JPH04228064A - ファフィア・ロドジーマによるアスタキサンチン製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】　　　　　　 【産業上の利用分野】本発明は高収率でアスタキサンチ
ンを供給できる、　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａ−
ｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　高生産性菌株、　フ
ァフィア・ロドジーマの培養方法、及び魚類、甲殻類、
鳥類に対し、食物色素補充のため利用できる形でファフ
ィア・ロドジーマ中に生産されたアスタキサンチンを調
達するための方法である。 【０００２】 【従来の技術】アスタキサンチン（３，３’−ｄｉｈｙ
ｄｒｏｘｙ−β，β−ｃａｒｏｔｅｎｅ−４，４’−ｄ
ｉｏｎｅ）は、オキシカロチノイド色素で、植物及び動
物に広く分布している。甲殻類及び鮭科魚類には、顕著
なオキシカロチノイド色素である。アスタキサンチンは
、また、藻類、イースト菌（ファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の様な）及び鳥
類に見られる。 【０００３】商業的な養殖では、鮭魚類、甲殻類、鳥類
に固有に見られる、明瞭なピンク色を付与するために、
鮭魚類及び甲殻類の食餌に、アスタキサンチンを添加す
ることが望ましい。商業的な養殖により生産される鮭魚
類及び甲殻類に明瞭なピンク色を付与することは、養殖
により生産される鮭魚類、甲殻類の消費者に対する受け
を促進するために重要なことと信じられている。最近で
は、経済的な、天然のアスタキサンチン源はない。　　
　　　　 【０００４】イーストの一種、ファフィア・ロドジーマ
（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　は、　養殖
を目的とする、潜在的なアスタキサンチン源の一つであ
る。ファフィア・ロドジーマは、イースト種としてその
分類がなされて以来、高含量のアスタキサンチンを有す
ると認識されている。 （そのカロチノイド色素の最高８５％が、アスタキサン
チンである、Ｎ．Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．　
Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
　Ｖｏｌ．　２６，　ｐ．２８６　（１９７６））。　
鮭魚類及び甲殻類の食餌に、　補充として、このイース
トを使用することは、エリックＡ．ジョンソン（Ｅｒｉ
ｃ　Ａ．　Ｊｏｈｎｓｏｎ）と他の研究者により１９８
０年代初期以来、調べられている。 【０００５】商業的なアスタキサンチン源としての、フ
ァフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚ
ｙｍａ）　の開発は、高収率のアスタキサンチンを生産
しそして適切な成長特性を有するファフィア・ロドジー
マの菌株が無いことにより、妨げられていた。商業的に
使用できる、ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株の適切な成長特性とは、
野生株のファフィア・ロドジーマに匹敵する成長速度、
高い菌株の安定性、発泡性の低減、ビタミン或は他の成
長補助剤が殆ど必要無い、と言ったことを含む。加える
に、商業的なファフィア・ロドジーマ菌株は、また、常
に高レベルのアスタキサンチンを生産しなければならな
い。最近、利用可能なファフィア・ロドジーマ菌株（Ｐ
ｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　は、細胞重量１
グラム当たり３０から２０００マイクログラムを生産す
ることができる。不運にも、最近利用可能な高アスタキ
サンチン生産菌株は、商業的な発酵には採用できない野
生株のファフィア・ロドジーマに対しても、極度に低い
成長速度しか示さない。（ＷＩＰＯ出願、　ＷＯ８８／
０８０２５で報告されている、ＤＢＴ　４０３　菌株の
様に）。　このように、高レベルのアスタキサンチン（
グラム表示細胞重量に対するマイクログラム）を生産す
ると同時に、また野生株のファフィア・ロドジーマに匹
敵する成長速度を有する（６７−２１０株の様に、この
物は、　米国農務省、　北部地区研究センターより登録
番号，ＮＲＲＬ　Ｙ−１０９２１で公衆の利用に供され
ている。）菌株が開発されることは、　非常に有益なこ
とである。 【０００６】 【発明が解決すべき課題】商業的な発酵のための適切な
、ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄ
ｏｚｙｍａ）　菌株を得て、その上更に、細胞重量に対
してアスタキサンチンの収量を最高にする、ファフィア
・ロドジーマを培養するための方法が、必要となる。現
時点で、ファフィア・ロドジーマ培養中の成長について
、文献は、過剰量の砂糖が存在するとき、砂糖から、エ
タノール及びアセトアルデヒドへの代謝を避けるため、
砂糖量を制限することを薦めている。勿論、ファフィア
・ロドジーマ培養中のエタノールとアセトアルデヒドの
生成は、ファフィア・ロドジーマ細胞に対し、高い毒性
のために有害である。しかしながら、制限された砂糖に
より成長した細胞は、低レベルのアスタキサンチンを生
産し、発酵槽中に過剰の発泡を生ぜしめる副産物を放出
する。発泡は、容積に対する使用可能な発酵重量を激し
く減少させる、そして機械的又は化学的手段を使用して
管理されなければならない。従って、これら諸問題の全
て又はいくつかでも解決した、ファフィア・ロドジーマ
（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞培養の
ための方法を提供することは、現在利用可能な技術にお
いて、意義のある改良となるであろう。 【０００７】最後に、ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａ
ｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞が採取された後
、魚類、甲殻類、鳥類のため、容易に利用可能な食餌色
素補充物として（動物はファフィア・ロドジーマ細胞膜
を破ることができない）細胞内部に生成したアスタキサ
ンチンを提供できる迅速、　経済的な方法を開発するこ
とが必要である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】このように、本発明の一
面は、商業用発酵に適切である高レベルのアスタキサン
チンを生産するファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉ
ａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株を提供する。 【０００９】本発明の他の面は、高収率のアスタキサン
チンを生産するファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉ
ａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　の成長に対する改良された
方法を提供する。 【００１０】本発明の付加的な面は、内部にアスタキサ
ンチンを含有するファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆ
ｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞を、　魚類、甲殻類
、鳥類、に対する食餌色素補充剤として、提供する。 【００１１】本発明のその他の面及び本発明の利点は本
明細書により明らかになるであろう。本発明に従って、
我々は、振盪フラスコを使用し、適切な成長条件下で成
長を行い、１リットル、１時間当たり４５マイクログラ
ムから１００マイクログラムの範囲のアスタキサンチン
を生産する、新規なファフィア・ロドジーマ　（Ｐｈａ
ｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の菌株を発見し、分離
した。 【００１２】本発明の更に進んだ実施により、我々は、
発酵槽により適切な条件下で成長させたとき、１リット
ル、１時間当たり４００マイクログラムから９６２マイ
クログラムの範囲のアスタキサンチンを生産する、　新
規なファフィア・ロドジーマの菌株を発見し、分離した
。 【００１３】本発明の他の実施により、　我々は、下記
の事項から成る、高収率でアスタキサンチンを生産する
ファフィア・ロドジーマ細胞の培養方法を発見した：　
（１）適切な、栄養媒体とファフィア・ロドジーマ（Ｐ
ｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）細胞を接触させて
発酵ブロスを構成すること、 （２）培養中に、上記発酵ブロスを、少なくとも、一種
の炭素エネルギー源と接触させること、及び発酵ブロス
内に存在するファフィア・ロドジーマ細胞の成長を抑制
するエタノール量を生成しない量の、少なくとも、一種
の炭素エネルギー源と発酵ブロスとを接触させる条件下
で、炭素エネルギー源を適度の濃度で保持すること、（
３）発酵ブロス内の上記ファフィア・ロドジーマの成長
を促進させるためのＰＨ、温度、通気条件下で上記発酵
ブロスを培養すること。 【００１４】更に進んだ本発明の実施により、下記の手
段を含む食餌源のアスタキサンチンとして、鮭魚類、甲
殻類、又は家禽に利用可能なアスタキサチンの形で、ア
スタキサチンを含むファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆ
ｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞を提供する方法を
発見した。即ち、アスタキサンチンを含むファフィア・
ロドジーマ細胞と、少なくとも、ファフィア・ロドジー
マの細胞膜を部分的に消化できる能力のある、トリコデ
ルマ・ハルジアニウムからの消化力のある、酵素製剤の
有効量とを接触させることである。野生株のファフィア
・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　は成長条件に応じて、　イースト１グラム当たり３０
−８００マイクログラムのアスタキサンチンを生産でき
る。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，　Ｅ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｌｅｗ
ｉｓ，　Ｍ．　Ｊ．，　１９７９．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１１５：　１７３−１８３）こ
のレベルのアスタキサンチンの生産は意義があるが、　
一方ファフィア・ロドジーマから商業的なアスタキサン
チンの生産を行うために、アスタキサンチンの収率につ
いて、さらなる改良がなされなければならない。　　　 【００１５】ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株によるアスタキサンチン
生産性は、イースト細胞を突然変異原で処理すること、
その後、高濃度のアスタキサンチンを含んでいるコロニ
ーを生産し得る、得られた突然変異細胞をスクリーニン
グすることによる組織的な、菌株開発プログラムによっ
て改良されることができる。この方法に適した突然変異
原は、紫外線照射、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸エ
ステル（ＥＭＳ）、ジエチル硫酸エステル、１−メチル
−１−ニトロ−ニトロソグアニジン（ニトロソグアニジ
ン、　ＮＴＧ）、　ｓ−ブロムウラシル、　２−アミノ
プリン、　アクリジンオレンジ、　エチジウムブロマイ
ド、　及びこれら２種以上の組み合わせを含むが、これ
らに制限されるわけでない。これらの突然変異原は、サ
ッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、　エシェリキア・コリ　
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　の様な、他の
イースト又はバクテリアを、開発したと同様なプロトコ
ールに従って、ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉ
ａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　に突然変異を生じさせるた
めに使用することができる。　最近好まれているのは、
　ニトロソグアニジン又はＥＭＳを利用したイーストに
対する、突然変異プロトコールである。ファフィア・ロ
ドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｉｍａ）　の
様なイーストに、　突然変異を生ぜしめるのに適した技
術で、当業者に良く知られているものは、イースト遺伝
学で議論されたもの及び、実施例Ｉ，Ａ−Ｃセクション
に記載されているが、これに限られるものではない。（
Ｓｈｅｒｍａｌ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　
１９７９）。　スクリーニングは、視覚での検査、アス
タキサンチンの抽出検定法、及び改良されたアスタキサ
ンチンレベルを有するコロニーにつき、発酵学的研究に
よって達成される。突然変異が生じたファフィア・ロド
ジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　のコ
ロニーから採取した菌株は、　また、その菌株が、繰り
返し発酵中及び後でも、望ましい特性をもっていること
を確実にするためスクリーニングされるべきである。 【００１６】突然変位誘発及びスクリーニングの、何回
にもわたるテストが、アスタキサンチン製造レベル及び
成長特性に、　重大な改良がなされたファフィア・ロド
ジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｉｍａ）菌株を
開発するために必要である。　不運にも、突然変異誘発
の各テストは、改良されたファフィア・ロドジーマ菌株
を提供することにつき、漸次低い確率を持つ、突然変異
体の新しいグループを、独立して産出した。加うるに、
突然変異誘発の各テストで、望ましくない突然変異体が
生じ、改良されたアスタキサンチン製造及び望ましい成
長特性を示す菌株が、より少数になるという可能性が増
加した。数多くの回数の突然変異テスト後、ペトリ皿ス
クリーニングで高いアスタキサンチン生産能を持つ、数
種の菌が、結局、低レベルのアスタキサンチンを生産し
、許容不可の発泡レベル、又は発酵中低い成長速度を示
す様になった。下記の菌株は、ニトログアニジン、ＥＭ
Ｓ、又はこれらの組み合わせで、突然変異を生じさせら
れた、そしてアスタキサンチン製造レベルで重要な改良
がなされ、一方、望ましい発酵特性を保持しているもの
である。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　表　　Ｉフィリップス　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　アスタキサン
　　　　　　アスタキサンチ　　培養、コレク　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　チン
、含量１　　　　　　　ン、生産性２　　　　ション、
番号　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ番号　　　　　　　
　　　μｇ／ｇ　ＤＣＷ４　　　　　　　　　　　　μ
ｇ／ｌ／ｈｒ３　　 　ＰＣ　８０５５＊　　　　　　　　　　　　　Ｙ−１
０２９１　　　　　　　　　　　　　　５３０　　　　
　　　　　　　　　　　４３．２　　　　　　ＰＣ　８
０５９５　　　　　　　　　　　　　Ｙ−１８５４９　
　　　　　　　　　　　　　７２６　　　　　　　　　
　　　　　　７９　ＰＣ　８０６５５　　　　　　　　
　　　　　Ｙ−１８５５０　　　　　　　　　　　　　
　７２０　　　　　　　　　　　　　　　５６　ＰＣ　
８０７１５　　　　　　　　　　　　　Ｙ−１８５５４
　　　　　　　　　　　　　　９７７　　　　　　　　
　　　　　　　５８　ＰＣ　８０７５５　　　　　　　
　　　　　　Ｙ−１８５５５　　　　　　　　　　　　
　１６８１　　　　　　　　　　　　　　　９８　ＰＣ
　８０７７５　　　　　　　　　　　　　Ｙ−１８５５
６　　　　　　　　　　　　　１３４５　　　　　　　
　　　　　　　　４７　ＰＣ　８０８８５　　　　　　
　　　　　　　Ｙ−１８５５１　　　　　　　　　　　
　　１６２２　　　　　　　　　　　　　　　８１　Ｐ
Ｃ　８０９１５　　　　　　　　　　　　　Ｙ−１８５
５２　　　　　　　　　　　　　１９８８　　　　　　
　　　　　　　　　５２　ＰＣ　８０９３５　　　　　
　　　　　　　　Ｙ−１８５５３　　　　　　　　　　
　　　１８１１　　　　　　　　　　　　　　　５５＊
　親菌株は６７−２１０であった。　また　ＰＣ　８０
５５　としても知られている。　このものは、米国イリ
ノイ州、Ｐｅｏｒｉａ　にある、農務省、農業研究サー
ビス、北部地区研究　センターに登録番号，　Ｙ−１０
９２１で寄託され、　公に利用可能である。 １　アスタキサンチン含量は、実施例　Ｉ．Ｃ．２　記
載の方法によって、　決定された。 ２　生産性は、　実施例　Ｉ　に記載された　ＨＰＬＣ
　により決定された。 ３　菌株の培養は、　振盪フラスコを使用、　実施例　
Ｉ．Ｃ．２　に記載の方法で行った。培養は、　５日間
（１２０時間）行い、　その後採取し、　検査を行った
。 ４　ＤＣＷは乾燥細胞重量（ｄｒｙ　ｃｅｌｌ　ｗｅｉ
ｇｈｔ）の略である。　乾燥細胞重量はブロスの２５ｍ
ｌサンプルを取り、　細胞の沈降物が形成されるまで遠
心分離を行う事により決定される。　上澄液を除き、　
沈降物を脱イオン水で、　再び最終的に２５ｍｌのサス
ペンションとする。　このサスペンションを、　再び沈
降物が生成するまで、　遠心分離にかける。　上澄液を
除き、　細胞の沈降物にスラリーを形成するまで脱イオ
ン水を混合する。　そのスラリーをアルミニウム製タラ
皿に移す。　遠心分離管を脱イオン水　５ｍｌですすぎ
、　残留細胞を洗いだし、　細胞スラリーを含む皿に加
える。　その皿を乾燥オーブンに入れ８０℃、１２時間
乾燥する。　１２時間後に、　皿の重量を測定し、　皿
そのものの重量を引いて、　乾燥細胞重量を得る。 ５　ファフィア・ロドジーマ　（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈ
ｏｄｏｚｙｍａ）の分離された、　実質的に純粋な菌　
株は、　対応するＮＲＲＬ番号を付し、　ブダペスト条
約に基づいて、　米国、　イリノイ　州　６１６０４、
　Ｐｅｏｒｉａ市、　北大学ストリート１８１５、　に
所在する、　米国農務省、農業研究サービス、　北部地
区研究センターに寄託された。　　　　　 【００１７】ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株、　ＰＣ８０５９，ＰＣ
８０６５，ＰＣ８０７１，ＰＣ８０７５，ＰＣ８０７７
，ＰＣ８０８８，ＰＣ８０９１，ＰＣ８０９３の発見に
よる、アスタキサンチンの生産性の向上は、速い細胞成
長速度と結び付いた、アスタキサンチン製造レベルの増
加によるものである。 振盪フラスコ中で培養した時、これら菌株の向上したア
スタキサンチン生産性は、適切な条件下、乾燥重量基準
のアスタキサンチン量で、４５μｇ／ｌ／ｈｒ　から１
００μｇ／ｌ／ｈｒの範囲である。　望ましくは、上記
の条件下、これら菌株のアスタキサンチンの生産性は、
乾燥重量基準で、５５μｇ／ｌ／ｈｒ　から１００μｇ
／ｌ／ｈｒ　の範囲であり、最も望ましくは、　乾燥重
量基準のアスタキサンチン量で、　７８μｇ／ｌ／ｈｒ
　から　１００μｇ／ｌ／ｈｒ　の範囲であろう。　振
盪フラスコによる適切な成長条件とは、　５日間の成長
後、激しく撹拌される振盪フラスコ中で培養される、フ
ァフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚ
ｙｍａ）　菌株に対し、　最大固有成長速度を提供する
のに必要な条件として定義づけられる。本発明における
、　ファフィア・ロドジーマ　（ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈ
ｏｄｏｚｙｍａ）菌株に対する適切な成長条件とは、　
実施例により示されるように、リッチ成長検査媒体（Ｒ
ｉｃｈ　Ａｓｓａｙ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）　
の利用と２０℃から２２℃の間での激しい撹拌下での菌
株の培養である。 【００１８】同様に、これらファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株は、　ま
た、回分供給発酵条件下でも、向上したアスタキサンチ
ン生産性を示した。適切な条件下、これら菌株による、
向上したアスタキサンチン生産性は、適切な発酵槽を使
用、回分供給方式で培養されたとき、乾燥重量基準のア
スタキサンチン量は、４００μｇ／ｌ／ｈｒから９６２
μｇ／ｌ／ｈｒの範囲である。　望ましくは、適切な条
件下、これら菌株のアスタキサンチン生産性は、適切な
発酵槽中、回分供給条件下で培養したとき、乾燥重量基
準のアスタキサンチン量は、４８０μｇ／ｌ／ｈｒから
９６２μｇ／ｌ／ｈｒの範囲であろう。　適切な発酵槽
による回分供給式成長での、適切な成長条件とは、培養
されるべきファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　
ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　菌株の最大固有成長速度を保持
するために必要な条件として定義される。　本発明にお
ける、回分供給方式で培養されたときの、ファフィア・
ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）菌
株に対する適切な成長条件とは、　適切な発酵槽内で、
　（２０リットルのバイオラフイッテ　（Ｂｉｏ　Ｌａ
ｆｉｔｔｅ）　発酵槽のような）新鮮な接種物に接種す
ることを含んでいて、そこでは、発酵ブロスがバイオラ
フイッテイ媒体（Ｂｉｏ　Ｌａｆｉｔｔｅ　ｍｅｄｉａ
）であり、実施例で示されるように、発酵が完了するま
で２４時間、ＰＨが４．５から５．５の間に、　温度が
１９℃から２１℃の間に、溶存酸素含量が飽和の３０％
から８０％の間に、可測グルコース含量が１ｇｒ／ｌか
ら３ｇｒ／ｌの間に保たれているものである。 【００１９】現時点で、アスタキサンチンの製造用に望
ましい菌株は、そのアスタキサンチン製造レベル及び高
度に望ましい成長特性の故に、ＰＣ８０５９，ＮＲＲＬ
　　Ｙ−１８５４９菌株である。 【発酵】　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　
ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　は工業的な発酵に使用されるこ
とが、比較的新しい有機体である。ファフィア・ロドジ
ーマの発酵に係わる、何人かの人々は、もし炭素エネル
ギー源として、砂糖が過剰に与えられると、ファフィア
・ロドジーマ対して毒性を示すレベルにまで、アルコー
ル又はアルデヒド類が蓄積することを観察した。このこ
とは、炭素エネルギー源が成長条件を抑制するという条
件の下でファフィア・ロドジーマの成長を行うことを暗
示している。しかしながら、ファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　は炭素エネル
ギー源の規定された量に対応して、　低いアスタキサン
チン収率を与え、発酵槽内で過剰に発泡を起こす化合物
を放出する。これら発泡を起こす化合物が存在すること
により、発酵槽のオーバーフローを避けるために、泡止
め剤の使用が必要になる。不運にも、泡止め剤の使用は
、更に、細胞当たりのアスタキサンチンの収率を、低下
させることになる。　 【００２０】しかしながら、　我々は、水性のファフィ
ア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ
）　細胞及び栄養素類を含む発酵ブロスに、適度に過剰
な、少なくとも、一種の適切な炭素エネルギー源を、存
在させることによって、アルコールとアルデヒドの生成
が容易にコントロールされ、発泡が避けられることを発
見した。加えるに、適度に過剰な、少なくとも、一種の
適切な炭素エネルギー源の存在は、また、アスタキサン
チン収率及び細胞成長速度の向上をもたらした。 【００２１】アスタキサンチンと細胞収率を改良するこ
とで、最も重要なことは、ファフィア・ロドジーマ（Ｐ
ｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞が、　接種
と対数的な成長相の間の遷移相に在る期間で、適度に過
剰な、少なくとも、一種の適切な炭素エネルギー源を保
持することである。望ましくは、ファフィア・ロドジー
マ細胞が、遷移相から対数的な成長相の実質的な部分を
通して、適度に過剰な、少なくとも一種の適切な炭素エ
ネルギー源に接触することであろう。 【００２２】添加された、適度に過剰な、少なくとも、
一種の適切な炭素エネルギー源は、ファフィア・ロドジ
ーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の発酵中
過剰の泡の生成を避けるべく、及びアルコール又はアル
デヒドの毒性レベル又は成長抑制を生じる事がない、　
効果的な量であるべきである。　望ましくは、水性ファ
フィア・ロドジーマ　（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚ
ｙｍａ）細胞及び栄養類から成る、発酵ブロス中で検出
し得る、適度に過剰で、少なくとも、一種の炭素エネル
ギー源は、１．０ｇｒ／ｌから２０．０ｇｒ／ｌ　の範
囲に、最も望ましくは、　１ｇｒ／ｌから５ｇｒ／ｌの
範囲になるであろう。　発酵ブロス中の適度に過剰な、
少なくとも、一種の適切な炭素エネルギー源は、過剰の
アルコール又はアルデヒドの生成を避けるべくコントロ
ールされるべきである。望ましくは、発酵ブロス中のア
ルコールの量は、０．０ｇｒ／ｌから３．０ｇｒ／ｌの
範囲にあるべきである。　望ましくは、　発酵ブロス中
に存在するアルデヒドの量は、０．０ｇｒ／ｌ　から０
．１ｇｒ／ｌの範囲になろう。 【００２３】ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　の発酵は、種々の炭素エネル
ギー源及び／又は　　栄養源を利用して、水性連続的又
は回分供給方式により行われる。ファフィア・ロドジー
マ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　の成長の
ために適切な炭素エネルギー源とは、　サクシネート（
ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、フマレート（ｆｕｍａｒａｔｅ
）、マレート（ｍａｌａｔｅ）、ピルベート（ｐｙｒｕ
ｖａｔｅ）、グルコース、スクロース、フラクトース、
マルトース、コーンシロップ、加水分解デンプン、デン
プン及びこれらの、任意の２種以上の組み合わせから成
るグループから選択される炭素エネルギー源を含むが、
これらに限られるわけでない。適切な栄養源又はファフ
ィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍ
ａ）のための媒体は、　少なくとも一種の窒素源、少な
くとも一種のリン源、少なくとも一種の鉄、銅、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、カルシウムの様な鉱物類、他
の微量元素、及びビタミン類（必要により、ビオチン、
パントテン酸及びチアシン等）を含むであろう。 【００２４】少なくとも、一種の炭素エネルギー源及び
栄養源には、適当な種々のものが有り糖蜜も単独で、そ
の供給源になるであろう。しかしながら、望ましいもの
は、明示された特性を持つ、栄養源及び／又は、少なく
とも、一種の炭素エネルギー源である。効果的であるこ
とが証明された、一種の炭素エネルギー源、及び／又は
　栄養源の組成は表ＩＩに示されている。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　表　　ＩＩ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　炭素エネルギー源及び栄養素類水
１リットル当たりの成分 　　炭素エネルギー源　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　−　　１０
０　　　　　（　ｇ／ｌ）　　Ｈ３ＰＯ４　（８５％）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１６　　−　　　　２．７　　　（ｍ
ｌ／ｌ）　　ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１１　−
　　　　０．８　　　（　ｇ／ｌ）　　Ｋ２ＳＯ４　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．１７１　−　　　　１．３　
　　（　ｇ／ｌ）　　　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．１４０　−　　　　１．５６　　（　ｇ／ｌ）　　　
　ＫＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４７　−
　　　　０．３５　　（　ｇ／ｌ）　　　　ビオチン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．００６　−　　　　０．０
４４　（ｍｇ／ｌ）　　　　チアミン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１２　　−　　　　９．８　　　（ｍｇ／
ｌ）　　１　イースト抽出物　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２　　　
−　　　　６．０　　　（　ｇ／ｌ）　　２　鉱物類及
び微量金属類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１１８　−　　　　９．８　　　（ｍ
ｌ／ｌ）　　１イースト抽出物は、アンバレックス１０
０３でユニバーサルフーズ社製で、この社の登録商標で
ある。（ＡｍｂｅｒｅｘＴＭ１００３，　Ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ　Ｆｏｏｄｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｍｉ
ｌｗａｕｋｅｅ，　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）　　　　　　
　　　　　　　　　　２鉱物類及び微量金属類は、Ｆｅ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　６５．０　ｇ／ｌ，　ＣｕＳＯ４・
５Ｈ２Ｏ　６．０　ｇ／ｌ，　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ　２０　ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４　３．０　ｇ／ｌ，　
及び　Ｈ２ＳＯ４　５．０　ｍｌ／ｌ。 【００２５】本発明で使用されているイースト抽出物は
、アンベレックス１００３（Ａｍｂｅｒｅｘ，登録商標
）　及びバクトイースト抽出物（Ｂａｃｔｏ，　登録商
標，　Ｄｉｆｃｏ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃｏ
ｒｐｏｒａｔｅｄ）　のグループから選択されるイース
ト抽出物を含むが、　これに限られるわけでない。　代
替として、コーンスティープ液が窒素源として、イース
ト抽出物の代わりに使用することができた。 【００２６】本発明で使用される微量元素は、コバルト
、モリブデン、鉄、銅、亜鉛、マンガン、から成るグル
ープから選択される微量金属を含むが、これに限られる
わけでなく、ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の、成長速度又はアスタキサン
チン製造を抑制しないが、　十分な量であることを条件
として、イーストの成長に一般的に利用されている微量
元素類である。 【００２７】発酵温度は、一般に１８℃から２２℃の範
囲にあるべきで、望ましくは、約２０℃であるべきであ
る。回分供給方式で行われる発酵槽中における、溶解酸
素含量は、飽和の１０％から８０％の範囲にあり、望ま
しくは、飽和の３０％から６０％の範囲になるであろう
。連続式発酵での溶解酸素含量は、飽和の７０％から１
００％で、望ましくは、飽和の７０％から８０％である
。ファフィア・ロドジーマ（ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄ
ｏｚｙｍａ）　細胞が培養されるＰＨは、３．０から５
．５の範囲であるべきで、望ましくは、ＰＨは４．５か
ら５．４の範囲であろう。 【００２８】ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）細胞を含む発酵ブロスが、　望
ましい細胞密度又はアスタキサンチンの含量に到達した
後、細胞は採取される。ファフィア・ロドジーマ培養物
が４時間から２４時間の範囲で、定常的な状態に保たれ
ることが望ましく、最も望ましいのは、８時間から１２
時間の範囲でアスタキサンチンの収率が増加することで
ある。 【００２９】しかしながら、ファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）は、　定常状態
で延長した時間、保持されるべきでない、何となれば、
食餌色素補充として使用するために適した形で、細胞中
に含まれるアスタキサンチンを調達するために、不利に
なるほど、ファフィア・ロドジーマの細胞膜が厚くなる
からである。 【細胞破壊】鮭魚類、甲殻類、鳥類は未破壊ファフィア
・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　細胞のアスタキサンチンを利用することができない。 　食餌源のアスタキサンチンとして、ファフィア・ロド
ジーマを利用するためには、その細胞膜を物理的、化学
的、機械的に或は酵素による手段により、崩壊されなけ
ればならない。ファフィア・ロドジーマ細胞膜は、通常
の溶菌プロトコールに非常に抵抗力がある。例えば、ビ
ーズミリング（ＢｅａｄＭｉｌｌｉｎｇ）では、　３回
のパス後で、ファフィア・ロドジーマ細胞に存在するア
スタキサンチンの４０％だけが、放出されるだろう。（
もっとパスを数多く行っても、実質的にアスタキサンチ
ンの放出は増加しない。）グアリンプレス（Ｇｕａｌｉ
ｎ　Ｐｒｅｓｓ）では、　ファフィア・ロドジーマに存
在するアスタキサンチンの９５％以上を、３回のパス後
でのみ放出する。（このことは、時間を消費し、大きな
出費を要することになる。）ファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の酵素による溶
菌は、　また、本発明の発見時までには、ファフィア・
ロドジーマからアスタキサンチンを放出させるために有
効であるか、経済的であるかについて、明らかになって
いない。　【００３０】我々は、トリコデルマ・ハルジ
アニウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｉ
ｕｍ）　菌からの消化力ある酵素製剤のある量が、　フ
ァフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚ
ｙｍａ）　の細胞膜を有効に消化する能力のあることを
発見した。　このことは、実施例Ｉ．Ｃ．２に記載され
ている、　アセトン抽出物との比較によって決定されて
いる様に、ファフィア・ロドジーマ中に存在しているア
スタキサンチンの、殆ど完全な利用をもたらしている。 実施例ＩＩＩにおける、表７は、トリコデルマ・ハルジ
アニウムの消化力ある抽出物、ムタナース（Ｍｕｔａｎ
ａｓｅＴＭ，　Ｎｏｖｏ　Ｅｎｚｙｍｅの登録商標）に
対する、数種の他の工業的酵素抽出物を比較したもので
ある。表７は、トリコデルマ・ハルジアニウム消化性酵
素製剤（ＭｕｔａｎａｓｅＴＭ）の微少量が、　ファフ
ィア・ロドジーマに含まれている全てのアスタキサンチ
ンを、実質的に放出させたことを説明している。　【０
０３１】トリコデルマ・ハルジアニウム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｉｕｍ）の適切な菌株は、
　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ
ｉｖｅ，　Ｒｏ−ｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ
）により、公に利用可能になっている（例えば、　ＡＴ
ＣＣ−６４９８６）。　これらの菌株は、　当業者によ
り知られている様に、水中での培養発酵により消化力の
ある酵素を製造するのによく使用される。トリコデルマ
・ハルジアニウムの消化酵素製剤として、適切なものの
一つは、ノボ酵素ＳＰ−２９９−ムタナース（Ｎｏｖｏ
Ｅｎｚｙｍｅｓ　ＳＰ−２９９−Ｍｕｔａｎａｓｅ）で
ある。 【００３２】アスタキサンチンを含む、ファフィア・ロ
ドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細
胞は、実質的にその中に含まれている、全てのアスタキ
サンチンを利用するために、トリコデルマ・ハルジアニ
ウム（Ｔｏｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｉｕ
ｍ）　消化性酵素製剤の有効量で処理されるべきである
。一般的に、水性ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆ
ｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の１００ｇｒ／ｌ当たりの
消化性酵素製剤の量は、温度、ＰＨ及び使用されるファ
フィア・ロドジーマ細胞の条件に依存していて、ガイド
ラインとして、１００ｇｒ／ｌで、トリコデルマ・ハル
ジアニウム消化性酵素製剤の、０．２単位から１０．０
単位の範囲で利用される。単位は、対数的成長相で採取
した、密度１００／ｌの水性ファフィア・ロドジーマの
サンプルで、消化性酵素をファフィア・ロドジーマ細胞
に、２２℃、ＰＨ４．５で接触させ、２４時間培養した
時、実施例Ｉ．Ｃ．２に記載した、アセトン抽出により
放出されたアストキサンチンと等しい量を提供するトリ
コデルマ・ハルジアニウム消化性酵素の量として定義さ
れる。 【００３３】ファフィア・ロドジーマ細胞が消化性酵素
製剤と接触する際の温度は、その消化性酵素製剤により
、ファフィア・ロドジーマ細胞膜が消化される任意の温
度である。一般的に、温度は０℃から６０℃の範囲にあ
るべきであるが、本発明の実施において、望ましい温度
は２０℃から３０℃の範囲である。 【００３４】ファフィア・ロドジーマ細胞が、消化性酵
素製剤と接触するときのＰＨは、消化性酵素製剤が、フ
ァフィア・ロドジーマ細胞膜を消化できる任意の適切な
ＰＨである。一般的に、ファフィア・ロドジーマ細胞が
消化性酵素製剤と接触するＰＨは、４．０から５．５の
範囲にあるべきで、望ましくは、４．５から５の範囲に
ある。 【００３５】アスタキサンチンを含むファフィア・ロド
ジーマ細胞は、ファフィア・ロドジーマ生活環の、いず
れの時期においても、トリコデルマハルザニウム（Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｉｕｍ　）から得
られた消化性酵素製剤と接触させる事ができる。しかし
ながら、対数的成長相にファフィア・ロドジーマが到達
後、できるだけ早く、消化性酵素製剤と接触することが
望ましく、対数的成長相に到達した後０から７２時間の
範囲にあるべきで、最も望ましくは、０から２４時間の
範囲である。 【００３６】ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）細胞の水性サスペンションとト
リコデルマハルザニウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈ
ａｒｚｉａｎｉｕｍ　）消化性酵素製剤との混合は、任
意の適切な手段で達成されることができ、その混合は一
般的に、乾燥消化性酵素製剤ヲ、水性ファフィア・ロド
ジーマ発酵ブロス或は水性細胞サスペンション中で、接
触すること、及び上記乾燥消化性酵素製剤を、溶液中へ
と混合することで、上記乾燥消化性酵素製剤を、溶液中
へと混合することで、達成される。 【００３７】トリコデルマハルザニウム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｉｕｍ　）から得られた、
消化性酵素製剤は、或る時間内で、アストキサンチンを
含んでいるファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　
ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞に接触し、　実施例Ｉに記
載されるアセトン抽出物と比較されるように、ファフィ
ア・ロドジーマ細胞中に存在するアスタキサンチンの相
当量を放出させる。その時間量は、細胞濃度、ＰＨ，温
度、及び利用される消化性酵素製剤の単位に依存してい
る。一般的に、ファフィア・ロドジーマとトリコデルマ
ハルザニウムから得られた、消化酵素製剤との接触時間
は、１２時間から２４時間であるべきで、望ましい接触
時間は約２４時間であろう。 【ファフィア・ロドジーマ細胞の乾燥】アスタキサンチ
ンを、食餌色素の補充としての利用が可能であるように
、細胞膜を消化或は破壊した後の、ファフィア・ロドジ
ーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　細胞は
乾燥される。　乾燥は、　流動床乾燥機、　ドラム乾燥
機、又はスプレー乾燥機を使用して行われる。現時点で
は、スプレー乾燥機が、アスタキサンチンを分解又は酸
化する恐れがある高温に、短時間の曝露で済む故に、望
ましいものである。 【００３８】スプレー乾燥は、破壊された又は消化され
たファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈ−ｏｄ
ｏｚｙｍａ）細胞のスラリーに実施されるべきである。 　もし、　スラリーが、　消化酵素製剤で処理された、
ファフィア・ロドジーマ細胞により形成されている時は
、そのスラリーは、細胞同士を粘着させる恐れがあるの
で、細胞表面にある残留物を除去するために洗うべきで
ある。細胞スラリーの洗浄は、当業者によって知られて
いる、適切な、任意の技術によって行われよう。そのス
ラリーには、随意で、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨ
Ｔ），　ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ），　又
はアスコルビン酸エステルの様な酸化防止剤、或はソル
ビトールモノステアレートの様な乳化剤を混合すること
ができる。次いで、スラリーは、温度範囲が４２５°Ｆ
から５２５°Ｆ、望ましくは、４４０°Ｆから５１０°
Ｆであるスプレー乾燥機入口に送られる。スラリーの送
入速度を、コントロールするために監視されるべき重要
なパラメーターは、スプレー乾燥機の出口温度で、１６
０°Ｆから２０５°Ｆに，望ましくは、１７０°Ｆから
１９０°Ｆに保持されるべきである。乾燥後、得られた
製品は、イーストの粉状物でサイクロンの様な、適切な
手段で回収され、次への供給、貯蔵、出荷の操作が行わ
れる。 【００３９】下記の例は、本発明の実際を説明したもの
であるが、これに限られるわけでな い。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　実　　例　菌株 　　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏ
ｄｏｚｙｍａ）　ＰＣ　８０５５　　　　　　　ＮＲＲ
Ｌ　Ｙ−１０９２１　　　　ファフィア・ロドジーマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　ＰＣ　８０５
９　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８５４９　　ファフ
ィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍ
ａ）　ＰＣ　８０６５　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１
８５５０　　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ
　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　ＰＣ　８０８８　　　　　　
　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８５５１　　ファフィア・ロドジー
マ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｉｍａ）　ＰＣ　８
０９１　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８５５２　　フ
ァフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚ
ｙｍａ）　ＰＣ　８０９３　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ
−１８５５３　　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆ
ｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　ＰＣ　８０７１　　　　
　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８５５４　　ファフィア・ロド
ジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）　ＰＣ
　８０７５　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８５５５　
　ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄ
ｏｚｙｍａ）　ＰＣ　８０７７　　　　　　　ＮＲＲＬ
　Ｙ−１８５５６媒体、　緩衝液及び溶液 ＹＥＰＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１％　Ｂａｃｔｏ　イースト抽出物
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２％　Ｂａｃｔｏ　ペプ
トン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３％　Ｄｅｘｔｒｏｓｅクエン
酸塩緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＰＨ
　５．５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
１　Ｍ　　　　　　　　リン酸塩緩衝液　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＰＨ　４．５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．１　Ｍ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０％　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−
３３５０）リッチ検査成長媒体　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｂａｃｔｏ　イースト抽出物　　　　　９．
０　　　ｇ／ｌ　　　（Ｒｉｃｈ　Ａｓｓａｙ　Ｇｒｏ
ｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）　　　　　　　　Ｄｉｆｃｏ　
Ｍａｌｔ　抽出物　　　　　　　　６．０　　　ｇ／ｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　　　　　　　　
　　　　　　　　１０．０　　　ｇ／ｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ＫＨ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　
　１５．０　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｋ２ＨＰＯ
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　
　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　
　　　　　　　　　　　　　０．５　　　ｇ／ｌ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　
　　　　　　０．０４　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
ＮＨ４）２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　３
．０　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　１６．２５　ｍｇ／
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　１．５　　ｍｇ／ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　
　　　５．０　　ｍｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＭｎＳＯ
４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　０．７５
　ｍｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ
）　　　　　　　　　０．０５　ｍｇ／ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）　　　　　　　１
．００　ｍｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１　Ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＮａＯＨ又はＨ３ＰＯ４で調整してｐＨを５．０
とする。 調整したＹＭＡ媒体　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｂａｃｔｏ　イースト抽出物　　　　　６　　　
　　ｇ／ｌ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＹＭＡ　Ｍｅｄｉｕｍ
）　　　　　　　　　　　　　Ｄｉｆｃｏ　Ｍａｌｔ　
抽出物　　　　　　　　６　　　　　ｇ／ｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　
　　　２０　　　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　寒天（
Ａｇａｒ）　　　　　　　　　　　　　　２０　　　　
　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　水　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１　Ｌ最小発酵槽（Ｍｉｎｉ
ｍａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）供給／ＦＭ−２１（Ｆｅ
ｅｄ／ＦＭ−２１）　　　　　　　　　　　　１０％炭
素源（Ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｈ２ＰＯ４　８５％　　　　　　　　　　　　　　　
　３．５　　ｍｌ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣａＳＯ４・
２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　０．１５　　
ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｋ２ＳＯ４　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２．３８　　ｇ／ｌ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　
　　　　　１．９５　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＫＯ
Ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
６５　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＹＴＭ−４　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　ｍｌ／ｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　水　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１　Ｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＨ３又は
ＮＨ４ＯＨで調整してｐＨを５．０とする。 ＩＭ３　塩媒体（ＩＭ３　Ｓａｌｔｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）
　　　　　　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１５．０　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｋ
２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．０　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　０．５０　　ｇ／
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　０．０４　　ｇ／ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　３．００　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ビオチン
（Ｂｉｏｔｉｎ）　　　　　　　　　０．０５　ｍｇ／
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　水　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１　Ｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨを５
．４とする。 Ｂｉｏ　Ｌａｆｉｔｔｅ　媒体　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｈ３ＰＯ４（８５％）　　　　　　　　
　　　　　　１４．５　　ｍｌ／ｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
０．６０　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｋ２ＳＯ４　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．１２　　ｇ
／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　７．６０　　ｇ／ｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＫＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２．６０　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ
ｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　
　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　イースト抽出物　　　
　　　　　　　２０　　　　　ｇ／ｌ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　微量金属類　　　　　　　　　　　　　　　４．０　
　ｍｌ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ
）　　　　　　　　　８　　　　ｍｇ／ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）　　　　　　　８
　　　　ｍｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＳＴＲＵＫＴＯＬ
　Ｊ８６７　又は　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＭＡＺＵ　ＤＦ　
３７Ｃ　　　　　　　　　　　　　１２　　　　滴／ｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　水　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１　Ｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＨ３でｐ
Ｈを５．０に調整。 １微量金属類は以下を含む（ＹＴＭ−４）：　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　１６．２５　ｇ
／２５０　ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ　　　　　　　　　　　　　１．５０　ｇ／２５０　
ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　５．００　ｇ／２５０　ｍｌ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　
　　　　０．７５　ｇ／２５０　ｍｌ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｈ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．２５　ｇ／２５０　ｍｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　Ｌ混合ビタ
ミン ＵＳ　Ｆ＆ＷＳ　Ｎｏ．　３０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ　　　　　　　
　　　１，６５３，４５０　Ｉ．Ｕ．／Ｋｇ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ３　　　　　　　　　
　　１１０，２３０　Ｉ．Ｕ．／Ｋｇ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　　　　　　　　　　　　　８８
，１８４　Ｉ．Ｕ．／Ｋｇ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｔａ
ｍｉｎ　Ｂ１２　　　　　　　　　　　　　　　　５．
５　ｍｇ／Ｋｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｒｉｂｏｆｌａｖｉ
ｎ　　　　　　　　　　　　１３，２２８　　　ｍｇ／
Ｋｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｎｉａｃｉｎ　　　　　　　　
　　　　　　　　５５，１１５　　　ｍｇ／Ｋｇ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｄ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ　Ａｃｉｄ　
　　　２６，４５５　　　ｍｇ／Ｋｇ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｍｅｎａｄｉｏｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　
　９０２　　　ｍｇ／Ｋｇ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　葉酸（Ｆ
ｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ）　　　　　２，２０５　　　ｍｇ
／Ｋｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ　　　
　　　　　　　　　　６，３４９　　　ｍｇ／Ｋｇ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｔｈｉａｍｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　　　　８，１０２　　　ｍｇ／Ｋｇ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　８８　　　ｍｇ／Ｋｇ混合鉱物類（Ｍｉｎｅｒａ
ｌ　Ｍｉｘ）　　　　　　ＵＳ　Ｆ＆ＷＳ　Ｎｏ．　３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　亜鉛　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３４，０００　　　
ｍｇ／ｌｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　マンガン　　　　　　　
　　　　　　　　９，１００　　　ｍｇ／ｌｂ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　銅　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　７００　　　ｍｇ／ｌｂ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ヨ
ウ素　　　　　　　　　　　　　　　　　４，５００　
　　ｍｇ／ｌｂ【００４０】 【実施例Ｉ】 【ファフィア・ロドジーマの改良された菌株の開発】菌
株、　ＰＣ　８０５９、　ＰＣ　８０６５，ＰＣ　８０
７５，ＰＣ　８０７７，ＰＣ８０８８、ＰＣ　８０９１
，及びＰＣ　８０９３を開発するために、下記のプロト
コールが使用された。 【００４１】Ａ．ファフィア・ロドジーマのＮＴＧによ
る突然変異誘発性 ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏ
ｚｙｍａ）　を、２５０ｍｌ三角フラスコ中、５０ｍｌ
のＹＥＰＤ中で、二次培養のため、２０℃で、４８時間
振盪しながら培養した。その後、培養した細胞を３０ｍ
ｌの無菌試験管中、４℃、１０分間、１２０００×ｇで
遠心分離を行い、３０ｍｌの無菌、ＰＨが５．５のクエ
ン酸緩衝液で２回洗浄した。細胞沈降物は、２７ｍｌの
無菌の、ＰＨ５．５のクエン酸緩衝液で再びサスペンシ
ョンとなし、これに１ｍｇ／ｌ、ＮＴＧの３ｍｌ（ＰＨ
５．５，クエン酸緩衝液）が加えられた。その後、その
細胞サスペンションは、振盪なしで、室温で１５分間培
養を行った。サスペンションは４℃で、５分間１２００
０×ｇで遠心分離を行い、無菌の脱イオン水で２回洗浄
を行った。細胞は２５０ｍｌ、三角フラスコ中のＹＥＰ
Ｄの３０ｍｌで、再びサスペンションとなし、２０℃で
、２０分振盪しながら培養した。無菌の０．１Ｍ、Ｍｇ
ＳＯ４を使用して、細胞を１／１００に希釈し、０．１
ｍｌをＹＥＰＤペトリ皿に入れた。これらのペトリ皿は
、２０℃で１０日間培養した。１０日後、ペトリ皿の突
然変異体が数えられ、記録された。 【００４２】Ｂ．ファフィア・ロドジーマのＥＭＳによ
る突然変異誘発性 ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏ
ｚｙｍａ）を２５０ｍｌの三角フラスコ中、５０ｍｌの
ＹＥＰＤ中で、二次培養し、２０℃、２日間振盪しなが
ら、培養した。その細胞は４℃、１０分間、１２０００
×ｇで、３０ｍｌの無菌の試験管を使用して遠心分離を
行った。その沈降物は、３０ｍｌの無菌、ＰＨ５．５の
クエン酸緩衝液で２回洗浄した。０．９ｍｌの細胞サス
ペンションは、１３個の１．５ｍｌ無菌の、円錐底ポリ
プロピレン製の遠心分離管に入れられ、そして７５μｌ
のＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸エステル）が、各々
の管に加えられた。 一本の管だけを直ちに取り出し、ミクロ遠心分離機によ
り細胞を沈降させ、１．０ｍｌの無菌の脱イオン水で２
回洗浄し、１．０ｍｌのの無菌の脱イオン水で、再度サ
スペンションとなし、希釈の間、氷上に放置した。この
作業を、各５分毎に、残りの管について行った。（ＥＭ
Ｓへの全曝露が、６０分になるまで）。次いで、全ての
管は、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０
７倍まで、無菌の０．１ＭＭｇＳＯ４で希釈され、各希
釈液の０．１ｍｌを２個のペトリ皿に入れた。全てのペ
トリ皿は、２０℃、１０日間培養された。１０日後、ペ
トリ皿の突然変異体が数えられ、記録された。 【００４３】Ｃ．スクリーニング方法 １．アスタキサンチンのペトリ皿による検査ａ．ペトリ
皿上でのファフィア・ロドジーマの成長調整したＹＭＡ
ペトリ皿を使用して、培養のため接種を行い、２０℃か
ら２２℃で、好気性の条件下で培養を行いテストを進め
た。４日後、無菌のステックとループを使用して、ＹＭ
Ａペトリ皿から、１又は２の大きいコロニー（０．１か
ら０．２ｇｒ正味重量）を取り出した。その細胞を１．
０ｍｌの脱イオン水、蒸留水で、再度サスペンションと
なし、２．０ｍｌの円錐底ポリプロピレンのミクロ遠心
分離管に入れた。 【００４４】ｂ．アスタキサンチンのアセトン抽出０．
１ｍｌの各細胞サスペンションを、９．９ｍｌ、脱イオ
ン水、蒸留水にピペットで移し、細胞濃度（リットル当
たりの洗浄乾燥した細胞のグラム数）を決定するため、
６００ｎｍで吸収を測定した。この方法では、１５ｇ／
ｌの本来の細胞濃度は、６００ｎｍの波長で（１ｃｍの
光通過厚さで）０．５５０の吸収を示した。その測定値
は、吸収範囲０．０００から１．０００まで、０から２
７ｍｇ／ｌの細胞濃度範囲で線形である。 【００４５】本来の細胞サスペンション（０．９ｍｌ容
量）を４℃、１４０００×ｇでミクロ遠心分離を行い、
沈降物を得、上澄液を傾瀉で分離した。アセトンを加え
て全容量を１．０ｍｌにした。０．２５ｇｒの４５０か
ら５００ミクロンのガラスビーズを加え、少なくとも、
全時間で１０分間、激しく撹拌する（この間、周期的に
氷上で冷却しながら）。１０分間の撹拌の後で、存在す
るファフィア・ロドジーマの細胞全てが破壊される、こ
のことは、顕微鏡的に確かめられるべきである。もし破
壊が、実質的に完了しないときは、ビーズミリングは破
壊が生じるまで繰り返されるべきである。得られた細胞
残骸及びガラスビーズを、４℃、１４０００×ｇのミク
ロ遠心分離により、沈降分離させる。０．５ｍｌの上澄
液は、１．５ｍｌのアセトンで希釈し、４７８ｎｍでの
吸収を測定する。アスタキサンチンの濃度は、下記によ
り計算される： １μｇ／ｌの純粋なアスタキサンチンを仮定するＡ４７
８＝１６０×１０−６、１ｃｍ光通過厚さ１．０ｍｌ細
胞サスペンションのアスタキサンチン濃度は、下記の様
になる。アスタキサンチン（μｇ／ｌ表示で） ＝（Ａ４７８／（ｂ×１６０×１０−６））×希釈係数
　ここで、　ｂ＝ｃｍ表示の光通過厚さ（通常１）で、
希釈係数は 希釈係数＝（１．５ｍｌ／０．５ｍｌ）×（１．０ｍｌ
／０．９ｍｌ）＝３．３３ 細胞中のアスタキサンチン濃度（細胞中、　μｇ／ｇ表
示）は、　下記の様に計算される。アスタキサンチン＝
アスタキサンチン濃度（μｇ／ｌ）／細胞濃度（ｇ／ｌ
）【００４６】２．アスタキサンチンの振盪フラスコに
よる検査 ａ．振盪フラスコ中でのファフィア・ロドジーマの成長
５０ｍｌのリッチ検査成長媒体（Ｒｉｃｈ　Ａｓｓａｙ
　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）に２５０ｍｌ三角フラ
スコ中７日間培養したものから、ループ一杯のファフィ
ア・ロドジーマ培養物を接種した。次いで、接種された
フラスコは、２０℃から２２℃で、激しく撹拌しながら
培養した。菌株は５日間（１２０時間）成長させ、採取
し、検査を行った。５日後各の培養物が採取された。 【００４７】ｂ．アスタキサンチンのアセトン抽出各培
養体につき、４℃で、１０分間、１２０００×ｇの遠心
分離を行い、細胞の沈降物を採取した。各沈降物を１０
ｍｌの脱イオン水、蒸留水により２回洗浄し、最終的に
１００ｍｌの脱イオン水、蒸留水でサスペンションとし
た。０．１ｍｌの各細胞サスペンションは、９．９ｍｌ
の脱イオン水、蒸留水を加え、細胞の濃度を測定するた
め、６００ｎｍにおける吸収を測定した。この方法によ
り、元の細胞濃度、１５ｇ／ｌは、　６００ｎｍ　（光
通過厚さ１ｃｍ）で０．５５０の吸収を示した。測定値
は、範囲０．０００から１．０００，細胞濃度０から２
７ｇｍ／ｌの吸収において、線形であった。 【００４８】１０ｍｌの各の、元の細胞サスペンション
より沈降物を得、再度、脱イオン水、蒸留水の１．０ｍ
ｌで、サスペンションとなし、２．０ｍｌの円錐底ポリ
プロピレンのミクロ遠心分離管に移した。細胞は４℃、
１４０００×ｇの遠心分離操作により、管内に沈降させ
た。上澄液は傾瀉し、アセトンを最終容量、１．０ｍｌ
になる様に添加した。 【００４９】０．２５ｇｒの４５０から５００ミクロン
のガラスビーズをサンプルに添加し、激しい撹拌を、少
なくとも、全時間で１０分間行った（周期的に氷上で冷
却しながら）。１０分後、撹拌により、実質的に、存在
する全てのファフィロドジーマ細胞を破壊し、このこと
は、顕微鏡的に確かめられた。もし、破壊が実質的に完
了しない場合は、ビーズミリングを破壊が生じるまで繰
り返し行った。ガラスビーズと細胞残骸は、４℃、１４
０００×ｇで遠心分離を行い、沈降物を得た。０．５ｍ
ｌの上澄液を取り、１．０ｍｌのアセトンを添加した。 その吸収を４７８ｎｍで測定した。 【００５０】１μｇ／ｌの純粋なアスタキサンチンが、
Ａ４７８＝１６０×１０−６を、１ｃｍ光通過厚さ、で
示すと仮定。１００ｍｌ、サスペンション中のアストキ
サンチンは：アスタキサンチン（μ／ｇ／ｌ）＝（Ａ４
７８／（ｂ×１６０×１０−６））×希釈係数 ここで、ｂ＝ｃｍ表示の光通過厚さ（通常１）、希釈係
数＝（１．５ｍｌ／０．５ｍｌ）×（１０ｍｌ／１ｍｌ
）＝０．３細胞中のアスタキサンチン（μｇ／ｇ）＝ア
スタキサンチン（μｇ／ｌ）／細胞濃度（ｇ／ｌ） ＤＣＷ中のアスタキサンチン（μｇ／ｇ）＝アスタキサ
ンチン濃度（μｇ／ｌ）／細胞濃度（ｇ／ｌ）ＤＣＷ乾
燥細胞重量（ＤＣＷ）は、ブロスの２５ｍｌを取り、細
胞沈降物を形成するまで遠心分離を行うことで測定され
る。上澄液を除き、沈降物を最終的に２５ｍｌ容量の細
胞サスペンションを得るために、再度、脱イオン水、蒸
留水でサスペンションとした。その細胞サスペンション
を遠心分離操作を行い、沈降物を作成した。上澄液を注
ぎ出し、細胞の沈降物は十分な量の脱イオン水と混合し
、流動可能な細胞スラリーとした。そのスラリーをアル
ミニウムタラ皿に入れた。遠心分離管は、また、残留し
た細胞を取り出すために、約５ｍｌの脱イオン水を使用
して濯ぎ、細胞スラリーを入れた皿に加えた。その皿を
乾燥オーブン中に入れ、８０℃、１２時間乾燥を行った
。１２時間の乾燥の後、皿の重量を量り、乾燥後の細胞
重量を得るために、タラの重量を引算した。 【００５１】３．アスタキサンチンのＨＰＬＣ検査６０
０ｎｍでの測定において、イースト０．０５ｇｒ／ｍｌ
を含むとされる、イーストブロス、０．２ｍｌのサンプ
ルを５個、別々に１．５ｍｌの円錐底遠心分離管に入れ
た。細胞濃度を、元の細胞濃度が１５ｇｒ／ｌで０．５
５０の吸収を有するとして計算した。そのサンプルを、
４℃、５分間、１４０００×ｇで細胞の沈降物を得るた
めに遠心分離を行った。１．０ｍｌのアセトンを０．２
５ｇｒのガラスビーズ（４５０から５００ミクロンのビ
ーズで、１０％リン酸で洗浄し、蒸留水で濯ぎ、８０℃
で乾燥したもの）と一緒に各サンプルに加えた。その管
は４℃で、２分間激しく、渦巻き撹拌をし、ガラスビー
ズと細胞残骸を除くため、４℃、１０分間、ミクロ遠心
分離を行った。全ての管からの上澄液を６ドラムの小さ
なガラスビンに傾瀉した。この操作により得られる上澄
液が、無色になるまで、アセトン添加、渦巻き撹拌、そ
の後の遠心分離操作を繰り返し行った。上澄液を一緒に
し、室温、窒素雰囲気中、フード下で乾燥し、黒色液を
得た。乾燥操作後に残った色素を、正確に５ｍｌのメタ
ノールと混合し、３０分間再溶解させた。メタノール色
素溶液を０．２ミクロンのフィルターを使用濾過した。 色素溶液の１００ｍｌを、ウオーターズＨＰＬＣ（Ｗａ
ｔｅｒｓ　ＨＰＬＣ）にかけた。　ＨＰＬＣ操作は、メ
タノールを溶媒として、２ｍｌ／分の流速、カラムは室
温に保って行った。検出器を４７８ｎｍに設定した。カ
ラム操作は１０分行った。アスタキサンチンのリテンシ
ョンは大体、２．６から２．７分であった。ピーク面積
はヒューレットパッカード３３９０Ａにより計算した（
Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　３３９０Ａ　ｉｎｔ
ｅｇｒａｔｅｒ）。　ウオータースのカラム（Ｗａｔｅ
ｒｓ　Ｒａｄｉａｌ−ＰＡＫ　Ｃ１８（Ｐ−Ｎ　８６３
４２））が、　このＨＰＬＣでカラムとして使用された
。　　 【００５２】細胞内のアスタキサンチン濃度は下記によ
り計算される。 細胞内アスタキサンチン（μｇ／ｇ）＝アスタキサンチ
ン濃度（μｇ／ｌ）／細胞濃度（ｇ／ｌ） ＤＣＷアスタキサンチン（μｇ／ｇ）＝アスタキサンチ
ン濃度（μｇ／ｌ）／細胞濃度（ｇ／ｌ）ＤＣＷＤＣＷ
は、乾燥細胞重量の略である。乾燥細胞重量は、２５ｍ
ｌのブロスを沈降物を得るまで遠心分離にかけた。上澄
液を注ぎ出し、沈降物を脱イオン水で再サスペンション
化し、最終容量２５ｍｌの溶液とした。再サスペンショ
ン化溶液を、再度、遠心分離を行い、細胞の沈降物を得
た。上澄液を注ぎ出し、細胞沈降物を十分な脱イオン水
と混合し、流動細胞スラリーを得た。そのスラリーをア
ルミニウムタラ皿に入れた。遠心分離管を約５ｍｌの脱
イオン水で濯ぎ、細胞残留物を取り出し、これを細胞ス
ラリーの入った皿に加えた。皿は８０℃、１２時間、乾
燥オーブンに入れた。１２時間後、皿の重量を測定し、
乾燥細胞重量を得るために、タラの重量を引算した。 【００５３】標準液は、５ｍｇのアスタキサンチン結晶
を、１００ｍｌのメタノールに溶解して得た。正確な濃
度を計算するために、４７８ｎｍでの吸収を測定した。 １ｃｍ，１％溶液の吸光率が、２．３５０になることが
、測定された。標準溶液の純度は、数種の希釈液をＨＰ
ＬＣ分析することで確かめられた。標準溶液の部分標本
は、暗所、−８０℃の冷凍庫で、最高４週間まで貯蔵で
きよう。 【００５４】Ｄ．菌株の開発 ファフィア・ロドジーマの突然変異体は、実施例ＩＡ及
びＩＢに詳細に述べられている様に、突然変異誘発性を
持つ、ＮＴＧ或はＥＭＳのいずれかを使用して、親菌株
ＰＣ８０５５（ＮＲＲＬ　Ｙ−１０９２１）から、開発
された。下記の流れ図は、各々の突然変異体の菌株の遺
伝的な歴史を例示したものである。左側の列の数字は世
代を示している。ＥＭＳ及びＮＴＧの文字は、次に示さ
れた世代を導くために、使用された、突然変異誘発剤を
代表している。各々の世代は、次のラウンドの突然変位
誘発が実施される前に、何百もの子孫をスクリーンする
ために、アセトンでのアスタキサンチン抽出と同じく、
ペトリ皿及び振盪フラスコによるスクリーニングが利用
されている。 【００５５】 【実施例ＩＩ】Ａ．ファフィア・ロドジーマの高細胞密
度発酵 この実施例は、米国特許４，６１７，２７４（参考とし
て記載）に、　開示されたフィリップス社の高細胞密度
発酵方法（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　Ｈｉｇｈ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｎ−ｓｉｔｙ
　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）を使用
する、　連続発酵方法で、　高細胞密度下で成長させ得
ることを例示する。　ファフィア・ロドジーマ、　ＰＣ
８０５７は、下記の条件下で、成長した。 １．成長温度は、２２℃であった。 ２．アンモニア及びリン酸を使用して、ＰＨを４．５か
ら５．０にした。 ３．撹拌、空気流、を増加させ、　発酵槽の圧力を高め
、飽和の７５％以上の溶解酸素を保った。 ４．ビオチン０．０５ｍｇ／ｌ、チアミン１ｍｇ／ｌ及
びイースト抽出物０．１％を補充したＦＭ−２１を成長
媒体とした。 ５．ケモスタットの希釈速度を０．０５４から０．０５
７容量／時間に保った。発酵後、　ケモスタット流出物
は、　通気なしで７２時間室温に保ち、ＰＨを４．５か
ら５．０にすることで、　細胞中のアスタキサンチンの
含量を最高のレベルに増加させることができた。　その
結果は、４表に要約されている。　 【００５６】Ｂ．４リットル発酵槽、回分供給法による
、ファフィア・ロドジーマの成長 この実施例は、４リットル発酵槽、回分供給法による、
ファフィア・ロドジーマの成長に使用されたプロトコー
ルを提供する。 【００５７】１００ｍｌの振盪フラスコ用媒体（イース
ト抽出０．６％，麦芽エキス０．６％，グルコース２．
０％）を含む２５０ｍｌ三角フラスコに、接種した。次
いで、２０℃、７２時間培養した。内容物を１０００ｍ
ｌの、振盪フラスコ媒体を含む、２８００ｍｌのフエル
ンバッハフラスコに移し、２０℃で、２４時間培養した
。 内容物を、さらに１０００ｍｌの、バイオフラッテイ媒
体を、含む４リットル発酵槽へ移した。発酵容量は、最
初、２リットル、２０℃、ＰＨ５．２であった。 【００５８】　　　　　　　４日間の発酵中、ＰＨは５
．２と５．５（アンモニアとリン酸使用）にコントロー
ルし、　温度を１９℃及び２１℃（冷却水浴使用）、　
溶存酸素（ＤＯ）は、　３０％から８０％に保持した。 【００５９】発酵は、最初の５０時間、グルコースを０
．１％から０．３％に保つように行った。発酵槽中のグ
ルコースが低下後、５０％グルコースタンクから原料供
給を行った（７５０ｇｒグルコースと７５０ｇｒ無菌水
）。　　最初の供給は一般的にゆっくりと、あとはだん
だん早くした。 反応中はグルコース濃度をＨＰＬＣで監視し、グルコー
スが検出しなくなるまで、発酵を行った。発酵は２４時
間で完了し、発泡を管理するため、必要に応じ反応液１
リットルにつき３、　４滴のマズ（ＭＡＺＵ，ＤＦ３７
Ｃ　Ｍａｚｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が加えられた。 【００６０】Ｃ．２０リットル容器、回分供給法による
ファフィア・ロドジーマの成長 この実施例は、２０リットル発酵槽、回分供給法でのプ
ロトコールを提供する。１００ｍｌの振盪フラスコ用媒
体（イースト抽出０．６％，麦芽エキス０．６％，グル
コース２．０％）を含む２５０ｍｌ三角フラスコに接種
した。フラスコは、２０℃、７２時間培養を行った。内
容物を１０００ｍｌの振盪フラスコ媒体を含む、２８０
０ｍｌフエルンバッハフラスコへ移し、２０℃、２４時
間培養した。内容物を９リットルの媒体を含む、バイオ
ラッフィッテ発酵槽へ移した。初期の培養容量は、１０
リットル、２０℃、ＰＨ５．２であった。 【００６１】４日間の培養で、ＰＨは５．２と５．５に
、コントロールし、温度は１９℃と２１℃（冷却水浴使
用）、溶存酸素量（ＤＯ）は、　３０％から８０％に保
持した。発酵は、グルコースの少量を保持（０．１％か
ら０．３％）するように５０時間行い、　発酵槽内の原
始グルコースの量が減ったら、５０％グルコースタンク
（３７５０ｇグルコース＋３７５０ｇ無菌水）から原料
供給を行った。最初の供給は一般的にゆっくりと、あと
はだんだん早くした。反応中グルコース濃度は、ＨＰＬ
Ｃで監視し、全供給の終了後、グルコースを検出しなく
なるまで、発酵を行った。発酵は２４時間で完了、発泡
をコントロールするため、必要に応じ、反応液１リット
ルにつき３、４、滴のマズ（ＭＡＺＵ，ＤＦＣ３７Ｃ　
Ｍａｚｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｇｕｒｎｅｅ，　
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を添加した。 【００６２】Ｄ．新規な菌株 下記の表は、本発明の新規な菌株の高い生産性を例示し
ている。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　表５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　アスタキサンチン　μｇ／ｇ　　突然変異体　
　　　　　　　　　　プレート１　　　　　　　　　振
盪フラスコ２　　　　　　　発酵槽３　　　　　　ＰＣ
８０５９　　　　　　　　　　　　　　　８７７　　　
　　　　　　　　　　　　　　７２６　　　　　　　　
　　　　　　　１１０８　　　　　　　　　ＰＣ８０６
５　　　　　　　　　　　　　　　５５９　　　　　　
　　　　　　　　　　　７２０　　　　　　　　　　　
　　　　　９００　　ＰＣ８０８８　　　　　　　　　
　　　　　１４６２　　　　　　　　　　　　　　　　
１６２２　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＤ　　
ＰＣ８０９１　　　　　　　　　　　　　　３３５１　
　　　　　　　　　　　　　　　１９８８　　　　　　
　　　　　　　　　３３００　　ＰＣ８０９３　　　　
　　　　　　　　　　３５７０　　　　　　　　　　　
　　　　　１８１１　　　　　　　　　　　　　　　１
１２１　　　ＰＣ８０７１　　　　　　　　　　　　　
　１７９２　　　　　　　　　　　　　　　　　９７７
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＤ　　ＰＣ８０
７５　　　　　　　　　　　　　　２１７９　　　　　
　　　　　　　　　　　１６８１　　　　　　　　　　
　　　　　２１５５　　ＰＣ８０７７　　　　　　　　
　　　　　　２６０２　　　　　　　　　　　　　　　
　１３４５　　　　　　　　　　　　　　　２００９　
　　　　　　１実施例Ｉ．Ｃ．１に記載した様に成長及
び検査を行った。２振盪フラスコ培養は、　２５０ｍｌ
三角フラスコで、５０ｍｌリッチ検査成長　　媒体（Ｒ
ｉｃｈ　Ａｓｓａｙ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）に
７日間培養したファフィア・ロドジーマ培養物をループ
一杯接種して行った。　フラスコは、２０から２２℃で
激しい撹拌下で行った。 ３実施例ＩＩ、Ｂ又はＣに記載の様に培養を行った。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　表６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　アスタキサンチン　　
μｇ／ｌ／ｈｒ突然変位体　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　振盪フラスコ１　　　　　　　　　
　　　　　発酵槽　　　　ＰＣ８０５９　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７８．９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０５　　
ＰＣ８０６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５５．９　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４８０　　ＰＣ８０８８　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０．
７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＤ　
　ＰＣ８０９１　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　５１．５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　９６１　　ＰＣ８０９３　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５
．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０１
　　ＰＣ８０７１　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　５７．５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＮＤ　　ＰＣ８０７５　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９
７．７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４１
５　　ＰＣ８０７７　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４７．０　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２６９　　　　　　　１表５に
記載された様に培養を行った。２実施例ＩＩ、Ｂ又はＣ
に記載された様に培養を行った。 【００６３】 【実施例ＩＩＩ】Ａ．ファフィア・ロドジーマの酵素的
溶菌 実施例は、トルコデルマハルザニウムからの消化性酵素
製剤が、アスタキサンチンを放出させるために、非常に
有効であることを示している。菌株ＰＣ８０５９（ＮＲ
ＲＬ　　Ｙ−１８５４９）から、　アスタキサンチンを
放出せしめるために、下記の酵素が溶菌に使用された。 全てのテストは製造業者が推薦するＰＨで、３０℃で行
われた。結果は表７に要約されている。溶菌に先立つ細
胞の濃度は約６８ｇｒ／ｌであった。 【００６４】使用されたファフィア・ロドジーマ細胞は
、実施例ＩＩ．Ｃ．２に、　記載されたものである。放
出されたアスタキサンチン含量は、各酵素で処理後、４
７８ｎｍの吸光を吸光光度法により測定し、細胞からア
セトン抽出により得られる吸収値により除することで決
定した。同量の細胞が、酵素処理とアセトン抽出に使用
された。アセトン抽出は実施例Ｉ．Ｃ．２．ｂ記載のよ
うに行った。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表７　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　アスタキサン　　　　
　　　　酵素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　投与量　　　　　　時間　　　　　　チ
ン放出量＊　　　　ＮＯＶＯ　ＭＵＴＡＮＡＳＥ　ＳＰ
２９９１　　　　　　　　　　　　　０．１　　ｇ／ｌ
　　　　　２４　ｈｒ　　　　　　　　　７９％　　　
　　（粉末）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４８　ｈ
ｒ　　　　　　　　　９２％　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１２
　ｇ／ｌ　　　　　２２　ｈｒ　　　　　　　　　８１
％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４３　
ｈｒ　　　　　　　　　９５％　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
　　ｇ／ｌ　　　　　２４　ｈｒ　　　　　　　　　９
９％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１　　　　ｇ／ｌ　　　　　２４
　ｈｒ　　　　　　　　　９９％　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　
　　　ｇ／ｌ　　　　　２４　ｈｒ　　　　　　　　　
９７％ＧＥＮＥＮＣＯＲ　ＣＹＴＯＬＡＳＥ　１２３２
　　　　　　　　　　１０　　　ｍｌ／ｌ　　　　　２
７　ｈｒ　　　　　　　　　３８％（液体）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　４８　ｈｒ　　　　　　　　　６
０％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０
　ｈｒ　　　　　　　　　６２％　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　
　　ｍｌ／ｌ　　　　　４８　ｈｒ　　　　　　　　　
２９％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　５０　　　ｍｌ／ｌ　　　　　４
８　ｈｒ　　　　　　　　　５５％ＮＯＶＯ　ＶＩＳＣ
ＯＺＹＭＥ　１２０Ｌ３　　　　　　　　　　　　１０
　　　ｍｌ／ｌ　　　　　２４　ｈｒ　　　　　　　　
　２２％（液体）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４８
　ｈｒ　　　　　　　　　２８％ＮＯＶＯ　ＧＡＭＡＮ
ＡＳＥ　１．５Ｌ４（液体）　　　　　　　１０　　　
ｍｌ／ｌ　　　　　２４　ｈｒ　　　　　　　　　　５
％ＮＯＶＯ　ＣＥＲＥＭＩＸ　２ＸＬ５　　（液体）　
　　　　　　１０　　　ｍｌ／ｌ　　　　　２４　ｈｒ
　　　　　　　　　　８％　　　　　　　　　＊実施例
Ｉ．Ｃ．２で、　定義されている。 １Ｍｕｔａｎａｓｅは、　Ｎｏｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｄａｎｂｕｒｙ，　ＣＴ　の製品。 ２Ｃｙｔｏｌａｓｅ　１２３　は、　Ｇｅｎｅｎｃｏｒ
　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　
ＣＡ　の製品。 ３Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅは、　Ｎｏｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｄａｎｂｕｒｙ，　ＣＴ　の製品。 ４Ｇａｍａｎａｓｅは、　Ｎｏｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｄａｎｂｕｒｙ，　ＣＴ　の製品。 ５Ｃｅｒｅｍｉｘは、　Ｎｏｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　ｏｆ　Ｄａｎｂｕｒｙ，　ＣＴ　の製品。 この結果は、トリコデルマハルザニウムの消化性酵素製
剤、　ムタナーゼ（Ｍｕｔａｎａｓｅ）が他の酵素製剤
に比べて、　特別に有効であることを示している。 【００６５】Ｂ．ファフィア・ロドジーマの機械的な破
壊 実施例ＩＩＡにおける、３１日目のサンプルＰＣ８０５
７を、ビーズミル、ガウリンプレス、ミクロフルイデッ
クミクロ流動床（ｂｅａｄ　ｍｉｌｌ，　Ｇａｕｌｉｎ
　ｐｒｅｓｓ、　Ｍｉｃｒｏ−ｆｌｕｉｄｉｃｓ　ｍｉ
ｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用して機械的細胞破壊
を行った。結果の要約を、表８に示す。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　表８　　　　　　　　　　　　　　　　　
ファフィアロドジーマ菌株の機械的な破壊　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　アス
タキサンチンの抽出可能％１　　　　　　　　　　パス
　　　　　　　　　　　　ビーズミル２　　　　　ガウ
リンプレス３　　　　　ミクロフルイデック４　　　０
　　　　　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　　
　　　　　　　　　　　７　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１５　　１　　　　　　　　　　　　　
　　　　３２　　　　　　　　　　　　　　　　７５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７３　　　２
　　　　　　　　　　　　　　　　　３７　　　　　　
　　　　　　　　　　９２　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　９３　　３　　　　　　　　　　　　　
　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　９９　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０１　　　４
　　　　　　　　　　　　　　　　　４２　　　　　　
　　　　　　　　　　９８　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０２　　　５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０１対照　
　　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　
　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００１ビーズビーダー（Ｂｅａｄ　ｂｅａｔ
ｅｒ）中６分間、破壊した細胞からのアセトン抽出可能
なアスタキサンチン量（アスタキサンチン７．８７５ｐ
ｇ／細胞サスペンションｍｌ）。 ２Ｗｉｌｌｙ　Ａ．　Ｂａｃｈｏｆｅｎ　Ｍａｃｈｉｎ
ｅｎｆａｂｒｉｋ，　Ｂａｓｅｌ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ　製。Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ ３Ｇａｕｌｉｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｅｖｅｒ
ｅｔｔ，　Ｍａ．，製。　Ｍｏｄｅｌ　６５　Ｍ３　１
０ＴＢＳＸ。 ４Ｃｅｌｌ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　１
１０Ｔ、　流速４　ｌ／ｍｉｎ．、　２０　ｌタンク９
５００ｐｓｉで操作。　 Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　Ｃｏｒｐｏｒ−　ａｔｉｏ
ｎ，　Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａ．　。 【００６６】 【実施例ＩＶ】この実施例は、　得られたアスタキサン
チンが、鮭魚類の食餌色素補充として、有効に使用でき
ることを示すものである。又、ファフィア・ロドジーマ
細胞に含まれるアスタキサンチンが、鮭魚類の食品用色
素源として使用される前に、ファフィア・ロドジーマ細
胞を処理しておかねばならないことを示すものである。 【００６７】Ａ．ファフィア・ロドジーマの成長使用さ
れた菌株は、ＰＣ８０５９である。ＰＣ８０５９の７日
培養物からループ一杯分を修正したＹＭブロス（寒天含
まず）１００ｍｌを含む４個の２５０ｍｌ三角フラスコ
に接種した。これを２２℃、４８時間オバル（ｏｖａｌ
）シェーカー（２５０ｒｐｍ）にかけて培養した。各フ
ラスコから５０ｍｌを採取し、１ｌのＹＭブロス（寒天
含まず）を含む２．８ｌフェルンバッハフラスコ４個へ
移す。これを２２℃、５６時間培養した。 【００６８】　　　　　４ｌの培養物を、１５６ｌのＥ
Ｍ−２１、塩を含む２％アンバレックス（Ａｍｂｅｒ−
ｅｘ　１００３）を含む４００ｌ発酵槽へ移す（２表参
照）。４００ｌの発酵槽は、ＰＨ、溶存酸素、撹拌スピ
ード、温度、空気流、圧力、発泡及び重量を監視し、管
理する機器を設置する。ＰＨは、アンモニアで４．８に
調整する。　原料添加は、　０．６ｌ／ｈｒで行い、グ
ルコース濃度が、　ＨＰＬＣで監視される。接種後、原
料添加速度は段々増加させ、全原料添加終了時は最高の
２．７から２．８ｌ／ｈｒとする。全１２５ｌの原料が
添加され、ＰＨが４．８から５．５に保ち、２２℃で発
酵させる。溶存酸素量は、３０％から６０％に保持し、
原料が消費されてから、槽は２２℃で、２４時間放置す
るとｐＨは６．４に上ってくる。 溶存酵素は全期間中９０％以下になるよう、空気流と撹
拌スピードを減らして維持する。４００ｌの発酵槽で、
２７５ｌ容量で終了する。これらのうち、１５０ｌを均
一化操作行いスプレー乾燥する。残り１２５ｌは均一化
を行わずスプレー乾燥を行った。２回目は、最終２００
ｌの容量作成し、酵素破壊を行いスプレー乾燥をした。 【００６９】発酵ブロスの１２５ｌから１５０ｌにつき
スプレー乾燥が行われた。酸化防止剤、エトキシキノン
の４００ｐｐｍ、ランゲンビタミン　（Ｒａｎｇｅｎ　
Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　Ｐｏｌｙ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
の１０００ｐｐｍ，アスコルブチルパルミテートの１０
００ｐｐｍが発酵ブロスに添加された。ブロスは、次い
で、７５℃から８６℃で殺菌された。その殺菌ブロスは
、入り口温度２８０℃から２８４℃、出口温度８０℃か
ら９６℃で、スプレー乾燥された。 【００７０】発酵ブロスにつき、細胞の均一化は、１０
℃で３００ｌタンクに保たれた１５０ｌにつき行われた
。これは、８０００ｐｓｉｇから１００００ｐｓｉｇの
リサイクルモードで、ガウリンホモジェナイザーを使用
し、４ｌ／ｈｒで全４時間（６．４パスと同等）　で行
った。 【００７１】酵素的な消化は、ノボムタナース（Ｎｏｖ
ｏ　ＭｕｔａｎａｓｅＴＭ　ＳＰ２９９，　Ｎｏｖｏ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，　Ｃｏｎ
ｎｅｔｉｃｕｔ）を２６ｇを使用して行った。これを２
００ｍｌの脱イオン水に溶解し、フィルター殺菌した後
、４００ｌの発酵槽中の２００ｌのブロスへ添加した。 そのブロスは、穏やかな撹拌で、３０℃、２２時間培養
した。アスタキサンチン含量はＨＰＬＣで測定された。 以下の研究で使用するマスの餌中に同量のアスタキサン
チンを含むように、フォーミュラートされた。　　【０
０７２】Ｂ．マス餌研究−供給と時間の比較下記の９表
は、カロフィルピンンク、逆対照、機械的破壊細胞、全
細胞、酵素的破壊細胞を、使用したマス給餌の研究結果
である。この表より、機械的破壊細胞又は酵素的破壊細
胞は、実質的に細胞中に存在する、アスタキサンチンの
全部を利用可能にする。この表は、また、未破壊細胞で
は食餌色素補充として、アスタキサンチンを利用できぬ
ことを示している。アセトンにより決定される抽出性は
、鮭魚類に利用され得る、アスタキサンチン量と相関が
ある。この研究の詳細は、以下に述べる。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　表９　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　マスのア
スタキサンチン含量　　　　　　　　　　　　食餌　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３０日ａ　　　　　
　　　　　　　６０日ｂ　　　　　　　　　　９０日ｃ
　　　　食餌１　　　　　　　　 マス肉色（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　５．０１±１
．８９　　　　　　　　　　５．６２±１．５８　　　
　　　　　６．６５±３．３１　　 給餌（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　　　　　　　　７
２．２　　　　　　　　　　　　　　　５３．３　　　
　　　　　　　　　　５３．３食餌２　　　　 マス肉色（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　　　　　０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　
　　　　　　　　　０給餌（ｐｐｍ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０　　　　　　　　　　　　　　　　０食餌３ マス肉色（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　１．５７±０
．９２　　　　　　　　　　２．８９±０．８０　　　
　　　　　５．４７±２．０５給餌（ｐｐｍ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０．８　　　　　　　　
　　　　　　　３１．８　　　　　　　　　　　　　３
１．８食餌４ マス肉色（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　０．５９±０
．３４　　　　　　　　　　０．９０±０．４７　　　
　　　　　１．８６±０．９３給餌（ｐｐｍ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　９．６　　　　　　　　
　　　　　　　　８．８　　　　　　　　　　　　　　
８．８食餌５　　　　　　　　　　 マス肉色（ｐｐｍ）　　　　　　　　　　１．８９±０
．９３　　　　　　　　　　２．４８±１．４１　　　
　　　　　５．３８±１．６７給餌（ｐｐｍ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　３２．７　　　　　　　　
　　　　　　　３５．０　　　　　　　　　　　　　３
５．０食餌１：クロロフィルピンク、　　食餌２：逆対
照、　　食餌：機械的破壊細胞、食餌４：全細胞、給餌
はアセトン抽出により決定された利用可能な、アスタキ
サンチン。 各々の期間で、全アスタキサンチン量は、３１ｐｐｍで
ある。食餌５：酵素的に破壊された細胞。　　ａ　表１
０での食餌、　　ｂ　表１１での食餌。マスの給餌研究
は、　９０日間、上に概説した様に行った。製品Ａ（表
１０、１１に示されるように）は食餌３に使用され、機
械的に破壊された細胞（菌株、ＰＣ８０５９）を含み、
３０−３２ｐｐｍの利用可能なアスタキサンチンを含む
。製品Ｂ（表１０、１１に示されるように）は食餌４に
使用され、全細胞（菌株ＰＣ８０５９）を含み、２９ｐ
ｐｍの全アスタキサンチンを含む。製品Ｃ（表１０、１
１に示されるように）は、食餌５に使用され、酵素的に
破壊された（Ｍｕｔａｎａｓｅを使用して）細胞（菌株
ＰＣ８０５９）を含み、食餌５は３０ｐｐｍのアスタキ
サチンを含む。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　１０　　　　　　　　　　　　　
　ファフィアロドジーマイースト試験給餌における　　
　　　　　　　　　　　　　　　ニジマスに給餌された
試験食餌　１−５　の成分　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　食餌１
　　　　　　食餌２　　　　　　食餌３−５　　　　成
分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　（％）　　　　　　　　　（％）　　
　　　　　　　　　（％）　　　　　　ニシン食餌（Ｈ
ｅｒｒｉｎｇ　ｍｅａｌ）　　　　　　　　　　　３９
．００　　　　　　　　３９．００　　　　　　　　３
９．００大豆食餌（Ｓｏｙｂｅａｎ　ｍｅａｌ）　　　
　　　　　　　　　　１４．００　　　　　　　　１４
．００　　　　　　　　　９．００　１製品Ａ，Ｂ，又
はＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００　　
　　　　　　　０．００　　　　　　　　　５．００綿
実食餌（Ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ　ｍｅａｌ）　　　　　
　　　　　１０．００　　　　　　　　１０．００　　
　　　　　　１０．００血液食餌（Ｂｌｏｏｄ　ｍｅａ
ｌ）　　　　　　　　　　　　　　　　５．００　　　
　　　　　　５．００　　　　　　　　　５．００　ビ
ール酵母（Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ）　　　　　
　　　　　５．００　　　　　　　　　５．００　　　
　　　　　　５．００小麦クリアー（Ｗｈｅａｔ　ｃｌ
ｅａｒｓ）　　　　　　　　　　８．５５　　　　　　
　　　８．５５　　　　　　　　　８．５５乾燥乳漿（
Ｄｒｉｅｄ　Ｗｈｅｙ）　　　　　　　　　　　　　　
　　５．００　　　　　　　　　５．００　　　　　　
　　　５．００２パーマペル（Ｐｅｒｍａｐｅｌ）　　
　　　　　　　　　　　　　２．００　　　　　　　　
　２．００　　　　　　　　　２．００魚油（Ｆｉｓｈ
　Ｏｉｌ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　９．６０　　　　　　　　　９．６０　　　　　　
　　　９．６０３混合ビタミン（Ｖｉｔａｍｉｎ　ｍｉ
ｘ）　　　　　　　　　　０．４０　　　　　　　　　
０．４０　　　　　　　　　０．４０４混合鉱物類（Ｍ
ｉｎｅｒａｌ　ｍｉｘ）　　　　　　　　　　　　０．
１０　　　　　　　　　０．１０　　　　　　　　　０
．１０塩化コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ
，　７０％）　　　０．１０　　　　　　　　　０．１
０　　　　　　　　　０．１０５ステイ−Ｃ（ＳＴＡＹ
−Ｃ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
１　　　　　　　　　０．１１　　　　　　　　　０．
１１ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．４０　　　　　　　　　１．１
４　　　　　　　　　１．１４６ＣＰ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．１０　　　　　　　　　０．００　　　　　　　　
　０．００合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００．００　　　　　　　
１００．００　　　　　　　１００．００　　　　　　
１ファフィアロドジーマをスプレー乾燥したもの。 ２バインダー　　　３米国　Ｆ＆ＷＳ　Ｎｏ．　３０，
実施例の媒体、　緩衝液、　溶液の表を参照。 ４米国　Ｆ＆Ｗ　Ｎｏ．　３，　実施例の媒体、　緩衝
液、　溶液の表を参照。 ５Ｌ−ａｓｃｏｒｂｙ−２−ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ（１００　ｐｐｍ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ−ｅ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ，　ｗ／ｗ） ６ゼラチン担体のＣａｒｏｐｈｙｌｌ　Ｐｉｎｋ　５％
　Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ（ｍｉｎｉｍｕｍ）（Ｈｏｆ
ｆｍａｎ　Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表１１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ファフィアロドジーマイースト試験給餌にお
ける　　　　　　　　　　　　　　　　　ニジマスに給
餌された試験食餌　１−５　の成分　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　食餌１　　　　　　食餌２　　　　　　食餌３−５　
　成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（％）　　　　　　　　　（％）
　　　　　　　　　　　（％）アンチョビー食餌（Ａｎ
ｃｈｏｖｙ　ｍｅａｌ）　　　　　　３０．００　　　
　　　　３０．００　　　　　　　　３０．００大豆食
餌（Ｓｏｙｂｅａｎ　ｍｅａｌ）　　　　　　　　　　
　　　　１４．００　　　　　　　１４．００　　　　
　　　　１４．００１製品Ａ，Ｂ，又はＣ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．００　　　　　　　　０
．００　　　　　　　　　０．００綿実食餌（Ｃｏｔｔ
ｏｎｓｅｅｄ　ｍｅａｌ）　　　　　　　　　　　１０
．００　　　　　　　１０．００　　　　　　　　１０
．００血液食餌（Ｂｌｏｏｄ　ｍｅａｌ）　　　　　　
　　　　　　　　　　　５．００　　　　　　　　５．
００　　　　　　　　　５．００ビール酵母（Ｂｒｅｗ
ｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ）　　　　　　　　　　　５．０
０　　　　　　　　５．００　　　　　　　　　５．０
０小麦クリアー（Ｗｈｅａｔ　ｃｌｅａｒｓ）　　　　
　　　　　　１７．５５　　　　　　　１７．５５　　
　　　　　　１７．５５乾燥乳漿（Ｄｒｉｅｄ　Ｗｈｅ
ｙ）　　　　　　　　　　　　　　　　　５．００　　
　　　　　　５．００　　　　　　　　　５．００２パ
ーマペル（Ｐｅｒｍａｐｅｌ）　　　　　　　　　　　
　　　　　２．００　　　　　　　　２．００　　　　
　　　　　２．００魚油（Ｆｉｓｈ　ｏｉｌ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．６０　　
　　　　　　９．６０　　　　　　　　　９．６０３混
合ビタミン（Ｖｉｔａｍｉｎ　ｍｉｘ）　　　　　　　
　　　　０．４０　　　　　　　　０．４０　　　　　
　　　　０．４０４混合鉱物類（Ｍｉｎｅｒａｌ　ｍｉ
ｘ）　　　　　　　　　　　　　０．１０　　　　　　
　　０．１０　　　　　　　　　０．１０塩化　コリン
（Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，　７０％）　　
　０．１０　　　　　　　　０．１０　　　　　　　　
　０．１０５ステイ−Ｃ（ＳＴＡＹ−Ｃ）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．１０　　　　　　　
　０．１０　　　　　　　　　０．１０ゼラチン（Ｇｅ
ｌａｔｉｎ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１．１０　　　　　　　　１．１０　　　　　　　　
　１．１０６ＣＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０８　　　　
　　　　０．００　　　　　　　　　０．００合計　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００．００　　　　　　１００．００　　　
　　　　１００．００１ファフィアロドジーマをスプレ
ー乾燥したもの。 ２バインダー　　　３米国　Ｆ＆Ｗ　Ｎｏ．　３０，　
実施例の媒体、　緩衝液、　溶液の表を参照。　　　４
米国　Ｆ＆Ｗ　Ｎｏ．　３，　実施例の媒体、　緩衝液
、　溶液の表参照。 ５Ｌ−ａｓｃｏｒｂｙ−２−ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ（１００　ｐｐｍ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ−ｅ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ，　ｗ／ｗ）　　　　　　　６ゼラ
チン担体のＣａｒｏｐｈｙｌｌ　Ｐｉｎｋ　５％　Ａｓ
ｔａｘａｎｔｈｉｎ（ｍｉｎｉｍｕｍ）（ｈｏｆｆｍａ
ｎ　Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ） 【００７３】Ｃ．マス食餌のプレミックス及び割当量か
ら色素の抽出 ５種の食餌プレミックス各々の２ｇを、正副２種の重量
を測定し、４０ｍｌのポリプロピレン遠心分離管に入れ
た。各々５種のマス割当ペレットの約５ｇを乳鉢と乳棒
で粉砕した。各々５種の粉砕したマス割当ペレットの２
ｇにつき、正副２種の重量を測定し、４０ｍｌのポリプ
ロピレン遠心分離管に入れた。 【００７４】１０ｍｌの脱イオン水を、プレミックス及
びマス割当サンプルの、各々の管に加えた。その管は、
５５℃、１０分間時々振蘯しながら培養し、室温に冷却
放置した。２０ｍｌのアセトンを、それぞれの遠心分離
管に加え、３０秒、渦巻き撹拌をした。２２℃、５分間
、１２，０００×ｇで遠心分離を行い、　固体を沈降物
とした。上澄液を傾瀉し、保持した。２０ｍｌのアセト
ンを上澄液に加え、渦巻き撹拌を３０秒行った。その中
の固体を更に、２２℃、５分間、１２，０００×ｇで、
遠心分離を行い、　沈降物として得た。上澄液を傾瀉し
、抽出のために冷却した。 【００７５】　　　　　　　　　　１０ｍｌの塩化メチ
レン（ＣＨ２Ｃｌ２）を、　各々のサンプルに加え（ク
ロロフィルピンクを含むサンプルに２０ｍｌを加えた）
渦巻き撹拌を行った。 相分離が起こるまで放置した。色素を含む下層を取り出
し、保持した。２回目の塩化メチレン抽出を行い、色素
を含むフラクションを冷却した。溶媒を室温で、フード
内、減光下で、窒素気流中乾燥の為に、飛ばした。 【００７６】各々のサンプルを、　１０．０ｍｌのｎ−
ヘキサンに、再度、　溶解し、１ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４
を微量の水を除去するために、添加した。各々のサンプ
ルの１ｍｌを、サンプル中の脂質から水を除去するため
に、フロリジルカートリッジ（ＦｌｏｒｉｓｉｌＣａｒ
ｔｒｉｄｇｅ　Ｓｅｐ　Ｐａｋ）にかけた。　このもの
を、　１０ｍｌのｎ−ヘキサンで洗い、　さらに、１０
ｍｌの７０：３０のｎ−ヘキサン：ヂエチルエーテルで
洗った。　カラムに付着した色素は、　１０ｍｌのアセ
トンで逆流置換して保持した。サンプル中のアセトン残
留物は、室温で、フード内、減光下、窒素気流中で乾燥
させた。各々のサンプルは、再度、１．０ｍｌのメタノ
ールで溶解し、全アスタキサンチン濃度を実施例Ｉ．Ｃ
．２の様にして決定した。 【００７７】Ｄ．ニジマス肉色からの色素の抽出約１０
ｇのニジマスの肉（正確な重量を記録する）を、カミソ
リの刃を使用して刻んだ。２０ｍｌのアセトンを添加し
、そのサンプルを、乳鉢と乳棒で粉砕した。アセトン抽
出物は、デスポーザルプラスチック遠心分離管に傾瀉し
、１０ｍｌのアセトンをサンプルに添加した。そのサン
プルを、再度、粉砕し、サンプルとアセトンを同じ遠心
分離管へ移した。サンプルを２０℃、１０分、２０００
ｒｐｍで遠心分離を行った。上澄液は、１１ドラムのガ
ラスビンに傾瀉し、窒素気流中で乾燥した。１０ｍｌの
アセトンをプラスチック遠心分離管に加え、渦巻き撹拌
し、２０℃、１０分、２０００ｒｐｍで遠心分離を行っ
た。その上澄液を、再度、１１ドラムガラスビンに傾瀉
した。（この時点で、もし沈降物が無色でないならば、
抽出は繰り返されるべきである。）サンプルは、残りが
水層だけになるまで、窒素気流中で乾燥される。 【００７８】１ｍｌのジエチルエーテルと５ｍｌのｎ−
ヘキサンを抽出物に添加し、激しく渦巻き撹拌を行う。 層分離が生じるまで放置し、上部有機層（色素を含む）
を取り出し、ガラスビンにパスツールペッテを使用して
移し、窒素気流中で乾燥した。 【００７９】サンプルを再度、５ｍｌのｎ−ヘキサンで
抽出し、層が分離するまで放置し、上部有機層を取り出
した。この抽出操作は、上部有機層が無色になるまで繰
り返された。サンプルは、プールされ、窒素気流下で乾
燥された。色素は、１０ｍｌのｎ−ヘキサンに再溶解さ
れ、一つまみの無水Ｎａ２ＳＯ４が、微量の水を除去す
るために添加された。 【００８０】各々の抽出物の、３．０ｍｌをシリカカー
トリッジにかけた（Ｓｉｌｉｃａ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ
　Ｓｅｐ　Ｐａｋにかけた。　これを、　１０ｍｌのｎ
−ヘキサン次いで、　５ｍｌの７０：３０のｎ−ヘキサ
ン：ジエチルエーテルで洗った。カラムに付着した色素
は、１０ｍｌのアセトンで、逆流置換により取り出し、
保持した。アセトンは窒素気流中で乾燥され、除去され
た。各々のサンプルは、３．０ｍｌのメタノール再溶解
し、そしてアスタキサンチンの濃度が、実施例Ｉ．Ｃ．
２の様に決定された。