JP2005522193A - キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）の選択された株の発酵によるアスタキサンチンの製造法 - Google Patents
キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）の選択された株の発酵によるアスタキサンチンの製造法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、（ｉ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生株を得る方法と、（ii）改良された発酵条件下で前記株を使用する方法に関する。使用される株の選択法は以下に基づく：（ｉ）ステロイド合成のインヒビター、呼吸のインヒビター、およびフリーラジカルの生成を誘導する化合物とに対する耐性、（ii）固形培地上のコロニーの色の強度とカロチノイドの産生、（iii）暗所でのアスタキサンチンの産生、（iv）高温条件下でのアスタキサンチンの産生、および（ｖ）グルコース以外の炭素源を用いるアスタキサンチンの産生。本発明の方法は、親株より多量のアスタキサンチンを産生し、他のカロチノイドの蓄積が少ないキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の変異体の効率的な選択を可能にする。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の液体培地培養物は、ヒトおよび動物の栄養に直接使用することができるバイオマスを得ることを可能にする。
Description
本発明は、（ｉ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生株を選択する方法と、（ii）改良された発酵条件下で前記株を使用する方法を記載する。
技術の現状
カロチノイドは、ある種の細菌、真菌および光合成生物により合成されるイソプレノイド性の色素である。健康に対する有益な作用とその魅力的な色により、カロチノイドは着色剤および食品添加物として商業的重要性が大きい。カロチノイドは、８〜１０のイソプレン単位（Ｃ５）から形成される４０または５０個の炭素原子を有するポリエン化合物である。これらは４００〜５００nmに吸収極大を有し、これがカロチノイドに黄色と赤の間の特徴的な色を与える。非置換炭化水素鎖を有するカロチノイド（リコペン、β−カロチン）はカロチン類と呼ばれる。酸素化誘導体は、キサントフィル類と呼ばれる。後者には、アルコール類（ルテインとゼアキサンチン）、エポキシド類（ビオラキサンチン）、エステル類（スフェロイデン）、ケトン類（エキネン、カンタキサンチン、アスタキサンチン）、および酸（トルラロジン）がある。カロチノイド構造中の発色団の存在は、光保護剤および抗酸化剤として重要な生物学的機能を有する。カロチノイドは、酸素一重項とフリーラジカルの作用に弱い組織を防御する。こうして、アスタキサンチンの生合成中間体３−ヒドロキシ−３’，４’−ジデヒドロ−β，ψ−カロチン−４−オン（ＨＤＣＯ）は、フリーラジカル捕捉剤として、ならびに非常にきれいな赤色を与えることで重要な役割を果たす。カロチノイドは多くの生物学的機能を果たし、特にこれは、抗癌剤、免疫系の増強剤、中枢神経系の変性疾患（視覚に関連するアルツハイマー病）を予防する物質、抗炎症剤、抗ストレス剤、光保護剤などとして作用する。アスタキサンチンは、自然界に広く分布するケトカロチノイド（キサントフィル）であり、その分子は１１個の共役２重結合を有する。これは、細菌（アグロバクテリウム・アウランチアクム（Agrobacterium aurantiacum）、ロードコッカス・マリス（Rhodococcus maris）など）、真菌（キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous））、藻類（ヘマトコッカス・プルヴィアリス（Haematococcus pluvialis））、および高等植物により産生される。一般に、植物のすべての緑の部分は、葉緑素によりマスクされたアスタキサンチンを含有し、これは他のカロチノイドとともに、これらに典型的な秋のような色を与える。これはまた、花アドニス・アエスティヴァリス（Adonis aestivalis）、トリ（フラミンゴとショウジョウトキ（scarlet ibis））、ウオ（サケ（salmonids））および海洋無脊椎動物（エビ、カニ、ロブスターなど）にも存在し、これらの生物の保護と生存に重要な機能を果たす。
カロチノイドは、ある種の細菌、真菌および光合成生物により合成されるイソプレノイド性の色素である。健康に対する有益な作用とその魅力的な色により、カロチノイドは着色剤および食品添加物として商業的重要性が大きい。カロチノイドは、８〜１０のイソプレン単位（Ｃ５）から形成される４０または５０個の炭素原子を有するポリエン化合物である。これらは４００〜５００nmに吸収極大を有し、これがカロチノイドに黄色と赤の間の特徴的な色を与える。非置換炭化水素鎖を有するカロチノイド（リコペン、β−カロチン）はカロチン類と呼ばれる。酸素化誘導体は、キサントフィル類と呼ばれる。後者には、アルコール類（ルテインとゼアキサンチン）、エポキシド類（ビオラキサンチン）、エステル類（スフェロイデン）、ケトン類（エキネン、カンタキサンチン、アスタキサンチン）、および酸（トルラロジン）がある。カロチノイド構造中の発色団の存在は、光保護剤および抗酸化剤として重要な生物学的機能を有する。カロチノイドは、酸素一重項とフリーラジカルの作用に弱い組織を防御する。こうして、アスタキサンチンの生合成中間体３−ヒドロキシ−３’，４’−ジデヒドロ−β，ψ−カロチン−４−オン（ＨＤＣＯ）は、フリーラジカル捕捉剤として、ならびに非常にきれいな赤色を与えることで重要な役割を果たす。カロチノイドは多くの生物学的機能を果たし、特にこれは、抗癌剤、免疫系の増強剤、中枢神経系の変性疾患（視覚に関連するアルツハイマー病）を予防する物質、抗炎症剤、抗ストレス剤、光保護剤などとして作用する。アスタキサンチンは、自然界に広く分布するケトカロチノイド（キサントフィル）であり、その分子は１１個の共役２重結合を有する。これは、細菌（アグロバクテリウム・アウランチアクム（Agrobacterium aurantiacum）、ロードコッカス・マリス（Rhodococcus maris）など）、真菌（キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous））、藻類（ヘマトコッカス・プルヴィアリス（Haematococcus pluvialis））、および高等植物により産生される。一般に、植物のすべての緑の部分は、葉緑素によりマスクされたアスタキサンチンを含有し、これは他のカロチノイドとともに、これらに典型的な秋のような色を与える。これはまた、花アドニス・アエスティヴァリス（Adonis aestivalis）、トリ（フラミンゴとショウジョウトキ（scarlet ibis））、ウオ（サケ（salmonids））および海洋無脊椎動物（エビ、カニ、ロブスターなど）にも存在し、これらの生物の保護と生存に重要な機能を果たす。
微生物生合成によるカロチノイドの産生は、化学的および生物学的プロセスの競合の古典的例である。生物工学的プロセスは、特に、より複雑な構造のカロチノイド、および天然にのみ存在するコンフォメーション異性体を簡単に得ることを可能にするという利点を示す。化学合成と競合するアスタキサンチン産生のための工業的生物工学的プロセスは、藻類ヘマトコッカス・プルヴィアリス（H. pluvialis）と酵母キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の使用に基づく。ヘマトコッカス・プルヴィアリス（H. pluvialis）を用いるアスタキサンチンの工業的生産は、その培養のための広い海の必要性、汚染の存在、およびいくつかの環境因子をコントロールすることに困難さがある。従って、１９７６年に初めてキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）が記載され（ファフ（Phaff H.F.）ら、1972Proc. IV IFS：Ferment. Technol. Today 759-774）、アスタキサンチンと他のカロチノイドを産生するその能力が証明された（ジョンソン（Jhonson）ら、1978，Environ. Microbiol. 35:1155-1159）時、ならびにサケ、トリの卵などの着色におけるその有用性が証明された時、酵母が急速にその工業的関心を引きつけた。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチンの豊富なバイオマスは、サケの肉を着色するための添加物として使用することができる。サケの食物は、アスタキサンチンを含有する微生物や甲殻類を含むため、その典型的な色は自然の環境から得ている。捕獲されて成長している魚は、その食物中にアスタキサンチンが無いため、肉と皮膚が元々オフホワイト色である。アスタキサンチンならびに色と風味を付与することは、魚の生殖と一般的成長において重要な役割を果たす。甲殻類の殻からの抽出は経済的に有利なため、現在いくつかのアスタキサンチンは化学合成により得られる。しかし化学添加剤や合成製品に対して消費者がますます敏感になっているため、アスタキサンチンの天然の供給源としてのキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）やヘマトコッカス・プルヴィアリス（H. pluvialis）の使用が増加している。
アスタキサンチンの生合成経路（スキーム１を参照）は、多くの生物、例えばキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）、エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）およびアグロバクテリウム・アウランチアクム（Agrobacterium aurantiacum）で説明されている（デュクレイ・サンピエトロ（Ducrey Sanpietro L.M.）、1998. Yeast 14:1007-1016；ミサワ（Misawa N.）ら、1995. J. Bacteriol. 177:6575-6584；フレーザー（Fraser P.D.）ら、1997, J. Biol. Chem. 272:6128-6135）。この生合成には少なくとも５つの酵素が必要である：（ｉ）フィトエンシンターゼ、これはゲラニルゲラニルピロリン酸の２つの分子を結合させてフィトエンを生成する、（ii）フィトエン脱水素酵素、これはフィトエン分子に４つの２重結合を導入してリコペンを合成する、（iii）リコペンシクラーゼ、これは、リコペンを基質として使用して、β−カロチン分子の両端に位置する環を形成する、（iv）β−カロチンケトラーゼ、これは、β−カロチン分子の２つの末端に位置するそれぞれの環のケト基の導入を触媒する、および（ｖ）β−カロチン水酸化酵素、これはβ−カロチン分子の各末端に位置する環のそれぞれの水酸化を行う。これらの最後の２つの酵素は、アスタキサンチンの一連の前駆体（エキネノン、カンタキサンチン、フェニコキサンチン、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、アドニキサンチン）の生合成に参加する（スキーム１）。酵素β−カロチンケトラーゼとベクターカルシウム水酸化酵素（ならびにこれらをコードする遺伝子）は、多くの生物、例えばエルウィニア・ウレドボラ（E. uredovora）、アグロバクテリウム・アウランチアクム（A. aurantiacum）、アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）などで性状解析されており、すべての場合で２つの別々のタンパク質の存在が記載されている。しかしキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）では、β−カロチンからアスタキサンチンへの変換を触媒するアスタキサンチンシンターゼと呼ぶ単一の酵素の存在が記載されている（タツオ（Tatsuo H.）ら、2000. EP1035206）。
スキーム１．キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）中のアスタキサンチンの単純化した生合成経路
アスタキサンチンの生産のためのキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）に対する商業的関心の高まりにより、この微生物への分子タイピング法の応用が促進された（アドリオ（Adrio J.L.）ら、1995. Curr. Genet. 27:447-450）。この方法で、改善プログラムで選択された株の間の差を確立することができる。さらにこれらの方法は、発酵中の株の遺伝的安定性を測定し、他の微生物による汚染の存在を測定することができるため、得られるバイオマスの品質の調節のために使用することができる。
それについて適当なプローブが存在しかつ生化学的方法によっては区別することができない微生物の分析のために、ＤＮＡプローブの使用が指摘されている。その感度と速度のために、ＤＮＡ増幅が直接検出のために使用される方法である。ほとんどの場合に増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色するだけで検出される。ＤＮＡ電気泳動に基づく分子タイピング法には以下がある：ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、リボタイピング（ｒＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション）、ＰＦＧＥ（パルスフィールドゲル電気泳動）、ＯＦＡＧＥ（直交フィールドゲル電気泳動）、ＦＩＧＥ（フィールド反転ゲル電気泳動）、ＣＨＥＦ（クランプト均一電界）など。一方、ＤＮＡ増幅に基づくいくつかの分子タイピング法がある：ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＲＥＰ（反復エクストラジニックパリンドロミック（Repetitive extragenic Palindromic））、ＥＲＩＣ（エンテロバクター反復インタージェニックコンセンサス（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus））、ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ（Randomly Amplified Polymorphic DNA））など。種々の生物のＤＮＡ中の変化の検出にはＲＦＬＰ電気泳動法がよく使用されている。しかしＰＣＲ法の発見は、ＲＡＰＤのような方法が、電気泳動法に対する迅速で効率的な代替法であることを意味した。さらにＲＡＰＤは、ラジオアイソトープを使用せず、分析のためにより少量のＤＮＡしか必要としないという利点を有する。この方法は、プライマーとして短いオリゴヌクレオチドの使用に基づく。該オリゴヌクレオチドは、鋳型として使用されるゲノムＤＮＡの異なる領域に結合し、特定のＤＮＡ配列を増幅することを可能にする。ＲＡＰＤ法で使用されるプライマーは任意の配列を有し、通常Ｇ＋Ｃ含量が５０％を超え、繰り返し反転内部配列が欠如している。増幅されたＤＮＡ断片の理論数は、プライマーの長さと鋳型として使用されるゲノムのサイズとに依存する。増幅は以下の確率に基づく：（ｉ）ゲノム中でプライマーが相補的ＤＮＡ配列を見つける確率、（ii）該配列が反対の鎖上に位置する確率、（iii）それが反転センス中に現れる確率、および（iv）ＰＣＲにより増幅することができる距離にある確率。多型の出現は、鋳型ＤＮＡへのプライマーの正しい結合を妨害するプライマーの結合配列の変化（例えば点突然変異）によるかも知れない。さらにこれらの多型は、増幅断片のサイズを変化させ、ＤＮＡの増幅を妨害し（あまりにも遠いプライマー結合部位ができるため）、プライマー結合部位の欠失を引き起こすなどの、ＤＮＡ配列の変化（例えば、挿入と反転）により引き起こされるかも知れない。
本発明で使用される株を選択する方法は以下に基づく：（ｉ）ステロイド合成のインヒビター、呼吸のインヒビター、およびフリーラジカルの生成を誘導する化合物に対する耐性、（ii）固形培地上のコロニーの色の強度とカロチノイドの産生、（iii）暗所でのアスタキサンチンの産生、（iv）高温条件下でのアスタキサンチンの産生、および（ｖ）グルコース以外の炭素源を用いるアスタキサンチンの産生。これらの方法は、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の変異体の効率的な選択を可能にする。さらに本発明に記載の株の選択法と発酵法は、アスタキサンチンの高収率と他のカロチノイドの低レベルの蓄積を可能にする。液体培地中のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の培養は、カロチノイド、タンパク質、炭水化物、ビタミン、脂肪酸および他の栄養物質の含量のために、栄養のある健康促進性のバイオマスを得ることを可能にする。該バイオマスは、ヒトや動物の食物で直接使用することができる。
発明の詳細な説明
本発明は、酵母キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を使用して高収率のアスタキサンチンを得るためのいくつかの方法を記載する。本発明は、（ｉ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生変異体を得る方法および選択する方法の設計、および（ii）改良された発酵条件の開発とを含む。高濃度のアスタキサンチンを有するキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株を得るために、研究を行った。これは、突然変異とスクリーニングの古典的方法を応用し、原料と発酵条件の両方を最適化することに基づいた。アスタキサンチンの濃度は、（ｉ）ppm（１ｇの乾燥バイオマス当たりの純粋なアスタキサンチンμg）、または（ii）乾燥バイオマスに対する純粋なアスタキサンチンのパーセントとして表される。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の野生型株は１００〜２００ppmのアスタキサンチンを産生するが、本発明は、少なくとも５０００ppmの産生法を記載する。アスタキサンチンの生物工学的生産のために、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）は工業的重要性が高い。実際該方法は、現在工業的に使用されている合成法と競合する。
本発明は、酵母キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を使用して高収率のアスタキサンチンを得るためのいくつかの方法を記載する。本発明は、（ｉ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生変異体を得る方法および選択する方法の設計、および（ii）改良された発酵条件の開発とを含む。高濃度のアスタキサンチンを有するキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株を得るために、研究を行った。これは、突然変異とスクリーニングの古典的方法を応用し、原料と発酵条件の両方を最適化することに基づいた。アスタキサンチンの濃度は、（ｉ）ppm（１ｇの乾燥バイオマス当たりの純粋なアスタキサンチンμg）、または（ii）乾燥バイオマスに対する純粋なアスタキサンチンのパーセントとして表される。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の野生型株は１００〜２００ppmのアスタキサンチンを産生するが、本発明は、少なくとも５０００ppmの産生法を記載する。アスタキサンチンの生物工学的生産のために、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）は工業的重要性が高い。実際該方法は、現在工業的に使用されている合成法と競合する。
アスタキサンチン過剰産生株を得ることを目的として、まず突然変異誘発物質であるエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）および紫外線照射（ＵＶＡ）を用いる、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の突然変異誘発法を開発した。突然変異すべき細胞の懸濁物は、液体培地Ｒ４−０６２−７中のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の培養物から得られた。ＥＭＳを用いる突然変異法では、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の６％ＥＭＳ溶液で１０8 細胞／mlを２０℃、１００rpm で４０〜８０分インキュベートした。ＮＴＧを用いる突然変異法では、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の２５０μg/mlのＥＭＳ溶液で１０8 細胞／mlを２０℃、１００rpm で６０〜１２０分インキュベートした。ＵＶＡを用いる突然変異法では、２５４nmのランプを使用して食塩水溶液中で１０7 細胞／mlの懸濁液を２０℃、４０rpm で５〜１０分インキュベートした。使用した３つの突然変異法では、突然変異した細胞は、その回復を促進するために１７〜２０℃で１００rpm でＹＥＰＤ液体培地中で１０時間インキュベートした。次に、ＹＥＰＤＡ固形培地を含有するシャーレに接種し、１７℃で４時間インキュベートして、単離したコロニーを得た。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生株を選択するために使用される方策は以下の通りである：（ｉ）ステロイド合成のインヒビター、呼吸のインヒビター、およびフリーラジカルの生成を誘導する化合物に対する耐性、（ii）固形培地上のコロニーの色の強度とカロチノイドの産生、（iii）暗所でのアスタキサンチンの産生、（iv）高温条件下でのアスタキサンチンの産生、および（ｖ）グルコース以外の炭素源を用いるアスタキサンチンの産生。アスタキサンチン過剰産生変異体を選択するために、突然変異した細胞を、以下を加えたＹＥＰＤＡ培地で増殖させた：（ｉ）ジュロキノンや過酸化水素のような細胞の酸化還元電位を変化させる化合物、または（ii）ステロイド合成のインヒビター、特にβ−イオノン、イミダゾール、ジエチルアミン、２−メチルイミダゾール、ナイスタチンおよびジフェニルアミン。
変異体を、固形培地上のその収率の関数として連続的に選択した。該選択は、第１相として、親株より濃い赤い着色を有するコロニーを単離し、次に固形培地上で増殖させたバイオマスのカロチノイド含量を評価する方法により行った。親株ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６より大きな吸収を有する変異体を選択することにより、アスタキサンチン過剰産生株ＡＳＴ−Ａ１とＡＳＴ−Ａ２を選択することができた（スキーム２）。暗所でアスタキサンチン産生株であった変異体を、暗所で固形培地上でインキュベートした時のそのカロチノイド含量の関数として選択した。こうしてＡＳＴ−Ａ３、ＡＳＴ−Ａ４、ＡＳＴ−Ａ５、ＡＳＴ−Ａ６、およびＡＳＴ−Ａ７株を選択した（スキーム２）。高温条件下でアスタキサンチンの産生株であった変異体を、通常の温度（１７〜２０℃）より高い温度で増殖しアスタキサンチンを産生する能力の関数として選択した。こうして２４℃で成長する能力とアスタキサンチンの収率についてＡＳＴ−Ａ８、ＡＳＴ−Ａ９、およびＡＳＴ−Ａ１０株を選択した（スキーム２）。グルコース以外の炭素源でアスタキサンチンを産生することができるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株は、唯一の炭素源としてショ糖の存在下で増殖しアスタキサンチンを産生する能力の関数として選択した。こうしてＡＳＴ−Ａ１１を選択し（スキーム２）、これはショ糖を唯一の炭素源として使用した時、親株より多量のアスタキサンチンを産生する能力を示した。
選択した株を、差別特性を確立することを目的としていくつかの遺伝的分析に付した。こうして、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株で染色体外要素の存在を証明した。さらに（ｉ）該染色体外要素（プラスミド）が線状コンフォメーションの２本鎖ＤＮＡからなること、および（ii）アスタキサンチン過剰産生株が、低産生の株が示したものと異なる染色体外要素のパターンを有すること、を確認した。アスタキサンチン過剰産生株と低産生株との間の差を、さらにＲＡＰＤ法を使用して確認した。
選択された株を、液体培地中でアスタキサンチンの収率を測定するために、フラスコ中で発酵させた。このために、接種物フラスコを増殖させ、次にフラスコ発酵を行った。発酵の完了後（約７日間）、ボルテックス攪拌を使用してキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を溶解し、産生されたカロチノイドを有機溶媒（例えばアセトン）で抽出し、アスタキサンチンの濃度と純度をＨＰＬＣにより測定した。得られた収率は１５０〜２００mg/lで変動した。培地への：（ｉ）フリーラジカルを放出する物質（例えばジュロキノン）、（ii）カロチン生成のインデューサーである化合物（例えばレチナル酸またはトリスポリック酸）、または（iii）炭化水素鎖の前駆体（例えばグルタミン酸）の添加は、アスタキサンチンの収率を改善し、収率は、レチナルで少なくとも２２５mg/l、トリスポリック酸で２００mg/l、そしてグルタミン酸で１８０mg/lに達した。さらに、（ｉ）アスタキサンチンの比収率を上昇させる培地を開発し、および（ii）白色光および紫外線の両方がアスタキサンチンの収率上昇させ、最適の結果は、６時間の紫外線明／暗のサイクルで得られることを確認した。
フラスコで選択された株を、アスタキサンチンの収率を測定する目的で、パイロットプラント発酵槽で培養した。発酵条件は、まず高レベルのバイオマスと最大収率を得ることを可能にする複合体培地上で微生物を増殖させた。初期増殖段階の後に、最小増殖と最大収率とを特徴とする産生相が続いた。さらに、アスタキサンチンの収率を以下の方法により上昇させた：（Ｉ）培地への、フリーラジカルの細胞内生成を誘導する酸化力のある物質の添加（例えば、２５〜５０μM濃度のジュロキノン）。真に有効であるためには、添加は発酵の最初の２４時間以内に行わなければならない。これらの化合物は増殖を低下（１５〜２５％）させ、アスタキサンチンの収率を上昇（１０〜２０％）させる。従ってバイオマスの比生産性の全体の上昇は３０〜６０％の範囲で変動し、フラスコでの６〜７日間の発酵で少なくとも２１５mg/lのアスタキサンチン収率に達した。（II）あまり激しくなくかつ生産性バイオマスの維持に充分な増殖を維持することを可能にする、発酵の進行した相での容易に同化可能な炭素源（例えばグルコース）の添加の減少と利用の遅い炭素源（例えばエタノール、グリセロールなど）による置換。（III）高強度の光（例えば２５０ルクスを超える）で生産相の培養物を照射。（IV）増殖より産生を促進する条件への、ｐＨと温度の値の変化。約１７℃の温度と３近辺のｐＨ値では、増殖が遅延し収率が上昇する。これらの変数の組合せ効果は、アスタキサンチンの収率を上昇させ、かつバイオマスレベルの上昇を得ることを可能にした。これは、工業的観点から最も重要な生産目的の１つである発酵槽の単位容量当たりのより高い収率を意味する。
発酵プロセスは、炭素源、窒素源、ミネラルエンおよびビタミン（例えば、チアミン、ビオチン、パントテン酸カルシウムなど）を含む培地中で行った。炭水化物が豊富な栄養物質を炭素源として使用することができ、例えばデキストリン、デンプン、グルコース、ショ糖、果糖、またはこれらの糖のいくつかが豊富な植物粉がある。以下は窒素源として使用することができる：（ｉ）有機化合物、例えば酵母エキス、綿実粉（ファルマメディア（Pharmamedia））、コーンスティープ、ダイズ粉、ペプトン、カゼインなど、または（ii）無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、リン酸ジアンモニウムなど。培地に加えることができるミネラル塩には、１価陽イオン（ナトリウム、カリウム、アンモニウムなど）または２価陽イオン（カルシウム、マグネシウムなど）のリン酸塩、硫酸塩または塩酸物がある。さらに、いくつかの微量元素（例えば、Ｃｕ、Ｉ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｚｎなど）を培地に加えることができる。栄養物質の比率は、微生物の増殖要求と収率に基づいて決定した。発酵は、１７℃〜２２℃の温度で液内好気的培養を行ったが、ただしアスタキサンチンを産生できる変異体を使用する時は２４℃で行った。培養物のｐＨは、最初の数時間は自由に変動させ、次にアルカリを加えて３．０〜５．０の範囲で制御した。ｐＨ制御の開始は増殖の進行に依存し、一般的に発酵の最初の２４時間内に始まる。このプロセスは、炭素源および窒素源の利用可能性、１v/v/m（容量／容量／分）より速い通気、および初期増殖相の完了後に５０％を超える溶存酸素レベルを確保する攪拌速度に基づく速い初期増殖が特徴である。高い比収率を有するバイオマスの最大濃度を達成するように、炭素源（一般にグルコース）を添加して、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の増殖を維持した。この目的の達成は、従来開発された技術と比較して、設置された発酵槽容量当たりより高い生産性を与える。
上記方策を用いると、７０g/lを超えるバイオマスと少なくとも４００mg/lの収率（これは、バイオマス単位当たりのアスタキサンチン収率が５０００ppm を超えることを意味する）の発酵培地を得ることが可能であった。得られたバイオマスはキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の新しい株由来であり、これは、分子タイピング法を使用して同じ種の他の株から区別することができる。アスタキサンチン過剰産生株の選択以外に、工業的により有利にするために発酵技術は最適化されている。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のバイオマスの収率は高アスタキサンチン含量を有することが記載されているが、これらの場合に培地中の酵母の増殖が非常に限定されている（５〜３０g/l）。これは、多量のカロチノイドを得るために処理しなければならない培地の容量が非常に多いことを意味する。我々の結果は、高収率のカロチノイドのみでなく、発酵培地中で５０〜１００g/lの酵母濃度をも与える。これらの結果は、工業的生産性と生産コストの低下のために重要な利点である。
スキーム２．突然変異法と選択法を利用したキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＶＫＰＭ Ｙ−９８９から得られるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の系統発生
バイオマスは遠心分離またはろ過により培地から分離され、乾燥され、次にマス（trout）で一連のバイオアベイラビリティ試験を行うために使用された。このために、該乾燥バイオマスをマスの餌に加え、この混合物を２ヶ月間いくつかのマスに与えた。最後に１０匹の該マスの組織中のアスタキサンチンとカロチノイドの存在を測定した。得られた結果（アスタキサンチン３．５μg/gとカロチノイド６．８μg/g）は、サケ色の色素をマスに与えるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）バイオマスの能力を証明した。
ブダペスト条約に従う微生物の寄託
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株は、ブダペスト条約の規定に従って、ロシア国立工業微生物保存機関（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（ＶＫＰＭ）、（GNII、Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscow 113545（ロシア））に以下の番号と日付で寄託されている：ＶＫＰＭ Ｙ−９８９を１３／０３／１９８９に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２４０を２０／１２／１９９６に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２５９を３１／０１／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２６２を１０／０６／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７８を０６／０８／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７９を３１／１０／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２４１０を３０／１０／１９９８に、ＶＫＰＭ Ｙ−２４４７を２２／０９／１９９９に、そしてＶＫＰＭ Ｙ−２４７６を０６／０３／２０００に。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株は、ブダペスト条約の規定に従って、ロシア国立工業微生物保存機関（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（ＶＫＰＭ）、（GNII、Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscow 113545（ロシア））に以下の番号と日付で寄託されている：ＶＫＰＭ Ｙ−９８９を１３／０３／１９８９に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２４０を２０／１２／１９９６に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２５９を３１／０１／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２６２を１０／０６／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７８を０６／０８／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７９を３１／１０／１９９７に、ＶＫＰＭ Ｙ−２４１０を３０／１０／１９９８に、ＶＫＰＭ Ｙ−２４４７を２２／０９／１９９９に、そしてＶＫＰＭ Ｙ−２４７６を０６／０３／２０００に。
以下の例は、本発明を詳細にかつ限定することなく説明する。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の突然変異の方策
まず、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株について突然変異誘発法を開発し、以下を分析した：（ｉ）異なる種類の突然変異誘発剤、（ii）突然変異誘発物質の濃度、（iii）細胞の濃度、（iv）インキュベーションｐＨ、および（ｖ）処理時間。この方法で突然変異誘発物質として以下を選択した：エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）および紫外線照射（ＵＶＡ）。
まず、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の株について突然変異誘発法を開発し、以下を分析した：（ｉ）異なる種類の突然変異誘発剤、（ii）突然変異誘発物質の濃度、（iii）細胞の濃度、（iv）インキュベーションｐＨ、および（ｖ）処理時間。この方法で突然変異誘発物質として以下を選択した：エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）および紫外線照射（ＵＶＡ）。
突然変異される細胞の懸濁液は、２５mlのＲ４−０６２−７培地を有する５００mlフラスコに液体培養物を接種し、これを１７〜２０℃で２５０rpm で２４時間インキュベートして得られた。Ｒ４−０６２−７培地は以下の組成を有する：６．２g/lの酵母エキス、５．５g/lの綿実粉、７０g/lのグルコース、２g/lのＫＨ2ＰＯ4、０．４g/lのＫ2ＨＰ4、１．５g/lのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２g/lの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２g/lのＮａＣｌ、０．２g/lのＣａＣｌ2、５０μg/lのビオチン、５００μg/lのチアミン、および２mg/lのパントテン酸カルシウム、最終ｐＨ５．８〜６．０。懸濁液中の細胞の濃度は、約１０6 細胞/mlであった。これらの細胞を食塩水溶液で２回洗浄し、３０００rpm 、１０℃で３分遠心分離し、次にその濃度を２×１０8 細胞/mlに調整した。
ＥＭＳを用いる突然変異法では、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の６％ＥＭＳ溶液で１０8 細胞／mlを２０℃、１００rpm で４０〜８０分インキュベートし、死滅率９０〜９９％を達成した。ＮＴＧを用いる突然変異法では、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の２５０μg/mlのＮＴＧを含有する溶液中で１０8 細胞／mlを２０℃、１００rpm で６０〜１２０分インキュベートし、死滅率９０〜９９％を達成した。突然変異した細胞を食塩水溶液で３回洗浄し、３０００rpm 、１０℃で３分遠心分離し、次に液体培地中で培養してその回復を促進した。このために、これらを１０mlのＹＥＰＤ培地に再懸濁し、２５０mlフラスコ中で１７〜２０℃、１００rpm で１０時間インキュベートした。ＹＥＰＤ培地の組成は以下の通りである：２０g/lのバクトペプトン、１０g/lの酵母エキス、および２０g/lのグルコース、最終ｐＨ６．０。
ＵＶＡを用いる突然変異法では、食塩水溶液中で１０7 細胞／mlの懸濁液に２５４nmのランプで２０℃、４０rpm で５〜１０分インキュベートし、死滅率９０〜９９％を達成した。突然変異した細胞を暗所で３０分休止させ、次にその回復のために液体培地中で培養した。このために、これらを１０mlのＹＥＰＤに再懸濁し、暗所で２５０mlフラスコ中で１７〜２０℃、１００rpm で１０時間インキュベートした。
ＹＥＰＤＡ固形培地を含有するシャーレに接種するために、突然変異した細胞を使用し、１７℃で４日間インキュベートして単離したコロニーを得た。ＹＥＰＤＡ培地の組成は以下の通りである：２０g/lのバクトペプトン、１０g/lの酵母エキス、２０g/lのグルコース、および２０g/lの寒天、最終ｐＨ６．０。接種したシャーレを１７℃で４日間インキュベートして単離したコロニーを得た。
固形培地上のカロチノイドの収率の関数としてキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチン過剰産生株を選択する方策
実施例１に記載の変異細胞から得られたコロニーを、ＹＥＰＤＡ培地または以下を加えたＹＥＰＤＡ培地に直接接種した：（ｉ）細胞の酸化還元電位を変化させる化合物、または（ii）ステロイド合成のインヒビター。（ｉ）型の化合物では、特にジュロキノン（１００μM）と過酸化水素（５mg/l）を使用し、（ii）型の化合物では、特に以下を使用した：β−イオノン（５０μl/l）、イミダゾール（５mM）、ジエチルアミン（１０μM）、２−メチルイミダゾール（５mM）、ナイスタチン（１mg/l）およびジフェニルアミン（１００μM）。
実施例１に記載の変異細胞から得られたコロニーを、ＹＥＰＤＡ培地または以下を加えたＹＥＰＤＡ培地に直接接種した：（ｉ）細胞の酸化還元電位を変化させる化合物、または（ii）ステロイド合成のインヒビター。（ｉ）型の化合物では、特にジュロキノン（１００μM）と過酸化水素（５mg/l）を使用し、（ii）型の化合物では、特に以下を使用した：β−イオノン（５０μl/l）、イミダゾール（５mM）、ジエチルアミン（１０μM）、２−メチルイミダゾール（５mM）、ナイスタチン（１mg/l）およびジフェニルアミン（１００μM）。
上記培養物に由来するコロニーを、ＹＥＰＤＡ培地に約３cm2 の線条の形で接種し、１７〜２０℃で４日間、光の存在下でインキュベートした。株を選択するプログラムにおいて、親株より強い赤色の着色を示す多くの線条を単離することができた。次に親株の濃い赤色の着色は、色に基づく直接選択を妨害し、従って固形培地上で増殖したバイオマスからカロチノイドを測定するための方法を開発した。この方法では、各線条から、０．８cm2 に対応するバイオマスを取り出し、これを１mlのジメチルスルホキシドに再懸濁した。２分間のボルテックス攪拌と１２０００rpm 、室温で５分間の遠心分離を使用してカロチノイドを抽出した。４７４nmで上清の吸光度を測定して、カロチノイドの収率を評価した。ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６親株より大きい吸光度値を有する株の選択は、アスタキサンチン過剰産生変異体ＡＳＴ−Ａ１とＡＳＴ−Ａ２を選択することを可能にした。
暗所でのアスタキサンチン過剰産生株であるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株を選択するための方策
本方法では、光の非存在下で増殖しアスタキサンチンを産生する能力について変異体を評価した。このために、一連のＹＥＰＤＡシャーレに変異細胞の懸濁液を接種し、光の非存在下で２２℃で４日間インキュベートした。次に、より強い着色と増殖を示した全部で１０３個のコロニーを選択した。これらのコロニーを再度ＹＥＰＤＡ上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の非存在下で２２℃で４日間インキュベートした。各線条の０．８cm2 に対応するバイオマスを使用して、１０mlのＲ４−０６２−７培地を含有する５０mlのフラスコに接種し、これを光の非存在下で２０℃、２５０rpm で７２時間インキュベートした。これらの培養物から、カロチノイド収率の高い５つの変異体（ＡＳＴ−Ａ３、ＡＳＴ−Ａ４、ＡＳＴ−Ａ５、ＡＳＴ−Ａ６およびＡＳＴ−Ａ７）を選択し、これらを暗所と光の存在下の両方で発酵で試験すると、アスタキサンチン収率は、暗所では親株ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６の２倍であり、光の存在下では同等であった。
本方法では、光の非存在下で増殖しアスタキサンチンを産生する能力について変異体を評価した。このために、一連のＹＥＰＤＡシャーレに変異細胞の懸濁液を接種し、光の非存在下で２２℃で４日間インキュベートした。次に、より強い着色と増殖を示した全部で１０３個のコロニーを選択した。これらのコロニーを再度ＹＥＰＤＡ上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の非存在下で２２℃で４日間インキュベートした。各線条の０．８cm2 に対応するバイオマスを使用して、１０mlのＲ４−０６２−７培地を含有する５０mlのフラスコに接種し、これを光の非存在下で２０℃、２５０rpm で７２時間インキュベートした。これらの培養物から、カロチノイド収率の高い５つの変異体（ＡＳＴ−Ａ３、ＡＳＴ−Ａ４、ＡＳＴ−Ａ５、ＡＳＴ−Ａ６およびＡＳＴ−Ａ７）を選択し、これらを暗所と光の存在下の両方で発酵で試験すると、アスタキサンチン収率は、暗所では親株ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６の２倍であり、光の存在下では同等であった。
高温条件下でアスタキサンチン過剰産生株であるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株を選択するための方策
本方法では、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の通常の温度（１７〜２０℃）より高い温度で増殖しアスタキサンチンを産生する能力について変異体を評価した。このプログラムは２相で行った：まず２２℃、次に２４℃。このために、ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６株由来のＮＴＧで変異した細胞の懸濁液をＹＥＰＤＡのシャーレに接種し、これを光の非存在下で２２℃で６日間インキュベートした。これらの条件下でＶＫＰＭ Ｙ−２４７６親株は増殖できなかった。この方法で、２２℃で増殖する能力に基づいて１００個のコロニーを単離した。これらのコロニーを再度ＹＥＰＤＡ上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の存在下で２２℃で４日間インキュベートした。次に固形培地上のカロチノイドの収率を評価し、全部で１０個の株を選択し、これらを液体培地中で２０℃と２２℃の両方で発酵させた。最後の４つの株を前選択した。
本方法では、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の通常の温度（１７〜２０℃）より高い温度で増殖しアスタキサンチンを産生する能力について変異体を評価した。このプログラムは２相で行った：まず２２℃、次に２４℃。このために、ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６株由来のＮＴＧで変異した細胞の懸濁液をＹＥＰＤＡのシャーレに接種し、これを光の非存在下で２２℃で６日間インキュベートした。これらの条件下でＶＫＰＭ Ｙ−２４７６親株は増殖できなかった。この方法で、２２℃で増殖する能力に基づいて１００個のコロニーを単離した。これらのコロニーを再度ＹＥＰＤＡ上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の存在下で２２℃で４日間インキュベートした。次に固形培地上のカロチノイドの収率を評価し、全部で１０個の株を選択し、これらを液体培地中で２０℃と２２℃の両方で発酵させた。最後の４つの株を前選択した。
あらかじめ選択した４つの株からの組合せ細胞懸濁液を、実施例１に記載のようにＮＴＧで変異させ、変異細胞をＹＥＰＤＡに接種し、次にシャーレを２３．５℃で光の非存在下で６日間インキュベートした。こうして２００個のコロニーを選択し、これらを再度ＹＥＰＤＡ上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の存在下で２４℃で４日間インキュベートした。次に固形培地上のカロチノイドの収率を評価し、全部で６つの株を選択した。いったんこれらの６つの株のアスタキサンチン収率を液体培地で２４℃で分析し、これらの３つを選択し、ＡＳＴ−Ａ８，ＡＳＴ−Ａ９、およびＡＳＴ−Ａ１０と名付けた。
グルコース以外の炭素源でアスタキサンチンを産生することができるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株を選択するための方策
グルコース（２０g/l）またはショ糖（２０g/l）を加えておいたＹＥＰＤＡ培地に、実施例１に記載した変異細胞から得られたコロニーを直接接種した。すでに記載した培養物由来のコロニーを再度ＹＥＰＤＡ−グルコースまたはＹＥＰＤＡ−ショ糖培地上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の存在下で１７〜２０℃で４日間インキュベートした。実施例２に記載のように各線条の０．８cm2 に対応するバイオマスでカロチノイドを評価し、ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６親株より大きい吸光度値を示した線条を選択した。こうしてＡＳＴ−Ａ１１を選択し、これは、グルコースまたはショ糖を炭素源として使用してＶＫＰＭ Ｙ−２４７６より高いアスタキサンチン収率を有した。
グルコース（２０g/l）またはショ糖（２０g/l）を加えておいたＹＥＰＤＡ培地に、実施例１に記載した変異細胞から得られたコロニーを直接接種した。すでに記載した培養物由来のコロニーを再度ＹＥＰＤＡ−グルコースまたはＹＥＰＤＡ−ショ糖培地上に約３cm2 の線条の形で接種し、光の存在下で１７〜２０℃で４日間インキュベートした。実施例２に記載のように各線条の０．８cm2 に対応するバイオマスでカロチノイドを評価し、ＶＫＰＭ Ｙ−２４７６親株より大きい吸光度値を示した線条を選択した。こうしてＡＳＴ−Ａ１１を選択し、これは、グルコースまたはショ糖を炭素源として使用してＶＫＰＭ Ｙ−２４７６より高いアスタキサンチン収率を有した。
異なるアスタキサンチン収率を示す一連のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の遺伝的分析
６．１．キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の染色体外要素の性状解析
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のいくつかの野生型株をアスタキサンチン過剰産生株と比較するために、その核酸を０．８％アガロースゲルで分析した。分析した４つの野生型株は以下の通りである：ＣＥＣＴ１６９０（ＡＴＣＣ２４２０２またはＣＢＳ５９０５とも呼ぶ）、ＣＥＣＴ１１０２８（ＡＴＣＣ２４２０３またはＣＢＳ５９０８とも呼ぶ）、ＣＢＳ６９３８とＡＴＣＣ２４２２９。分析した過剰産生株は以下の通りである：ＶＫＰＭ Ｙ−９８９、ＶＫＰＭ Ｙ−２２４０、ＶＫＰＭ Ｙ−２２５９、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７９、ＶＫＰＭ Ｙ−２４１０およびＶＫＰＭ Ｙ−２４７６。いったん前記株の全ＤＮＡを精製した後、これをＲＮａｓｅで処理し、電気泳動で分析した。結果を図１に示す。図から明らかなように、過剰産生株は、野生型株とは異なる染色体外核酸のパターンを有する。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＡＴＣＣ２４２２９株は、過剰産生株に最も近いパターンを有する。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のいくつかの野生型株をアスタキサンチン過剰産生株と比較するために、その核酸を０．８％アガロースゲルで分析した。分析した４つの野生型株は以下の通りである：ＣＥＣＴ１６９０（ＡＴＣＣ２４２０２またはＣＢＳ５９０５とも呼ぶ）、ＣＥＣＴ１１０２８（ＡＴＣＣ２４２０３またはＣＢＳ５９０８とも呼ぶ）、ＣＢＳ６９３８とＡＴＣＣ２４２２９。分析した過剰産生株は以下の通りである：ＶＫＰＭ Ｙ−９８９、ＶＫＰＭ Ｙ−２２４０、ＶＫＰＭ Ｙ−２２５９、ＶＫＰＭ Ｙ−２２７９、ＶＫＰＭ Ｙ−２４１０およびＶＫＰＭ Ｙ−２４７６。いったん前記株の全ＤＮＡを精製した後、これをＲＮａｓｅで処理し、電気泳動で分析した。結果を図１に示す。図から明らかなように、過剰産生株は、野生型株とは異なる染色体外核酸のパターンを有する。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＡＴＣＣ２４２２９株は、過剰産生株に最も近いパターンを有する。
染色体外遺伝子要素の存在は、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の種々の株で記載されている：これらは主に２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、ある株ではウイルス様粒子（ＶＬＰ）に封入されていることがわかった（カスチロ（Castillo A.）とシフエンテス（Cifuentes V.）、1994、Curr.Genet. 26:364-368；プフェイファー（Pfeiffer, H.）ら、（1996）Curr.Genet. 30:294-297）。過剰産生株の染色体外要素がｄｓＲＮＡの分子であるかどうかを決定するために、これらをＲＮａｓｅＡ（３５０ng/ml）で２つの異なる食塩水濃度（ＳＳＣ ０．０１×とＳＳＣ ２×）で処理した。さらに、ＳＳＣ ０．０１×中のＲＮａｓｅで処理せずに、対照試料を調製した。この試料を３７℃で３０分インキュベートし、次に０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分析した。図２から明らかなように、ＲＮａｓｅＡでインキュベーション後は染色体外要素は分解されず、従って該核酸はｄｓＲＮＡの分子ではないと結論された。
該染色体外要素の本質を決定するために、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）Ｙ−２４１０からの全ＤＮＡ試料を種々の核酸修飾酵素で処理した：ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＨ、ヌクレアーゼＳ１、ＤＮａｓｅＩ、および制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ。結果を図３に示す。ＲＮａｓｅＡによる消化は、前記した結果を確認した。しかし（ｉ）レーン９（ＤＮａｓｅＩによる処理）中の染色体外要素と全ＤＮＡの完全な消失と、（ii）制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩによる消化（レーン１０）に対するこれらの感受性は、これらがＤＮＡ分子であることを示した。
次にキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＣＢ６９３８株とキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）Ｙ−２４１０株の染色体外要素のコンフォメーションの測定を行った。このために、全ＤＮＡの試料を１％アガロースゲルの２次元電気泳動で分析した。図４から明らかなように、両方の株の染色体外要素のパターンは、ゲルの２次元で同じであり、すなわちＤＮＡ断片はそのサイズに従って泳動する。これは、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）で検出されるＤＮＡ分子が線状コンフォメーションを有することを示す。これらの結果から、分析した株の染色体外要素は、２本鎖ＤＮＡから形成される線状プラスミドであると結論される。
６．２．ＲＡＰＤ法を使用する一連のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の遺伝子多型の測定
目的は、ＰＣＲでＤＮＡをランダムに増幅することにより、異なるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の遺伝子多様性の存在を測定することであった。この方法はＲＡＰＤ（ランダムに増幅された多型ＤＮＡ）と呼ばれる。多型は、（ｉ）プライマー結合配列の変化（例えば点突然変異）、（ii）サイズを変化させるＤＮＡ配列の変化（例えば挿入と逆位）、（iii）増幅されたＤＮＡ断片のサイズを変化させる挿入、（iv）プライマの結合部位の消失などの存在により検出される。この試験は、セクション６．１に記載の４つの野生型株と６つの過剰産生株を含んだ。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ですでに使用された（マイヤー（Meyer P.S.）ら、1994 Biotechnol. Tech. 8:1-6）すでに記載されていた（ウィリアムズ（Williams J.G.）ら、1990．Nucleic Acids Res. 18:6531-6535）プライマー 5'-CATGTGTGGCGGGCA-3'を、分析に使用した。全ＤＮＡを９６℃で５分間加熱して変性させ、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００（パーキン・エルマー（Perkin Elmer））で最終容量５０μlでＰＣＲ反応を行った。以下の条件下で３５サイクルの増幅を行った：３０℃で１分間の環形成、７２℃で２分間の重合、そして９２℃で１分間の変性。最後のサイクルで、重合時間を７２℃で１０分間に延長し、次に４℃まで冷却した。この方法で増幅したＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動に付し、得られた結果を図５に示す。明らかなように、アスタキサンチン過剰産生株は同等のパターンを与え、一方キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＡＴＣＣ２４２２９株（これは、セクション６．１で行った分析で過剰産生株に最も類似していた）は、過剰産生株とは異なる増幅パターンを示した。この実験から、アスタキサンチン過剰産生株は、分析したすべての野生型株とは遺伝子的に異なると結論できる。
目的は、ＰＣＲでＤＮＡをランダムに増幅することにより、異なるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株の遺伝子多様性の存在を測定することであった。この方法はＲＡＰＤ（ランダムに増幅された多型ＤＮＡ）と呼ばれる。多型は、（ｉ）プライマー結合配列の変化（例えば点突然変異）、（ii）サイズを変化させるＤＮＡ配列の変化（例えば挿入と逆位）、（iii）増幅されたＤＮＡ断片のサイズを変化させる挿入、（iv）プライマの結合部位の消失などの存在により検出される。この試験は、セクション６．１に記載の４つの野生型株と６つの過剰産生株を含んだ。キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ですでに使用された（マイヤー（Meyer P.S.）ら、1994 Biotechnol. Tech. 8:1-6）すでに記載されていた（ウィリアムズ（Williams J.G.）ら、1990．Nucleic Acids Res. 18:6531-6535）プライマー 5'-CATGTGTGGCGGGCA-3'を、分析に使用した。全ＤＮＡを９６℃で５分間加熱して変性させ、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００（パーキン・エルマー（Perkin Elmer））で最終容量５０μlでＰＣＲ反応を行った。以下の条件下で３５サイクルの増幅を行った：３０℃で１分間の環形成、７２℃で２分間の重合、そして９２℃で１分間の変性。最後のサイクルで、重合時間を７２℃で１０分間に延長し、次に４℃まで冷却した。この方法で増幅したＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動に付し、得られた結果を図５に示す。明らかなように、アスタキサンチン過剰産生株は同等のパターンを与え、一方キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）ＡＴＣＣ２４２２９株（これは、セクション６．１で行った分析で過剰産生株に最も類似していた）は、過剰産生株とは異なる増幅パターンを示した。この実験から、アスタキサンチン過剰産生株は、分析したすべての野生型株とは遺伝子的に異なると結論できる。
キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のフラスコ発酵によるアスタキサンチンの産生法
まず、Ｒ３−０２−５培地のスラントに接種し、１７〜２０℃で５日間インキュベートした。Ｒ３−０２−５培地の組成は以下の通りである：バクトペプトン ６．５g/l、酵母エキス ２g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １．３g/l、ＮａＣｌ ０．１g/l、ＣａＣｌ2 ０．１g/l、グルコース ５０g/l、寒天 ２０g/l、Ｈ3ＢＯ3 ５００μg/l、ＣｕＳＯ4 ４０μg/l、ＫＩ １００μg/l、ＦｅＣｌ3 ２００μg/l、ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ ４００μg/l、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ２００μg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４００μg/l、ｐＨ６．０。微生物がいったん増殖したら、各スラントを３mlの食塩水溶液に再懸濁し、この懸濁液を使用して、Ｒ４−０６２−７培地２５mlを含有する５００mlのフラスコにフラスコ当たり１．５mlの細胞懸濁液の比率で接種した。これらの接種物を、１７〜２０℃、２５０rpm で４８時間インキュベートした。
まず、Ｒ３−０２−５培地のスラントに接種し、１７〜２０℃で５日間インキュベートした。Ｒ３−０２−５培地の組成は以下の通りである：バクトペプトン ６．５g/l、酵母エキス ２g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １．３g/l、ＮａＣｌ ０．１g/l、ＣａＣｌ2 ０．１g/l、グルコース ５０g/l、寒天 ２０g/l、Ｈ3ＢＯ3 ５００μg/l、ＣｕＳＯ4 ４０μg/l、ＫＩ １００μg/l、ＦｅＣｌ3 ２００μg/l、ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ ４００μg/l、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ２００μg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４００μg/l、ｐＨ６．０。微生物がいったん増殖したら、各スラントを３mlの食塩水溶液に再懸濁し、この懸濁液を使用して、Ｒ４−０６２−７培地２５mlを含有する５００mlのフラスコにフラスコ当たり１．５mlの細胞懸濁液の比率で接種した。これらの接種物を、１７〜２０℃、２５０rpm で４８時間インキュベートした。
接種物を使用して、Ｒ４−２０培地２５mlを含有する５００mlのフラスコ（３つのくぼみ）にフラスコ当たり２．５mlの比率で接種した。Ｒ４−２０培地の組成は以下の通りである：酵母エキス６．２g/l、綿実粉５．５g/l、ＫＨ2ＰＯ4 ２g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．５g/l、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２g/l、ＮａＣｌ ０．２g/l、ＣａＣｌ2 ０．２g/l、ＣａＣＯ3 １．６g/l、グルコース ２００g/l、ビオチン ５０μg/l、チアミン ５００μg/l、パントテン酸カルシウム ２mg/l、ｐＨ５．８〜６．０。これらのフラスコを１７〜２０℃で光の存在下で５〜７日間インキュベートした。これらの条件下でＶＫＰＭ Ｙ−２４７６株からのアスタキサンチン収率は、約１５０mg/lおよび４０００ppm であり、バイオマス３７g/lであった。
培地の修飾によるアスタキサンチン産生の改良
アスタキサンチンの産生を改良するために、培地への種々の化合物の添加を試験した：（ｉ）フリーラジカルを放出する物質、例えばジュロキノン（２５〜５０μM）、（ii）他のカロチノイド産生微生物中のカロチン生成のインデューサーである化合物、例えばレチナル（３５μM）およびトリスポリック酸（５０〜１００μg/ml）、（iii）綿実粉の代わりに、炭化水素鎖の前駆体である分子、例えばグルタミン酸（５．５mg/ml）。実施例７に記載のように発酵を行い、結果を図６に示す。最適条件下で得られたアスタキサンチンの収率は２２５mg/lおよび５０００ppm であり、バイオマス４５g/lであった。明らかなように、これらのすべての化合物は、元々の培地Ｒ４−２０と比較して収率を上昇させた。
アスタキサンチンの産生を改良するために、培地への種々の化合物の添加を試験した：（ｉ）フリーラジカルを放出する物質、例えばジュロキノン（２５〜５０μM）、（ii）他のカロチノイド産生微生物中のカロチン生成のインデューサーである化合物、例えばレチナル（３５μM）およびトリスポリック酸（５０〜１００μg/ml）、（iii）綿実粉の代わりに、炭化水素鎖の前駆体である分子、例えばグルタミン酸（５．５mg/ml）。実施例７に記載のように発酵を行い、結果を図６に示す。最適条件下で得られたアスタキサンチンの収率は２２５mg/lおよび５０００ppm であり、バイオマス４５g/lであった。明らかなように、これらのすべての化合物は、元々の培地Ｒ４−２０と比較して収率を上昇させた。
アスタキサンチンの比収率を上昇させる培地の開発
アスタキサンチンの比収率（アスタキサンチンmg／バイオマスｇ）を改良するために、ウェスター−ボッツ（Weuster-Botz D.）（インスチチュート・フィア・ビオテクノロギー（Institut fur Biotechnologie）、フルシュングスツェントルム・ユリッヒＧｍｂＨ（Forschungszentrum Julich GmbH）、ユリッヒ（Julich）、ドイツ）により開発された、遺伝子アルゴリズムに基づくギャロップ（ＧＡＬＯＰ）ソフトウェアを使用して培地を開発した。設計は、培地成分のいくつか（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、およびＣａＣＯ3）の濃度を一定に維持し、他の成分（グルコース、グリセロール、ペプトン、コーンスティーソリッド（ＣＳＳ）、硫酸アンモニウムおよび大豆油）の種々の濃度を分析することに基づいた。ギャロップ（ＧＡＬＯＰ）ソフトウェアを使用して７つの培地を設計したが、これらは種々の濃度の同じ成分からなる。表Ｉは、第４世代で分析した培地の組成を示す。
アスタキサンチンの比収率（アスタキサンチンmg／バイオマスｇ）を改良するために、ウェスター−ボッツ（Weuster-Botz D.）（インスチチュート・フィア・ビオテクノロギー（Institut fur Biotechnologie）、フルシュングスツェントルム・ユリッヒＧｍｂＨ（Forschungszentrum Julich GmbH）、ユリッヒ（Julich）、ドイツ）により開発された、遺伝子アルゴリズムに基づくギャロップ（ＧＡＬＯＰ）ソフトウェアを使用して培地を開発した。設計は、培地成分のいくつか（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、およびＣａＣＯ3）の濃度を一定に維持し、他の成分（グルコース、グリセロール、ペプトン、コーンスティーソリッド（ＣＳＳ）、硫酸アンモニウムおよび大豆油）の種々の濃度を分析することに基づいた。ギャロップ（ＧＡＬＯＰ）ソフトウェアを使用して７つの培地を設計したが、これらは種々の濃度の同じ成分からなる。表Ｉは、第４世代で分析した培地の組成を示す。
塩溶液２５×は１リットル当たり以下を含有した：５０ｇのＫＨ2ＰＯ4、１０ｇのＫ2ＨＰＯ4、３７．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｇのＮａＣｌ、５ｇのＣａＣｌ2 および４０ｇのＣａＣＯ3。図７は、その組成の４世代連続の最適化を実施した後の、これらの培地で得られた比収率の結果を示す。明らかなように我々は、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）Ｙ−２４１０株のアスタキサンチンの比収率を、絶対収率（mg/l）を低下させることなく２０９６（μg/g）（培地Ｐ）から４４９０ppm（培地５）に上昇させる培地の開発に成功した。
培養物に光照射することによるアスタキサンチンの産生の改良
アスタキサンチン産生の改良法を開発するために、Ｙ−２４７６株を、使用する光の波長を変化させながらフラスコ中で発酵させた。このために、実施例７に記載のように一連の発酵を行った。光の存在下または非存在下で、フラスコを１７〜２０℃で６日間インキュベートした。さらに異なる種類の光を試験した：白色、青、緑、黄色および紫外線。得られた結果を図８Ａに示す。明らかなように、白色光と紫外線は、暗所で行った発酵と比較して産生の最大の上昇を与えた。
アスタキサンチン産生の改良法を開発するために、Ｙ−２４７６株を、使用する光の波長を変化させながらフラスコ中で発酵させた。このために、実施例７に記載のように一連の発酵を行った。光の存在下または非存在下で、フラスコを１７〜２０℃で６日間インキュベートした。さらに異なる種類の光を試験した：白色、青、緑、黄色および紫外線。得られた結果を図８Ａに示す。明らかなように、白色光と紫外線は、暗所で行った発酵と比較して産生の最大の上昇を与えた。
さらに、Ｙ−２４７６株からのアスタキサンチン産生を、絶えず光照射するかまたは明／暗サイクル６、１２または２４時間で、フラスコ発酵で比較した。これらのサイクルを白色光と紫外線で行った。得られた結果を図８Ｂに示す。明らかなように、紫外線／暗の６時間のサイクルが、最大の産生上昇を与えた。
１０リットル発酵槽中のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の発酵によるアスタキサンチンの産生法
接種物のフラスコ（２００mlのＲ４−０６２−７培地を有する２リットル、実施例１）に、フラスコ当たり１つのスラントからの細胞を接種し、２０℃で光照射しながら２５０rpm で４８時間回転攪拌してインキュベートした。この方法で、７％のバイオマス（ペレット細胞容量として表示、ＰＣＶ）とｐＨ約３を有する培地が得られた。次に、栄養増殖用の中間発酵槽に、０．４％(v/v)の接種物を有するＲ４−１０−３Ｐ培地を接種した。Ｒ４−１０−３Ｐ培地は１リットルにつき以下の組成を有する：酵母エキス ６．２ｇ、綿実粉 ５．５ｇ、グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．５ｇ、ＰＯ4Ｈ（ＮＨ4）2 ５ｇ、ＮａＣｌ ０．２ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、およびチアミン ０．５mg、最終ｐＨ５．８〜６．０。栄養段階のものを、２０℃で４８時間、充分に攪拌して少なくとも５０％溶存酸素（ＤＯ2）を維持して、１．５vvm（容量／容量／分）で１２．５％濃度のアンモニアでｐＨを４．５に制御してインキュベートした。栄養相で得られた増殖は、３０〜３５％のバイオマス（ＰＣＶとして表示）に達した。産生相はＲ４−１０培地を有するホウケイ酸ガラスタンクの発酵槽で行い、これは接種後の容量（９リットル）に対して以下の組成を有する：酵母エキス ６．２g/l、綿実粉 ５．５g/l、ＫＨ2ＰＯ4 ２g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．５g/l、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ５g/l、ＮａＣｌ ０．２g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２g/l、微量元素の溶液 ２ml/lおよびポリプロピレングリコール２０２５ ０．９g/l、ＮａＯＨでｐＨを５．４に調整）。微量元素の溶液の組成は以下の通りである：ホウ酸 １mg、モリブデン酸ナトリウム２水和物 ０．４mg、硫酸亜鉛７水和物 ０．８mg、塩化第２鉄６水和物 ０．４mg、硫酸銅５水和物 ０．８mg、ヨウ化カリウム ０．２mg、硫酸マグネシウム４水和物 ０．８mg。培地を６リットルの容量に調整し、滅菌後、１．０５リットルのグルコースシロップ（接種後のグルコース濃度を１００g/lにするため）と１ml/lのビタミン溶液（ビオチン ０．１g/l、チアミン １g/l、およびパントテン酸カルシウム ４g/l）を加えた。発酵槽に２リットルの栄養培養物を加え、以下の栄養培養物条件に調整した：（Ｉ）通気：１．５vvm。（II）攪拌：１８時間までは７００rpm 、次に１２００rpm に上げてＤＯ2 ＞５０％に維持する。（III）圧力：０kg/cm2。（IV）温度：７２時間までは２０℃、次に１７℃。（Ｖ）ｐＨ：７２時間までは１２．５％のアンモニアで下限を４．５に制御、次に下限を３．０まで下げる。（VI）ＤＯ2 ：攪拌して下限を５０％で制御。（VIII）光照射：タンクの上に配置した全部で８０ワットの６つの蛍光管。
接種物のフラスコ（２００mlのＲ４−０６２−７培地を有する２リットル、実施例１）に、フラスコ当たり１つのスラントからの細胞を接種し、２０℃で光照射しながら２５０rpm で４８時間回転攪拌してインキュベートした。この方法で、７％のバイオマス（ペレット細胞容量として表示、ＰＣＶ）とｐＨ約３を有する培地が得られた。次に、栄養増殖用の中間発酵槽に、０．４％(v/v)の接種物を有するＲ４−１０−３Ｐ培地を接種した。Ｒ４−１０−３Ｐ培地は１リットルにつき以下の組成を有する：酵母エキス ６．２ｇ、綿実粉 ５．５ｇ、グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．５ｇ、ＰＯ4Ｈ（ＮＨ4）2 ５ｇ、ＮａＣｌ ０．２ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、およびチアミン ０．５mg、最終ｐＨ５．８〜６．０。栄養段階のものを、２０℃で４８時間、充分に攪拌して少なくとも５０％溶存酸素（ＤＯ2）を維持して、１．５vvm（容量／容量／分）で１２．５％濃度のアンモニアでｐＨを４．５に制御してインキュベートした。栄養相で得られた増殖は、３０〜３５％のバイオマス（ＰＣＶとして表示）に達した。産生相はＲ４−１０培地を有するホウケイ酸ガラスタンクの発酵槽で行い、これは接種後の容量（９リットル）に対して以下の組成を有する：酵母エキス ６．２g/l、綿実粉 ５．５g/l、ＫＨ2ＰＯ4 ２g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．５g/l、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ５g/l、ＮａＣｌ ０．２g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２g/l、微量元素の溶液 ２ml/lおよびポリプロピレングリコール２０２５ ０．９g/l、ＮａＯＨでｐＨを５．４に調整）。微量元素の溶液の組成は以下の通りである：ホウ酸 １mg、モリブデン酸ナトリウム２水和物 ０．４mg、硫酸亜鉛７水和物 ０．８mg、塩化第２鉄６水和物 ０．４mg、硫酸銅５水和物 ０．８mg、ヨウ化カリウム ０．２mg、硫酸マグネシウム４水和物 ０．８mg。培地を６リットルの容量に調整し、滅菌後、１．０５リットルのグルコースシロップ（接種後のグルコース濃度を１００g/lにするため）と１ml/lのビタミン溶液（ビオチン ０．１g/l、チアミン １g/l、およびパントテン酸カルシウム ４g/l）を加えた。発酵槽に２リットルの栄養培養物を加え、以下の栄養培養物条件に調整した：（Ｉ）通気：１．５vvm。（II）攪拌：１８時間までは７００rpm 、次に１２００rpm に上げてＤＯ2 ＞５０％に維持する。（III）圧力：０kg/cm2。（IV）温度：７２時間までは２０℃、次に１７℃。（Ｖ）ｐＨ：７２時間までは１２．５％のアンモニアで下限を４．５に制御、次に下限を３．０まで下げる。（VI）ＤＯ2 ：攪拌して下限を５０％で制御。（VIII）光照射：タンクの上に配置した全部で８０ワットの６つの蛍光管。
以下の添加物を作成した：（Ｉ）以下の添加スケールに従ってグルコースの５０％溶液（１リットル１時間当たりの純粋なグルコースのグラムとして表す）：０〜２５時間は０、２６〜５１時間は２．５、５２〜１１６時間は２．３、および１１７〜２１２時間は１．６。添加物中の５０％グルコースの総消費は６．４７リットルであった。（II）無水エタノール：７２時間から開始して２４時間毎に０．５％。総消費量は２７０mlであった。（III）消泡剤：ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、総消費量は２００mlであった。（IV）ｐＨの制御のために１２．５％で総消費量は４６４ml。
さらに、必要な部分的な採取を行って、作業容量を１０リットルに維持する。部分採取の総量は２．６リットルであり、タンクの最終容量は８．５リットルであった。発酵は２１２時間目に終了し、バイオマス３２％（ＰＣＶとして表す）であり、これは８４g/l（乾燥重量として表す）に等しかった。ＨＰＬＣで測定したアスタキサンチン濃度は４２５mg/lであり、従って乾燥バイオマスのアスタキサンチン濃度は５０００ppmを超えた。蓄積したカロチノイドの総濃度は６２３mg/l（７４１６ppm）であった。発酵の進行を図９に示す。
８００リットル発酵槽中のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の発酵によるアスタキサンチン産生法
接種物培地（Ｒ４−０６２−７、実施例１）を、フラスコ当たり２００〜４００mlの比率で２０００mlの三角フラスコに調製した。いったん滅菌後キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を接種し、次に２０℃、２５０rpm で４８時間インキュベートした。接種物を無菌条件下で、Ｒ４−１０−２培地を有する栄養増殖のための中間タンクに０．４％(v/v)の比率で移し、この培地はリットル当たり以下を含有した：酵母エキス ６．２ｇ、ファーマメディア（Pharmamedia） ５．５ｇ、グルコースシロップ（７０％(v/v)） １４３ｇ（別々に滅菌）、コーンスティーソリッド ２４ｇ，リン酸１カリウム ２ｇ、リン酸２カリウム ０．４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物 １．５ｇ、リン酸２アンモニウム ５ｇ、塩化ナトリウム ０．２ｇ、塩化カルシウム２水和物 ０．４ｇ、消泡剤 ０．１ｇ、塩酸チアミン １mg、ホウ酸 １mg、モリブデン酸ナトリウム２水和物 ０．４mg、硫酸亜鉛７水和物 ０．８mg、塩化第２鉄６水和物 ０．４mg、硫酸銅５水和物 ０．８mg、ヨウ化カリウム ０．２mg、硫酸マグネシウム４水和物 ０．８mg。初期ｐＨは５．６であった。栄養相を１７℃で５４時間、１．５v/v/mの通気速度で頭部圧力１気圧で、ｐＨが３．５より小さくなるまでインキュベートした。次にバイオマスが３０〜３５％（ＰＣＶとして表した）になるまで、Ｒ４−１０−２培地中で第２の増殖相を行った。Ｒ４−１０−２培地を含有する生産発酵槽（８００リットル容量）に、２０％(v/v)の栄養培養物を接種した。
接種物培地（Ｒ４−０６２−７、実施例１）を、フラスコ当たり２００〜４００mlの比率で２０００mlの三角フラスコに調製した。いったん滅菌後キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を接種し、次に２０℃、２５０rpm で４８時間インキュベートした。接種物を無菌条件下で、Ｒ４−１０−２培地を有する栄養増殖のための中間タンクに０．４％(v/v)の比率で移し、この培地はリットル当たり以下を含有した：酵母エキス ６．２ｇ、ファーマメディア（Pharmamedia） ５．５ｇ、グルコースシロップ（７０％(v/v)） １４３ｇ（別々に滅菌）、コーンスティーソリッド ２４ｇ，リン酸１カリウム ２ｇ、リン酸２カリウム ０．４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物 １．５ｇ、リン酸２アンモニウム ５ｇ、塩化ナトリウム ０．２ｇ、塩化カルシウム２水和物 ０．４ｇ、消泡剤 ０．１ｇ、塩酸チアミン １mg、ホウ酸 １mg、モリブデン酸ナトリウム２水和物 ０．４mg、硫酸亜鉛７水和物 ０．８mg、塩化第２鉄６水和物 ０．４mg、硫酸銅５水和物 ０．８mg、ヨウ化カリウム ０．２mg、硫酸マグネシウム４水和物 ０．８mg。初期ｐＨは５．６であった。栄養相を１７℃で５４時間、１．５v/v/mの通気速度で頭部圧力１気圧で、ｐＨが３．５より小さくなるまでインキュベートした。次にバイオマスが３０〜３５％（ＰＣＶとして表した）になるまで、Ｒ４−１０−２培地中で第２の増殖相を行った。Ｒ４−１０−２培地を含有する生産発酵槽（８００リットル容量）に、２０％(v/v)の栄養培養物を接種した。
発酵は以下の温度プログラムで行った：１６時間まで１９℃、１６〜６０時間は１８℃、そして最後まで１７℃。攪拌は１５０〜２７５rpm で変化させ、通気速度は１．５v/v/mであった。頭部圧力は０．５atm で維持した。ｐＨの制御は２５％水酸化アンモニウムで行い、２４時間までは４．５より上、２４〜６０時間は３．５より上、そして６０時間から最後までは３．０より上であった。溶存酸素は５０％より高く維持し、必要な時は攪拌速度を上昇させた。発酵の間、以下のプログラムに従ってグルコースを添加を行った（kg/m3/時間で表す）：０〜２４時間は０、２４〜４８時間は４．４１、４８〜７０時間は３．７７、７０〜９４時間は２．０８、および９４〜１８４時間は２．６０。
さらに、必要な時は以下を行った：（ｉ）消泡剤の添加、（ii）発酵槽中の容量を総容量の約７５％に維持するために部分的採取。培養物に、５４ワット蛍光管を６つ含有（全部で３２４Ｗ）する、培養物中に沈めた１メートルの長さのホウケイ酸管を使用して光を照射した。発酵を１８４時間続け、最後に４００mg/lのアスタキサンチン収率とバイオマス９０g/l（乾燥重量として表す）を得て、これは、乾燥バイオマスが４４００rpm を超えることを意味する。
５０μMのジュロキノンを添加すると、アスタキサンチン収率が約１５〜２０％上昇した。
マス中のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のアスタキサンチンが豊富なバイオマスの回収法とバイオアベイラビリティ分析
前記実施例に記載のように純粋な培養物で発酵した酵母キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を発酵槽から冷蔵タンクに移し、遠心分離またはろ過して回収するまでここに保持した。遠心分離またはろ過ユニットを使用して培地の予備濃縮を連続的に行い、濃縮培養物を得た。バイオマスの処理中にアスタキサンチンを保護するために、ある場合には、濃縮バイオマスに抗酸化剤エトキシキンを加えた。次に、通常の方法を使用して濃縮バイオマスの乾燥を行い、処理中の細胞の大半が破砕されることがないようにした。最後に、光、酸素および水分から保護できるように、乾燥バイオマスを保存した。
前記実施例に記載のように純粋な培養物で発酵した酵母キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）を発酵槽から冷蔵タンクに移し、遠心分離またはろ過して回収するまでここに保持した。遠心分離またはろ過ユニットを使用して培地の予備濃縮を連続的に行い、濃縮培養物を得た。バイオマスの処理中にアスタキサンチンを保護するために、ある場合には、濃縮バイオマスに抗酸化剤エトキシキンを加えた。次に、通常の方法を使用して濃縮バイオマスの乾燥を行い、処理中の細胞の大半が破砕されることがないようにした。最後に、光、酸素および水分から保護できるように、乾燥バイオマスを保存した。
混合物中にアスタキサンチン濃度が７５ppm になるように、乾燥バイオマスを養魚で使用される餌調製物と混合した。次に混合物を円筒形またはペレットの形で押しだし、これを用いていくつかのマスに２ヶ月間餌を与えた。次に、ランダムに選択した１０匹のマスを屠殺し、その筋肉組織中のアスタキサンチンとカロチノイド含量を測定した。さらに、あらかじめ前記のペレットを与えなかった１０匹の対照マスで、アスタキサンチンとカロチノイドの含量を分析した。得られた平均値を以下の表に示す：
バイオアベイラビリティ試験の結果は、キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の乾燥バイオマス中に存在するアスタキサンチンおよび他のカロチノイドがマスの組織に移行し、マスに魅力的なサケ色を与えたことを示す。
Claims (26)
- ６〜７日間の発酵で少なくとも４０００ppm のアスタキサンチンをフラスコ中で産生することができる、スキーム２に記載のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）株またはその変異体または形質転換した誘導体の培養を含んでなる、発酵によるアスタキサンチンの産生方法。
- 工業的発酵において、７〜９日間の発酵で少なくとも５０００ppm のアスタキサンチン収率が達成される、請求項１の発酵法。
- 発酵プロセス中にジュロキノンが加えられる、請求項１と２の発酵法。
- ジュロキノンが２５〜５０μMの濃度で加えられる、請求項３の発酵法。
- レチナルが発酵プロセス中に加えられる、請求項１と２の発酵法。
- レチナルが３５μMの濃度で加えられる、請求項５の発酵法。
- トリスポリック酸が発酵プロセス中に加えられる、請求項１と２の発酵法。
- トリスポリック酸が５０〜１００μg/mlの濃度で加えられる、請求項７の発酵法。
- グルタミン酸が発酵プロセス中に加えられる、請求項１と２の発酵法。
- グルタミン酸が５．５mg/mlの濃度で加えられる、請求項９の発酵法。
- 表Ｉに記載の培地が発酵プロセスに使用される、請求項１と２の発酵法。
- ６〜７日間の発酵でフラスコ中で４４９０ppm のアスタキサンチンが産生される、請求項１１の発酵法。
- 発酵プロセス中に発酵培地が照射される、請求項１１の発酵法。
- 使用される照射源は白色光である、請求項１３の発酵法。
- 使用される照射源は紫外線である、請求項１３の発酵法。
- 照射は発酵の最初から最後まで、好ましくは４０〜２００時間行われる、請求項１３〜１５の発酵法。
- ６時間の照射／暗サイクルが使用される、請求項１６の発酵法。
- 請求項１〜１７のいずれかの発酵法であって：
（ａ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の接種物が接種される、
（ｂ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の接種物は２０℃で４８時間培養される、
（ｃ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の初代培養相に、約０．４％(v/v)の接種相が接種される、
（ｄ）キサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）の初期相は１７〜２０℃で４８〜５４時間培養される、
（ｅ）各発酵槽は、２０％(v/v)の初期相のキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）が接種される、
（ｆ）発酵は、１８〜２０℃で６０〜７２時間、および１７℃でさらに５〜７日間インキュベートされる、
ことを含んでなる上記方法。 - ７〜９日目に少なくとも４２５mg/l のアスタキサンチンが産生される、請求項１８の発酵法。
- 発酵培地１リットル当たり少なくとも５０ｇ乾燥重量濃度のバイオマスが産生される、請求項１８と１９の発酵法。
- 発酵培地１リットル当たり少なくとも８０ｇ乾燥重量濃度のバイオマスが産生される、請求項２０の発酵法。
- ７〜９日間の発酵で細胞の乾燥重量１ｇ当たり少なくとも５０００μgのアスタキサンチンが産生される、請求項１８〜２１の発酵法。
- ヒトおよび動物の食物として使用される、請求項１〜２２の発酵プロセスにより得られる、栄養価と着色価のあるキサントフィロミセス・デンドロロウス（X. dendrorhous）のバイオマス。
- 以下を含有する、請求項２３のバイオマス：
ａ）少なくとも５０００μg/g濃度のアスタキサンチン；
ｂ）少なくとも７４００μg/g濃度の総カロチノイド；
ｃ）少なくとも１５％濃度のタンパク質、および
ｄ）少なくとも１５％濃度の炭水化物。 - 請求項２３および２４のバイオマスからなるまたはこれを含有する動物の食物のための化合物。
- 請求項２３および２４のバイオマスからなるまたはこれを含有するヒトの食物のための化合物。
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