DK175766B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en gær med forhöjet indhold af astaxanthin og anvendelse af gæren som fodertilskud - Google Patents

Description

i DK 175766 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en gær med et forhøjet indhold af astaxanthin. Opfindelsen angår også anvendelse af en således fremstillet gær på brudt form til øgning af pigmentering af 5 kødet hos salmonider eller på skindet, kødet eller æggeblommen fra fjerkræ.

Det rødlige carotenoidpigment astaxanthin findes almindeligt i naturen og fremvises synligt af en række 10 dyr. Dyr, der ikke er i stand til at syntetisere dette pigment, er afhængige af fødeindtag af pigmentet eller en precursor for pigmentet.

Den røde farve på skindet og kødet af laks og ørreder i naturen skyldes hovedsagelig astaxanthin, der 15 normalt findes som et ikke bundet pigment i disse fisk. I naturen forsyner zooplankton og nekton fra havet i føden laks med deres carotenoidpigmenter.

På grund af en mangel på astaxanthin i foderet er fisk, der er vokset op på fiskefarme eller i ud-20 klæknlngsanstalter, sædvanligvis blege og mangler farverne på skind og kød, der er karakteristiske for fisk, der er vokset op i deres naturlige omgivelser. Man har ikke bestemt, om carotenoiderne er ernæringsmæssigt værdifulde for mennesker eller dyr, men pigmenterne gør 25 visse fødevarer tiltrækkende. Da farven på en fødevare ofte er et tegn på dens kvalitet, er der en stærk forkærlighed hos forbrugerne for fisk med naturlige farver, selvom de blege opdrættede fisk ernæringsmæssigt kan være identiske med sådanne, der er vokset op i de-30 res naturlige omgivelser. Der er også tegn på, at astaxanthin eller dets precursor bidrager til den karakteristiske aroma hos ristet laks.

En voksende helbredsomsorg har ført til et forbud mod forskellige farvemidler, der kan være carcino-

I DK 175766 B1 I

I 2 I

I gene og/eller teratogene. Gule og røde azofarvestoffer, I

I der 1 voksende grad bliver forbudt til anvendelse 1 fø- I

I devarer, er ved at blive erstattet med ikke toksiske I

I carotenoider. Carotenoider er almindeligvis ikke tok- I

5 siske selv ved et højt indhold. Således er naturligt I

I 'forekommende carotenoider foretrukne pigmenter for I

farvning, f.eks. af salmonlder. I

Man har tidligere udført mange undersøgelser un- I

I der anvendelse af skaldyr eller bearbejdet skaldyrsaf- I

I 10 fald med indhold af carotenoider til foder for salmoni- I

I der. Den blege farve hos fisk, der er opdrættet på fi- I

I skefarme eller i udklækningsanstalter, bliver forbed- I

ret, når fiskene får et foder, der er supplementeret I

I med store mængder tørrede knuste exoskeletale skaldyrs- I

15 rester. Imidlertid har skaldyrsskaller et meget lavt I

I carotenoidindhold og et højt mineralindhold, der uden I

en grundig bearbejdning for at forbedre deres foder- ; I

i værdi vil begrænse deres indførelse i foder til salmo- :

nider. Man kan derudover kun udvikle en tilfredsstil- I

I 20 lende farve, når man fodrer på denne måde i meget lang I

I tid, og økonomisk set er det ønskværdigt, hvis ikke I

I endog væsentligt, at udvikle tilfredsstillende farver I

indenfor en meget kort tidsperiode. I

Man ved, at selve astaxanthin kan sættes til fi- I

I 25 skefoder for at forbedre farven af fisk. F.eks. beskri- I

. ver US patentskrift nr. 4.239.782 en fremgangsmåde til I

I forstærkning af farver hos fisk, hvorved man til fiske- I

I foderet sætter et pigmenterende middel såsom astaxan- I

I 30 thin og derudover begrænsede mængder af hormonet testo- I

I steron, idet dette hormon virker som en katalysator I

I kombineret med et udvalgt pigmenterende middel eller I

I midler til at forstærke farven hos fisk. I

I De to vigtigste kommercielle kilder til selve I

I astaxanthin er ekstrakter af skaldyrsskaller og kemisk I

B

3 DK 175766 B1 syntese. Det røde carotenoidpigment kan ekstraheres fra exoskeletale skaldyrsskaller og væv og Indgives blandet med andet foder 1 foderpræparater til fisk, skaldyr og visse former for fjerkræ under opdræt, i store koncen-5 trationer til udvikling af tilfredsstillende pigmentering på skindet, kødet, rygskjoldet eller 1 æggeblommen. Eksempler på fremgangsmåder til ekstraktion af asta-xanthin fra skaldyrsskaller og affaldsvæv beskrives f.eks. i OS patentskrifter nr. 3.906.112 (Anderson) og 10 4.505.936 (Meyers et al.).

I en artikel i Journal of Food Science, bind 47 (1982) med titlen "Extraction of Astaxanthin Pigment from Crawfish Waste Using a Soy Oil Process" beskrives forskellige ekstraktionsfremgangsmåder. F.eks. kan man 15 knuse hele affaldskrebsdyr, blande de findelte affaldskrebsdyr med vand, tilpasse pH med et alkali eller med en syre, sætte et enzym til opløsningen og omrøre, opvarme og hydrolysere opløsningen. Efter hydrolysen ekstraherer man astaxanthin med en olie og udvinder den 20 astaxanthinberigede olie ved centrifugering. Imidlertid er prisen for naturlige isolater af astaxanthin, især fra krill- og krebsskaller, et sted mellem 5000-15000 dollars pr. kg. Det er tydeligt, at man savner en mere økonomisk fremgangsmåde, der er mindre afhængig af kil-25 derne til produktion af astaxanthin.

Man har også opnået pigmentering af kødet hos laks og ørreder under anvendelse af det syntetiske carotenoid canthaxanthin som foderadditiv, men dette stof er temmelig dyrt, og man har meddelt, at det giver 30 en noget utilfredsstillende farve hos salmonider. Eksempler på nyere arbejde, hvad angår den kemiske syntese af astaxanthin, ses i US patentskrifterne nr. 4.245.109 (Mayer et al.), 4.283.559 (Broger et al.) og 4.585.885

I DK 175766 B1 I

I 4 I

I (Bernhard et al.)· Den nuværende pris på syntetisk I

astaxanthlnpigment er omtrent 2000 dollars/kg. Imidler- I

I tid forbyder mange lande anvendelse af syntetiske caro- I

I tenoider.

I 5 Astaxanthin er stadig et af de dyreste ingre- I

I dienser, der benyttes 1 laksefoder til burlaks. Da I

I interessen i akvakultur, dvs. fiskeopdræt, 1 de seneste I

I år nærmest er eksploderet, er den kommercielle efter- I

I spørgsel efter en økonomisk kilde for astaxanthin vok- I

I 10 set tilsvarende. I

I Pigmenteringen af fugleæggeblommer er også ble-

I vet undersøgt på grund af den økonomiske vigtighed af I

I farve i hønsesggeblommer. Forbrugerne forlanger ægge- I

I blommer med et højt indhold af pigment. Den almindelig- I

I 15 ste kilde for pigment i kommercielt foder har været gul I

I majs, der tilvejebringer de vigtigste æggeblommepigmen- I

ter cryptoxanthin, zeaxanthin og lutein. Desværre er I

I korn med højere energiindhold såsom milo, hvede, ris og 1 I

I byg ved at erstatte majs som kyllingefoder med et til- I

I 20 svarende tab i pigmentering. Astaxanthin kan benyttes I

I som fjerkræfodertilskud for at forøge æggeblommepigmen- I

I teringen. I

Man har ikke tidligere kommercielt anvendt bio- I

I syntese til produktion af astaxanthin, dvs. anvendt I

I 25 mikroorganismer til at syntetisere astaxanthin. I

I Man kender som mikrobiel kilde til astaxanthin I

gæren Phaffla rhodozyma (Johnson, "Astaxanthin Pro- I

I duction by the Yeast Phaffla rhodozyma and its use as a I

I Pigment Source in Animal Feeding", magistergrad, Uni- I

I versity of California, Davis, 1976). Gær betragtes al-

I ment som et meget nærende foder og er ofte gavnlig i I

I dyrefoder; den yderligere fordel med astaxanthinind- , I

I hold tyder på, at ^ rhodozyma kan være et ideelt fo- ! I

DK 175766 B1 5 dertilskud til dyr, der kræver et tilskud i foderet af dette pigment, f.eks. salmonider, skaldyr, æglæggende høner eller fugle såsom flamingoer.

Imidlertid er pigmentudbyttet af naturligt fore-5 kommende P^ rhodozyma kun af størrelsesordenen 200-600 ppm/tørstofvægt af gær efter 6 dages vækst. Som en kilde for selve astaxanthin er naturligt forekommende p. rhodozyma utilstrækkelig. Forsøg med tilskud til foderet for visse fisk, skaldyr og fjerkræ med naturligt fo-10 rekommende P^ rhodozyma virkede dog lovende. Imidlertid er det store rumfang af P^ rhodozyma, der må tilsættes som fodertilskud for at opnå tilfredsstillende niveauer af pigmentering, en mangel ved den kommercielle egnethed af naturligt forekommende P^ rhodozyma som en pig-15 mentkilde.

I J. Appl. Bacterol. 59 (1985), 243-255, anføres det ganske vist i resumeet, at Phaffia rhodozyma kan producere 800-900 pg astaxanthin pr. g gær. udtalelsen refererer imidlertid J. Gen. Microbiol. 115 (1979), 20 173-183, hvoraf det fremgår at sådanne høje astaxan-thinindhold i naturligt forekommende stammer af Phaffia kun kan opnås ved anvendelse af vækstmedier tilføjet specielle næringskilder, og at dyrkning af sådanne stammer på standard YM medium ikke giver større produk-25 tion af astaxanthin end det i forrige afsnit anførte. Modificerede stammer af Phaffia, der ved dyrkning på standardmedium kan give forhøjet astaxanthinproduktion, nævnes derimod ikke.

I overensstemmelse hermed er det et mål for op-30 findelsen at tilvejebringe en proces til opnåelse af kulturer af gæren Phaffia rhodozyma med et forøget astaxanthinindhold. Derudover er det et mål for opfindelsen at tilvejebringe således fremstillet P^ rhodozyma.

Η

I DK 175766 B1 I

i I

Det er et yderligere mål for opfindelsen at ud- I

vikle en proces til forbedring af astaxanthinindholdet I

af efterkommere afledt af naturligt forekommende I

I rhodozyma, såsom stammerne ATCC 24230 eller ATCC 24202 I

I 5 deponeret hos ATCC. I

I Endelig er det et mål for opfindelsen at udvik- I

I le en proces til forbedring af astaxanthinindholdet af I

I muterede stammer af gæren P^ rhodozyma. I

I Disse og andre mål opfyldes ved en fremgangsmå- I

I 10 de ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at man I

I dyrker en mikroorganisme af slægten Phaffla i et næ- I

ringsmedium indeholdende et antibiotikum, en cytochrom I

B inhibitor eller en inhibitor for terpenoidsyntese- I

I vejen. I

I 15 Nøgletrinnet i udvælgelsen af stammer er trinnet I

med morfologisk udvælgelse. Der er ingen begrænsning på I

de mulige kombinationer af rækkefølge og type af muta- I

tion og antibiotikum, cytochrom B inhibitor eller ter- I

penoidinhibitor, som man kan underkaste P^ rhodozyma I

20 indenfor opfindelsen. Nyere resultater bekræfter re- I

producerbarheden af denne teknik. I

I Beslægtede mål og fordele ved opfindelsen vil I

ses mere tydeligt under reference til den følgende teg-

ning og den detaljerede beskrivelse. I

25 Fremgangsmåden og apparatet ifølge opfindelsen I

I vil nu blive beskrevet under reference til den ledsa- I

H gende tegning, hvori: I

fig. 1 viser den kemiske struktur og slægtsska- I

I bet mellem forskellige pigmenter og mellemprodukter, I

30 der findes i P^ rhodozyma; I

fig. 2 er et procesdiagram, der viser foretrukne I

I sekvenser for isolering af mutanter af P^ rhodozyma; I

I I

a 7 DK 175766 B1 fig. 3 er en mikrofotografi, der viser udseendet af forskellige kolonier.

Under en ekspedition i 1967 med det formål at studere gærflora på træer i de vigtigste japanske 5 øer og i det nordvestlige Stillehav isolerede man en særlig astaxanthinsyntetiserende organisme fra slimafsondringer fra forskellige bredbladede træer (Phaff et al., "A comparative study of the yeast florae associated with trees on the Japanese Islands and on the 10 west coast of North America", Proc. IV: Ferment, Tech-nol. Today, (1972) side 759-774. Denne organisme, der nu kendes som Phaffia rhodozvma, fandtes at have evnen til at producere carotenoide pigmenter og fermentere adskillige sukkerarter.

15 Phaffia er blevet tildelt en slægt på grund af dens unikke karakteristika, der inkluderer dens evne til at fermentere glucose og andre sukkerarter (sammenlignet med de andre carotenoiddannende gærarter, der alle er strengt aerobiske), dens syntese af astaxan-20 thin som vigtigste carotenoid, dens knopskydningsfacon, dens besiddelse af visse metaboliske egenskaber såsom evnen til at benytte urinstof, som ikke er så almindelig hos sporedannende gærarter og dens cellevægs-sammensætning. P^ rhodozyma, den eneste art i denne 25 slægt, reproducerer udelukkende ved knopskydning, og en undersøgelse af denne type vegetativ reproduktion ved scanning elektronmikroskopi viser, at gæren gentagne gange skyder knopper fra samme sted, hvilket fører til dannelse af mangelagscellevæggen.

Andre karakteristika for Phaffia inkluderer dens 30 dannelse af chlamydosporer, dens mol% G+C indhold på I

48,3%, dens evne til at spalte urinstof ved hjælp af urease og dens tilsyneladende mangel på en perfekt til-

DK 175766 B1 I

stand. Dens egenskaber tyder på, at gæren af basidio- I

mycetisk affinitet. Alle forsøg på at finde en seksuel I

cyklus hos Phaffla er indtil nu mislykkedes. I

Andrewes et al. fandt som meddelt i "Carotenoids I

5 of Phaffla rhodozyma, a red pigmented fermenting I

yeast", Phytochem. 15, (1976) side 1003-1007, at caro- I

tenoiderne fra P^ rhodozyma var usædvanlige. Pigmenter I

og pigmentmellemprodukter fundet af Andrewes i natur- I

ligt forekommende P^ rhodozyma ses i fig. 1, hvor (A)

10 er echinenon, (B) er 3-hydroxyechinenon, (C) er phenl- I

coxanthin og (D) er astaxanthin. Man fandt, at asta- I

xanthin var det vigtigste pigment, der blev syntetise- I

ret af denne gær; i naturligt forekommende gær omfatte- I

de det ca. 85% af carotenoidblandingen. I

15 Selvom carotenoiderne fra de fleste plantekilder I

og dyrekilder let kan ekstraheres med vandblandbare op- I

løsningsmidler, er gærarterne velkendte for, at de hol- I

der kraftigt på deres pigmenter. Astaxanthin er fast I

fæstet i gærcellerne og kan ikke ekstraheres med lipide I

20 opløsningsmidler, uden at man først ændrer strukturen I

af gærcellen. I

Den mest kvantitative ekstraktionsmetode invol- I

verer, at man mekanisk bryder gærcellerne såsom i en

fransk presse (Simpson et al., "Modified French press I

25 for the disruption of microorganisms", J. Bact., 86, I

(1963) side 1126-1127) eller i en Braun homogenisator I

(Bae et al., "The occurrence of plectaniaxanthin in I

Cryptotococcus laurentii", Phytochem., 10, (1070) side I

625-629) og derefter ekstraherer cellerne med opløs- I

30 ningsmidler. Disse metoder benyttes rutinemæssigt til I

vurdering af astaxanthinkoncentration. I

Behovet for udvinding i stor skala af astaxan- I

thin førte til udvikling af en enzymatisk metode til I

9 DK 175766 B1 ekstraktion, ved metoden benytter man ekstracellulære lytiske enzymer produceret af bakterien Bacllllus cir-culans WL-12, der delvis fordøjede gærcellevæggen og gjorde carotenoidpigmenterne ekstraherbare med lipide 5 opløsningsmidler. Man kunne opnå en fuldstændig ekstraktion af astaxanthin fra varmedræbte P^ rhodozyma celler efter at have dyrke EL clrculans WL-12 på disse gærceller i 26 timer og derefter ekstrahere blandingen af gær og bakterier med acetone.

10 Et bakteriefrit lytisk system, der gav en kvan titativ ekstraktion af astaxanthin fra rhodozyma, kunne opnås ved indkoncentrering af kultururten fra vadesten af clrculans WL-12 på IL rhodozyma celler.

Man dyrker foretrukket B^ clrculans WL-12 på et medium, 15 der indeholder P^ rhodozyma celler. Man fandt, at det lytiske system virkede mest effektivt ved pH 6,5 og ved lave gærkoncentrationer.

Almindeligvis har ernæring og omgivelser en indflydelse på udbyttet af carotenoider fra forskellige 20 carotenoidproducerende mikroorganismer. En oversigt over forstærkning af carotenoiddannelse ved fermentationer i komplekse medier findes hos Hanson, "Microbial production of pigments and vitamins", i Microbial Technology, udgivet af H.J. Peppier, Reinhold, New 25 York(1967) side 222-250.

Carotenoider er tetraterpener, og deres grundlæggende syntesevej minder om, hvad man finder hos andre terpenoider. Acetyl CoA er den første preursor, og den første specifikke terpenoidforbindelse er mevalon-30 5yre (Schopfer et al., "Sur la biosynthese du β-carote-ne par Phycomyes cultivé sur un mileu contenant de 1'acetate de sodium comme unique source de carbone", Experientia 8, (1952) side 140). Den fundamentale pre-

I DK 175766 B1 I

10 I

cursor fra hvilken carotenoider afledes, er isopente- I

I nylpyrophosphat (se Goodwin, "Biosynthesis", Caroten- I

I oids, udgivet af O. Isler, Basel, Birkhauser, (1971) I

I side 577-636; Britton, "Biosynthesis of Carotenoids", i I

I 5 chemistry and biochemistry af plant pigments, Vol. 1, I

I (1976) side 262-327). I

I De fleste tidligere arbejder med rhodozyma er I

I blevet foretaget med stammen af type nr. 67-210. Visuel I

I undersøgelse af unge kolonier fra adskillige yderligere I

10 naturligt forekommende isolater (UCD-PST nr. 67-202, I

I 1 67-203, 67-210, 67-383, 67-385 og 68-653C) tydede på, I

at 67-210 og 67-385 (American Type Culture Collection I

I henholdsvis nr. ATCC 24202 og ATCC 24230) var de mest I

I pigmenterede stammer. Kvantitativ bestemmelse af asta- I

I 13 xanthinindholdet i disse to stammer efter 5 dages I

I vækst i YM urt tydede på, at 67-385 indeholdt ca. 450 I

yg/g tør gær sammenlignet med ca. 295 yg/g i 67-210. I

I .Vi har hovedsagelig benyttet 67-385 til stammeforbed- I

I ringer på grund af dennes højere naturlige astaxanthin- I

I 20 indhold. I

Som et resultat af en række eksperimenter til I

I bestemmelse af de bedste dyrkningsbetingelser for vækst I

I og pigmentering af rhodozyma fandt man, at biosyn- I

I tesen af astaxanthin foregik maksimalt under den eks- I

I 25 ponentielle vækstfase. Man fandt, at pigmentudbyttet i I

I vækstmediet ikke udelukkende var afhængigt af cellekon- I

I centrationen, men var påvirket af dyrkningsbetingelser- I

' ne. Man fandt, at det optimale pH for astaxanthinpro- I

H duktlon var 5,0 i rystekolber, ved andre afprøvede pH I

30 værdier forblev koncentrationen af astaxanthin i ^ I

rhodozyma imidlertid temmelig konstant. I

Man fandt af dyrkningstemperaturen påvirkede I

væksthastigheden for P^ rhodozyma, men ikke akkumule- I

11 DK 175766 B1 ringen af astaxanthin i gærcellerne. Lys påvirkede heller ikke carotenogenesen i rhodozyma, selvom celler dyrket under kraftig lysintensitet syntes at være mere rødlige, hvilket eventuelt kan skyldes forskellige kon-5 centrationer af specielle carotenoider.

Man fandt, at en lav glucosekoncentration og en kraftig tilførsel af luft effektivt fremmede astaxan-thinproduktion af rhodozyma. Koncentrationen af astaxanthin i den røde gær faldt betydeligt, hvis luft-10 tilførslen var under 20 mmol/time, eller hvis glucose-koncentrationen var over ca. 4% w/v. Imidlertid var astaxanthin stadig det dominerende pigment, hvis man dyrkede gæren under en af disse betingelser. Hvis man imidlertid kombinerede virkningen af høj glucosekoncen-15 tration og lav lufttilførsel, faldt koncentrationen af astaxanthin i P^ rhodozyma til overordentlig lave niveauer, og der forekom en dannelse af β-zeacaroten.

Under disse ugunstige betingelser dannedes astaxanthin ikke effektivt ud fra carotenerne.

20 Når denne gær blev dyrket på carbonforbindelser, der undertrykker ethanolproduktion (f.eks. cellobiose) var udbyttet af astaxanthin temmeligt højt. Hvis den blev dyrket på carbonkilder, der antageligt fremmede ethanolproduktionen (f.eks. et stort indhold af gluco-25 se) var udbytterne af astaxanthin temmeligt lave. Carbonforbindelser, der metaboliseres via pentosephosphat-vejen (f.eks. xylose), fremmede ikke en effektiv caro-tenogenese.

Trods mange eksperimenter vedrørende optime-30 ring af dyrkningsmedium og ydre betingelser for naturligt forekommende stammer af P^_ rhodozyma kunne man ikke herved opnå en voldsom vækst i pigmentindholdet.

Heraf sluttede man, at manipulering af disse faktorer I DK 175766 B1

I 12 I

I alene eventuelt ikke er tilstrækkeligt til at inducere I

I en vækst i astaxanthinindhold af P^ rhodozyma i en I

I grad, så biosyntesen bliver kommercielt tiltrækkende. I

I Til opnåelse af isolering af en ny genetisk I

I 5 mutant af rhodozyma, der var i stand til forøget I

I astaxanthinproduktion, underkastede man P. rhodozyma I

I mutagenese. Imidlertid var resultaterne herfra for- I

I virrende, sandsynligvis på grund af den tilfældige og I

I ikke formålsrettede art af mutationerne. F.eks. var I

I 10 forsøg på at isolere meget pigmenterede varianter ikke I

heldige selv efter gennemsøgning af mange tusinde ko- I

H lonier efter bestråling med ultraviolet lys. De fleste I

I af de uv-dannede mutanter havde et betydelig reduceret I

astaxanthinindhold og var meget blege. I

15 Mulighederne for yderligere fremskridt, hvad I

angår forbedring af astaxanthinindholdet i P. rhodozyma I

ved konventionelle mutagenesefremgangsmåder, synes at I

være begreensede. Dette skyldes, at mikroorganismer be- I

sidder en stram genetisk regulerende kontrol over bio- I

20 syntesen af deres cellekomponenter, hvorfor de har en I

tendens til ikke at overproducere unødvendigt indhold I

i cellerne. Da biosyntesen af pigment såsom astaxan- I

thin tilsyneladende er stramt reguleret i en hvilken I

H som helst kendt stamme af gærceller, er chancen for at I

25 producere en levedygtig arvelig genetisk ændring til I

frembringelse af kolonier, der er 1 stand til forøget I

astaxanthinproduktion ved ikke målrettet mutagenese, I

sandsynligvis meget lav. I

Da gennemsøgning af kolonier efter mutagenese I

30 ikke medførte nogen større succes, prøvede man at ud- I

vikle udvælgelsesprocedurer for overproduktion af asta- I

xanthin. Da dannelse af astaxanthin undertrykkes af I

høje koncentrationer af glucose, prøvede man 2-desoxy- I

DK 175766 B1

Iglycose som selektivt middel til isolering af glucose- resistente stammer, der kunne være katabolit-antiunder-trykte og derefter opvise en forstærket biosyntese af pigment. Skønt visse stammer, der blev frembragt ved 5 denne udvælgelsesfremgangsmåde, opviste en ændret pigmentering, var mange af disse overordentligt ustabile, og ingen havde en større forøgelse i astaxanthinkoncen-tration end til det dobbelte af, hvad man fandt hos den naturligt forekommende udgangsstamme.

10 Man forsøgte at inkorporere en inhibitorer for sterolbiosyntese, deriblandt ketoconazol og miconazol, i maltekstraktmedium gæragar, hvilket førte til en tydelig aflivning af P. rhodozyma. Imidlertid fandt man ved gennemsøgning af adskillige tusinde overlevende 15 ikke stærkt pigmenterede gærstammer. Adskillige andre afprøvede forbindelser inkluderende nicotin (1 mM), ! imidazol (4 mM), 2-methylimidazol (1 mM) og morpholin (10 mM) ændrede synligt farven af kolonierne, men hæmmede ikke væksten, hvilket var et tegn på ændring i 20 sammensætning af carotenoiderne. Da disse varianter

imidlertid ikke havde forøget astaxanthinindhold, gen- I

nemførte man ikke nogen yderligere analyse over ændringen i pigmentsammensætningerne.

Man forsøgte også at behandle P. rhodozyma med 25 adskillige inhibitorer for elektrontransport, deriblandt thenoyltrifluoracetone (TTFA), antimycin A og natriumcyanid. Naturligt forekommende P. rhodozyma blev i det væsentlige dræbt af lave koncentrationer af antimycin A og TTFA, men man fandt, at den var temmelig 30 ufølsom overfor cyanid og azid.

Som et resultat af grundige forsøg, hvoraf en i del er diskuteret ovenfor, har man overraskende opdaget en fremgangsmåde, hvorved man kan producere kolo- I DK 175766 B1

I 14 I

nier af P. rhodozyma, idet disse kolonier er ejendomme- H lige ved højt astaxanthinindhold. P. rhodozyma produ- ceret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ikke reverterende, astaxanthin findes i gæren i en tilstræk- 5 kelig høj koncentration, så denne kan være et mere effektivt foder og pigmenttilskud end naturligt fore- kommende P. rhodozyma, og man kan opnå kolonier af gæ- ren, der er i stand til at producere astaxanthin i til- strækkelige mængder til at gøre astaxanthinfermentering 10 en kommerciel tiltagende proces til fremstilling af astaxanthin.

Mere detaljeret opdagede man, at hvis man under-

kaster en naturligt forekommende eller muteret stamme I

af P. rhodozyma vækst under tilstedeværelse af et anti- 15 biotikum, en cytochrom B inhibitor eller en inhibitor for terpenoidsyntesevejen som udvælgelsesmiddel, finder en direkte og specifik udvælgelse af stærkt pigmenteret I Z· rhodozyma sted. P.eks. førte udplatning af den pink- farvede gær P. rhodozyma på agar med indhold af et an- I 20 tibiotikum, en cytochrom B inhibitor eller en inhibitor I for terpenoidsyntesevejen til kolonier med usædvanlig morfologi, der var ejendommelige ved en ikke pigmente- I ret lavere glat overflade, der efter 1-2 måneder ud- viklede stærkt pigmenterede vertikale papiller. Isole- 25 ring og rensning af papillerne fulgt af afprøvning I for pigmentering i rystekolber demonstrerede, at ad- I skillige mutanter havde et 3-6 gange forøget astaxan- I thinindhold i forhold til det oprindelige naturligt fo- rekommende isolat.

I 30 Et af det udvalgte afkom (XGX-887J0; se fig. 2 I og ledsagende tekst) blev karakteriseret fysiologisk.

I Mutanten voksede langsommere på diverse nitrogenkilder I og havde lavere celleudbytter på adskillige carbonkil- 15 DK 175766 B1 der. Den viste forøget følsomhed overfor respirationsinhibitorer såsom antimycin A og TTFA, men afveg ikke fra det naturlige isolat, hvad angår følsomhed overfor cyanid og azid. Den var mere følsom overfor aflivning 5 med hydrogenperoxid. Analyse af carotenoiderne ved tyndtlagschromatografi viste to ukendte carotenoider, der ikke fandtes i udgangsgæren, såvel som en forøget akkumulering af carotener og cis-astaxanthin.

Antibiotiske udvælgelsesmidler inkluderer f.eks.

10 en eller flere af antimycin, tunicamycin og nystatin. Antimycin kan endvidere klassificeres som en inhibitor for elektrontransport eller for cytochrom B. Andre cytochrom B inhibitorer, der forstærker pigmenteringen af udvalgt afkom, inkluderer f.eks. 2-n-heptyl-4-hy-15 droxyquinolin-N-oxid (H0QN0). Inhibitorer for terpe-noidsyntesevejen inkluderer f.eks. mevalonsyrelacton, der alment kan betegnes som en metabolismeinhibitor og som er et eksempel på en sterolinhibitor.

Koncentrationerne af udvælgelsesmidler, f.eks.

20 antimycin, ligger foretrukket i området 1-100 pm på maltekstrakt gærmedium (YM) plader, mere foretrukket 30-80 pM, og mest foretrukket til dannelse af de klareste kolonier, ca. 50 pM.

Virkningen af antibiotikum, cytochrom B inhibi-25 tor eller inhibitor for terpenoidsyntesevej en på p. rhodozyma er overraskende, og den detaljerede underliggende mekanisme derfor mangler endnu opklaring. Det er overraskende, at P. rhodozyma, når den underkastes en udvælgelse med antibiotikum, cytochrom B inhibitor el-30 ler inhibitor for terpenoidsyntesevejen, producerer ko-.1onier med høj ere pigmentindhold, når eksperimenter udført med andre midler såsom respirationsinhibitorer, deriblandt KCN, rotenon, TTFA og andet ikke i det væ-

I DK 175766 B1 I

I 16 I

sentlige synes at påvirke pigmenteringen af P. rhodozy- I

ma på YM plader eller i væskeformige vækstmedier, I

Man har udviklet en hypotese, der kan give en I

mulig forklaring på virkningen af antimycin på P. rho- I

5 dozyma, men denne hypotese er spekulativ og bør ikke I

påvirke opfindelsens omfang. I

Man har mistanke om, at siden ringslutning og - I

hydroxylering kan afhænge af cytochrom P450, der fore- I

kommer i sterolsyntese, og siden en cytochrom B inhibi- I

H 10 tor såsom antimycin reagerer med cytochrom B, der er I

I det samme cytochrom, der reducerer cyt. P450, kan den I

I forøgede pigmentering af antimycinmutanterne måske I

I skyldes en ændret cyt. P450 funktion eller aktivitet. I

I Man ved endvidere, at dette molekyle inaktiverer glut- I

15 aminsyntetase, og dette kan være grunden til den obser- I

I verede langsommere nitrogenkatabolisme. En yderligere I

I diskussion af denne hypotese kan findes i An et al., I

"Isolation of Mutants of Phaffla rhodozyma with in- I

creased quantities of Astaxanthin", utrykt manuskript, I

20 til en væsentligt grad forfattet af en af opfinderne; I

I Applied and Environmental Microbiology, 55 (1989), 116- I

I 124. I

I : Nyere forsøg bekræfter, at denne teknik kan be- I

I nyttes flere gange med P. rhodozyma. I

25 De naturligt forekommende gærceller, der er ud- I

I valgt med et antibiotikum, en cytochrom B inhibitor el- I

I ler en inhibitor for terpenoidsyntesevejen, kan yderli- I

gere udsættes for mutagen før, efter, eller både før og I

efter udvælgelse eller et hvilket som helst ønsket an- I

30 tal eller kombinationer af mutationer og udvælgelser, I

I sålænge der herved, er Inkluderet et antibiotikum, en I

I cytochrom B inhibitor eller en inhibitor for terpenoid- I

I syntesevejen ved udvælgelsen. I

17 DK 175766 B1

Mutagener eller mutageniske midler kan vælges blandt en række kemiske forbindelser eller blandt andre påvirkninger, og de er foretrukket kraftige nok til at ! føre til produktion af ikke revertable mutationer, i 5 Mutanter, hvori man ikke har observeret degeneration, er meget ønskede til industrielt brug. Kraftige mutagener inkluderer ethylmethansulfonat, nitrosoguanidin (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin), salpetersyrling (skønt man herved skal benytte temmelig store mængder), 10 ultraviolet bestråling i betydeligt omfang, røntgenbestråling og andet.

I øjeblikket foretrækkes nitrosoguanidin og UV-bestråling på grund af den nemme tilgængelighed, den temmelige kraftige mutagene natur, og idet håndteringen 15 af disse er temmelig let og sikker. Imidlertid kan man benytte et hvilket som helst kraftigt mutagen, idet man benytter mængder og fremgangsmåder til påvirkning ifølge kendt teknik.

I visse tilfælde kan man kombinere et svagt mu-20 tagen med et kraftigt mutagen. Blandt de svage mutagener kan nævnes 2-aminopurin, t-bromuracil, hydroxyl-amin, natriumbisulfit og andre.

Den rækkefølge af mutationer og udvælgelser, hvorved man har opnået stammer med højeste udbytte af 25 astaxanthin Indtil nu, ses i fig. 2. Idet vi refererer til fig. 2, fandt man ved analyse, at den naturligt fo-i rekommende udgangsgær 67-385 opnået fra American Type

Culture Collection som ATTC nr. 24230 indeholdt 200-600 ]xg/g gærtørstof efter 6 dages vækst. Man underkastede 30 67-385 antimycinudvægelse og opnåede et højere pigmenteret afkom betegnet IGI-887J0. Den første mutante papillus, der blev skåret fra den basale koloni, indeholdt ca, 700 vig totalt carotenoid/g gær, hvorimod ud-

DK 175766 B1 I

I I

gangsstammen indeholdt 300-400 yg/g. Man analyserede, I

at IGI-887JO havde et astaxanthinindhold på 960 yg/g I

gærtørstof efter 6 dages vækst. Man genudplattede IGI- I

867J0 på YM agar med indhold af 50 yM antimycin og ud- I

5 valgte anden generations antimycinkolonier. En af disse I

producerede 1200 yg/g og en anden producerede 1450 I

yg/g· Det ses således, at antimycin Ά er et udmærket I

udvælgelsesmiddel til isolering af pigmenterede varian- I

ter af P. rhodozyma. I

10 IGI-887J0 blev underkastet nitrosoguanidin (NTG) I

mutation til opnåelse af IG1-887J2, der producerede I

1200-1500 yg totale carotenoider/g gær. IGI-887J2 blev I

yderligere udvalgt med antimycin til opnåelse af IGI- I

887Jl, der ved analyse viste sig at have et astaxan- I

15 thinindhold på 700-1100 yg/g gærtørstof efter 6 dages I

vækst. En anden NTG mutagenese producerede IGI-887J3 I

som afkom. I

Ved rensning af kolonierne fra IGI-887J3 delte I

I isolatet sig i hvide og pigmenterede kolonier. Den hvi- I

I 20 de revertant blev betegnet IGI-887J4. Disse blege kolo- I

I nier voksede meget dårligt på ammoniumsulfat ved 5 g/1, I

I voksede lidt bedre på høje indhold af ammoniumsulfat I

I (20 g/1) og voksede på plader godt på glutamat eller I

I glutamin. Disse resultater tyder på, at stammerne ef- I

I 25 terhånden får hæmmet nitrogenmetabolismen, hvilket be- I

I grænser væksthastigheden. I

I IGI-1287Jl blev Isoleret efter mutation med ni- I

I trosoguanidin af IGI-887J4, den hvide udskillelse af I

I IGI-1887J3. Ved analyse viste IGI-1287J1 sig at inde- I

30 holde 900-1400 yg/g gærtørstof efter 6 dages vækst. I

Denne stamme havde også en hæmmet nitrogenmetabolisme. I

Man bemærkede, at stammerne IGI-287J3 og IGI-1287J1 ik- I

I ke vokser på ethanol, hvorimod tidligere mutanter gør. I

DK 175766 B1 19 IGI-2280B60 kunne opnås fra IGI-887J2 ved muta-.genese med NTG og viste sig ved analyse at Indeholde 1700 pg/g gærtørstof efter 6 dages vækst.

5 Karakterisering af antlmyclnnrutanterne.

Udgangsstammen (67-385), IGI-887J0 og IGI-887J2 havde omtrent samme celleudbytter med ammonlumglutamat eller glutamin som nitrogenkilder. Imidlertid viste 10 analyse af væksthastigheder, at serien af stammer voksede langsommere og langsommere på disse nitrogenforbindelser. Disse data tydede på, at hastigheden eller effektiviteten af nitrogenudnyttelse var hæmmet i anti-mycinmutanterne.

15 Udgangsstammen og de to undersøgte mutanter hav de reducerede celleudbytter på fire afprøvede carbonkilder, men var kraftigere pigmenteret. Antimycinmutan-terne fermenterede stadigvæk glucose og havde også en tydelig ethanoldehydrogenaseaktivitet. Imidlertid vok-20 sede IGI-887J2 ikke længere på ethanol og havde reducerede celleudbytter på andre respiratoriske substrater, deriblandt succinat. De reducerede udbytter på energikilderne og den specifikke inhibition forårsaget af antimycin, hvad angår elektrontransportkæden, tydede 25 på, at den respiratoriske funktion eller den mitokon-triske funktion var ændret i de pigmenterede mutanter.

Man undersøgte følsomheden af mutanterne for forskellige respirationsinhibitorer inkluderende antimycin A, theonyltrifluoracetin, natriumazid, hydrogen-peroxid og natriumcyanid. Disse inhibitorer påvirker forskellige områder af respirationskæden. Overraskende var de antimycininducerede mutanter mere følsomme overfor antimycin A på YM plader og også i væskemedier.

I DK 175766 B1 I

I

Udgangsstammen havde ca. 50% overlevelse ved 100 μΜ I

H antimycin sammenlignet med mutanterne, der Ikke over- I

H levede over ca. 60 μΜ. Den koncentration af antimycin, I

der aflivede 50% af populationerne af IG1-B87J0 og IGI- I

5 887J2 på YM agar, var henholdsvis ca. 18 og 3 μΜ. Mu- I

H tanterne var mere følsomme 1 væskemedier og blev afll- I

vet ved antimycinkoncentrationer nær ved 0,5 μΜ. I

Disse resultater viser tydeligt, at de pigmen- I

terede papiller, der voksede ud fra de blege kolonier i I

10 virkeligheden var mere følsomme overfor medikamentet, I

selv om de var isoleret på plader med indhold af anti- I

mycin. Tilsyneladende gjorde den rumlige adskillelse I

H af papillerne fra agaren dannelsen af de mere følsomme I

I stammer lettere. I

I i 15 Mutanterne var også ganske følsomme over for an- I

I I dre respirationsinhibitorer, deriblandt TTFA og hydro- I

genperoxid, men var kun en smule mere følsomme over for I

cyanid og havde ingen forskel i følsomhed over for I

azid. Disse data understøttede den ovennævnte hypotese, I

I 20 at de antimycinisolerede stammer havde en ændret respi- I

I ratorisk kæde og gav støtte for en formodning om, at en I

beskadigelse kan findes i tidlige områder af kæden nær- I

I ved cytochrom B. I

I Hvad angår carotenoidsammensætningen af mutan- I

I 25 terne, se An et al., "Isolation of Phaffla rhodozyma I

I Mutants with increased Astaxanthin Content", Applied I

I and Environmental Microbiology, 55 (1989), 116-124, i I

en væsentlig grad forfattet af en af opfinderne. I

Det er nødvendigt at tilføre passende mængder I

30 næringsmidler og mineraler til dyrkningsmediet for at I

opnå en ordentlig vækst af mikroorganismen, for at mak- I

simere assimilering af carbonenergikæden af cellerne I

under den mikrobielle omdannelsesproces og for at opnå I

21 DK 175766 B1 højst muligt celleudbytte med en maksimal celledensitet 1 fermenteringsmediet.

Sammensætningen af fermenteringen kan variere bredt, dels afhængig af gærstammen, dels af det anvend-5 te substrat samt af mineralindholdet i fermenteringen (dvs. væske plus celler). Nedenfor i tabellen ses minimum, et bredt område og det for tiden foretrukne område for koncentrationer af forskellige grundstoffer i fermenteringen, idet koncentrationen udtrykkes som af 10 grundstoffet, selvom naturligvis en del af eller alt af hvert grundstof kan være til stede som en opløselig ion eller i tilfælde som P i en kombineret form af en eller anden type såsom et phosphat. Mængden af hvert grundstof er udtrykt i g eller mg pr. 1 fermentering (vandig 15 fase, inkluderende cellerne): Vægt af grundstoffer pr. 1 fermentering Element Minimum Bredt område Foretrukket område 2o p . 0,2 q 0,2-5 g 0,4-2 g K 0,1 g 0,1-3 g 0,1.0,7 g

Mg 0,15 g 0,15-3 g 0,3-1,2 g

Ca 0,06 g 0,06-1,6 g 0,08-0,8 g S 0,1 g 0,1-8 g 0,2-5 g 25 Fe 0,5 mg 0,5-30 mg 0,6-20 mg

Zn 2 mg 2-100 mg 3-40 mg

Cu 0,6 mg 0,6-16 mg 1-10 mg

Mn 0,6 mg 0,6-20 mg 0,9-8 mg 30 Den måde, den omhandlede opfindelse skal udøves på, og yderligere træk og fordele ved opfindelsen kan ses af følgende illustrerende eksempler.

I eksemplerne er naturligt forekommende stammer opnået fra det officielle deponeringssted, nemlig

I DK 175766 B1 I

I 22 I

American Type Culture Collection i Rockville, Maryland I

og er betegnet ATCC nr. 24230 og 24202. ATCC betegnel- ι I

I serne viser, at to skråstivnede agarkulturer af hver ! I

stamme er deponeret på det officielle deponeringssted. .1 I

I 5 I

Mutaqenese I

I Eksempel 1 I

I 10 Ultraviolet mutaqenese I

I Man mutageniserede stammen IGI-2880B60 med ul- I

I travlolet lys fra en germicid UV lampe anbragt 30 cm I

I fra en saltvandssuspension af celler, i 1 minut (95,3% I

af Uvelse), 3 minutter (99,4% af Uvelse) og 5 minutter I

I 15 (99,99% aflivelse). Man holdt mutageniserede celler i I

I mørke i en 1 time efter mutagenesen og udplattede dem I

I på maltekstrakt gærmedium (YM) med adskillige fortyn- I

dinger. Pladerne blev inkuberet ved 20*0. Man isolerede I

mørk rødorange kolonier på basis af observerede for- I

I 20 skelle i pigmemtering og udstrøg dem på skråstivnet I

substrat. I

I Eksempel 2 I

I 25 Nitrosoquanidin mutaqenese I

I Man dyrkede stamme 1287J1 i YM i 48 timer.-Cel- I

lerne blev udcentrifugeret, man bortkastede supernatan- I

ten og suspenderede cellerne igen i 0,1 M citratpuffer. I

pH 5,0. Derefter behandlede man cellerne med 100 pg/ml I

30 nitrosoguanidin (NTG) i 25 minutter ved stuetemperatur I

uden omrystning. Suspensionerne blev centrifugeret, man I

dekontaminerede supernatanten og vaskede cellerne tre I

gange med 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0. Centrifu- I

23 DK 175766 B1 gebundfaldet blev suspenderet 1 phosphatpuffer, fortyndet 1 kolber med Indhold af 20 ml YM og holdt under omrystning natten over. Derefter blev cellerne udplat-i tet på YM og Inkuberet ved 20 C. Kolonierne blev isole- 5 ret baseret på observerede forskelle 1 pigmentering, idet man udvalgte kolonier/ der var mørk rødligorange ved undersøgelse under dissektionsmikroskop og udstrøg dem på skråstivnet substrat. Man benyttede tre dage gamle udstrygninger til at inokulere YM kolber. Herved 10 benyttede man 1 ml YM medium til at suspendere indholdet af skråkulturen/ og man satte hele denne suspension til 250 ml kolber med indhold af 20 ml YM og holdt 9

Indholdet under omrystning i 6 dage ved 20 C.

15 Morfologisk udvælgelse

Eksempel 3

Antlmycinbehandlinq 20 Man udplattede eksponentielt voksende gærceller af stamme ATCC 24230, enten NTG mutageniseret som beskrevet under trin 1(a) ovenfor eller ikke mutageniseret, på YM medium af indhold af 50 yM antimycin A (en blanding af antimycinerne A^ og Ag; Sigma katalog nr.

25 2006) og inkuberede ved 20°C, indtil en koloni voksede.

Væksten varede ca. en måned. Efter to yderligere ugers inkubering fremkom et rødt centrum i kolonien, hvorved denne kom til at ligne et spejlæg. Dette røde center blev isoleret i YM medium.

DK 175766 B1

I I

H Eksempel 4 I

Behandling med tunicamycln : I

H Man udvalgte tunicamycinmutanter, Idet man ud- ' I

5 plattede en kultur 1 logaritmisk fase af stamme ATCC { I

24202 (naturlig forekommende) på en gradlentplade af : I

GYE agar med 5 yg/ml tunicamycln. Kolonier, der voksede ; I

på disse plader, blev udstrøget på GYE agarplader med I

indhold af 5 og 8 yg/ml tunicamycln. Kolonier, der vok- I

10 sede på disse sekundære plader, blev analyseret for I

pigment. Kontrollen Indeholdt 270 yg/g sammenlignet med I

610 \ig/g for 8 yg/ml tunicamycinreslstent mutant. I

Eksempel 5 I

i I

I Behandling med nystatin I

Man Isolerede nystatinmutanter ved at inokulere I

YM kulturer 1 logaritmisk fase af stamme ATCC 24202 1 I

I YM kolber med indhold af 3 og 5 yg/ml nystatin. Efter I

I 20 48 timer udplattede man disse udvælgelseskulturer på I

I antibiotiske plader med indhold af YM agar med nystatin I

I (3 og 5 yg/ml). De opnåede kolonier blev analyseret for I

I pigment. Kontrollen indeholdt 280 yg/g sammenlignet med I

I 400 yg/g for nystatinmutanten med det højeste indhold. I

I 23 I

I Eksempel 6 I

I Behandling med mevalonsyre I

I Man mutagenlserede stamme ATCC 24202 med NTG til I

I 30 50% overlevelse og udplattede på YM medium. Man udplat- I

I tede kolonierne tilfældigt på YM agar med indhold af 5 I

I mM mevalonsyrelacton. Alle disse kolonier blev derefter I

I overført til et medium, der først indeholdt 10 og de- I

25 DK 175766 B1 refter 25 inM mevalonsyrelacton. Kolonier, der voksede ’ på 25 mM mevalonsyrelacton, blev analyseret for pigment.

Kontrollen indeholdt 275 pg/g sammenlignet med 540 pg/g for en mutant, der var resistent for 25 mM mevalonsyre- 5 lacton.

i

Carotenoid ekstraktion og analyse i Man kan analysere kolonier for pigmentindhold på følgende måde.

10 Efter indhøstning fra 30 ml dyrkningsmedium va sker man cellerne med vand og udsuspenderer dem i 30 ml vand. Den optiske densitet måles for at bestemme væksten. Omtrent 13 ml af suspensionen brydes med 0,5 mm glasperler i 3-4 minutter under afkøling i en Bead 15 Beater (Bio Spec Products, Bartlesville, OK). Efter brud udhælder man blandingen af glasperler og celler i et bæger og ekstraherer den 5 gange med 10 ml portioner af acetone. Acetoneekstrakterne samlet og centrifugeres ved 15.000 o/m i 45 minutter. Den klare acetonesuperna-20 tant hældes fra cellebundfaldet; hvis bundfaldet indeholder rester af pigment, knuses det manuelt med en glashomogenisator og ekstraheres igen med acetone.

De kombinerede acetoneekstrakter anbringes i en skilletragt, og man tilsætter ca. 10 ml petroleumsether 25 samt nogle få ml af en mættet NaCl opløsning for at bryde emulsionen. Man samler petroleiimsethereks trak terne og ekstraherer igen acetonelaget. Petroleumsether-ekstrakterne samles og filtreres gennem glasuld for at fjerne lipid-småkugler og andre partikler. Man optager 30 absorbansspektret (maksimal absorbans af transasta-xanthin i petroleums ether er 474 nm). Den totale caro-tenoidsammensætning beregnes under anvendelse af 1% ekstinktionskoefficient = 2100 ved hjælp af formlen:

DK 175766 B1 I

26 I

Total carotenoid (pg/g gær) = I

(ml petroleumsether) (absorbans 474 run) (100) I

(21) (tørstofvægt af gær,.g) I

Han kan analysere for enkelte carotenoider ved I

tyndtlagskromatografi (TLC) og elektroniske absorp- I

tlonsspektra. Til fremstilling af carotenoidekstrakter I

til analyse tørrer man petroleumsetherekstrakter over I

10 vandfri Na2S04 og indkoncentrerer ved fordampning i en I

nitrogenstrøm. Disse kromatograferes ved TLC på silica- I

gelplader (silicagel 60, 5 x 20 dm, 0,25 mm tykkelse, I

E. Merck, Darmstadt, DE) under anvendelse af 20% I

acetone/80% petroleumsether. Efter fremkaldelse udskra- I

15 ber man båndene og eluerer dem i acetone gennem en H

pasteurpipette lukket med glasuld. Man benytter absor- I

bansmaksima, R^-værdier og cokromatografi med standar- I

der til identificering af pigmenterne. Synlige absorp- I

tionsspektre optages i acetone eller petroleumsether på I

20 et Gilford Response spektrofotometer, og man beregner

koncentrationer af carotenoider under anvendelse af de I

specifikke absorptionskoefficienter, der ses hos I

Davies, Carotenoids, side 38-165 i Chemistry and Bio- I

chemistry of Plant Pigments, bind 2, T.W. Goodwin I

25 (editor), Academic Press, London (1976). I

Fermentering 1 laboratorleskala I

Eksempel 7 I

30 Produktionen af astaxanthin i en 10 1 labora- I

toriefermenteringsbeholder illustreres af følgende I

fremgangsmåde: H

Man benyttede 20 ml frosset Phaffla rhodozyma I

stamme IGI-887J1 (se fig. 1 og ledsagende tekst) til at I

27 DK 175766 B1 inokulere 300 ml af et medium omfattende 3% glucose, 1% gærekstrakt og 0,1% caseinhydrolysat. Mediet blev steriliseret ved 121°C og 15 psi i ca, 20 minutter før inokuleringen. Man rystede det inokulerede medium i ca.

_ p 5 48 timer ved en temperatur på 20 C på en roterende ryster med 2,5 cm slaglængde og en rotationshastighed på 250 o/m. Man benyttede de 300 ml celleurt til at inokulere en 5 1 podefermenteringsbeholder med indhold af 3 1 steriliseret podemedium med følgende sammensætning 10 pr. 1:

Ammoniumsulfat 5,0 g

Kaliumphosphat,monobasisk 1,5 g

Magnesiumsulfat,heptahydrat 1,5 g 15 Calciumchlorid,dihydrat 0,1 g Gæresktrakt 6,0 g

Vitaminblanding 2 ml

Blanding af sporelementer 1 ml 20 Vitaminblandingen bestod af følgende ingredien ser:

Biotin 0,08 g

Inositol 5,00 g 25 Thiamin 5,00 g

Calciumpantothenat 2,00 g

Pyroxidin,HCl 2,25 g

Vand, q.s. til opnåelse af l 1 30 Blandingen af sporelementer består af følgende ingredienser:

I DK 175766 B1 I

I 28 I

I i) Fed g, gH2o 3 g I

2) Na2Mo04,2H20 2 g I

I 3) ZnS04,7H20 8 g I

I MnS04,H20 3 g I

I 5 CuS04,5H20 6 g I

Vand, q.s. op til 11 I

I Efter inokuleringen førte man i små portioner en I

I 70% cereloseopløsning til fermenteringsbeholderen, idet I

10 man holdt den specifikke væksthastighed af cellerne ved I

I ca. u=0,15. Man holdt fermenteringsbeholderen på en I

Η I

temperatur på 20 C og kontrollerede pH til en værdi på

I 5 med 8N KOH. Omrøringen var 900 o/m og beluftningen I

I var på 1,5 v/v/m. Når ODggQ (optisk densitet) havde nå- I

I 15 et en værdi på ca. 30, benyttede man 1 1 af urten til I

I at inokulere en 15 1 fermenteringsbeholder med indhold I

af 10 1 produktionsmedium. I

Sammensætningen af produktionsmediet var den I

I samme som podemediet, idet dog: (1) man forøgede ind- I

I 20 holdet af ammoniumsulfat til 16 g/1, og (2) man tilsat- I

te 1 g/1 mononatriumglutamat og 5 g/1 majsstøbevæske. I

I Temperaturen i fermenteringsbeholderen blev holdt ved I

I 20°C, og man opretholdt en pH værdi på 5 med 8N KOH. I

I Omrøring og beluftning var henholdsvis 900 o/m og 1,5 I

25 v/v/m. Man førte i små portioner ca. 2 1 70% cerelose I

I til gæringsbeholderen, idet man holdt den specifikke I

I væksthastighed for cellerne under 0,15. Ved afslutnin- I

I gen af fermenteringen (efter c. 60 timer) indeholdt I

I cellerne ca. 1100 yg/g astaxanthin. I

29 DK 175766 B1

Fermentering 1 større skala

Eksempel 8

Produktionen af astaxanthin i pilot plant skala 5 illustreres ved følgende procedure.

Man benyttede 20 ml frossen P^ rhodozyma stamme IGI 188JB1 (se fig. 1 og ledsagende tekst) til at in-okulere 300 ml vækstmedium, idet sammensætningen af mediet og dyrkningsbetingelserne var de samme som i eks-10 empel 1. Efter 48 timers forløb benyttede man de 300 ml celleurt til at inokulere den første podefermenteringsbeholder, der indeholdt 3 1 af et steriliseret første podemedium med følgende sammensætning pr. liter: 13 Ammoniumsulfat 4 g

Kaliumphosphat,monobasisk 1,5 g

Magnesiumsulfat,heptahydrat 1,5 g

Calciumchlorid,dihydrat 0,1 g Gærekstrakt 4,0 g 20 Majsstøbevæske 10,0 g

Vitaminblanding* 2 ml

Sporelementblanding* 1 ml * som i eksempel 1.

25 Man satte aseptisk 90 g steriliseret cerelose til fermenteringsbeholderen efter inokulering. Fermen- 0 teringsbeholderen blev holdt ved 21 C, pH blev kontrolleret til en værdi på 5 med 8N KOH, omrøringen var 900 o/m og beluftningen var 1,5 v/v/m. Efter at den oprin-30 delige cerelose var brugt op, tilførte man i små portioner en steriliseret 70% cereloseopløsning til fermenteringsbeholderen. Man holdt den specifikke vækstrate af cellerne kontrolleret ved ca. 0,1. Ved en cel-

I DK 175766 B1 I

I 30 I

levækst svarende til en OD på ca. 20 benyttede man de 3 I

1 celleurt til at lnokulere en 30 1 fermenteringsbehol- I

der med indhold af 20 1 steriliseret 2. trins poderne- I

dium. I

5 Sammensætning af 2. trins podemedium var den I

samme som 1. trins podemedium. Dyrkningsbetingelserne I

var også de samme, idet man dog benyttede en langsomme- I

re omrøring, 300 o/m. Efter opbrug af den oprindelige I

cerelose førte man i små portioner en steriliseret op- I

10 løsning af 70% cerelose og 7% ammoniumsulfat til fer- I

menteringsbeholderen, indtil man nåede en værdi for OD I

på ca. 30. Den specifikke vækstrate fra cellerne blev I

kontrolleret til ca. 0,1. Den anden podning blev benyt- I

tet til at inokulere en 250 1 fermenteringsbeholder med I

13 indhold af 170 1 steriliseret produktionsmedium. I

Bortset fra en højere koncentration af majsstø- I

' bevæske (12 g/1) var sammensætningen af produktions- I

mediet det samme som i podemediet i første trin. Tem- I

I peraturen blev holdt ved 21 C, og pH blev holdt på 5 I

I 20 ved hjælp af 8N KOH. Man forøgede beluftningen på 250 I

I 1/min. i de første 15 timer til 300 1/min. En omrøring I

på 150 o/m i de første 15 timer blev forøget til 200 I

I o/m. Man tilførte i små portioner en steriliseret op- I

løsning af 70% cerelose, 7% ammoniumsulfat til fermen- I

I 2 5 teringsbeholderen og kontrollerede den specifikke I

I vækstrate af cellen til ca. 0,1. Efter tilførsel af 30 I

I · kg cerelose til fermenteringsbeholderen indhøstede man I

cellerne. Cellerne indeholdt ca. 1000 yg/g astaxanthin. I

DK 175766 B1 I

31 I

I Forstærkning af biosyntesen af astaxanthln I

Man har endvidere fundet, at astaxanthinindhol- I

det af cellerne bliver betydeligt forstærket, hvis man I

5 sætter antimycin eller en anden inhibitor for hoved- I

respirationskæden til Phaffia rhodozyma celler og ud- I

sætter cellerne for lys. Basismekanismen for dette fæ- I

nornen er ikke forstået, men man kan teoretisere, at I

lys, når den primære respirationsvej bliver inhiberet I

10 virker som en udløser for en sekundær (oxidativ) respi- I

rationsvej, og at nettovirkningen heraf bliver en bety- I

delig stimulering af produktionen af astaxanthin. Såle- I

des omfatter opfindelsen processer til forøgelse af I

indholdet af astaxanthln eller andre carotenoider i I

15 gær, hvorved man dyrker gæren under tilstedeværelse af I

en metabolismevejsinhibitor, idet man inducerer en se- I

kundær respirationsvej. Den sekundære respirationsvej I

kan induceres ved påvirkninger såsom lys, visse betingelser i omgivelserne såsom sådanne, der vides at frem-20 kalde belastning, næringsstoffer etc. Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset af den ovennævnte hypotese.

Det vil kunne ses af nedenstående eksempler, at man kan inducere en forstærket biosyntese af astaxanthin ved den ovenfor nævnte kombination af en inhibi-tor for respirationskæden og udløsning af en sekundær respirationsvej.

Eksempel 9

De anvendte P. rhodozyma stammer var det natur-30 lige isolat UCD-FST-67-385 (Phaff et al., 1972; Miller et al., 1976), mutanten Ant-l-4, der blev benyttet ovenfor og stamme 18-13-6, en astaxanthinforstærket mutant opnået ved ethylmethansulfonat (EMS) mutagenese- I DK 175766 B1 I 32

procedurer (Isoleret på YM agar). Disse blev dyrket I

1 gærekstrakt/maltekstrakt/pepton/glucosemedium (YM me- I

dium, Dlfco Co., Detroit, MI) som tidligere beskrevet I

(An et al., 1989) 1 en temperaturkontrolleret rystein- I

5 kubator (Environ-Shaker Model 3597, Lab-Line Instru- I

ments, Inc., Melrose Park, IL). Man bestemte væksten I

ved hjælp af den optiske densitet (660 nm) af en vasket I

cellesuspension; 1 mg tørstofvægt af celler pr. ml sva- I

rer til en O.D. på 1,35. I

10 Lys blev tilført ved hjælp af to Sylvania 20 I

watt Coolwhlte fluorescensrør anbragt 20-40 cm fra I

overfladen af mediet 1 kolberne. Man Inokulerede kol- I

I berne med ca. 102-10® celler af aktivt voksende gær. I

Til kontrol i mørke Indpakkede man kolber i aluminium- I

I 15 folie. Hvis der indgik uopløselige kemikalier i mediet, I

I blev disse først opløst i en lille mængde ethanol I

(slutkoncentration 0,3%), der ikke påvirkede vækst el- I

I ler pigmentering af cellerne. I

20 Carotenoldekstraktlon og analyse I

I Man dyrkede P. rhodozyma i 5 dage i kolber før I

I ekstraktion. Herefter indhøstede man gæren fra væske- I

I mediet ved centrifugering, og man udsuspenderede gær- I

I cellerne i destilleret vand, vaskede med vand og eks- I

25 traherede og analyserede for carotenoider ved tyndt- I

I lagskromatografi og absorptionsspektroskopi som tidli- I

I gere beskrevet (An et al., 1989). I

I Induktion af en sekundær resplratlonsvej forøger caro- I

I ^ tenoldproduktlonen I

I Man undersøgte indflydelse af to 20 watt fluo- I

rescenslamper anbragt 20 cm fra overfladen af et natur- I

ligt isolat af p. rhodozyma, UCD-FST-67-385 og af dets I

antimycinsensitive mutanter, Ant-l-4 og 18^13-6. I

DK 175766 B1 I

33 I

Man dyrkede adskilte kulturer under følgende be- I

tingelser (a) fuldstændigt mørke 1 30 timer (herefter I

•’mørke"), (b) fuldstændigt mørke med 0,2 μΜ antimycin I

(antimycin indføres ved inokuleringen) (herefter I

5 "mørke/antimycin") og under betingelserne (c) og (d), I

der var identiske med (a) og (b), idet man dog udsatte I

kulturerne for lys fra ca. 30 timer ind i eksperimen- I

tet til ca. 60 timer ind i eksperimentet (herefter I

"lys" og "lys/antimycin*·). I

10 Ekstraktion og karakterisering af pigmenterne I

tydede på, at pigmenterne kvalitativt havde en ens- j I

artet sammensætning, idet man dog fandt mere cis-asta- I

xanthin og lavere koncentrationer af caroten i celler I

dyrket under lys. I

15 Analyse af gærarter viste, at carotenoidindhol- I

det i lys/antimycin P. rhodozyma UCD-FST-67-385 voksede I

I med en faktor 2 i forhold til både mørke, mørke/anti- I

mycin eller lyskulturerne af dette naturlige isolat I

(tabel l). Tabel 2 viser, at mutanten 18-13-6, der er I

20 antimycinfølsom, producerede en vækst med en faktor 2 i I

carotenoidindhold ved antimycin/lys i forhold til lys- I

kulturen. I

Tabel 1 I

Betingelser Vækst Carotenoid _(mq/ml)_Imq/q gær) Mørke 4,4 520 Mørke + Ant 1,6 480 30 Lys 3,3 440

Lys + Ant 2,2 1000 I DK 175766 B1

I I

Tabel 2 I

Antimycln_Ikke tilsat_Tilsat I

Carotenoidindhold (yg carotenoider/g gær) I

5 Hvidt lys 540 1410 I

Blåt lys 1050 1360 I

Rødt lys 960 1210 I

I Mørke 830 1013 I

H Som man kan se af de ovenfor givne resultater, I

er vækst og dannelse af carotenoider i naturlig og I

H astaxanthinforstærket P. rhodozyma tydeligt påvirket af I

lys. Det naturlige isolat UCD-FST-67-385 og dets anti- I

mycinfølsomme mutanter Ant-1-4 og 18-13-6 voksede hver I

15 bedre og havde en forøget pigmentering i mørke, men I

blev påvirket forskelligt af lys. I

I Phaffla som foder og som plqmentkllde I

Man kan sprænge eller bryde de indhøstede celler I

I 20 under anvendelse af mekanisme eller enzymatiske midler I

I eller af en kombination deraf og benytte dem som foder I

til salmonider etc. som en del af den totale ernæring. I

For at forøge stabiliteten af astaxanthin i de sprængte I

eller brudte gærceller mod varme og luft er det fore- I

25 trukket at tilvejebringe en beskyttende matrix eller et I

overtræk, som normalt benyttes ved foder, f.eks. en na- I

turlig gummiart. I

Eksempler, hvori P. rhodozyma benyttes som fo- I

dersupplement for regnbueørreder (Salmo qalrdnerl), I

30 amerikanske hummere, Coturnix vagtler og æglæggende I

høns, diskuteres i en afhandling af en af opfinderne I

Johnson, benævnt "Astaxanthin Production by the Animal I

Feeding", magistergrad, University of Calfornia, Davis I

(1976). I

I DK 175766 B1 35

Som en konsekvens af det højere astaxanthinind-hold pr. enhed celler på tørstof basis af gæren, som er opnået ifølge opfindelsen, kan man i væsentlig grad reducere mængden af gær, der skal anvendes for at in-5 ducere pigmentering.

i

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en gær med H I et forhøjet indhold af astaxanthin, kendeteg- I I net ved, at man dyrker en mikroorganisme af siæg- I I 5 ten Phaffia i et næringsmedium indeholdende et anti- I I biotikum, en cytochrom B inhibitor eller en inhibitor I for terpenoidsyntesevejen. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- H tegnet ved, at nævnte antibiotikum er antimy- I I 10 cin, tunicamycin eller nystatin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I tegnet ved, at cytochrom B inhibitoren er anti- I mycin eller 2-n-heptyl-4-hydroguinolin-N-oxid. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I H 15tegnet ved, at nævnte inhibitor for terpenoid- syntesevejen er mevalonsyrelacton. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I tegnet ved, at koncentrationen af inhibitoren I I for terpenoidsyntesevejen i næringsmediet er 1-100 I I 20 μΜ. I

6. Fremgangsmåde ifølge krav l,kende- I tegnet ved, at man underkaster mikroorganismen I af slægten Phaffia mutagenese før, efter eller både I før og efter et trin med morfologisk udvælgelse. I

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I tegnet ved, at astaxanthinindholdet i den ind- I H høstede gær er 1000 ppm eller mere, baseret på tør- I stofvægt af gærcellerne. I

8. Anvendelse af en gær fremstillet ifølge krav I 30 1-7, på brudt form til øgning af pigmenteringen af I kødet hos salmonider eller af skindet, kødet eller I æggeblommen hos fjerkræ. I