc tgaaattgtt gcctggggtg ttccagtcgg ggcggtttgc atgcagctcc cgtcagggcg agcgatagcg agtgcaccat gcgctcttcc ggtatcagct aaagaacatg ggcgtttttc aggtggcgaa gtgcgctctc ggaagcgtgg cgctccaagc ggtaactatc actggtaaca tggcctaact gttaccttcg ggtggttttt ctttgatctt tggtcatgag ctgggcgggt ctggctgacg tccacgggtc gcgttggtgt cccggccgca cgatttccgg cctcatagtg cgggggccgc ccagcaggtc gggtctgctc acagcacgcc gcaggtccag gcaccagctg cctcggtgat tcgcgggctg gcgatgcggc cgcccgaggc gcgcgccatg tctcctcaag gtgccttcgc cccgtcatcc ttcgacggcg cgatggccgc ccaggatcgt cccaggccat ccatgtcgcg tggccatcgc cgtgcgaggc tgcggcggtg ccagcggtcg gccgcgcctg tcccgcgggt cgatgcgcgc tgatctggcg tggcatcggc atccgctcac cctaatgagt gaaacctgtc gtattggctg cggagacggt cgtcagcggg gagtgtatat atgcggtgtg gcttcctcgc cactcaaagg tgagcaaaag cataggctcc acccgacagg ctgttccgac cgctttctca tgggctgtgt gtcttgagtc ggattagcag acggctacac gaaaaagagt ttgtttgcaa ttctacgggg attatcaaaa tgcgtgattc gacgaccaga gatgaccggc gatgctccgc tcacgcctag agcctgaagg gcgggacacg cgcatcgcga gtcataggac ctcagcgtcg ggtcttcagg gtcctggccg cgcccgcacc cagggcgatg gccgcggcgc atgcaccaac ctctgccgca gctcatggcc tctggtctgc gcttgggttc accgt caaca acgcggggtc gcgcagccag ccggcgcgcg cgcgtccgcg gaccagttcg ctcggacagg ctgcagcgtg atccaggtcc gccataggac caggcgggcg ggcataggtg ctgcgggtcg gcgcagcacc caggtcgaat aattccacac gagctaactc gtgccagctg cctcgcgcgt cacagcttgt tgttggcggg actggcttaa aaataccgca tcactgactc cggtaatacg gccagcaaaa gccccctgac actataaaga cctgccgctt tagctcacgc gcacgaaccc caacccggta agcgaggtat tagaaggaca tggtagctct gcagcagatt tctgacgctc aggatcttcc aagctcccga tggagcggct gcgttctgag ccgagtacgg gcgcgcgcgg cgcttgctgc ttctgcaggt ccggtatcct tggaacacgc aactccttga tcctgttcct gcgcacaggc gtgcccgacg ccgcccagca aggccggcat tcgaccgcgc agcagcatca gcgccgagcg agaagggtgg tgacctggcg gtccccatgt gcgcggcaat gcatccttgg gcgcggcgca acctcgtccg cgcaccgggg gaccaggagg cggacatatt agctggtcga acgctgtcat acgccgcgca atcacggggc gggcggtgca gggggaaagc tcgtaatcat aacatacgag acattaattg cattaatgaa ttcggtgatg ctgtaagcgg tgtcggggcg ctatgcggca cagatgcgta gctgcgctcg gttatccaca ggccaggaac gagcatcaca taccaggcgt accggatacc tgtaggtatc cccgttcagc agacacgact gtaggcggtg gtatttggta tgatccggca acgcgcagaa agtggaacga taggttcagg actgacgggg gcggcccttc tgggataatt tccgccgaag

26460

652 0

26580

26640

26700

26760

26820

26880

26940

27000

27060

27120

27180

27240

27300

27360

27420

27480

27540

27600

27660

27720

27780

27840

27900

27960

28020

28080

28140

28200

28260

28320

28380

28440

28500

28560

28620

28680

28740

28800

28860

28920

28980

29040

29100

29160

29220

29280

29340

29400

29460

29520

29580

29640

29700

29760

29820

29880

PL 231 220 Β1 acgctctaca gggctggcct gcgcaccgta tctgatcggt aggccgcccg ggccttgctg cgactggctc gtcgcgcggc ga tca tgttc aaaggtcttc gaatgagtcc accgctgggt ccgggggtgg cggcttcgag cgcacgaagg atccgcttct gactgcctgc cgggatgcct aagcccatca ggcaggctca ctcgccgccg tgacccta ccgctggagc tgaggagaag cctgcgggtc gcggactgaa tcatgacggc cggatgcaga tgaaagacaa agcacgacaa aggactggcg tcacactcgc cggatggggg gtcgtgatga aaaaaggggg caccaagttg gggccaggtc ttggctgatc ggggataaag gcgccgctac ccgcgttgcc tgcaaccgtc ttttcgcccg tcgacgcgac gccgacgaca cacgcggtca agcgactaca gccgaccgtg ccctgcatcc aaacggcgca acccgctacg atcttctggc gatgatggtg gtatctcaag agcgcgggcg cggatgccat tcggtgcggc gctatgacgc ccggccggaa accggatcga acaggtgccc tatgaaacaa

29940

30000

30060

30120

30130

30240

30300

30360

30420

30480

30498

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Plazmid, znamienny tym, że jest pochodnym plazmidu pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686 oraz obejmuje funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22, zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz w gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22 oraz marker selekcyjny, przy czym plazmid obejmuje sekwencję przedstawioną na SEKW NR ID: 1.
2. 2. Plazmid według zastrz. 1, znamienny tym, że jest plazmidem pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1.
3. 3. Nowy szczep Paracoccus aminophilus CRT 1 zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa, Polska pod numerem KKP 2053p.
4. 4. Zastosowanie nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2053p do wytwarzania β-karotenu, korzystnie β-karotenu czystego chemicznie, wolnego od a- i γ-karotenu.
5. 5. Nowy szczep Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu RolnoSpożywczego pod numerem KKP 2054p.
6. 6. Zastosowanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p do wytwarzania ksantofili, korzystnie kantaksantyny i/lub adonirubiny i/lub astaksantyny i/lub do wytwarzania karotenów, korzystnie echinenonu i/lub hydroksyechinenonu i/lub β-karotenu.
7. 7. Sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do syntezy karotenoidów, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   a) uzyskanie szczepu biorcy;

   b) wprowadzenie plazmidu obejmującego funkcjonalne geny crt z Paracoccus marcusii OS22 zapewniające zdolność do wytwarzania karotenoidów, oraz system replikacyjny umożliwiający stabilną replikację w Paracoccus marcusii OS22 oraz gospodarzu innym niż Paracoccus marcusii OS22, i system stabilizacyjny umożliwiający stabilne utrzymanie plazmidu w hodowli bez stosowania presji selekcyjnej, korzystniej system toksyna-antytoksyna typu tad-ata, oraz marker selekcyjny, do szczepu biorcy, przy czym plazmidem jest plazmid pCRT01 o sekwencji przedstawionej na SEKW NR ID: 1;

   c) selekcję otrzymanych hodowli na podstawie obecności dwóch cech: zabarwienia na kolor żółty, pomarańczowy, czerwony lub brązowy oraz obecności markera selekcyjnego.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap b) przeprowadza się przez koniugację trójrodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego wprowadzany plazmid i szczepu pomocniczego niosącego plazmid pomocniczy.
9. 9. Sposób według dowolnego z zastrz. 7-8, znamienny tym, że szczepem biorcy jest szczep bakterii użyteczny w procesie produkcyjnym wytwarzania karotenoidów, korzystnie z rodziny

   PL 231 220 B1

   Enterobacteriaceae lub klasy Alphaproteobacteria, a najkorzystniej szczep bakterii należący do rodzaju Paracoccus.
10. 10. Nowy szczep bakteryjny zdolny do syntezy karotenoidów, otrzymany sposobem jak określonym w dowolnym z zastrz. 7-9.
11. 11. Zastosowanie plazmidu określonego w dowolnym z zastrz. 1-2 lub nowego szczepu jak określonego w zastrz. 3 lub 5 lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem jak określonym w dowolnym z zastrz. 7-9 lub szczepu określonego w zastrz. 10 do otrzymywania szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy karotenoidów.
12. 12. Zastosowanie plazmidu określonego w dowolnym z zastrz. 1 -2 lub nowego szczepu jak określonego w zastrz. 3 lub 5, lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem określonym w dowolnym z zastrz. 7-9, lub szczepu określonego w zastrz. 10 do wytwarzania karotenoidów.
13. 13. Sposób wytwarzania β-karotenu w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus aminophilus CRT1 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2053p
14. 14. Sposób wytwarzania astaksantyny w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.
15. 15. Sposób wytwarzania adonirubiny w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.
16. 16. Sposób wytwarzania kantaksantyny w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowegoszczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.
17. 17. Sposób wytwarzania echinenonu w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.
18. 18. Sposób wytwarzania hydroksyechinenonu w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.
19. 19. Sposób wytwarzania β-karotenu w hodowli bakteryjnej, znamienny tym, że obejmuje wykorzystanie nowego szczepu Paracoccus kondratievae CRT2 zdeponowanego w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2054p.