KR100249731B1

KR100249731B1 - 아스타산틴 생산 효모 돌연변이주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100249731B1
Application number: KR1019970066697A
Authority: KR
Inventors: 이용화; 정승식; 강구환
Original assignee: 심광경
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2000-03-15
Also published as: KR19990048085A

Abstract

본 발명은 카로티노이드계 색소인 천연 아스타산틴(astaxanthin) 색소의 생산성이 높은 효모 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 돌연변이 균주에 관한 것으로, 본 발명에 따른 파피아 로도지마 돌연 변이주 KT-9 및 KT-12는 약 410,000 ㎍/ℓ 및 620,000 ㎍/ℓ의 총 카로티노이드 생산성을 가진다.

Description

아스타산틴 생산 효모 돌연변이주 및 이의 제조방법

본 발명은 아스타산틴(astaxanthin) 생산성이 높은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 돌연변이주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

아스타산틴(3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 하기 화학식의 카로티노이드계 색소이다.

아스타산틴 색소는 동물의 혈관에 침착된 후 지방조직에 축적되고 최종적으로 표적조직(target tissue)에 축적되어 새우나 가재의 껍데기의 색, 조류의 부리 및 난황, 및 연어나 송어와 같은 어류의 살색을 핑크색으로 만듦으로써, 결과적으로는 색상 증진과 더불어 특유한 영양소 및 풍미 효과을 나타낸다. 또한 아스타산틴은 색조 및 열안정성등에 뛰어난 특성을 지니며, 다른 카로티노이드나 토코페롤보다도 뛰어난 항산화 효과를 보이고 있는 것으로 증명되어 항산화제 색소로서 식품업계 뿐만 아니라 의약분야에서도 상당히 주목되고 있다(Kurashige, M., et al., Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 27-38(1990); Terao, Lipids 24, 659 (1989); Miki, W. Pure Appl. Chem. 63, 141-146 (1991)). 특히 비타민 에이의 전구체, 면역기능의 활성화 및 산소 라디칼의 제거에 의한 항암작용등으로 사람에게도 중요한 대사적 역할을 나타낸다(Goodwin, T. W. Metabolism, Nutrition and Function of Carotenoids. Ann. Rev. Nutr. 6, 273 (1986); Benidch, A., et al., Biological actions of carotenoids. FASEB J. 3, 1927 (1989)).

현대 식생활 방식들이 동물성 지방 및 콜레스테롤 함유 식품들을 피하는 쪽으로 기울기 때문에 수산 식품의 소비는 계속적으로 증가를 나타내고 있으며, 소비되는 수산식품의 약 15% 정도는 양식으로 생산하고 있다. 이러한 많은 어류중에서 특히 연어는 중요한 수산 양식 자원의 하나인데 자체적으로 색소를 합성하지 못하므로 이를 위해 외부에서 사료로서 공급해야만 한다. 이러한 사료원으로 아스타산틴 색소를 함유하고 있는 효모 파피아 로도지마가 물고기의 영양원 및 색소원으로 많이 이용되고 있다. 이로 인해 현재 아스타산틴 색소는 전세계적으로 그 사용량이 증가 추세에 있고 그에 따라 시장에 색소를 원활하게 공급하기 위해 천연색소의 자연 추출 방법보다는 화학적 합성방법에 의해 색소를 대량 생산하여 왔다. 그러나, 합성색소는 생체 흡수율이 떨어질 뿐만 아니라 안정성이 확보되지 않았으므로 미국 식품의약국(FDA)에 의해 인정받지 못하고 있다.

이에 따라 천연 색소인 아스타산틴을 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 색소를 대량 생산하고자 하는 연구들이 계속되어 왔다. 그러나 천연형(wild type) 효모 파피아 로도지마는 천연 아스타산틴 색소의 생산량이 적어 산업적 이용에는 한계가 있다. 따라서 균주 개량에 의한 효모 파피아 로도지마의 돌연 변이주를 개발하여 천연 아스타산틴 색소의 생산 능력을 향상시키려는 연구가 현재 활발히 진행되고 있다.

아스타산틴 색소를 생산하는 미생물에 관해서는 1972년에 허먼 파프 등에 의해 일본, 알래스카 및 구 소련 등지에서 파피아 로도지마를 발견하였으며 (Phaff et al., A comparative study of the yeast florae associated with trees on the Japanese Islands and on the west coast of North Ameira, Proc. IV: Ferment. Technol. Today 759-774 (1972)), 1976년 밀러 등에 의해 산악지대 등의 한랭지에서 생식하는 파피아 로도지마가 특이적으로 카로티노이드계 색소의 일종인 아스타산틴 을 생산하는 효모인 것으로 보고되어 있다. 이밖에도 앤드류 등은 이 효모가 아스타산틴 이외의 카로티노이드로서 아스타산틴 합성단계의 중간 산물(intermediate)인 에키네논(echinenone), 3-하이드록시에키네논(hydroxyechinenone), 및 페니코산틴(phenicoxanthin)들을 생성한다(도 1)고 보고한 바 있으나, 파피아 로도지마에서 생성되는 이들 카로티노이드 전체양의 약 85% 이상이 아스타산틴인 것으로 보고되었다(Andrews, A.G., et al., Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a Red-Pigmented Fermenting Yeast, Phytochemistry, 15, 1003-1007 (1976)).

해양 미생물과 담수생물에서도 아스타산틴 (3,3'-dihydroxy-4,4'-diketo-β-carotene)를 생산할 수 있는 것으로 알려졌다. 조류(algae)의 일종인 헤마토코커스 프루비아리스(Hamatococcus pluvialis)는 높은 양의 아스타산틴 색소 생산 능력을 가지고 있는 것이 알려지고 있어, 이것들의 균주, 배양 조건의 개량에 의해 아스타산틴 색소 생산 능력을 향상시키는 연구도 진행되고 있다. 그러나 이 균주는 오랜 기간 동안 연못에서 배양해야 하고 생산 후에 색소를 균체로부터만 추출해야 하기 때문에 사용이 제한되고 있다(Droop, M.R. Carotenogenesis in Haematococcus pluisalis. Nature 175, 42 (1955); Goodwin, T. W., et al., Studies in carotenogenesis. II. Carotenoid synthesis in the alga Haematococcus pluvialis. J. Biochem. 57, 376 (1954)).

또 아스타산틴 생산 균주로는 해양 미생물인 아그로박테리엄(Agrobacterim)이 있는데, 현재는 이 미생물 자체로부터 색소를 생산하는 방식보다는 여기서 부터 유전자를 추출하여 빵 효모로부터 색소를 생산하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 이 방법도 6개 이상의 유전자를 빵 효모에로 도입함으로 인해 생산 효율 증가가 상당히 어렵다. 그 이유는, 아스타산틴의 생산은 카고티노이드의 구조적 유전자(structural gene) 외에도 많은 유전자들이 색소 생산에 지대한 영향을 미치는 것으로 이해되고 있기 때문이다(Yamano, S. et al., Metabolic engineering for production of β-carotene and lycopene on Sacharomyces cerevisiae. Biosci. Biotech. Biochem., 58, 112 (1994)).

효모 파피아 로도지마의 특징으로는 유성생식을 하는 단세포 미생물이고 생활의 대부분을 구형 또는 난형으로 존재하며 핑크색 색소를 띠는 콜로니(colony)를 형성한다. 호기성 균으로서 알코올 발효를 하지 않고 산소 라디칼에 대한 보호 본능으로 강력한 항산화 효과가 있는 아스타산틴 색소를 생산한다.

한편, 효모 파피아 로도지마는 다른 효모에 비해 낮은 온도에서 자라기 때문에 약 5 내지 6일의 장기간의 배양이 필요하고 이에 따라 많은 비용이 소모될 뿐 아니라 많은 양의 아스타산틴 색소은 파피아 로도지마의 성장이 멈춘 뒤에 축적이 된다. 따라서, 적당한 냉온도의 유지(cooling)와 공기의 유입(aeration)은 꼭 필요로 하는 조건이기에 이에 따른 비용 감축의 연구가 절실히 요구된다.

또한 천연형 파피아 로도지마는 낮은 천연 아스타산틴 색소 생산성으로 인해 상업적으로 사용하는데 상당한 제한을 받고 있는데, 합성 아스타산틴 색소와 경쟁할 수 있으려면 적어도 효모 g 당 아스타산틴 6 mg 이상으로 카로티노이드를 대량 생산할 수 있는 돌연변이 균주 개량이 필요하다.

본 발명자들은 이미 아스타산틴 색소의 생산량이 많은 파피아 로도지마의 돌연변이주 HP-30, R 10-1, p1-2 및 M-18를 개발하여 한국 특허출원 제 95-4260 호(공개 제 96-34396 호)로 출원한 바 있으며, HP-30 돌연변이주에 대한 연구를 계속하여 색소의 생산량이 더욱 증가된 효모 파피아 로도지마의 돌연변이 균주를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연색소 아스타산틴을 대량으로 생산하는 돌연변이 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1는 아스타산틴의 합성 단계와 그 중간 산물을 나타낸다.

도 2는 파피아 로도지마 KT-9 및 KT-12의 제조 과정을 나타내는 모식도이다.

도 3은 파피아 로도지마 KT-9의 현미경 사진(1,500배 배율)이다.

도 4는 파피아 로도지마 KT-12의 현미경 사진(1,500배 배율)이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 아스타산틴의 생산성이 높은 파피아 로도지마 돌연변이 균주 KT-9 및 KT-12가 제공된다.

또한 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 파피아 로도지마 균주에 감마광선 조사, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 처리 및 사이몰(thymol) 처리를 사멸률이 각각 60 내지 99.9%가 되도록 임의의 순서로 각각 1회 이상 실시하는 것을 포함하는 돌연변이주 KT-9의 제조방법이 제공된다.

또한 본 발명에서는 파피아 로도지마 KT-9 균주에 NTG 처리, 베타-아이오논(β-ionone) 처리, 트리에틸아민(TEA) 처리, 베타-카로틴(β-carotene) 처리를 사멸률이 각각 60 내지 99.9%가 되도록 임의의 순서로 각각 1회 이상 실시하는 것을 포함하는 돌연변이주 KT-12의 제조방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '색소 생산성'은 배양액 ℓ당 수득되는 색소의 양(㎍)을 나타낸다. 또한 본 발명에서 사용되는 '균체 수율(Yx/s)'는 기질에 대한 균체량의 수율을 나타내며, '총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x)'은 균체량에 대한 카로티노이드의 수율을 나타내고, 이때 x는 균체량(cell mass)이고, s는 기질(substrate)이며, Y는 수율(yield)이고, p는 생산물(product)인 카로티노이드이다.

본 발명의 개량된 효모 균주들은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.

파피아 로도지마 HP-30(미국의 애그리컬춰 리서치 컬춰 컬렉션(Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 12월 2일자 기탁번호 제 NRRL Y-21359 호로서 기탁함)를 YM 액체배지(0.3% 효모추출물, 0.3% 맥아추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 포도당)에서 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체를 완충용액에 현탁시키고 물리적인 돌연변이 유도방법인 감마광선을 조사하여 효모를 사멸시킨다. 즉, 효모를 YM 액체배지에서 배양한 후 [⁶⁰Co]로부터 방출되는 감마광선을 상기 돌연변이 효모 세포가 60% 내지 99.9%, 바람직하게는 95% 내지 99.9% 사멸할 정도로, 0.7 내지 3.0 KGy, 바람직하게는 2.6 KGy로 균체 현탁액에 조사한다.

현탁액을 YM 액체배지에 넣고 배양한 후 이 배양액을 YD 고체배지(0.5% 효모 추출물, 0.6M 염화칼륨, 1.0% 포도당, 1.8% 한천)에 희석 도말한 후 배양하여 생성된 콜로니중 윤기가 있는 짙은 핑크색의 콜로니를 모두 선별한다. 순수한 콜로니를 얻기 위해 YD 고체배지상에서의 선별 과정을 2 내지 5회 반복한다. 이들 균주들을 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 후, 균체 수율 및 총 카로티노이드 수율을 측정하고 비교하여 색소 생산성이 가장 높은 1개의 균주를 선별한다. 이 균주는 유가식 배양하고 균체 수율 및 총카로티노이드 생산 수율을 보다 정확하게 측정한다. 상기 감마광선 조사 및 선별과정은 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 반복적으로 수행한다.

선별된 돌연변이 효모를 YM 액체배지에서 배양한 후 NTG로 처리하여 효모를 사멸시킨다. 이때, NTG 의 농도, 처리 온도 및 처리 시간에 따라 효모의 사멸률이 달라질 수 있으며, 사멸률에 따라 변이주를 얻는 확률이 달라지므로 이들 조건들을 적절히 조절하는데, 사멸률이 60% 내지 99.9%, 바람직하게는 95% 내지 99.9%가 되도록 조절한다. 생존한 효모를 YM 고체배지에 희석 도말한 후 배양하여 생성된 콜로니중 모균주보다 성장이 빠르며 윤기가 있고 핑크색이 짙은 균주들을 모두 선별한다. 순수한 콜로니를 얻기 위해 YD 고체배지상에서의 선별 과정을 2 내지 5회 반복한다. 이들 균주들을 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 후, 균체 수율 및 총카로티노이드 수율을 측정하고 비교하여 색소 생산성이 가장 높은 1개의 균주를 선별한다. 이 균주는 유가식 배양하고 균체 수율 및 총카로티노이드 생산 수율을 보다 정확하게 측정한다. 상기 NTG 처리 및 선별과정은 1회 내지 5회, 바람직하게는 1회 반복적으로 수행한다.

이어서 NTG에 의한 돌연변이 효모를 YM 액체배지에서 배양한 후 화학적 저해제(chemical inhibitor)인 사이몰로 처리된 YM 고체배지에 희석 도말하여 사멸시킨다. 이때, 상기 사이몰의 농도, 처리 온도 및 처리 시간에 따라 효모의 사멸률이 달라질 수 있으며, 사멸률에 따라 변이주를 얻는 확률이 달라지므로 이들 조건들을 적절히 조절하는데, 사멸률이 60 내지 99.9%가 되도록 조절한다. 바람직하게는 80 내지 90%, 더욱 바람직하게는 85%가 되도록 조절한다. 사이몰로 처리한 YM 고체배지에서 생존한 효모를 모균주와 비교하여 성장이 빠르며 짙은 핑크색 콜로니를 나타내는 균주들을 모두 선별한다. 순수한 콜로니를 얻기 위해 YD 고체배지상에서의 선별 과정을 2 내지 5회 반복한다. 이들 균주들을 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 후, 균체 수율 및 총카로티노이드 수율을 측정하고 비교하여 색소 생산성이 가장 높은 1개의 균주를 선별한다. 이 균주는 유가식 배양하고 균체 수율 및 총카로티노이드 생산 수율을 보다 정확하게 측정한다. 상기 사이몰 처리 및 선별과정은 1회 내지 5회, 바람직하게는 1회 반복적으로 수행한다.

상기한 감마광선 조사, NTG 처리, 사이몰 처리의 순서는 임의로 변경하여도 무관하며, 바람직하게는 도 2에 도시한 바와 같이 감마광선 조사 2회, NTG 처리, 사이몰 처리의 순서로 실시하는 것이다.

선별된 균주는 파피아 로도지마 KT-9로 명명하고 한국 미생물 보존 협회(Korean Culture Center of Microorganism (KCCM))에 1997년 10월 7일자 기탁번호 제 KCCM-10112 호로서 기탁하였다.

상기 돌연변이주 KT-9는 YM 액체배지에서 배양한 후 다시 NTG 처리 및 선별 과정을 상기와 같은 방법으로 실시한다. NTG 선별 과정은 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복적으로 수행한다.

NTG 처리에 의해 선별된 돌연변이주는 YM 액체배지에서 배양한 후 화학적 저해제인 베타-아이오논을 처리한 YM 고체배지에 희석 도말하여 사멸시킨다. 이때 사멸률은 60 내지 99.9%, 바람직하게는 70 내지 80%, 더욱 바람직하게는 75%가 되도록 조절한다는 점을 제외하고는, 베타-아이오논 처리와 선별 과정은 상기한 사이몰의 경우에서와 동일한 방법으로 실시한다.

상기 선별된 돌연변이주는 YM 액체배지에서 배양한 후 다시 화학적 저해제인 트리에틸아민을 처리한 YM 고체배지에 희석 도말하여 사멸시킨다. 이때 트리에틸아민의 처리와 선별 과정은 상기한 사이몰의 경우에서와 동일한 방법으로 실시한다.

상기 선별된 돌연변이주는 YM 액체배지에서 배양한 후 다시 화학적 저해제인 베타-카로틴을 처리한 YM 고체배지에 희석 도말하여 사멸시킨다. 이때 사멸률은 60 내지 99.9%, 바람직하게는 90 내지 99.9%, 더욱 바람직하게는 95%가 되도록 조절한다는 점을 제외하고는, 베타-카로틴의 처리와 선별 과정은 상기한 사이몰의 경우에서와 동일한 방법으로 실시한다.

상기한 NTG 처리, 베타-아이오논 처리, 트리에틸아민 처리 및 베타-카로틴 처리의 순서는 임의로 변경하여도 무관하며, 바람직하게는 도 2에 도시한 바와 같이 NTG 처리, 베타-아이오논 처리, NTG 처리, 트리에틸아민 처리, NTG 처리 및 베타-카로틴 처리의 순서로 실시하는 것이다.

선별된 균주는 파피아 로도지마 KT-12로 명명하고 한국 미생물 보존 협회에 1997년 10월 7일자 기탁번호 제 KCCM-10113 호로서 기탁하였다.

상기 균주의 유가식 배양 방법은 다음과 같다.

먼저, 파피아 로도지마 돌연변이 균주를 YM 액체배지에서 18 내지 22℃로 5일 동안 진탕 배양하여 균을 활성화시킨 후, 5 ppm 이상의 바이오틴과 0.05% 이상의 효모 추출물을 필수적으로 포함하는 개시배지에서 3 내지 6일 동안 종균 배양한다. 교반식 발효기를 이용한 유가식 본 배양을 위해서는 상기와 동일한 조성의 개시배지가 들어있는 발효기에서 상기에서 준비된 종균을 접종하여 pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 6.0, 교반속도 200 내지 600 rpm, 바람직하게는 300 rpm, 배양은 18 내지 23 ℃, 바람직하게는 21℃, 통기량 0.5 내지 1.5 vvm, 바람직하게는 1 vvm을 유지하며 5 내지 8일 동안 배양하고, 배지내의 당이 완전히 소모되었을 때 5% 이상의 탄소원을 필수적으로 포함하는 공급배지를 당농도가 1% 이하로 유지되도록 공급하면서 유가식 배양을 진행한다. 상기 유가식 배양에 사용되는 개시배지로는 배지 ℓ당 포도당 40.0g, 펩톤 7.0g, 시에스엘(CSL) 5.0g, 효모 추출물 5.0g, 맥아 추출물 4.0g, 황산 암모늄 2.5g, 초산 암모늄 1.0g, 인산칼륨 1.0g, 인산 제2 암모늄 0.8g, 황산 마그네슘 0.5g, 실리콘 오일 3.0㎖, 티아민 10.0㎎, 황산구리 6.0㎎, 바이오틴 5.0㎎, 염화철 5.0㎎ 및 황산망간 4.0㎎를 포함하는 배지가 가장 바람직하고, 공급배지로서는 배지ℓ당 포도당 450.0g 및 황산암모늄 5.0g를 포함하는 배지가 바람직하다.

상기 건조균체 중량의 측정 방법은 다음과 같다.

파피아 로도지마 돌연변이 균주를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양하거나 상기와 같이 유가식 배양하고 배양이 완료된 배양액을 70 내지 120℃, 바람직하게는 100℃에서 5 내지 25분, 바람직하게는 15분 동안 열처리한 다음, 배양액 5 ㎖을 6,000 내지 10,000 rpm, 바람직하게는 9,000 rpm에서 5 내지 15분, 바람직하게는 10분 동안 원심 분리하여 균체를 회수하고 증류수로 2회 세척한 다음 105℃에서 12 내지 15시간 정도 건조시켜 균체건조 중량을 측정한다.

또한, 상기 총 카로티노이드 추출 및 정량 방법으로는 상기 균주로부터 당해 분야에 공지된 여러 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들면 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)로 세포벽을 파괴하고 추출된 색소의 양을 정량할 수 있다. 즉, 세포내에 함유된 색소의 총량을 측정하기 위하여 상기 유가식 배양이 완료된 세포 배양액 1㎖를 원심분리 튜브에 넣고 9㎖의 증류수를 가한 다음 9,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 세척하고 진공 건조기를 이용하여 수분을 제거한다. 여기에 35 내지 65℃, 바람직하게는 55℃ 에서 미리 가온된 디메틸설폭사이드 원액 5 내지 20㎖, 바람직하게는 10㎖을 넣고 동일 온도에서 5 내지 10분, 바람직하게는 8분간 반응시킨 후 세게 흔들어 효모 세포가 충분히 파쇄되도록 한다. 색소가 용매층에 잘 추출되도록 세포 파쇄액에 1.0M 인산염 완충용액(pH 7.0) 3㎖ 및 헥산(hexane)과 에틸 아세테이트(ethyl acetate)가 동량으로 혼합된 용매 10 내지 30㎖, 바람직하게는 20㎖을 넣고 혼합한 후 원심분리하여 용매층의 불순물을 제거하고 474nm 에서 상층액의 흡광도를 측정하여 세포내에 함유된 총색소를 정량하였다.

상기에서 얻은 흡광도와 균체 중량으로부터 1% 흡광계수(extinction coefficient=2,100) 값을 이용하여 존슨 등의 방법으로 하기 식에 의해 총 카로티노이드를 정량할 수 있다(Johnson, E.A. et al., Isolation of Phaffia rhodozyma mutants with increase astaxanthin content, Appl. and Environ. Microbiol. 55, 116-124 (1989)).

총 카로티노이드 양(㎍/g 효모건조중량) = (S x A₄₇₄x 100)(21 x D)

이때, S는 추출에 사용된 용매의 양(㎖)이고; A₄₇₄는 474nm 에서 측정된 색소의 흡광도이고; D는 사용된 효모의 건조 중량이다.

상기 식에서, 총 카로티노이드 양을 측정하기 위해서는 색소 분석에 사용되는 효모의 건조 중량을 측정하여야 한다. 그러나 색소 분석에 사용된 효모는 너무 소량이어서 건조중량을 직접 측정하기 어려우므로, 사용된 효모 배양액의 10배량을 물로 세척하여 105℃ 에서 무게변화가 없을 때까지 건조시킨 뒤 측정한 건조중량을 10으로 나눠 계산한다.

상기의 색소 추출 및 정량 방법에서는 동일 균주라도 배양시간 및 처리시간 등의 각 조건들을 변경시킴으로써 그에 따른 총 카로티노이드 양 및 균주 파괴율의 변화를 살펴볼 수 있다.

본 발명의 KT-9 균주는 도 3의 형태를 가지며 63 g/ℓ의 균체 수율(Yx/s)과 6,573 ㎍/g 의 아스타산틴을 포함한 총 카로티노이드의 생산 수율(Yp/x)을 갖고 있어 전체적으로는 414,099 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가진다. 또한 KT-12 균주는 도 4의 형태를 가지며 73 g/ℓ의 균체 수율(Yx/s)과 8.434 ㎍/g의 아스타산틴을 포함한 총 카로티노이드의 생산 수율(Yp/x)을 갖고 있어 전체적으로는 615,682 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가진다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 유가식 배양

실시예에서의 유가식 배양은 다음과 같이 실시하였다.

먼저, 파피아 로도지마 돌연변이 효모균을 YM 배지 30㎖가 들어 있는 250㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 21℃에서 150rpm으로 교반하면서 4일간 배양한 후, 이 배양액을 개시배지(ℓ당 포도당 40.0g, 펩톤 7.0g, 시에스엘(CSL) 5.0g, 효모 추출물 5.0g, 맥아 추출물 4.0g, 황산 암모늄 2.5g, 초산 암모늄 1.0g, 인산칼륨 1.0g, 인산 제2 암모늄 0.8g, 황산 마그네슘 0.5g, 실리콘 오일 3.0㎖, 티아민 10.0㎎, 황산구리 6.0㎎, 바이오틴 5.0㎎, 염화철 5.0㎎ 및 황산망간 4.0㎎) 200㎖가 들어있는 1ℓ 삼각 플라스크에 접종하여 상기와 동일한 조건하에 3일간 배양하였다.

이 배양액을 상기 개시배지 1.8ℓ가 들어있는 5ℓ 발효기에 접종한 후 교반속도 300 rpm, 배양온도 21℃, 통기량 1 vvm 및 pH 6.0을 유지하면서 배양한 다음 당이 고갈되면 공급배지(ℓ당 포도당 450.0g 및 황산암모늄 5.0g) 1.5ℓ를 발효기내의 당농도가 1% 이하로 유지되도록 정량 펌프로 공급하면서 6일간 배양하였다.

참조예 2: 건조균체 중량의 측정

실시예에서의 건조 균체 중량의 측정은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 즉, 콜로니를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양하거나 참조예 1에서와 동일한 방법으로 배양하고 배양이 완료된 후, 배양액을 100℃에서 15분간 열처리하고 열처리된 배양액 5㎖를 9,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고 증류수로 2회 세척한 다음 105℃에서 약 15시간 동안 건조시키고 건조 중량을 측정하였다.

참조예 3: 총 카로티노이드의 정량

실시예에서의 색소의 정량은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 즉, 콜로니를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양하거나 참조예 1에서와 동일한 방법으로 배양하고 배양이 완료된 후, 배양액 1㎖를 50㎖의 원심분리 튜브에 넣고 증류수 9㎖를 가하고 원심분리한 후 침전물을 증류수로 2회 세척하고 진공건조기를 이용하여 수분을 제거하였다. 여기에 55℃에서 미리 가온된 10㎖의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 넣고 동일 온도에서 5분 동안 반응시킨 후 세게 흔들어 세포를 파쇄하였다. 1.0M 인산염 완충용액(pH 7.0) 3㎖를 세포 파쇄액에 넣고 헥산과 에틸아세테이트가 동량으로 혼합된 용매 20㎖를 넣어 카로티노이드 색소를 용매층으로 추출하였다. 용매층을 9,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 고분자 불순물을 제거한 후 얻은 상층액의 흡광도를 474㎚에서 측정하여 세포내에 함유된 총 카로티노이드를 정량하였다.

비교예: 파피아 로도지마 HP-30 균주의 색소 생산성

파피아 로도지마 HP-30(NRRL Y-21359)는 멸균된 YM 고체배지(0.3% 효모추출물, 0.3% 맥아 추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 포도당, 1.8% 한천)을 이용하여 제조한 사면배지에서 매주 계대 배양하여 냉장 보관하면서 실험에 이용하였다.

파피아 로도지마 HP-30 균주는 참조예 1에서와 동일한 방법으로 배양한 후, 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정하였다. 그 결과 파피아 로도지마 HP-30 균주는 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 4,200 ㎍/g 과 균체 수율(Yx/s) 60 g/ℓ을 갖고 있어, 전체적으로는 252,000 ㎍/ℓ의 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 1: 파피아 로도지마 KT-9 균주의 선별

(단계 1) 감마광선 조사에 의한 1차 돌연변이 유발

파피아 로도지마 HP-30(NRRL Y-21359)를 YM 액체배지에 접종하고 21 ℃를 유지하면서 5일 동안 150rpm의 회전 속도로 진탕 배양한 후, 이 배양액 5㎖를 동일한 조성을 갖는 YM 액체배지 45㎖에 접종하여 3일 동안 동일한 조건으로 더 배양하였다. 그 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 감마광선 조사에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

감마광선 조사에 의한 돌연변이 유도방법으로서 [⁶⁰Co]로부터 방출되는 감마광선을 파피아 로도지마가 90% 이상 사멸하는 2.6 KGy로 균체 현탁액에 조사한 후 이 현탁액을 YM 액체배지에 넣고 3일 정도 배양하고 이 배양액을 YM 고체배지에 희석 도말한 다음 21 ℃에서 10일 동안 배양하였다. 이때, 감마광선을 조사하지 않은 배양액을 동일한 방법으로 YM 한천 배지에 희석 도말하고 배양하여, 감마광선 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다. 생성된 콜로니는 YM 액체배지에 넣고 5일 정도 배양한 후 선별배지인 YD 고체배지(0.5% 효모 추출물, 0.6M 염화칼륨, 1.0% 포도당, 1.8% 한천)에 도말한 다음 21℃에서 10일 동안 다시 배양하였다. 생성된 콜로니중 균체 수율은 약간 떨어지지만 색소 생성이 뛰어나고 윤기가 있으며 안정한 짙은 핑크색 콜로니를 모두 선별하였다. 이때 안정성은 콜로니를 평판도말하여 배양하였을 때 균일한 콜로니를 형성하는 것을 나타낸다. 상기 YD 고체배지에서의 선별과정을 3회 반복적으로 수행하여 순수한 콜로니를 얻었다.

선별된 콜로니들을 각각의 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 다음, 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정하여 색소 생산성이 가장 높은 1 개의 균주를 선별하였다.

선별된 1개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 58 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 4,925 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 285,650 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 2) 감마광선 조사에 의한 2차 돌연변이 유발

단계 1에서 선별된 균주는 YM 액체배지에서 5일 동안 진탕배양한 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 감마광선 조사에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

감마광선 조사에 의한 돌연변이는 단계 1에서와 동일한 방법으로 실시하였다.

생성된 콜로니중 색소 생성이 뛰어나고 윤기가 있으며 안정한 짙은 핑크색 콜로니를 모두 선별하였다. 상기 YD 고체배지에서의 선별과정을 3회 반복적으로 수행하여 순수한 콜로니를 얻었다.

선별된 1개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를을 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 60 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 5,487 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 329,220 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 3) NTG 처리에 의한 3차 돌연변이 유발

단계 2에서 선별된 균주는 YM 액체배지에서 5일 동안 진탕 배양한 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 구연산염 완충용액(pH 5.5)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 NTG에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

이 현탁액 4.8㎖에 1.2㎎/㎖ NTG 250㎕를 넣고 25 분 동안 반응시켜 파피아 로도지마 효모균이 95% 이상 사멸하도록 하였다. 반응이 끝난 후 5% 염화나트륨 용액을 넣어 반응을 중지시키고 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)으로 2회 이상 세척한 다음 침전된 효모에 YM 액체배지 5㎖를 넣어 12시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 YM 고체배지에 도말한 후 21 ℃에서 10일간 충분히 배양하였다. 이때, NTG를 처리하지 않고 배양한 액을 동일한 방법으로 YM 한천 배지에서 희석 도말하고 배양하여 NTG 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다.

생성된 콜로니 모균주보다 색소 생성이 뛰어나고 윤기가 있으며 안정한 짙은 핑크색 콜로니를 모두 선별하였다. 상기 YD 고체배지에서의 선별과정을 3회 반복적으로 수행하여 순수한 콜로니를 얻었다.

선별된 1개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 61 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 5,936 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 362,096 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 4) 사이몰 처리에 의한 4차 돌연변이 유발

단계 3에서 선별된 콜로니를 YM 액체 배지에 넣고 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양 후 이 배양액을 85% 이상의 사멸효과를 나타내는 0.4mM의 사이몰이 함유된 YM 고체배지인 선택배지에 희석 도말한 다음 21℃에서 10일 정도 콜로니가 성장할 때까지 배양하였다. 이때, 동일한 균주 배양액을 사이몰이 함유되지 않은 YM 고체배지에 희석 도말하고 동일한 방법으로 배양하여 사이몰 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다.

생성된 콜로니중 모균주보다 색소 생성이 뛰어나고 윤기가 있으며 안정한 짙은 핑크색 콜로니를 모두 선별하였다. 상기 YD 고체배지에서의 선별과정을 3회 반복적으로 수행하여 순수한 콜로니를 얻었다.

선별된 1개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 63 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 6,573 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 414,099 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

선별된 1개의 균주는 파피아 로도지마 KT-9로 명명하고, 1997년 10월 7일자로 한국 미생물 보존 협회에 기탁번호 제 KCCM 10112 호로 기탁하였다.

실시예 2: 파피아 로도지마 KT-12 균주의 선별

(단계 1) NTG 처리에 의한 5차 돌연변이 유발

실시예 1의 단계 4에서 선별된 파피아 로도지마 KT-9 균주를 YM 액체 배지에서 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양한 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 구연산염 완충용액(pH 5.5)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 NTG 처리에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

NTG에 의한 돌연변이는 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하였다.

선별된 1개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 66 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 6,921 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 456,786 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 2) 베타-아이오논 처리에 의한 6차 돌연변이 유발

단계 2에서 선별된 균주를 YM 액체 배지에 넣고 5일 동안 진탕 배양 후 이 배양액을 75% 이상의 사멸효과가 있는 3.0mM의 베타-아이오논이 함유된 YM 고체배지인 선별배지에 희석 도말한 다음, 콜로니가 성장할때까지 21 ℃에서 10일 정도 배양한다. 이때 동일한 균주 배양액을 베타-아이오논이 함유되지 않은 YM 고체배지에 희석 도말하고 동일하게 배양하여 베타-아이오논 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다.

선별된 1 개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 67 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 7,450 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 499,150 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 3) NTG 처리에 의한 7차 돌연변이 유발

단계 2에서 선별된 균주를 YM 액체 배지에서 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양한 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 구연산염 완충용액(pH 5.5)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 NTG 처리에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

선별된 1 개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 68 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 7,817 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 531,556 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 4) 트리에틸아민 처리에 의한 8차 돌연변이

단계 3에서 선별된 균주를 YM 액체배지에 넣고 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양한 후 이 배양액을 85% 이상의 사멸효과가 있는 15mM의 트리에틸아민이 함유된 YM 고체배지에 희석 도말한 다음, 21 ℃에서 10일 정도 콜로니가 성장할때까지 배양한다. 이때 동일한 균주 배양액을 트리에틸아민이 함유되지 않은 YM 고체배지에 희석 도말하고 동일하게 배양하여 트리에틸아민 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다.

선별된 콜로니들을 각각의 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 다음, 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정하여 1 개의 균주를 선별하였다.

선별된 1 개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 70 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 8,022 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 561,540 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 5) 4차 NTG 처리에 의한 9차 돌연변이

단계 4에서 선별된 균주를 YM 액체배지에서 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양한 후 배양액을 멸균된 원심분리 튜브를 이용하여 원심분리하고, 0.1M 구연산염 완충용액(pH 5.5)을 이용하여 균체를 세척한 후 동일 완충액으로 600㎚에서의 흡광도 값이 2.3이 되도록 현탁시켜 NTG 처리에 의한 돌연변이를 위해 사용하였다.

선별된 1 개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 72 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 8,210 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 591,120 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

(단계 6) 베타-카로틴 처리에 의한 10차 돌연변이

단계 5에서 선별된 균주를 YM 액체배지에 넣고 5일 동안 150 rpm의 교반 속도로 진탕 배양 후 이 배양액을 95% 이상의 사멸효과가 있는 0.05%의 베타-카로틴 함유된 YM 고체배지에 희석 도말한 다음 21℃에서 10일 정도 콜로니가 성장할 때까지 배양하였다. 이때 동일한 균주 배양액을 베타-카로틴이 함유되지 않은 YM 고체배지에 희석 도말하고 동일한 방법으로 배양하여 베타-카로틴 처리군과 비처리군의 균 사멸률을 비교하였다.

생성된 콜로니중 모균주보다 색소생성이 뛰어나고 윤기가 있으며 안정한 짙은 핑크색 콜로니를 모두 선별하였다. 상기 YD 고체배지에서의 선별과정을 3회 반복적으로 수행하여 순수한 콜로니를 얻었다.

선별된 1 개의 균주를 다시 참조예 1에서와 동일한 방법으로 유가식으로 배양하고 참조예 2 및 3에서와 동일한 방법으로 건조균체 중량 및 총 카로티노이드를 측정한 결과, 선별된 균주는 균체 수율(Yx/s) 73 g/ℓ와 아스타산틴 색소를 포함한 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x) 8,434 ㎍/g를 갖고 있어 전체적으로는 615,682 ㎍/ℓ의 색소 생산성을 가짐을 알 수 있었다.

선별된 1개의 콜로니는 파피아 로도지마 KT-12로 명명하고, 1997년 10월 7일자로 한국 미생물 보존 협회에 기탁번호 제 KCCM-10113 호로서 기탁하였다.

상기의 돌연변이 유발 과정에서 선별된 균주들의 색소 생산성을 종합하면, 하기 표 1과 같다.

균주명	균체 수율(g/ℓ)	총 카로티노이드 수율(㎍/g효모건조중량)	색소 생산성(㎍/ℓ)
ATCC 66272	4	975	3,900
HP-30(NRRL Y-21359)	60	4,200	252,000
1차 돌연변이된 균주	58	4,925	285,650
2차 돌연변이된 균주	60	5,487	329,220
3차 돌연변이된 균주	61	5,936	362,096
4차 돌연변이된 균주(KT-9)	63	6,573	414,099
5차 돌연변이된 균주	66	6,921	456,786
6차 돌연변이된 균주	67	7,450	499,150
7차 돌연변이된 균주	68	7,817	531,556
8차 돌연변이된 균주	70	8,022	561,540
9차 돌연변이된 균주	72	8,210	591,120
10차 돌연변이된 균주(KT-12)	73	8,434	615,682

본 발명의 파피아 로도지마 돌연변이주 KT-9 및 KT-12 균주는 높은 건조 균체 수율(Yx/s)과 총 카로티노이드 생산 수율(Yp/x)을 가짐으로써 전체적으로는 약 410,000 ㎍/ℓ 및 620,000 ㎍/ℓ의 높은 색소 생산성을 가진다. 이는 모균주인 파피아 로도지마 HP-30의 색소 생산성 252,000 ㎍/ℓ에 비해 약 1.6 배 및 2.5 배 정도 증가한 것이다.

Claims

아스타산틴(astaxanthin)의 생산성이 높은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 돌연변이주 KT-9(제 KCCM-10112 호).
파피아 로도지마 균주에 감마광선 조사, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 처리 및 사이몰 처리를 사멸률이 각각 60 내지 99.9%가 되도록 임의의 순서로 각각 1회 이상 실시하는 것을 포함하는 제 1 항의 돌연변이주의 제조방법.
아스타산틴의 생산성이 높은 파피아 로도지마 돌연변이주 KT-12(제 KCCM-10113 호).
파피아 로도지마 돌연변이주 KT-9에 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 처리, 베타-아이오논(β-ionone) 처리, 트리에틸아민(TEA) 처리, 베타-카로틴(β-carotene) 처리를 사멸률이 각각 60 내지 99.9%가 되도록 임의의 순서로 각각 1회 이상 실시하는 것을 포함하는 제 3 항의 돌연변이주의 제조방법.