JPH04501053A - アスタキサンチンのイン・ビボ生産方法およびアスタキサンチン含量を増加させるファフィア・ロドジマ酵母 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アスタキサンチンのイン・ビボ生産方法およびアスタキサンチン含量を増加させ るファフィア・ロドジマ酵母発明の分野 本発明は、−の態様において、色素アスタキサンチンの経済的なｉｎ　ｖｉｖｏ 生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は抗生物質、チトクローム Ｂ阻害剤、またはテルペノイド合成経路阻害剤含有の栄養培地中、ファフィア（ Ｐｈａｆｆｉａ）属の微生物を培養し、生き残っている色素増加微生物を培養し 、該酵母を採取することからなる、ファフィア属微生物の培養体のアスタキサン チン含量を増加させる方法に関する。

聚吸卑背量 赤黄色のカロチノイド色素であるアスタキサンチンは、通常、天然において見ら れ、多くの動物によって顕著に示されている。この色素を合成できない動物は、 この色素または色素先駆体の食餌摂取に依存している。

天然のサケおよびマスの赤い皮および身の色は、主にアスタキサンチンによるも のであり、それは通常、これらの魚において非結合色素として存在する。自然に おいては、食餌の海洋性動物プランクトンおよびネクトンがサケにそのカロチノ イド色素を供給している。

食餌アスタキサンチンの不足のため、養殖場で、または郷化場にて大きくなった 魚は、一般に色が薄く、その天然環境で成長した魚に特徴的な皮および身の色彩 を欠いている。カロチノイドが動物またはヒトの食事において栄養学的に重要で あるか否かは測定されていないが、色素はある種の食物を魅力的にするものであ る。したがって、たとえ、栄養学的に色の薄い養殖魚が天然環境で成長した魚と 同じであるとしても、食物の色相がしばしばその質のインジケーターであるため 、天然色の魚に対する消費者の強い要望がある。さらには、アスタキサンチンま たはその先駆体がベータトサーモンの特有の好みの一因となるという証拠がある 。

最近の健康損傷のおそれに対する関心の増加は、発癌性および／または催奇性の 可能性を有する種々の合成着色剤の使用禁止に帰着している。食品における使用 がだんだん禁止されている黄色および赤色アゾ染料は、非毒性のカロチノイドに 取って代えられている。

カロチノイドは、一般に、高濃度であっても毒性ではない。したがって、天然の カロチノイドは、例えば、サケ科の魚を着色する好ましい色素である。

過去において、サケ科の魚の食餌にてカロチノイド含有の甲殻類または甲殻類加 工処理廃棄物を利用する多くの研究がなされてきた。

甲殻類残物を補った食餌を魚に与えると、その魚の淡い色は改良される。しかし ながら、甲殻類シェルはカロチンイド含量が非常に低く、ミネラルを多く含み、 その食餌特性を改良する広範な加工処理なしでは、サケ科の魚の食餌における該 シェルの使用は制限される。

さらには、長期間にわたって飼料を与えた場合にのみ満足のいく色相を得ること ができ、経済的な意味で本質的なことではないが、非常に短期間で満足のいく色 相を得ることが望ましい。

アスタキサンチン自体を魚の飼料に加え、前色を改良しうることが知られている 。例えば、米国特許第４２３９７８２号は、アスタキサンチンのような着色剤を 魚の飼料に加え、加えて選択された着色剤または着色剤類と組み合わさって触媒 として作用し、魚の色相度を高めるホルモンであるテストステロンを制限量添加 することからなる、魚の色相度を高める方法を記載している。

７７．９牛すンチン自体の２つの主な商業源は甲殻類シェルと化学合成物からの 抽出物である。赤色カロチノイド色素は外骨格性甲殻類シェルおよび組織から抽 出することができ、定量以上の濃度にて食餌処方における他の飼料と混合し、養 殖場の魚、甲殻類およびある種の家禽類に与え、満足のいく皮、身、甲皮または 卵黄色素形成を得ることができる。甲殻類シェルおよび組織廃棄物からのアスタ キサンチンの抽出方法の例は、例えば、米国特許第３９０６１１２号（アンダー ソン（Ａ　ｎｄｅｒｓｏｎ）　）および第４５０５９３６号（メイヤースら（Ｍ ｅｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）　）において記載されている。

ジャーナル・オブ・フード・サイエンス、第４７巻（１９８２）、表題「大豆油 方法を用いるクローフィッシ二廃棄物からのアスクキサンチン色素の抽出」の論 説において、種々の抽出法が記載されている。例えば、クローフィッシュ廃棄物 全体をすり砕き、粉砕したクローフィッシュ廃棄物を水と混合し、ｐＨをアルカ リまたは酸テ調整し、酵素を溶液に加え、該溶液を撹拌し、加熱して加水分解す る。加水分解後、アスタキサンチンを油で抽出し、該アスタキサンチンに富んだ 油を遠心分離により回収する。しかしながら、特にグリルおよびクローフィッシ ュ・シェルからの天然単離物のアスタキサンチンの価格は、およそ、１キログラ ム当たり＄５０００から＄１５０００のコストとすることができる。アスタキサ ンチンの生産について、より原料依存性が少なく、より経済的な方法が望まれて いることは明らかである。

サケおよびマスの身の着色もまた、食品添加物として合成カロチノイドカンタキ サンチンを用いて行われてきたが、この化学物質はかなり高価であり、サケ科の 魚においてはいくらか不満な色相が得られた旨報告されている。アスクキサンチ ンの化学合成における最近の研究が、米国特許第４２４５１０９号（メイヤーら （Ｍａｙｅｒｅｔ　ａｌ、））、第４２８３５５９号（ブロガーら（Ｂｒｏｇｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、）　）および第４５８５８８５号（バーンハードら（Ｂｅｒｎ ｈａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）　）に示されている。現在の合成アスタキサンチン色 素の価格は、１キログラム当たり約５２０００である。しかしながら、多くの国 は合成カロチノイドの使用を禁止している。

アスクキサンチンは、囲い飼育されるサケの飼料に用いられる最も高価な成分の 一つである。アグリカルチャー、すなわち、魚の養殖に対する興味が最近急激に 様相を変えているため、それに比例して経済的なアスタキサンチン源に対する商 業的要求も大きくなってきた。

鶏の卵黄の色相もまた経済的に重要であるため、鳥類の卵黄の色素形成について も研究されている。高色素含量の卵黄が要求されている。商業的食餌における最 も一般的な色素源はイエローコーンであり、それは顕著な卵黄色素のクリプトキ サンチン、ゼアキサンチンおよびルティンを供給する。残念ながら、鶏の食餌に おいては、マイロ、小麦、米および大麦のような高エネルギー穀物がコーンに取 って代わり、その結果、色素形成が喪失している。アスタキサンチンは家禽類飼 料補足剤として使用され、卵黄色素形成を高めることができる。

現在のところ商業的に用いられていない、アスタキサンチン生産における解決手 段の一つは、生合成、すなわち、微生物を用い、アスタキサンチンを合成するこ とである。

アスタキサンチンの微生物源として、酵母のファフィア・ロドジマ（Ｐ　ｈａｆ Ｔｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が知られている（デーヴイス（Ｄ　ａｖｉｓ）の カリフォルニア大学、ジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）の修士Ｅｆｉ文、ｒ酵母 ファフィア・ロドジマによるアスタキサンチン生産および動物飼料における色素 源としてのその使用Ｊ　（１９７８））。酵母は、一般に、高栄養価の家畜飼料 であり、動物食餌においては、しばしば、望ましいものであると考えられている ；アスタキサンチン含有の付加的属性は、この色素の食餌源を必要とする動物、 例えば、サケ科の魚、甲殻類、産卵鶏またはフラミンゴのような鳥類にとっては 、ピー・ロドジマが理想的な飼料補足剤であるかもしれないこと示唆している。

しかしながら、天然のピー・ロドジマの色素収量は、６日増殖において、２００ 〜６００ｐｐｍ／乾燥重量酵母のオーダーにすぎない。アスタキサンチン自体の 供給源として、天然のビー・ロドジマは不適当である。ある種の魚、甲殻類およ び家禽類の食餌を天然のビー・ロドジマで補足する実験ではいくらかの徴候が示 された。しかしながら、実際に、飼料補足剤として満足のいく色素形成レベルを 得るのに、添加しなければならないピー・ロドジマは多量であり、色素源として 天然のビー・ロドジマは商業的適合性を欠く。

発明の要約 したがって、本発明の目的は、色素アスタキサンチンの経済的なｉｎ　ｖｉｖｏ 生産方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、高アスタキサンチン含量を有する酵母ノファフィア ・ロドジマの培養物を得る方法を提供する。本発明のもう−つ別の目的は、高ア スタキサンチン含量により特徴付けられるビー・ロドジマを提供することにある 。

本発明のさらなる目的は、ＡＴＣＣに寄託されている株ＡＴＣＣ−２４２３０ま たはＡＴＣＣ−２４２０２のような天然のピー・ロドジマから由来する子孫のア スタキサンチン含量を改良する方法を開発することである。

本発明のさらにもう一つ目的は、酵母のピー・ロドジマの突然変異株のアスタキ サンチン含量を改良する方法を開発することである。

これらのおよび他の目的は、その最も基本的な形式にて、抗生物質、チトクロー ムＢ阻害剤、またはテルペノイド合成経路阻害剤含有の栄養培地において、ファ フィア属の微生物を培養し、生き残っている色素増加微生物を培養し、該酵母を 採取することからなる方法により達成される。

株発育におけるキーとなる工程は、形態学的な選択工程にある。

突然変異の順序および型と抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド 阻害剤選択との可能な組み合わせは、本発明においてビー・ロドジマに付した組 み合わせに限定されるものではない。最近の結果はこの技法の再現性を確認して いる。

本発明の関連する目的および利点は、以下の図面および詳細な記載を参考するこ とによりさらに明らかとなる。

図面の簡単な記載 本発明において用いる方法および機構は添付図面に記載されており： 図１は、ピー・ロドジマにて見いだされた種々の色素および中間体の化学構造式 および関係を示す。

図２は、ビー・ロドジマの突然変異体分離の好ましい順序を示すフローチャート である。

図３は、斑入りコロニーの外観を示すマイフロピフタグラフである。

発明の詳説 日本および太平洋北西部の樹木に付随する酵母フロラを研究する目的で１９６７ 年に行った航海の間に、特異アスタキサンチンを合成する微生物が種々の広葉樹 の粘着流動体から単離された（）（）ら（Ｐｈａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、）　ｒ日本 および化アメリカ西海岸の樹木に付随する酵母フロラの比較研究Ｊ　、Ｐｒｏｅ 、　ＩＶ　：フェルメント・チクノール・ツブエイ　（Ｆ　ｅｒｍｅｎｔ、　Ｔ 　ｅｃｈｎｏｌ、　Ｔ　ｏｄａｙ）、（１９７２）７５９〜７７４頁）。今日、 ファフィア・ロドジマとして知られているこの微生物は、カロチノイド色素を生 産し、数種のショ糖発酵能を有することが解明された。

ファフィアはその独特な特性のため属であることが承認され、それは、そのゲル コールおよび他のショ糖を発酵させる能力、その主たるカロチノイドとしてのア スタキサンチン合成、その出芽形成モード、その子嚢菌性酵母においては通常で ない尿素使用能のようなある種の代謝特性の所有、およびその細胞壁構成を包含 する。この属におけるピー・ロドジマの該種だけが独占的に出芽により生殖し、 電子顕微鏡をスキャンすることにより植物的生殖のこのモードの試験は、該酵母 が、多層細胞壁の形成に至る同一部位から繰り返し出芽することを示している。

ファフィア属の他の特性は、その厚壁胞子の形成、その４８．３％のモル％Ｇ＋ Ｃ含量、そのウレアーゼによる尿素分解能、およびそのパーフェクト段階の明ら かな欠如を包含する。その特性は該酵母が担子菌類親和性であることを示唆して いる。ファフィア属の生殖サイクルを解明する試みはすべて失敗した。

「ファフィア・ロドジマ、赤着色発酵酵母のカロチノイド」、フィトケミストリ ー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｔ）　１５、（１９７６）１００３〜１０ｏ７頁にて報告 されているように、アントリユースら（Ａ　ｎｄｒｅｗｅｓｅｔａｌ、）は、ピ ー・ロドジマのカロチノイドが普通でないことを見いだした。天然のピー・ロド ジマにてアントリユースによって見いだされた色素および色素中間体を図１に示 す。図中、（Ａ）はエチネノン（ｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ）、（Ｂ）は３−ヒドロ キシェチネノン、（Ｃ）はフェニフキサンチン（ｐｈｅｎｉｃｏｘａｎｔｈｉｎ ）　、および（Ｄ）はアスタキサンチンである。アスタキサンチンは、この酵母 により合成される主たる色素であること；天然の酵母においては、約８５％のカ ロチノイド混合物からなることが判明した。

大抵の植物および動物源のカロチノイドは水混和性溶媒で容易に抽出することが できるが、酵母がその色素とねばり強く付着していることはよく知れらでいる。

アスタキサンチンは強固に酵母細胞に付着しており、まず酵母細胞の構造を変え ることなく、脂質溶媒により抽出することはできない。

抽出物の大部分の定量方法は、フレンチ・プレス（Ｆ　ｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ） 　（シンプソンら（Ｓ　ｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、「微生物破壊用の修飾 フレンチ・プレス」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔ、）　、８６．　（１９６３）　１１２６〜１１２７頁）のように、ま たはブラウン・ホモジナイザー（Ｂ　ｒａｕｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）　（ バエら（Ｂａｅ　ｅｔ　ａｌ、）、「クリプトコツカス・ラウレンティーにおけ るプレフタニアキサンチンの発生」、フィトケミストリー、１０．　（１９７０ ）６２５〜６２９頁）のように機械的に酵母細胞を破壊し、ついで該細胞を溶媒 で抽出することからなる。これらの方法は、通常、アスタキサンチン濃度の測定 に用いられる。

アスタキサンチンを大規模に回収する必要性が酵素の抽出方法の発達をもたらし た。該方法は、細菌のバシラス・サーキュランスＷＬ　−１２（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｃｉｒｅｕｌａｎｓ　ＷＬ　−１２）により産生される細胞外溶菌酵素を利 用し、それは酵母細胞壁を部分的に消化し、カロチノイド色素を脂質溶媒で抽出 可能とする。これらの酵母細胞上で２６時間ビー・サーキュランスＷＬ−１２を 増殖させ、ついで該酵母−細菌混合物をアセトンで抽出した後、熱−滅菌ピー・ ロドジマ細胞からアスタキサンチンの完全抽出物を得た。

ピー・ロドジマからの７スタキサンチンの定量抽出を付与する細菌−フリー溶菌 系は、ピー・ａドジマ細胞上でピー・サーキュランスＷＬ−１２を増殖させた培 養ブロスを濃縮することにより得た。

好ましくは、ピー・サーキュランスＷＬ−１２をピー・ロドジマ細胞含有の培地 上にて増殖させる。溶菌系は、ｐＨ６，５で、低濃度の酵母中にて最も効果的に 作用することが判明した。

一般に、栄養源および環境が、種々のカロチノイド生産微生物のカロチノイド収 量に対して効果を有する。複合培地における発酵のカロチノイド形成の増加が報 告されている（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）、「微生物の色素およびビタミン生産 」、マイクロビアル・テクノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）　＋　エイチ・ジエイ・ペブラー編（Ｈ，Ｊ、Ｐｅｐｐｌｅｒ）　、ライン ホルト、ニニーヨーク（１９６７）２２２〜２５０頁）。

カロチノイドはテトラテルペンであり、その基本的な合成経路は他のテルペノイ ドの経路と同様である。アセチルＣｏＡは初期の先駆体であり、第１のテルペノ イド化合物はメバロン酸である（スフブフア−ら（Ｓ　ｃｈｏｐｆｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、　）、“Ｓ　ｕｒ　ｌａ　ｂｉｏｓｙｎｔｈＡｓｅ　ｄｕβ−ｃａｒｏｔ ６ｎｅ　ｐａｒ　Ｐｈｙｃｏｍｙｅｓ　ｃｕｌｔｉｖ６　ｓｕｒ　ｕｎ　ｗｉｌ ｅｕ　ｃｏｎｔｅｎａｒ＋ｔ　ｄｅ１’　ａｃｅｔａｔｅ　ｄｅ　５ｏｄｉｕｓ 　ｃｏｍｍｅ　ｕｎｉｑｕｅ　５ｏｕｒｃｅ　ｄｅ　ｃａｒｂｏｎｅ″。

Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、８．　（１９５２）　１４０頁）。インペンテニルピ ロホスフェートは、カロチノイドが誘導される基本的な先駆体である（グツドウ ィン（Ｇ　ｏｏｄｖｉｎ）　、バイオシンセシス（Ｂ　１ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ）、カロチノイド、オー・アイスラーｆｉｇ　（０，１５ｌｅｒ）　、バーセル （Ｂａｓｅｌ）　、バークハウザ−（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）　、（１９７１） 　５７７〜６３６頁：ブリットン（１３ｒｉｔｔｏｎ）、「カロチノイドの生合 成」、植物性色素の化学および生化学、Ｖｏｌ、１．　（１９７６）２６２〜３ ２７頁参照）。

ピー・ロドジマでの最先の研究は株＃６７−２１０型でなされた。

さらに数種の天然の単離体（ＵＣＤ−ＦＳＴ＃ｓ　６７−２０２．６７−２０３ ．６７−２１０．６７−３８３．６７−３８５および６８−６５３Ｇ）の若コロ ニーの視覚試験は、６７−２１０および６７−３８５　（各々、アメリカン・タ イプ・カルチャー・フレクシタンＡＴＣＣＮｏ、２４２０２および２４２３０） が最も高色素形成株であることを示した。ＹＭブロスにて５日間増殖させた後、 これら２種の株におけるアスタキサンチン含量の定量測定は、６７−２１０で約 ２９５μｇ／ｇであるのに対して６７−３８５は約４５０μｇ／ｇ乾燥酵母を有 することを示した。その高天然アスタキサンチン含量のため、該発明者らは株成 長用に主として６７−３８５を用いた。

ピー・ロドジマの増殖および色素形成の最適培養条件を決定するのに設計された 一連の実験の結果として、アスクキサンチン生合成は、増殖の指数相の間に最も 効果的に起こることが判明した。増殖培地中の色素収量は、単に細胞濃度に依存 するだけでなく、培養条件によっても影響されることが判明した。アスタキサン チン生産の最適ｐＨは、振盪フラスコにて５．０であることが判明した。しかし ながら、他の試験ｐＨで、ピー・ロドジマのアスタキサンチン濃度は比較的一定 を維持した。

培養温度は、ピー・ロドジマの増殖速度に影響を及ぼすが、酵母細胞におけるア スタキサンチンの蓄積には影響しないことが判明した。さらには、光の作用もピ ー・ロドジマのカロチノイド生成（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓ＃ｓ）に影響を 与えないが、高光強度下にて増殖させた細胞がより赤い色相を有することは明ら かであり、それは特定のカロチノイドの濃度が異なることによるものであろう。

低グルコース濃度および高空気供給速度が、ピー・ロドジマによる効果的なアス タキサンチン生産を促進することが判明した。空気供給速度が２０ミリモル／時 間以下であるか、またはグルコース濃度が４％Ｗ／Ｖ以上である場合、赤色酵母 における′ｒアスタキサンチン濃度かなり減少する。しかしながら、これらいず れかの条件下で培養した酵母においても、なおアスタキサンチンがなお優勢色素 であった。しかしながら、低空気供給および高グルコース濃度の作用を組み合わ せた場合、その場合、ピー・ロドジマのアスタキサンチン濃度は極端に低濃度ま で減少し、β−ゼアカロチン（β−ｚｅａｃａｒｏｔｅｎｅ）形成を生じた。こ れら不利な条件下では、再度、アスタキサンチンは該カロチンから効率よく形成 されなかった。

この酵母にけるエタノール生産を抑制する炭素化合物（例えば、セロビオース） にて培養した場合、アスタキサンチン収量は比較的高収率であった。エタノール 生産を促進する炭素源（例えば、高グルコース）にて培養した場合、アスタキサ ンチン収量は比較的低収率であった。ペントース−ホスフェート経路を介して代 謝される炭素化合物（例えば、牛シロース）は、有効なカロチノイド生成を促進 しなかった。

天然林のピー・ロドジマに対する栄養培地および環境条件の最適化における広範 な実験にもかかわらず、色素含量の劇的な増加は得られなかった。発明者らは、 上記要因単独の操作では、生合成を商業上可能とするのに必要な程度までピー・ ロドジマのアスタキサンチン含量の増加を誘発するのに十分ではないかもしれな いと結論した。

高アスタキサンチン生産能を有するピー・ロドジマの新規な遺伝子変異体を単離 する目的で、ピー・ロドジマを突然変異生成に付した。しかしながら、結果は、 思うに、突然変異のランダムおよび非定方向特性によって相互に一致しなかった 。例えば、ＵＶ照射後の数千のコロニーをスクリーニングした後では、高着色変 異体を単離する試みは成功しなかった。大部分のＵＶ生成突然変異体は、アスタ キサンチン含量がかなり減少しており、色相は非常に薄かった。

従来の突然変異誘発法によるピー・ロドジマのアスタキサンチン含量の改良にお いてさらなる発展の可能性が制限されることは明らかである。これは、微生物が 不必要な細胞構成成分を過剰に生産する方同にいかないように、その細胞構成成 分の生合成に対して厳重な遺伝子調節機能を有しているからでる。アスタキサン チンのような色素の生合成は、明らかに、酵母細胞のいずれか所定の株において 厳重に調節されているため、非定方向突然変異生成による高アスタキサンチン生 産能を有するコロニーを生成する、生存能力のある遺伝可能な遺伝子交代を引き 起こす可能性はおそらく非常に低い。

突然変異生成後のコロニーのスクリーニングは、相対的に不成功に終わっている ため、発明者らはアスタキサンチンを過剰生産する選択操作を開発することを試 みた。アスタキサンチン形成は高濃度のグルコースにより減少するため、発明者 らは、選択剤として２−デオキシグルコースを用い、カタボライト−抑制解除さ れ、ついで高色素生合成を示すグルコース−耐性株を単離した。この選択的操作 により生成された株のいくつかは色素形成を変化させるが、多くは極端に不安定 であり、一つの株も、天然の親よりもアスタキサンチン濃度を２倍以上増加させ なかった。

ケトフナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）およびミコナゾール（ｍｉｃｏｎ ａｚｏｌｅ）を包含するステロール生合成抑制剤を、酵母麦芽エキス培地寒天に 混合し、その操作はピー・ロドジマの有意な死滅をもたらした。しかしながら、 数千の残存種のスクリーニングは、高着色酵母株を生産しなかった。ニコチン（ １ｍＭ）、イミダゾール（４ｍＭ）　、２−メチルイミダゾール（１ｍＭ）およ びモルホリン（１０ｍＭ）を含有する数種の他の試験化合物は、視覚的にフロニ ーを色相変化させたが、それは増殖を害することな（、カロチノイド組成が変化 していることを示した。しかしながら、これらの変化はアスタキサンチンが増加 したのではないため、さらに色素組成の変化における分析は実施しなかった。

さらに、発明者らは、ピー・ロドジマを、セノイルトリフルオロアセ）ン（ｔｈ ｅｎｏｙｌ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）　（ＴＴＦＡ）　、アンチマ イシンＡおよびシアン化ナトリウムを含有する数種の電子伝達阻害剤で処理する ことを試みた。天然のピー・ロドジマは、実質的に低濃度のアンチマイシンＡお よびＴＴＦＡにより死滅したが、シアン化物およびアジドに対して比較的不感性 であることが判明した。

上記広範な実験の結果、発明者らは、ピー・ロドジマのコロニーが生成され、そ のフロニーが高アスタキサンチン含量により特徴付けられる驚くべき方法を見い だした。本発明の方法によって得られるピー・ロドジマは非復帰性であり、アス タキサンチンが天然のピー・ロドジマよりもより効果的な飼料および色素補足で あるに充分なくらい高濃度にて酵母中に存在し、アスタキサンチン発酵を商業上 可能なアスタキサンチン生産方法とするに充分な量のアスタキサンチンを生産す ることが可能な酵母のコロニーを得ることができる。

さらに詳しくは、発明者らは、天然のまたは突然変異株のピー・ロドジマを、代 謝経路阻害剤、特に第１呼吸経路阻害剤の存在下で、第２呼吸経路を作動させる 薬剤または環境条件のような影響の存在下、または選択剤、とりわけ選択剤とし て抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド合成経路阻害剤を用いる 形態学的選択条件下にて増殖させることにより、高着色ピー・ロドジマの定方向 および特異的選択性が得られることを見いだした。例えば、ピンク色酵母のピー ・ロドジマを、抗生物質、チトクロームＢ阻害剤、またはテルペノイド合成経路 阻害剤含有の寒天上に置き、１〜２ケ月後、高着色の縦方向パビラに発育し、非 色素形成の滑らかな底面により特徴付けられる普通でない形態のコロニーを得た 。該パピラを単離し、精製し、つづいて振盪フラスコにて色素形成を試験し、各 突然変異体が、親の天然単離体と比較してアスタキサンチン含量を３〜６倍増加 させることが証明された。

選択された子孫の一つ（（ＩＧＩ−８８７ＪＯ）；図２および添付したテキスト 参照）は生理学的に特徴付けられる。該突然変異体は種々の窒素源にてゆっくり と生長し、数種の炭素源にて低細胞収量を示した。それは、アンチマイシンＡお よびＴＴＦＡのような呼吸阻害剤に対して高感受性を示したが、シアン化物また はアジドに対する感受性においては天然の単離体と異ならなかった。それは過酸 化水素による殺菌に対してより感性であった。薄層クロマトグラフィーを用いる カロチノイド分析は、親中には存在しない２つの未知のカロチノイド、ならびに カロチンおよびシス−アスタキサンチンの蓄積増加を示した。

抗生物質選択剤は、例えば、１種またはそれ以上のアンチマイノン、ツニカマイ シン（ｔ、ｕｎ　ｉｃａｍｙｃ　ｉｎ）および二スタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ） を包含する。アンチマイシンはまた、電子伝達阻害剤またはチトクロームＢ阻害 剤としても分類することができる。選択子孫の色素形成を強化する他のチトクロ ームＢ阻害剤は、例えば、２−ｎ−ヘプチル−４−ヒドロキシ−キノリン−Ｎ− オキシド（ＨＯＱＮＯ）を包含する。テルペノイド合成経路阻害剤は、例えば、 メツ釦ン酸ラクトンを包含し、それは一般に代謝阻害剤と称されてもよく、ステ ロール阻害剤の一例である。

選択剤、例えば、アンチマイシンの濃度は、酵母麦芽エキス培地（ＹＭ）プレー トにおいて、好ましくは１〜１００μＮ１の範囲、さらに好ましくは３０〜８０ μＭ１最も好ましくは、最も特徴的なコロニーを生成するには、約５０μＭであ る。

ビー・ロドジマに対する抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド合 成経路阻害剤の作用は意外であり、さらに特有の基礎をなす機構を解明しなけれ ばならない。抗生物質、チトクロームＢ阻害剤、またはテルペノイド合成経路阻 害剤の選択に付されたビー・ロドジマが高色素含量のコロニーを生産し、一方、 ＫＣＮ、ロチノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）　、Ｔ　Ｔ　Ｆ　Ａ等を包含する呼吸阻 害剤のような他の薬剤で行った実験では、ＹＭプレート上のまたは液体増殖培地 におけるビー・ロドジマの色素形成に対して有意に影響しないことは意外なこと である。

本発明者らは、ビー・ロドジマにおけるアンチマイシンの作用を説明しうる仮説 を展開するが、この仮説は推測的であり、本発明の範囲に影響を与えるとするべ きではない。

本発明者らは、ステロール合成において生じるような、環化およびヒドロキシル 化はチトクロームＰ４５０に依存しており、アンチマイシンのようなチトクロー ムＢ阻害剤が、ｃｙｔ、Ｐ２Ｓ５になるチトクロームであるチトクロームＢと反 応するため、おそらくアンチマイシン突然変異体の色素形成増加はｃｙｔ、Ｐ２ Ｓ５の機能または活性の変化によるものである。この分子はグルタミン・シンセ ターゼを不活性化することが知られており、、これは観察される窒素異化作用の 遅延によるものであるかもしれない。さらに、該仮説の論考は、アンら（Ａｎ　 ｅｔ　ａｌ、）　、ｒアスタキサンチン量を増加させるファフィア・ロドジマ突 然変異体の単離コにおいても示されている。

最近の研究は、この技法がビー・ロドジマで繰り返し行うことができることを確 認している。

抗生物質、チトクロームＢ阻害剤、またはテルペノイド合成経路阻害剤選択が該 プロトコルに包含される限りは、天然の、または抗生物質、チトクロームＢ阻害 剤、またはテルペノイド合成経路阻害剤選択の酵母細胞に、選択の前、後、また は前および後に、または所望数のまたは組み合わせの突然変異および選択工程に て付加的に突然変異原を照射してもよい。

突然変異原または突然変異誘発剤は、種々の化学物質または他の照射より選択す ることができ、好ましくは非復帰突然変異を引き起こすに十分強力なものである 。変性が観察されない突然変異体が工業的使用には非常に望ましい。強力な突然 変異原は、エチルメタンスルホネート、ニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ− 二トローＮ−二トロソーグアニジン）、亜硝酸（ただし、比較的高量を必要とす るかもしれない）、有意な量の紫外線照射、Ｘ−線等を包含する。

その利用容易性、比較的強力な突然変異誘発特性および操作が比較的容易かつ安 全であるため、ニトロソグアニジンおよびＵＶが好ましい。しかしながら、当該 分野にて公知の量および照射法を用い、どのような強力な突然変異原を用いても よい。

ある場合には、弱い突然変異原と強力な突然変異原とを組み合わせることができ る。弱突然変異原には、２−アミノプリン、ｔ−ブロモウラシル、ヒドロ牛ジル アミン、重亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。

現在における高アスタキサンチン生産株を生成する突然変異および選択の順序を 図２に示す。図２に関して、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジンＡ ＴＣＣＮｏ、２４２３０より得られる天然の親６７−３８５は、６日培養にて２ ００〜６００μｇ／ｇ乾燥重量酵母を有することが検定された。８７−３８５を アンチマイシン選択に付し、ＩＧＩ−８８７ＪＯと称される高着色子孫を得た。

基部コロニーから切開された第１の突然変異体パピラ（ＰａＰｉｌｌｕｓ）は合 計約７００μｇのカロチノイド７ｇ酵母を含有し、それに対して親株は３００〜 ４００μｓ／ｇを有した。ＩＧＩ−８８７ＪＯは、６日培養にて９６０μｇ／ｇ 乾燥重量酵母のアスタキサンチン含量を有することが検定された。ＩＧＩ−８８ ７ＪＯをアンチマイシン５０μＭ含有のＹＭ寒天に戻し、第２代のアンチマイシ ンコロニーを選択した。これらのうちの１つは１２００Ｊｇ／ｇを生産し、他は １４５０Ｊｇ／ｇを生産した。したがって、アンチマイシンＡがピー・ロドジマ の着色変異体単離用の優れた選択剤であることは明らかである。

ＩＧＩ−８８７ＪＯをニトロソグアニジン（Ｎ　Ｔ　Ｇ）突然変異に付し、合計 １２００〜１５００μｇのカロチノイド７ｇ酵母を生産するＩＧＩ−８８７Ｊ２ を得た。さらに、ＩＧＩ−８８７Ｊ２をアンチマイシンで選択してＩＧＩ−８８ ７Ｊ　ｌを得、それは６日培養１ニア７００〜１１００μｇのアスタキサンチン 含量／ｇ乾燥重量酵母を有することを検定した。第２のＮＴＧ突然変異誘発はＩ ＧＩ−８８７Ｊ３子孫を生産した。

ＩＧＩ−８８７Ｊ３のコロニーを精製した後、該単離体を白色および着色コロニ ーに分離した。白色復帰突然変異体をＩＧＩ−８８７Ｊ４と称した。淡色コロニ ーは５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムではほとんど増殖せず、高濃度の硫酸アンモニ ウム（２０ｇ／］）にてわずかに増殖し、培養基上、グルタメートまたはグルタ ミンで良好に増殖した。これらの結果は、該株が窒素代謝において前進的に損な われ、それが培養速度を制限していることを示唆している。

ＩＧＩ−８８７Ｊ４、ＩＣｌ−１８８７Ｊ３の白色分離体をニトロソグアニジン 突然変異に付した後、ＩＧＩ−１２８７Ｊ　１を単離した。ＩＧＩ−１２８７Ｊ 　１は、６日培養に７９００〜１４００μｇ／ｇ１４００Ｊ母を含有することが 検定された。この株もまた、窒素代謝にて損なわれた。株ＩＧＩ−８８７Ｊ３お よびＩＧＩ−１２８７Ｊ１はエタノール上にて増殖しないが、従来の突然変異体 は増殖することに留意すべきである。

ＩＧＩ−８８７Ｊ２をＮＴＧ突然変異誘発に付してＩＧＩ−２８８０８６０を得 、それは６日培養にて１７００Ｊｇ／ｇ乾燥重量酵母を含有することを検定した 。

アンチマイシン突然変異体の特性 親株（６７−３８５）、ＩＧＩ−８８７ＪＯおよびＴＧＩ−８８７Ｊ２は、窒素 源としてアンモニウム、グルタメートまたはグルタミンを用い、はぼ等しい菌体 収率を有した。しかしながら、培養速度の分析は、一連の株がこれら窒素化合物 上にて前進的にゆっくりと増殖することを示した。これらのデータは、窒素利用 の割合または効率がアンチマイシン突然変異体にて損なわれていることを示唆す る。

該親および２種の研究した突然変異体は、４種の試験炭素源において菌体収率を 減少させたが、さらに高い色素形成を示した。さらには、該アンチマイシン突然 変異体はグルコースを発酵させ、有意なエタノールデヒドロゲナーゼ活性をも有 した。しかしながら、ＩＧＩ−８８７Ｊ２はもはやエタノール上では増殖せず、 スクシネートを包含する他の呼吸基質での菌体収率を減少させた。エネルギー源 における収率減少および電子伝達鎖用アンチマイシンによる阻害特異性は、着色 突然変異体における呼吸またはミトコンドリア機能が変化したことを示唆してい る。

該突然ＲＸ　体の、アンチマイシンＡ１上オニルトリフルオロアセチン、ナトリ ウムアジド、過酸化水素およびシアン化ナトリウムを包含する呼吸阻害剤に対す る感受性を試験した。これらの阻害剤は種々の呼吸鎖部位に影響を与えた。意外 にも、アンチマイシン誘発突然変異体はＹＭプレート上の、およびまた液体培地 におけるアンチマイシンＡに対してより感性であった。親株はアンチマイシン１ ｏＯμＭで約５０％生存したのに対して、該突然変異体は約６０μＭｔ’死滅し た。ＹＭ寒天上のＩＧＩ−８８７ＪＯおよびＩＧＩ−８８７Ｊ２集団の５０％を 殺菌するアンチマイシンの濃度は、各々、約１８および３μＭであった。突然変 異体は液体培地にてさらに感受性であり、約０．５ｇＭのアンチマイシン濃度に て死滅した。

これらの結果は、明らかに、淡色コロニーから発生した着色バビラがアンチマイ シン含有のプレート上にて単離された場合であっても、それらは該薬剤に対して 実質的により感受性であることを示す。

該寒天からのパビラの空間的分離は、より感受性である株の生産を促進すること は明らかである。

該突然変異体はまた、ＴＴＦＡおよび過酸化水素を包含する他の呼吸阻害剤に対 しても感受性であるが、シアン化物に対してほんのわずかにより感受性であり、 アジドに対する感受性と変わらなかった。これらのデータは、アンチマイシン単 離株が変性呼吸路を有するという前記仮説を支持し、障害が該鎖の初期部位、チ トクロームｂの近辺に生じているかもしれないことを示唆している。

突然変異体のカロチノイド組成については、アンらの「アスタキサンチン量を増 加させるファフィア・ロドジマ突然変異体の単離」参照。

適当な微生物培養を保証し、細菌転換法にて細胞による炭素エネルギー源の吸収 を最大にし、発酵培地における最大細胞密度での菌体収率を最大にするには、飼 料培地中に適当量の栄養源およびミネラルを供給することが必要である。

発酵体の組成は広範に変化し、酵母株、用いる基質および発酵体（すなわち、液 体と細胞の合計）中のミネラル含量にいくらかは依存している。以下の表におい て、発酵体中における種々の元素の濃度の最低限、広範な範囲、および好ましい 範囲を示すが、該１度は元素濃度として表されており、各々のすべてはまたは一 部は適当なイオン形にて、またはＰのようなケースにて、ホスフェートのような ある種の結合形にて存在しうろことを認識すべきである。各元素量はグラムまた は発酵体く細胞含有の水相）１リツトル当たりのミリグラムにて表されている。

発酵体１リツトル当たりの元素重量 元素　最低限　広範な範囲　好ましい範囲Ｐ　０．２　ｇ　０．２〜５ｇ　０． ４〜２ｇＫ　０．１ｇ　０．１〜３ｇ　０．１〜０．７ｇＭｇ　０．１５ｇ　０ ．１５〜３ｇ　０．３〜１．２ｇＣａ　０．０６ｇ　０．０６〜１．６ｇ　０． ０８〜０．８ｇＳ　０．１　ｇ　０．１〜８ｇ　０．２〜５ｇＦｅ　Ｏ，５ｍｇ 　０．５〜３０ｍｇ　０．６〜２０ｍｇＺｎ　２ｍｇ　２〜１００ｍｇ　３〜４ ０ｍｇＣｕ　０．６ｍｇ　０．６〜１６ｍｇ　１〜］ＯｍｇＭｎ　０．８ｍｇ　 ０．８〜２０ｍｇ　０．９〜８ｍｇ本発明を実施する方法、さらには本発明の特 徴および利点は以下の実施例から明らかである。該実施例は、本発明の本質の理 解を促進する目的に供されるものである。該実施例における条件および専門用語 が特異的であるとしても、それが本発明の範囲を限定するのに用いられていると 認識すべきではなく、かかる変形および本発明の本質の修飾および応用は、当該 分野において通常の知識を有する者により容易に予想される。

実施例における天然林は、公認の寄託機関、メリーランド州、ロックビルのアメ リカン・タイプ・カルチャー・フレクシランから、所定のＡＴＣＣＮｏｓ、２４ ２３０および２４２０２を入手した。該ＡＴＣＣの明示は、各株の２つの寒天斜 面培養物が公認の寄託機関で寄託されていることを示すものである。

突然変異誘発 実施例１：紫外線突然変異誘発 ｒＧＩ　２８８０Ｂ６０株を、細胞のセライン懸濁液から１２インチ離して、１ 分間（９５，３％殺菌）、３分間（９９，４％殺菌）および５分間（９９，９９ ％殺菌）、殺菌性ＵＶランプの紫外線で突然変異誘発に付した。突然変異誘発の 期間後、１時間、該突然変異誘発細胞を暗所に保持し、数倍の希釈度にて酵母麦 芽エキス培地（ＹＭ）上にプレートした。プレートを２０℃にてインキュベート した。

暗赤−橙色コロニーを観察される色素形成差に基づいて単離し、スラントにスト リークした。

実施例２：ニトロソグアニジン突然変異誘発株１２８７Ｊ１をＹＭにて４８時間 培養ｌ、た。細胞を遠心分離によりペレット状をし、上澄液を捨て、該細胞を０ ．１Ｍシトレート緩衝液（ｐＨ５，０）中に再度懸濁させた。細胞を振盪するこ となく、室温にて２５分間、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）１００μｇ／ｍｌで 処理した。該懸濁液を遠心分離に付し、上澄液を除染し、該細胞を０．１Ｍリン 酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で３回洗浄した。

ペレットをリン酸塩緩衝液に懸濁させ、ＹＭ２０ｍｌＭ有のフラスコ中にて希釈 し、−夜振盪した。細胞をＹＭ上にプレートし、２０℃にてインキュベートした 。解剖顕微鏡の下で観察される暗赤色がかった橙色により特徴付られるコロニー を選択し、該コロニーを色素形成差に基づいて単離し、スラントにストリークし た。３日齢のスラントを用いてＹＭフラスコを接種した。ＹＭ培培地１ｍ合用い 、該スラント内容物を懸濁させ、この全懸濁液をＹＭ２０ｍｌＭ有の２５０ｍ１ フラスコに加え、２０℃にて６日間振盪した。

前記工程１（ａ）にて記載されているＮＴＧ突然変異誘発の、または非突然変異 誘発のいずれかの株ＡＴＣＣ２４２３０の指数的に増殖する酵母細胞を、アンチ マイシンＡ（アンチマイシンＡ、およびＡ、の混合物；ジグ７−カタログ＃２０ ０６）５０Ｉｉｍ含有のＹＭ培地上にプレートし、２０℃にてコロニーが増殖す るまでインキュベートした。培養を約１カ月間行った。２週間以上インキュベー トした後、フライド・エラグ（ｆｒｉｅｄ　ｅｇｇ）が出現しているコロニーに おいて赤色中心が現れた。この赤色中心を７Ｍ培地に単離した。

絶倒４：ツニカマイシン処理 ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）　５　ｉｔ　ｇ／ｍ　Ｉを有するＧ ＹＥ寒天の傾斜プレート上、（天然の）株ＡＴＣＣ２４２０２のｌｏｇ相培養物 をプレートすることによりツニカマイシン突然変異体を選択した。これらの第２ プレート上にて培養したコロニーを、ツニカマイシン５および８μｇ／ｍｌ含有 のＧＹＥ寒天プレートにストリークした。対照は２７０μｇ／ｇであり、それに 対して８μｇ／ｍｌのツニカマイシン耐性突然変異体では６１０μｇ／ｇであっ た。

実施例５：二スタチン処理 ＡＴＣＣ２４２０２株のｌｏｇ相ＹＭ培養物を、二スタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ ）　３および５μｇ／ｍｌ含有のＹＭ７ラスコに接種することにより二スタチン 突然変異体を単離した。４８時間後、これら選択培養物をＹＭ寒天と二スタチン （３および５μｇ／ｍｌ）含有の抗生作用プレートにプレートした。得られたコ ロニーを色素について検定した。対照は２７０μｇ／ｇであり、それに対して高 ニスクチン突然変異体では４００μｇ／ｇであった。

実施例６：メバロン酸処理 株ＡＴＣＣ２４２０２をＮＴＧで生存５０％まで突然変異誘発に付し、７Ｍ培地 にプレートした。コロニーを５ｍＭのメバロン酸ラクトン含有のＹＭ寒天にラン ダムにプレートした。これらすべてのコロニーを第１に１０、ついで２５ｍＭの メバロン酸ラクト、ン含有の培地に続けて移した。メバロン酸ラクトン２５ｍＭ にて培養させたコロニーを色素について検定した。対照は２７５μｇ／ｇであり 、それに対して２５ｍＭメバロン酸ラクトン耐性突然変異体では５４コロニーは 色素含量について以下のように分析することができる。

培養培地３０ｍ１から採取した後、細胞を水中にて洗浄し、水３０ｍ１中に再度 懸濁させる。光学濃度を測定して生長度を決定する。

該懸濁成約１３ｍ１を、ビーズ・ビータ−（Ｂｅａｄ　ＢｅａｔｅｒＳＢｉ。

５ｐｅｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、　ＯＫ）にて冷却し ながら、０゜５ｍｍのガラスピーズで３〜４分間粉砕する。粉砕後、ビーズ／細 胞混合物をビーカーに入れ、アセトン１０ｍ１部で５×抽出する。

該アセトン抽出液をプールし、１５０００ｒｐｍで４５分間遠心分離に付す。清 澄なアセトン上澄液を細胞ペレットより流出させる；該ペレットが残りの色素を 有している場合、それをガラスホモジナイザーを用いて手動で粉砕し、さらにア セトンで抽出する。

合したアセトン抽出液を分離漏斗中に合し、約１０ｍ１の石油エーテルを、なら びに数ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液を加え、エマルジョンの解消を助ける。ベ トロール抽出液を収集し、アセトン層を再度抽出する。該ベトロール抽出液を合 し、ガラスウールを介して濾過し、脂質小球体および他の粒子物質を除去する。

吸光度スペクトルを記録する（石油エーテル中のトランスアスタキサンチンの最 大吸光度は４７４ｎｍである）。カロチノイドの合計組成を１％死滅係数＝２１ ００を用い、式： 力ロチノイド合計（μｇ／ｇ酵母）＝ （ｍｌベトロール）（４７４ｎｍ吸光度）（１００）／（２１）（乾燥重量酵母 ［ｇ］） により算定する。

個々のカロチノイドは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および電子吸光スペク トルにより分析することができる。分析用のカロチノイドエキスを調製するには 、石油エーテル抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、窒素流にて蒸発させる ことにより濃縮して調製する。これらを、２０％アセトン／８０％石油エーテル を用いるシリカゲルプレート（シリカゲル６０．５Ｘ２０ｄｍ、０．２５ｍｍ厚 ）　（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ ）上のＴＬＣによりクロマトグラフィーに付す。展開後、バンドをこすり落とし 、ガラスウール充填のパスツール・ピペット（Ｐ　ａｓｔｅｕｒ　Ｐ　１ｐｅｔ 、）を介してアセトンで溶出する。色素の同定には、最大吸光度のｒｒ値と標準 体との共同クロマトグラフィーを用いる。可視吸収スペクトルをギルホールド・ レスポンス・スペクトロフォトメーター（Ｇ　１Ｈｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　 ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてアセトンまたはベトロールにて 記録し、デービス（Ｄａｖｉｅｓ）のカロチノイド（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ） 　、３８〜１６５頁、植物色素の化学および生化学、第２巻、ティー・タブリュ ー・グツドウィン（Ｔ、Ｗ、　Ｇｏｏｄｖｉｎ）編、アカデミツク・プレス、ロ ンドン（１９７６）にてリストされている化成光係数を用いて算定する。

１０リツターの実験用発酵槽中におけるアスタキサンチンの生産は、以下の操作 に従って行う； 冷凍したファフイア・ロドジマ株ＩＧＩ−８８７Ｊ　１　（２０ｍｌ）（図１お よび添付テキスト参照）を用い、３％グルコース、１％酵母エキスおよびＯ１％ カゼイン氷解物からなる培地３００ｍ１に接種した。接種する前に、該培地を１ ２１℃および１５ｐ、ｓ、ｉ。

にて約２０分間滅菌した。該接種培地を、１インチのストロークを有するロータ リーシェーカー上、２５　Ｏｒ、　ｐ、ｍ、の速度で、２０°Ｃの温度にて約４ ８時間振盪した。細胞ブロス３００　ｒｎ　Ｉを用い、１リツター当たり以下の 組成を有する滅菌シード培地３す、ター含有の５リツターのシード発酵槽を接種 した。

硫酸アンモニウム　５．０ −塩基性リン酸カリウム　１．５ 硫酸マグネシウム・ヘプタ水和物　１．５塩化カルシウム・ジ水和物０．１ 酵母エキス　６．０ ビタミン混合物　２ｍｌ 微量元素混合物　１ｍｌ ビタミン混合物は以下の成分からなる：チアミン　５．００ カリシラム・パントセ＊−）　２．００ビロキシジンＨＣＩ　２．２５ 水　ｌリッターまで適量 微量元素混合物は以下の成分からなる：１）ＦｅＣ１，−ｇＨ２Ｏ３ ２）Ｎａ＊ＭｏＯ４’２ＨｔＯ２ ３）ＺｎＳＯ，・７Ｈ，０８ Ｍｎ５Ｏ，・Ｈ，０３ ＣｕＳＯ，・５Ｈ，０６ 水を適量加え１リツターにする。

接種後、７０％セレローズ（ｃｅｒｅｌｏｓｅ）溶液を発酵槽に増加的に送り込 み、細胞の比増殖速度を約ｕ＝ｏ、　１５に保持した。該発酵槽は温度２０’Ｃ に維持し、ｐＨを調整した。

高濃度のコーン浸液（１２ｇ／Ｉ）を除いては、該生産培地の組成は第１段階シ ード培地と同じであった。温度を２１℃に維持し、ｐＨを８Ｎ　ＫＯＨで５に調 整した。初期の１５時間の間の２５０Ｌ／分での通気を３０　ＯＬ／分に上げた 。初期の１５時間の間の１５　Ｏｒ、　ｐ、ｍ、での撹拌を２０　Ｏｒ、　ｐ、 ｍ、に上げた。７０％セレローズ、７％硫酸アンモニウムの滅菌溶液を発酵槽に 増加的に送り込んだ。細胞の比増殖速度を約０．１にて調整した。セレローズ３ ０ｋｇを発酵槽に送り込んだ後、細胞を採取した。該細胞は約１０００μｇ／ｇ のアスタキサンチンを有した。

アスタキサンチン生合成の強化 さらには、アンチマイシンまたは第１呼吸鎖の別の阻害剤をファフィア・ロドジ マ細胞に加え、該細胞を光に照射した場合、酵母のアスタキサンチン含量がかな り増加することが判明した。この現象の基礎をなす機構は理解されていないが、 第１の呼吸経路が阻害されると、光がアスタキサンチン生産をかなり刺激する作 用を有する第２の呼吸（酸化）経路の誘因として作用すると仮説することができ る。したがって、本発明は、代謝経路阻害剤の存在下にて第２呼タキサンチンま たは他のカロチノイド含量を増加させる方法を包含する。第２の呼吸経路は、光 、ストレスを引き起こすことが公知のある種の環境条件、栄養素等の影響により 刺激することができる。

しかしながら、本発明は上記仮説により制限されるものではない。

前記の呼吸鎖阻害剤と第２呼吸経路の開始とを組み合わせることによりアスタキ サンチン生合成の強化が誘発されることが、以下の実験かられかるであろう。

実施例９ 使用するビー・ロドジマ株は、天然の単離体、ＵＣＤ−ＦＳＴ−８７−３８５（ ファフら（Ｐｈａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、）　、１９７２　；ミラーら（Ｍｉｌｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、１９７６）　、前記使用の突然変異体Ａｎｔ−１−４、 および株１Ｂ−１３−６、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘発操 作に従って得られたアスタキサンチン増加突然変異体（ＹＭ寒天にて単離）であ った。該株を温度調節１．たインキュベーター／シェーカー（エンピロン−シェ ーカーモデル３５９７　（Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ−３ｈａｋｅｒ　Ｍｏｄｅｌ）　、 　Ｌ　ａｂ　−Ｌ　ｉｎｅ　Ｉ　ｎ５ｔｒｕｉｅｎｔｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｍｅｌｒｏｓｅ　Ｐａｒｋ、Ｉ　Ｌ）中、前記（アンら、１９８９ ）と同様に、酵母工牛ス／麦芽エキス／ペプトン／グルコース培地（ＹＭ培地、 Ｄｉｒｃｏ　Ｃｏ、、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）にて培養させた。洗浄細胞懸 濁液の光学密度（６６０ｎｍ）を測定することにより増殖度を決定した；１ｍｇ の乾燥細胞重量／ｍｌがＯ，Ｄ、１．３５に相当する。

フラスコ培地表面から２０〜４０ｃｍを保持した２本のシルバニア２０ワット・ クールホワイト蛍光灯（Ｓｙｌｖａｎｉａ　２０　ｗａｔｔＣｏｏｌ豐ｈｉｔｅ ）を用いて光を照射した。フラスコに活性的に増殖する酵母約１０１〜１０１個 の細胞を接種した。対照の暗所の場合、フラスコをアルミニウムホイールでラッ プした。不溶性の化学物質が培地中に含まれている場合、それらをまず、酵母増 殖または色素形成に影響を与えない少量のエタノールに溶かした。

カロチノイド抽出お−に切盆近 抽出前、ピー・ロドジマをフラスコ中にて５日間培養した。酵母を遠心分離法に より液体培地より採取した。該酵母細胞を蒸留水に懸濁させ、水で洗浄し、抽出 し、前記（アンら、１９８９）と同様にして薄層クロマトグラフィーおよび吸収 分光分析法によりカロチノイドについおて分析した。

第２呼吸経路刺激のカロチノイド生産の増加ビー・ロドジマ天然単離物、ＵＣＤ −ＦＳＴ−６７−３８５およびそのアンチマイシン感性突然変異体、Ａｎｔ−１ −４および１８−１３−６の表面から２０ｃｍに位置する２本の２０ワツトの蛍 光球の影響を研究した。

各培養物を、（ａ）合計３０時間の暗さく以下、暗所という）、（ｂ）アンチマ イシン０．２μＭと一緒に合計の暗さく接種の際にアンチマイシンを導入）（以 下、暗所／アンチマイシンという）の条件下、および実験に約３０時間から実験 に約６０時間まで培養物を光にさらす以外、（ａ）および（ｂ）と同様の条件（ Ｃ）および（ｄ）下（以下、明所および明所／アンチマイシンという）にて増殖 させた。

より多量のシス−アスタキサンチンとより少量のカロチン濃度がが明所増殖細胞 にて存在することが解った以外、色素抽出および特性は、該色素が組成において 定性的に同様であることを示した。

酵母分析は、明所／アンチマイシンのビー・ロドジマＵＣＤ−ＦＳＴ−６７−３ ８５のカロチノイド含量が、暗所、暗所／アンチマイシンまたはこの天然単離物 の明所培養物のいずれに対しても２倍まで増加していることを示した（表１）。

表２は、アンチマイシン感受性である突然変異体１８−１３−８が、明所培養物 よりもアンチマイシン／明所において、力ロチ／イド含量の２倍増加を引き起こ すことを示している。

表　１ 条件　増殖　カロチノイド （ｍ　／ｍｌ）　、（μ　／ｌ工−−−暗所　４．４　５２０ 暗所＋Ａｎｔ　Ｌ、６　４８０ 明所　３．３　４４０ 明所＋Ａｎｔ　２．２　１０００ 表　２ アンチマイシン　非添加　添加 明所　カロチノイド含量（μｇカロチ／イド／ｇ酵母）白色　５４０　１４１０ 青色　１０５０　１３６０ 赤色　９８０　１２１０ 暗所　８３０　１０１３ 上記結果から解るように、天然およびアスタキサンチン増加ビー・ロドジマの増 殖およびカロチノイド形成は、光によって明らかに影響を受けている。天然単離 体、ＵＣＤ−ＦＳＴ−６７−３８５、およびそのアンチマイシン感受性突然変異 体Ａｎｔ−１−４および１８−１３−６は、各々、より良好に増殖し、暗所にお いても色素形成を増加させたが、光による影響とは違っていた。

食品および色素源としてのファフィア 採取した細胞は、機械的または手動手段またはその組み合わせを用いて粉砕する か、または破壊し、全栄養飼料の一部としてサケ科の魚に与えることができる。

熱および空気に対する粉砕または破壊した酵母のアスタキサンチンの安定性を増 加させるために、食品分野において通常用いられる保護コーティングまたはマト リックス、例えば、天然ガムを使用することが好ましい。

食品補助剤としてビー・ロドジマを、ニジマス（サルモ・ガイルドネリ（Ｓ　ａ ｌｓｏ　ｇａｉｒｄｎｅｒｉ）　、アメリカ・ロブスタ−、コリンウズラ（Ｃｏ ｔｕｒｎｉｘ　ｑｕａｉｌ）および産卵鶏に使用する例が、デービス（Ｄ　ａｖ ｉｓ）でのカリフォルニア大学、共同発明者であるジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｏ ｎ）の修士論文、表題「酵母ファフィア・ロドジマによるアスタキサンチン生産 およびその動物飼料における色素源としての使用」　（ここに提出したコピー） に記載されている。

本発明に従って得られた酵母における、乾燥基準での細胞単位当たりの高アスタ キサンチン含量の結果として、色素形成を誘発するのに用いられる酵母量は、実 質的に減少させることができる。

前記具体例のデザインまたは操作において、該発明方法を種々の操作要求に適合 させるように変形してもよく、それらはすべて、本発明の範囲および精神の範囲 内である。

ファフィア・ロドジマにおける エチネノン（Ａ）、３−ヒドロキシェチネノン（Ｂ）、フエオニコキサ〉チン（ Ｃ）およびアスタキサンチン（Ｄ）ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ　、３゜ ＦＩＧ、３ｂ 国際：Ｊ！舟報告 ｌＡ＋−１４〜゛−““″″″　ｐＣＴ／Ｉｔ！；８Ｑ１０３３２７

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド合成経路阻害剤含有の 栄養培地において、ファフィア属の微生物を培養することからなることを特徴と する高アスクキサンチン含量を有する酵母の生産方法。
2. ２．抗生物質がアンチマイシン、ツニカマイシンおよびニスタチンからなる群よ り選択される請求項１記載の方法。
3. ３．チトクロームＢ阻害剤がアンチマイシンおよび２−ｎ−ヘプチル−４−ヒド ロキシ−キノリン−Ｎ−オキシドからなる群より選択される請求項１記載の方法 。
4. ４．テルペノイド合成経路阻害剤がメバロン酸ラクトンである請求項１記載の方 法。
5. ５．培地中の抗生物質またはテルペノイド合成経路阻害剤の濃度が１μＭと１０ ０μＭの間にある請求項１記載の方法。
6. ６．ファフィア属の微生物を形態学的選択の前、後、または前後のいずれかにて 突然変異誘発に付す請求項１記載の方法。
7. ７．採取酵母におけるアスタキサンチンが、酵母細胞の乾燥重量に基づき、１０ ００ｐｐｍまたはそれ以上である請求項１記載の方法。
8. ８．ファフィア属と同定される特徴を有する酵母であって、天然のファフィア属 の、または抗生物質選択剤またはテルペノイド合成経路阻害剤含有の培地を用い て培養した天然ファフィア属の突然変異体の少なくとも１回の形態学的選択工程 によって得られることを特徴とする酵母。
9. ９．サケ科の魚の身または皮、家禽の肉または卵黄の色素形成を増加させるに十 分な量の粉砕した形の請求項１記載の方法により得られる酵母を、該サケ科の魚 または家禽に与えることを特徴とするサケ科の魚の身またはその皮、家禽の肉ま たは卵黄の色素形成を増加させる方法。
10. １０．抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド合成経路阻害剤含有 の栄養培地において、ファフィア属の微生物を１回またはそれ以上培養し、生存 している色素形成増加を示す微生物を培養し、培養した酵母を採取し、アスタキ サンチンを抽出することからなることを特徴とするアスクキサンチンの　ｉｎ　 ｖｉｖｏ　生産方法。
11. １１．さらに、抗生物質、チトクロームＢ阻害剤またはテルペノイド合成経路阻 害剤含有の栄養培地において、該培養のうちのいずれかの培養の前または後のい ずれかにて、ファフィア属の微生物を少なくとも１回、突然変異に付すことから なる請求項１０記載の方法。
12. １２．第２呼吸（酸化）経路を作動させる影響の下、代謝経路阻害剤の存在下に て該酵母を増殖させることからなる高アスタキサンチン含量を有する酵母の生産 方法。
13. １３．代謝経路阻害剤が第１呼吸経路阻害剤である請求項１２記載の方法。
14. １４．第１呼吸経路阻害剤がアンチマイシンである請求項１３記載の方法。
15. １５．第１呼吸経路阻害剤の存在下で、第２呼吸（酸化）経路を作動させる薬剤 の存在下または環境条件の影響下にて、請求項１において得られた酵母を増殖さ せることからなる高アスタキサンチン含量を有する酵母の生産方法。
16. １６．第１呼吸経路阻害剤の存在下で、第２呼吸（酸化）経路を作動させる薬剤 の存在下または環境条件の影響下にて、酵母を増殖させることによって別のオキ シダーゼ系を包含することからなる高アスクキサンチン含量を有するピー・ロド ジマ属の酵母の生産方法。