DE3883539T3 - Astaxantin liefernde hefezellen, verfahren zur herstellung. - Google Patents

Astaxantin liefernde hefezellen, verfahren zur herstellung. Download PDF

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    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Astaxanthin produzierende Hefestämme, Verfahren zu ihrer Herstellung, Verfahren zu ihrer Kultivierung und Verfahren zum Isolieren des Astaxanthins aus den Hefezellen. Weiter bezieht sich die Erfindung sowohl auf ein Nahrungsmittel oder Futter, welches die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder das aus diesen gewonnene Astaxanthin enthält, als auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines Nahrungsmittels oder Futters und ein Verfahren zum Füttern von Tieren mit dem Futter.
  • Es ist bekannt, daß die rote Farbe des Fleisches von anadromen Fischen, wie etwa Lachs oder Lachsforelle, von roten Pigmenten wie Astaxanthin, herrührt, welche in der vom Fisch aufgenommenen Nahrung vorhanden sind. In natürlichen Umgebungen erhalten die Fische ihre rote Farbe von Krustentieren oder anderen astaxanthinhaltigen Organismen, wenn die Fische aber in Fischfarmen gezüchtet werden, haben sie zu diesen natürlichen Pigmentquellen keinen Zugang und erlangen daher die anziehende rote Farbe nicht, solange im Futter keine roten Pigmenten zugeführt werden.
  • So sind sowohl aus Krustentierabfällen isoliertes oder synthetisch hergestelltes Astaxanthin aus auch andere synthetische rote Pigmente wie etwa Cantaxanthin als Bestandteile in Fischfutter verwendet worden. Die Verwendung von Cantaxanthin in Tierfuttermitteln ist jedoch in bestimmten Ländern verboten und sowohl die synthetische Astaxanthinherstellung als auch das Verfahren zum Isolieren natürlichen Astaxanthins sind ziemlich teuer und unterliegen oft jahreszeitlichen Schwankungen.
  • Andere natürliche Astaxanthinquellen, unter diesen die Hefe Phaffia rhodozyma und einige Mikroalgen, wie etwa die einzellige Grünalgengruppe Chlamydomonas nivalis [Gert Knutson et al., "Pigmentering af laks med astaxanthin fra mikroalger", Norsk Fiskeopdræt Nr. 3, S. 4–5, 55 (1980)] sind bekannt. Von dem durch diese Organismen produzierten Astaxanthin ist gezeigt worden, daß es anadromen Fischen die gewünschte rote Farbe verleiht [Eric A. Johnson et al., "Phaffia rhodozyma as an astaxanthin source in salmonid diets", Aquaculture, 20, S. 123–134 (1980) und JP-A-57-206342 ]. Die Verwendung von Hefezellen in großen Mengen als Ernährung für Fische ist jedoch nicht erwünscht, da dieses Futter nicht genügend abwechs lungsreich ist. Andererseits ist die durch die Organismen produzierte und in einer ernährungsmäßig annehmbaren Menge Hefezellen vorliegende Astaxanthinmenge zum Erhalten der gewünschten Pigmentierung nicht ausreichend und die Isolierung von Astaxanthin aus Hefe durch die bekannten Verfahren ist ziemlich teuer.
  • Falls es jedoch möglich wäre, von diesen Organismen eine höhere Astaxanthinproduktion zu erhalten, wäre eine lohnende Astaxanthinproduktion möglich, welche keinen jahreszeitlichen Bedingungen unterliegt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Phaffia rhodozyma Hefezellen bereit, welche Astaxanthin in ausreichend hohen Konzentrationen enthalten, um es zu ermöglichen, die Hefezellen als oder in Futter für anadrome Fische und andere Tiere zu verwenden, bei welchen eine Pigmentierung des tierischen Fleischs oder eines Tierprodukts erwünscht ist. Die Erfindung stellt auch attraktive Verfahren zum Erhalten von Astaxanthin aus astaxanthinhaltigen Hefezellen, insbesondere den vorgenannten Hefezellen mit hohen Astaxanthingehalten, bereit. Wichtige Aspekte der Erfindung gründen sich auf ein besonderes Verfahren zum Kultivieren Astaxanthin produzierender Zellen und/oder die Bereitstellung von Mutantenstämmen mit verbesserter Befähigung zum Produzieren von Astaxanthin.
  • Somit bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf eine Phaffia rhodozyma Hefezelle, welche eine Hefezelle ist, die zu dem Hefestamm, der unter der Hinterlegungsnummer 225-87 CBS hinterlegt ist, oder dem Hefestamm, der unter der Hinterlegungsnummer 215-88 CBS hinterlegt ist, gehört, oder eine Mutante oder ein Derivat davon, oder eine Mutante oder ein Derivat des Hefestammes, der unter der Hinterlegungsnummer 224-87 CBS hinterlegt ist, welche bzw. welches ihre bzw. seine Fähigkeit zur Produktion von Astaxanthin beibehalten hat, und, wenn sie bzw. es unter Bedingungen, welche eine Sauerstofftransferrate von mindestens 30 mmol/l/h umfassen, auf Difco YM Medium bei 20–22°C 5 Tage lang in 500 ml Schüttelflaschen mit zwei Schikanen, welche 50 ml Medium enthalten und bei 150 Upm kreisförmig geschüttelt werden, kultiviert wird, wobei die Impfkultur 100 μl einer vier Tage alten Kultur in YM-Medium ist, Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse produziert, bestimmt durch HPLC-Analyse eines Methanolextraktes der Hefe, welcher hergestellt wird, indem eine Suspension von 0,2 g Hefetrockenmasse in 20 ml Methanol 5 × 1 Minute lang in Intervallen von einer halben Minute aufgebrochen wird, wobei das Aufbrechen bei einer Temperatur von maximal 20°C in einer Glaskugelmühle, welche 15 g Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,4 mm enthält, durchgeführt wird, wobei die Glaskugelmühle mit einem Kühlmantel mit Eiswasser ausgestattet ist, wobei reines Astaxanthin als Standard verwendet wird.
  • Die vorstehend angeführten Wachstumsbedingungen und Bestimmungsbedingungen werden angegeben, um die Anzucht- und Testverfahren zu standardisieren, so daß das erhaltene Ergebnis die der vorliegenden Hefe innewohnenden Fähigkeiten zur Produktion von Astaxanthin widerspiegelt. Dieses Verfahren ist nach mehreren, vom Anmelderunternehmen ausgeführten Versuche als geeignetes und reproduzierbares Verfahren befunden worden, welches in der Praxis leicht auszuführen ist. Es sollte angemerkt werden, daß das Bestimmungsverfahren nicht dasselbe wie das bisher in der Literatur verwendete ist. Die bisher in der Literatur verwendeten Verfahren, vgl. z.B. Eric A. Johnson et al., "Astaxanthin formation by the yeast Phaffia rhodozyma", Journal of general microbiology 115, 1979, S. 173–83, beruhen auf der Absorption einer 1%igen (Gew./Vol.) Lösung in Aceton in einer 1 cm-Küvette von 1600, wogegen der Wert, welcher durch Messen des Astaxanthinstandards von Hoffmann-La Roche erhalten wird, 2100 beträgt. Dieser Wert beruht sowohl auf den eigenen Messungen des Anmelderunternehmens als auch auf den von Hoffmann-La Roche gegebenen Informationen.
  • Weiterhin mißt das bekannte Bestimmungsverfahren den Gesamtpigmentgehalt der Hefe, wogegen das vorgenannte, in der vorliegenden Erfindung verwendete Standardverfahren ausschließlich den Astaxanthingehalt mißt. Wenn man die nach dem vorstehend angeführten Standardverfahren erhaltenen Werte mit den in der Literatur angegebenen Werten vergleicht, sollte man nicht vergessen, daß die in der Literatur angegebenen Werte beträchtlich höher sind als die durch das vorstehend angeführte Standardverfahren erhaltenen wahren Werte. Somit sollte, wann immer der vorhandene Gesamtpigmentgehalt mit den Literaturangaben verglichen wird, eine Korrektur des Unterschieds in den Extinktionskoeffizienten durch Multiplizieren des in der Literatur angeführten Gesamtpigmentgehalts mit 1600/2100 angebracht werden.
  • Die vorstehend angeführten Wachstumsbedingungen sind diejenigen, welche das Anmelderunternehmen als zur Bestimmung der Befähigung zum Produzieren von Astaxanthin als reproduzierbar und von Bedeu tung erkannt hat. Eine genauere Erläuterung der zum Bestimmen der Fähigkeiten zum Produzieren von Astaxanthin verwendeten Wachstums- und Bestimmungsbedingungen der Hefestämme wird in Zusammenhang mit den Beispielen gegeben.
  • Die Hefezelle gemäß der Erfindung ist eine, welche der Art Phaffia rhodozyma angehört, da diese die einzige derzeit bekannte Phaffia-Art ist.
  • Zur Zeit ist Phaffia rhodozyma die einzige bekannte Hefe, welche Astaxanthin produziert. Der Wildtyp P. rhodozyma wird aus Laubbaumabsonderungen isoliert und ein Beispiel eines derartigen Stamms vom Wildtyp ist in der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC 24261 hinterlegt.
  • Vegetative P. rhodozyma-Zellen bilden Knospen wie Heterobasidiomyzetenhefe. Chlamydosporen werden durch Knospung entwickelt aber ein Promycel und eine richtige Sporenbildung treten nicht auf. Die Chlamydosporen sind verhältnismäßig große runde Zellen mit einem größeren Lipidgehalt als die vegetativen Zellen. Versuche, die verschiedenen Stämme zu kreuzen, in der Hoffnung, die Bildung eines dikaryotischen Mycels und Teliosporen zu beobachten, sind nicht erfolgreich gewesen. P. rhodozyma wurde daher in die Gattung Deuteromycotina der Ordnung Blastomycetes (vgl. M.W. Miller et al., "Phaffia, a new yeast genus in the duteromycotina (Blastomycetes)" in International Journal of systematic bacteriology 26:2, 1976, S. 286–291) eingeordnet.
  • Vegetative Zellen sind ellipsoid (3,6–7,5) × (5,5–10,5) μm und liegen in einem flüssigen Medium einzeln, paarweise und in einigen Fällen in kurzen Ketten oder kleinen Anhäufungen vor. Es wird kein echtes Mycel entwickelt, ein rudimentäres Pseudomycel kann jedoch vorhanden sein. Knospung tritt mehrere Male vom selben Punkt auf der Zelle auf. P. rhodozyma hat eine starke, aus vielen Schichten bestehende Zellmembran und das Hüllmaterial verleiht der Oberfläche ein körniges Aussehen und verursacht das vorstehend erwähnte Anhäufen.
  • Ein geschlechtlicher Lebenszyklus ist nicht beobachtet worden. Während der Entwicklung der Chlamydosporen werden durch Knospung vegetative Zellen gebildet. Diese Zellen können nicht als Promycelien mit Sporen, wie für Aessosporon (vgl. J.P. van der Walt, "The perfect and imperfect states of Sporobolomyces salminicolor", J. Microbiol. Serol. 36, 1970, S. 49–55) beschrieben, angesehen werden. Die Chlamydosporen können nicht als Gonotokonten (getrennt-geschlechtliche Sporen) angesehen werden und ihre Knospen können nicht als die haploide Generation angesehen werden. Es ist nicht möglich gewesen, durch Kernfärbung in irgendeinem Wachstumsstadium eine Diploidisierung zu zeigen. Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen haben während aller Wachstumsphasen nur einen einzigen Kern gezeigt (vgl. M.W. Miller et al., op. cit.). Somit ist P. rhodozyma wahrscheinlich haploid, aber dies ist nicht bewiesen worden.
  • Nach 2–4 Wochen Wachstum auf YM-Agar (Difco Laboratories Incorporated, Difco manual: dehydrated culture media and reagents for microbiology, 10. Auflage, Detroit 1984) sind die Fadenkulturen in Abhängigkeit vom Stamm orangefarben bis lachsrosa.
  • P. rhodozyma besitzt die besondere Eigenschaft, bei Temperaturen über 27°C nicht zu wachsen. Sie fermentiert D-Glukose, Maltose, Sucrose und Raffinose, wogegen D-Galaktose und Melibiose nicht fermentiert werden. Die gebräuchlichsten Kohlenstoffquellen Harnstoff werden assimiliert; D-Galaktose, L-Sorbose, Melibiose, Laktose, Glycerin und Citrat werden jedoch nicht assimiliert. Die Hefe kann in vitaminfreiem Medium ohne Zusatz von Biotin nicht wachsen (M.W. Miller et al., op. cit.). Die gebräuchlichsten Stickstoffquellen einschließlich Harnstoff werden assimiliert. Kaliumnitrat und Ethylamin werden nicht assimiliert. Die Hefe kann weder auf 50 Gew.-% Glukose-Hefeextraktagar noch auf 10 Gew.-% Natriumchlorid-Hefeextraktagar wachsen. Die Säurebildung auf Kreideagar durch die Hefe ist schwach, wie es auch die Gelatineverflüssigung ist. Eine Caseinhydrolyse, depolytische Aktivität und Wachstum in Anwesenheit von 0,1 μg Cycloheximid pro ml sind nicht vorhanden, wohingegen die Hefe in der Lage ist, unabhängig vom pH stärkeähnliche Verbindungen zu synthetisieren. Die Mol-% G+C werden als 48,3 ± 0,18 gemessen (vgl. M.W. Miller et al., op. cit.).
  • Während des Wachstums unter Kohlenhydrate und Stickstoff einschränkenden Bedingungen produziert P. rhodozyma im Zulaufverfahren Trehalose als Kohlenhydratabscheidung. Dies ist eine ziemlich neue, vom Anmelderunternehmen gemachte Beobachtung und ist bis jetzt nicht mitgeteilt worden.
  • P. rhodozyma produziert eine Anzahl Carotinoide, welche gemäß der Literatur aus 83–87% Astaxanthin, 2–2,5% β-Carotin, 2–4% Echinenon und 5–7% Phoenicoxanthin bestehen. In der Praxis ist jedoch gefunden worden, daß das Verhältnis von Astaxanthin zum gesamten, von P. rhodozyma produzierten Pigment in Abhängigkeit sowohl von den Wachstumsbedingungen der Hefezellen als auch dem Pigmentbestimmungsverfahren beträchtlich schwankt, und ist im allgemeinen im Bereich von 50–80% gefunden worden.
  • Figure 00060001
  • Alle hydroxylierten Pigmente einschließlich Astaxanthin sind als ungebunden, nicht als Ester oder andere Derivate beschrieben worden (Arthur G. Andrewes et al., "Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red-pigmented fermenting yeast", in Phytochemistry 15, 1976, S. 1003–1007). Es gibt drei optisch isomere Formen von Astaxanthin: (3S,3'S), (3R,3'R) und (3S,3R), welche jeweils in verschiedenen trans- und cis-Konfigurationen vorkommen. Es ist berichtet worden, daß P. rhodozyma nur (3R,3'R)-Astaxanthin produziert (Arthur G. Andrewes et al., "(3R,3'R-Astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma", op. cit., S. 1009–1011). Im vorliegenden Zusammenhang wird "Astaxanthin" sowohl für trans- als auch cis-Konfigurationen von Astaxanthin verwendet.
  • Das Pigment in den einzelnen P. rhodozyma-Zellen ist nicht sichtbar, wenn die Zellen im Mikroskop untersucht werden, was darauf hinweist, daß das Pigment über die ganze Zelle zerstreut sein kann. Es ist jedoch auch möglich, daß das Pigment in bestimmten Teilen der Zellen konzentriert ist.
  • Astaxanthin ist ein oxidiertes Carotinoid und gehört daher zur Xanthophyllgruppe. Ähnlich anderen Carotinoiden ist Astaxanthin aus acht Isopreneinheiten zusammengesetzt. Bei der Biosynthese von Astaxanthin, welche katabolit-reprimiert ist, wird wie nachstehend veranschaulicht Pyrophosphorsäureisopentenylester aus Acetyl-CoA gebildet.
  • Figure 00070001
  • Durch drei Prenyltransferasereaktionen bildet Pyrophosphorsäureisopentenylester wie nachstehend veranschaulicht über Pyrophosphorsäuregeranylester und Pyrophosphorsäurefarnesylester Pyrophosphorsäuregeranylgeranylester.
  • Figure 00080001
  • Die Kondensation zweier Moleküle Pyrophosphorsäuregeranylgeranylester bildet Phytoen, welches über Dehydrierungsschritte und Ringbildung aus β-Carotin Astaxanthin bildet. Der letzte Teil der Biosynthese ist nicht eindeutig bestimmt worden, aber Andrews et al. (op. cit.) haben auf der Grundlage der Pigmentzusammensetzung in P. rhodozyma den nachstehend gezeigten Stoffwechselweg vorgeschlagen.
  • Figure 00080002
  • Figure 00090001
  • Das Enzymsystem, welches Pyrophosphorsäuregeranylgeranylester in Astaxanthin überführt, ist nicht bekannt und es ist daher nicht bekannt, warum P. rhodozyma (3R,3'R)-Astaxanthin produziert und ob es während dieses Teils der Biosynthese einige regulierende Schritte gibt. Andererseits sind die Überführung von Acetyl-CoA in Pyrophosphorsäureisopentenylester in anderen Isopren produzierenden Organismen als P. rhodozyma und die Enzyme, welche daran teilnehmen, in verhältnismäßig großer Einzelheit beschrieben worden. Weniger ist über die Enzyme bekannt, welche Pyrophosphorsäureisopentenylester in Pyrophosphorsäuregeranylgeranylester überführen (Pyrophosphorsäureisopentenylesterisomerase und Prenyltransferase (J.W. Porter, S.L. Spurgeon (Hrsg.), "Biosynthesis of isoprenoid compounds", New York, 1981–1983).
  • Der Proteingehalt von P. rhodozyma schwankt in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen von 25 bis 50% der Hefetrockenmasse. Dies ist ein verhältnismäßig geringer Proteingehalt. Im Gegensatz dazu ist der Lipidgehalt außerordentlich hoch (14–27%). Es wird erwartet, daß die Nukleinsäure ähnlich anderen Hefen 8% ausmacht und daß die Aminosäurenzusammensetzung der Zusammensetzung in anderen bekannten Hefen, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, ähnlich ist und z.B. Methionin und Cystein (vgl. Gerald Reed und Henry J. Peppler, Yeast Technology, 1973, S. 329, herausgegeben von The AVI Publishing Company, Inc.). Dies und die Hefegesamtzusammensetzung, welche eine hohe Menge Nukleinsäuren umfaßt, macht die Hefe wie vorstehend angegeben für Tierernährungszwecke ungeeignet, wenn die Hefe der einzige Nährstoff ist. Somit ist die Hefe ohne Zusatz bestimmter Aminosäuren und anderer Nährstoffbestandteile für Fische oder andere Tiere kein geeigneter Hauptnährstoffbestandteil.
  • Die Gesamtmenge Astaxanthin, welche vom P. rhodozyma Wildtyp produziert wird, wenn dieser unter den normalen, bekannten Bedingungen gezüchtet wird, reicht aus, um den Hefezellen eine rote Färbung zu verleihen, ist aber nicht ausreichend, um die Gewinnung des Astaxanthins aus den Hefezellen ökonomisch durchführbar zu machen.
  • Keine der in der Literatur beschriebenen Arten von Phaffia rhodozyma besitzt eine Befähigung zum Produzieren von über 600 μg Astaxanthin pro g Hefetrockenmasse, wenn es gemäß den vorstehenden Standardmethoden analysiert wird; siehe Tabelle 2 und Tabelle 6 der Beispiele. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedoch gefunden worden, daß es möglich ist, Hefezellen zu erhalten, welche zum Produzieren von Astaxanthin in einer Menge von wenigstens 600 μg pro g Hefetrockenmasse, vorzugsweise wenigstens 700 μg pro g Hefetrockenmasse, bevorzugter wenigstens 1000 μg pro g Hefetrockenmasse, fähig sind, wobei die Aufzucht und die Bestimmung durch die vorstehend angegebenen Standardmethoden ausgeführt werden. Diese Hefezellen sind aus natürlich vorkommender Phaffia rhodozyma durch Mutagenisierung hergestellt worden. Somit offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Hefezelle, welche die vorstehend erläuterte hohe Befähigung zum Produzieren von Astaxanthin zeigt, wobei das Verfahren das Behandeln einer Hefezelle mit einem Mutagen und das Auswählen eines sich daraus ergebenden Mutanten umfaßt, welcher, wenn er unter den vorstehend angeführten Bedingungen kultiviert wird, fähig ist, Astaxanthin in einer Menge von wenigstens 600 μg pro g Hefetrockenmasse, bestimmt durch das vorstehend angeführte Verfahren, zu produzieren.
  • Die Mutagenisierung kann durch eine einzige Mutagenisierung ausgeführt werden, aber es ist gefunden worden, daß es vorteilhaft ist, zwei oder mehrere aufeinanderfolgende Mutagenisierungen auszuführen, da man gefunden hat, daß die Befähigung zum Produzieren von Astaxanthin durch jeden Mutagenisierungsschritt verbessert werden kann. Die der Mutagenisierung unterzogene Ausgangshefezelle ist normalerweise eine Hefezelle, welche, wenn sie unter den vorstehend angeführten Bedingungen kultiviert wird, Astaxanthin in einer Menge von weniger als 300 μg pro g Hefetrockenmasse produziert, bestimmt durch das vorstehend angeführte Verfahren, es ist aber offensichtlich, daß ein Anwärter auf die Mutagenisierungsbehandlung eine natürlich vorkommende Hefezelle mit einer Astaxanthinproduktion so hoch wie möglich ist. Derartige Hefezellen sind normalerweise Hefezellen, welche der Gattung Phaffia angehören, insbesondere wie vorstehend erwähnt der Art Phaffia rhodozyma angehörende Hefezellen.
  • Die Mutagenisierungsbehandlung kann mittels jedes geeigneten Mutagens ausgeführt werden (im vorliegenden Zusammenhang ist der Ausdruck "Mutagen" im weitesten Sinne als z.B. nicht nur Mittel, welche eine mutagene Wirkung haben, sondern auch eine Behandlung, welche eine mutagene Wirkung hat, wie etwa UV-Strahlung, umfassend anzusehen). Beispiele geeigneter Mutagene sind Methansulfonsäureethylester, UV-Strahlung, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Nukleotidbasenanaloga, wie etwa Bromuracil, und Acridine, es wird aber erwartet, daß jedes andere wirksame Mutagen für die Behandlung geeignet ist.
  • Im Einklang mit herkömmlichen Mutagenisierungstechniken folgt auf die Mutagenisierung eine geeignete Auswahl der Zellen, welche die höchste Astaxanthinproduktion besitzen. Aufgrund der Tatsache, daß Astaxanthin ein Pigment ist, kann diese Auswahl verhältnismäßig leicht durch normale visuelle Mittel ausgeführt werden, wie etwa eine einfache Beobachtung einzelner Kolonien. Ein alternatives Verfahren ist das Ausführen einer Analyse an Kulturen, welche aus einzelnen Kolonien hergestellt wurden, z.B. durch Verwenden der vorstehend erläuterten Standardkultivierungsbedingungen und -bestimmungsbedingungen.
  • Zwei durch das erfindungsgemäße Mutagenisierungsverfahren erzeugte Stämme, welche eine besonders hohe Astaxanthinproduktivität zeigten, wurden am 6. April 1987 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Niederlande (CHS), unter den Zugangsnr. 224-87 beziehungsweise 225-87 hinterlegt und ein Stamm, welcher ein erneutes Isolat aus CBS 225-87 ist (siehe Beispiel 1), wurde am 23. März 1988 beim CBS unter der Zugangsnummer 215-88 hinterlegt, und ein Aspekt der Erfindung bezieht sich sowohl auf die letztgenannten zwei Hefestämme als auch auf Mutanten oder Derivate der drei hinterlegten Hefestämme, welche die Fähigkeit zum Produzieren von Astaxanthin im Wesentlichen behalten oder verbessert haben.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen astaxanthinhaltiger Phaffia rhodozyma Hefezellen nach Anspruch 1 oder Zellteile oder von diesen Hefezellen oder Zellteilen stammendes Astaxanthin. Dieses Verfahren umfaßt das Kultivieren Astaxanthin produzierender Hefezellen unter aeroben Bedingungen in einem Medium, das Kohlenhydratquellen, assimilierbare Stickstoff- und Phosphorquellen, Mikronährstoffe und Hiotin oder Desthiobiotin enthält, bei einer Temperatur im Bereich von 15–26°C, um eine Biomasse zu erhalten, die Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse, bestimmt durch das vorstehend angegebene Verfahren, enthält, und wahlweise das Ausführen eines oder mehrerer der folgenden Schritte in willkürlicher Reihenfolge:
    • – Ernten der Zellen aus der Kultur, um eine Hefecreme zu erhalten,
    • – Öffnen der Zellen, z.B. Aufbrechen der Zellwände mittels mechanischer, chemischer und/oder enzymatischer Behandlung und/oder Behandeln der Zellen durch Beschallung, Autolyse, Osmolyse und/oder Plasmolyse wahlweise unter Zugabe geeigneter Mittel, wie etwa Detergentien, Säuren, Hasen, Enzyme, autolysefördernde Substanzen, osmolytische Mittel wie Salze und/oder plasmolytische Mittel,
    • – Homogenisieren der Zellen, um ein Homogenisat zu erhalten,
    • – Trocknen der Zellen, der Zellfragmente oder des Homogenisats, vorzugsweise bis zu einem Wassergehalt von maximal 12 Gew.-%, vorzugsweise maximal 10 Gew.-%,
    • – Extrahieren von Astaxanthin aus den Zellen, den Zellfragmenten oder dem Homogenisat.
  • Die vorstehend angegebene Astaxanthinmenge, 600 μg pro g Hefetrockenmasse, ist höher als irgendeine in der Literatur berichtete Astaxanthinkonzentration. Obgleich Johnson et al., op. cit., einen Astaxanthingehalt von bis zu 814 μg pro g Hefetrockenmasse berichten, umfaßt dieser Wert nicht nur den Astaxanthingehalt, sondern tatsächlich auch den Gesamtpigmentgehalt der Hefezelle. Ferner wurde dieser Pigmentgehalt unter Verwendung eines Absorptionswerts einer 1%igen (Gew./Vol.) Lösung in Aceton in einer 1 cm-Küvette von 1600 gemessen, welcher niedriger als der von den gegenwärtigen Anmeldern gemessene ist (2100), so daß der von Johnson et al. berichtete Wert höchstens 814 × 1600/2100 = 620 μg Gesamtpigment (nicht nur Astaxanthin) pro g Hefetrockenmasse entspricht. Vorausgesetzt, daß Astaxanthin 87% des Gesamtpigments darstellt, entspricht der Wert von Johnson et al. höchstens 540 μg Astaxanthin pro g Hefetrockenmasse. Dieser Pigmentgehalt aus der Literatur sollte mit dem Gesamtpigmentgehalt der Hefestämme der vorliegenden Erfindung verglichen werden, welcher 885 μg/g Hefetrockenmasse für den Stamm CBS 224-87, 1176 μg/g Hefetrockenmasse für den Stamm CBS 225-87 und etwa 1340 μg/g Hefetrockenmasse für den Stamm CBS 215-88 oder sogar noch mehr beträgt.
  • Die hohe Astaxanthinkonzentration in den Hefezellen der Erfindung kann teilweise durch Verwendung besonderer, nachstehend erläuterter Kultivierungsbedingungen und teilweise durch Auswählen eines Hefestamms mit hoher Astaxanthinproduktivität, vorzugsweise ein vorstehend erörterter Hefestamm, erhalten werden und insbesondere ist es bevorzugt, die besonderen Kultivierungsbedingungen und die Verwendung besonderer Astaxanthin produzierender Hefestämme zu kombinieren.
  • Die Kultivierung wird vorzugsweise als Zulauffermentation unter Bedingungen ausgeführt, wo im wesentlichen kein Alkohol gebildet wird. Wie vorstehend angeführt liegt die Temperatur der Kultur im Bereich von 15–26°C. Unter 15°C neigt das Wachstum dazu, zu langsam zu sein, um für eine industrielle Produktion annehmbar zu sein, und über 26°C wird die Lebensfähigkeit der Kultur schwer beeinträchtigt. Der bevorzugte Temperaturbereich ist 20–22°C.
  • Die Fermentation oder wenigstens ein Teil davon wird normalerweise in einem Medium ausgeführt, welches geeignete Makro- und Mikronährstoffe für die Zellen umfaßt, wie etwa Molassen oder Saccharose als Kohlenhydratquelle und Stickstoffquellen, wie etwa Maisquellwasser, Diammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydroxid oder Harnstoff, Phosphorquellen, wie etwa Ammoniumphosphat und Phosphorsäure, und zugesetzte Mikronährstoffe oder Mineralsalze, wie etwa Magnesiumsulfat, Zinksulfat, und Biotin oder Desthiobiotin. Die Molassen oder Saccharose werden dem Medium vorzugsweise getrennt von den anderen Bestandteilen gemäß herkömmlichen, bei der Hefeherstellung verwandten Verfahren zugeführt. Wenn das Medium Molassen umfaßt, ist gefunden worden, daß das Wachstum der Hefezellen durch die Zuckerkonzentration oder andere wachstumshemmende Substanzen im Fermenter beeinflußt wird. Dieser Effekt ist nicht beobachtet worden, wenn das Medium Maisquellwasser oder Feststoffe enthält. Dementsprechend kann es vorteilhaft sein, die Fermentation so zu steuern, daß die Zuckerkonzentration (ausgedrückt als Gesamtkonzentration an Glukose und Saccharose) im Fermenter höchstens 8 g/l, vorzugsweise höchstens 5 g/l und am bevorzugtesten höchstens 1 g/l ist.
  • Die Kultur wird während der gesamten Fermentation belüftet, d.h. sie wird unter aeroben Bedingungen kultiviert. Unter dem Ausdruck "aerobe Bedingungen" wird verstanden, daß die Sauerstoffzufuhr ausreichend sein sollte, so daß während der Fermentation im wesentlichen keine Sauerstoffbegrenzung auf tritt.
  • Gemäß einem besonderen Aspekt der wie vorstehend angegebenen Erfindung wird die Astaxanthinkonzentration in der erhaltenen Biomasse durch Ausführen der Kultivierung unter ausgewählten Bedingungen erhöht. Diese Bedingungen umfassen eine Kultivierung, welche eine Wachstumsphase unter Bedingungen umfaßt, welche im wesentlichen ausreichend im Hinblick auf im wesentlichen alle Wachstumsbedingungen sind, und eine nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase. Die wachstumsbeschränkte Phase wird vorzugsweise durch Bereitstellen von Bedingungen begründet, wo das Wachstumsmedium unter fortgesetz ter Belüftung an mindestens einem Wachstumsfaktor Mangel hat, so daß die Produktion von Astaxanthin während der nachfolgenden Phase gefördert wird.
  • Die wachstumsbeschränkte Phase sollte so verstanden werden, daß sie im allgemeinen die Phase bedeutet, in welcher der Hauptteil der Zellen zu wachsen aufgehört hat. Diese Phase tritt selbstverständlich auf, wenn das Medium an mindestens einem Wachstumsfaktor Mangel hat, wird aber auch während des letzten Teils des Zeitraums der Kohlenhydratzugabe beobachtet, wenn die Menge an im Fermenter vorhandenen Zellen das Belüftungsvermögens des Fermenters beträchtlich übersteigt.
  • Es ist nicht bekannt, warum die nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase die überraschende Wirkung des beträchtlichen Förderns der Produktion von Astaxanthin hat (zum Beispiel von 231 auf 369 μg pro g Hefetrockenmasse wie in einem der folgenden Beispiele erhalten), aber es wird angenommen, daß die Vorläufer von Astaxanthin während der Wachstumsphase produziert worden sind und daß die nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase Bedingungen bereitstellt, welche die Endproduktion von Astaxanthin fördern, möglicherweise oxidierende Bedingungen mit dem Sauerstoffüberschuß, welcher verfügbar wird, wenn das Wachstum beendet ist. Auf jeden Fall scheint es wesentlich, daß die Belüftung während der nachfolgenden wachstumsbeschränkten Phase fortgesetzt wird. Die Dauer der nachfolgenden wachstumsbeschränkten Phase beträgt wenigstens etwa 16 Stunden, wie etwa 16–24 Stunden, da eine kürzere Dauer dazu neigt, die erreichbare Zusatzwirkung zu verringern, wogegen durch Ausdehnen der wachstumsbeschränkten Phase auf mehr als 24 Stunden keine wesentliche Wirkung erreichbar scheint.
  • Ausgedrückt auf eine funktionelle Weise sollten die Bedingungen der wachstumsbeschränkten Phase so eingerichtet sein, daß die Astaxanthinproduktion auf mindestens das 1,2-fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, wie etwa wenigstens das 1,3-fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, vorzugsweise wenigstens das 1,4-fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, und am bevorzugtesten das 1,5-fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, gesteigert wird.
  • Die der besonderen Kultivierung mit der nachfolgenden wachstumsbeschränkten Phase unterzogene Hefezelle ist eine Hefezelle gemäß der Erfindung mit einer verbesserten Fähigkeit des Produzierens von Astaxanthin, typischerweise eine durch eine wie vorstehend erläuterte Mutagenisierung erhaltene Hefezelle. Mit diesen Hefezellen mit einer erhöhten Astaxanthinproduktion kann die Astaxanthinkonzentration in der Biomasse, welche beim Anwenden des besonderen, eine wachstumsbeschränkte Phase umfassenden Kulturverfahrens erhalten wird, wenigstens 600, vorzugsweise wenigstens 800, bevorzugter wenigstens 1000 μg pro g Hefetrockenmasse, bestimmt wie vorstehend angegeben, sein.
  • Normalerweise und wie vorstehend angewandt werden der Gesamtpigmentgehalt und der Astaxanthingehalt der Hefezellen oder Hefezellteile in μg/g Hefetrockenmasse angegeben. Andere Wege des Angebens des Gesamtpigment- und Astaxanthingehalts können jedoch als angebracht befunden werden. Es kann z.B. nützlich sein, den Gesamtpigmentgehalt und Astaxanthingehalt als μg/ml der Suspension anzugeben, in welcher es vorliegt, z.B. im Wachstumsmedium. Dadurch ist es nicht notwendig, das Gewicht der Hefetrockenmasse der Hefezellen zu bestimmen, aus welchen das Astaxanthin oder Gesamtpigment gewonnen werden. Auf diese Weise kann während der Fermentierung oder Kultivierung der Hefezellen, der Astaxanthin- und/oder Gesamtpigmentgehalt der Hefezellen leicht bestimmt werden.
  • Nach der wie vorstehend beschriebenen Kultivierung zum Erhalten von Hefezellen mit einem hohen Astaxanthingehalt kann die Kultur den nachfolgenden, vorstehend angeführten Behandlungen unterzogen werden, um die Hefezellen zu isolieren, und/oder sie für die nach folgende Verwendung aufzubereiten, wie etwa durch Aufbrechen der Zellen, und/oder Astaxanthin kann aus den Zellen extrahiert werden.
  • Die folgenden wichtigen Beispiele dieser Behandlungen werden in größerer Einzelheit erörtert:
    Die Zellen können durch Aussetzen der Zellen einem erhöhten Druck und dann Abfallen des Drucks aufgebrochen werden.
  • Die Zellen können dem erhöhten Druck und dem Abfallen des Drucks durch Hindurchgehen durch ein System ausgesetzt werden, welches einen Ventilhomogenisator umfaßt, wo der erhöhte Druck vor dem Ventilhomogenisator aufgebaut wird. Der Ventilhomogenisator umfaßt typischerweise eine Luftdüse, durch welche die Zellsuspension unter hohem Druck geleitet wird, und ein Störelement, auf welches der Strahl im wesentlichen nach dem Durchgang durch das Ventil auftrifft. Beispiele von Zellbruchventilen werden im APV Gaulin Technical Bulletin Nr. 74 vom März 1985 (APV Gaulin International SA, Postfach 58, 1200 AB Hilversum, Niederlande) beschrieben, welches durch Verweis hierin inbegriffen ist. Als Beispiel eines geeigneten Zellbruchhomogenisators kann ein APV Gaulin MC4-Homogenisator mit einem in der vorgenannten Veröffentlichung beschriebenen Zellbruchventil des Typs CR angeführt werden. Der Homogenisator ist an einen Wärmetauscher angeschlossen, in welchen die zerbrochene Zellen umfassende Suspension aus dem Zellbruchventil fließt. Der Druck der Zellsuspension vor dem Ventil kann z.B. etwa 400–1200 bar, wie z.B. etwa 700 bar, sein. Diese Behandlung kann zum Beispiel drei Mal unter dazwischen stattfindendem Kühlen des Homogenisats im Wärmetauscher wiederholt werden.
  • Wie nachstehend erläutert wird, ist es notwendig, daß die Zellen aufgebrochen oder auf andere Weise behandelt werden, wenn sie im Futter verwendet werden sollen, da die Verwendung des Astaxanthininhalts in hohem Maße von dem Zellinhalt abhängt, welcher für das Verdauungssystem des betreffenden Tiers verfügbar ist. So wird im wesentlichen keine Pigmentierungswirkung beobachtet, wenn Fische mit Futter gefüttert werden, welche nicht aufgebrochene, astaxanthinhaltige Zellen enthalten.
  • Die aufgebrochenen Zellen können einer Ultrafiltration oder Verdampfung ausgesetzt werden, um die aufgebrochenen Zellen zu konzentrieren. Die Ultrafiltration kann zum Beispiel in einem von De Danske Sukkerfabrikker erhältlichen Laboreinheitssystem, zum Beispiel ein System 37, welches drei Filtereinheiten mit einer Gesamtfilterfläche einer Ultrafiltrationsmembran des Typs RC 70 von 0,88 m2 umfaßt, ausgeführt werden. Ein weiteres Verfahren zum Konzentrieren der aufgebrochenen Zellen ist das Ausführen einer Vakuumverdampfung von Wasser aus der Zellsuspension.
  • Die aufgebrochenen Zellen können durch Sprühtrocknen oder Trommeltrocknen getrocknet werden. Vor dem Trocknen werden vorzugsweise Träger, wie etwa Natriumcaseinat, Antioxidantien und/oder Emulgatoren zugesetzt. Das Sprühtrocknen kann zum Beispiel durch Aussetzen einer homogen gemischten Anschlämmung der aufgebrochenen Zellen und gegebenenfalls eines Trägers wie etwa Natriumcaseinat, vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung, einem Sprühtrocknen ausgeführt werden. Das Sprühtrocknen kann geeigneterweise durch Mischen der wäßrigen Natriumcaseinatlösung mit der Hefeanschlämmung unter Erhalten einer Natriumcaseinatkonzentration von etwa 2–10% (Gew./Vol.) durchgeführt werden. Das sich daraus ergebende Gemisch wird anschließend unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre stehen gelassen, bevor es in einen Sprühtrockenturm gepumpt wird, in welchem es dem Trocknen bei einer Temperatur von z.B. 150–230°C, wie etwa 180°C, ausgesetzt wird, um den Wassergehalt des Hefezellenmaterials auf z.B. höchstens 10 Gew.-% zu erniedrigen. Das Hefezellenmaterial wird dann anschließend mittels eines Sprührads zerstäubt. Das sich aus der Sprühtrocknungsbehandlung ergebende pulverige Hefematerial wird geeigneterweise mittels eines Zyklons gewonnen und gegebenenfalls anschließend gesiebt und verpackt. Ein Beispiel einer geeigneten Sprühtrocknungsausrüstung ist ein Sprühturm des Typs EAK-1 von Anhydro. Als Alternative können die aufgebrochenen Hefezellen einem Trommeltrocknen ausgesetzt werden, zum Beispiel in einer geschlossenen Trommeltrocknungsausrüstung bei einer Temperatur von 150–200°C.
  • Da das Astaxanthin bei hohen Temperaturen sehr leicht zersetzt wird, ist es wichtig, daß die aufgebrochenen Zellen hohen Temperaturen eine so kurze Zeit wie möglich ausgesetzt werden. Da das Astaxanthin weiter sauerstoffempfindlich ist, sollte das Trocknen vorzugsweise unter nicht-oxidierenden Bedingungen ausgeführt werden, zum Beispiel in einer Inertatmosphäre, wie etwa Wasserdampf (welcher der aus der Hefesuspension verdampfte Wasserdampf sein kann), Stickstoff und/oder Kohlendioxid, ausgeführt werden.
  • Vor dem Trocknen werden die aufgebrochenen Zellen gegebenenfalls mit geeigneten Emulgatoren, wie etwa Sorbitanmonostearat, oder Antioxidatien, Butylhydroxytoluol (BHT), Butylhydroxyanisol (BHA), Vitamin E, Ascorbinsäure, Ascorbinsäure(II)-sulfat- oder -(II)-phosphatester oder Ascorbylpalmitat, vermischt.
  • Getrocknete aufgebrochene Zellen sind wie nachstehend erläutert unmittelbar als Tierfutterbestandteil brauchbar.
  • Der Astaxanthininhalt der Hefezellen kann aus diesen durch Verwendung verschiedener Extraktionsmittel und Extraktionsverfahren extrahiert werden, um sicherzustellen, daß eine im wesentlichen völlige Extraktion des Astaxanthins aus den Zellen erhalten worden ist. In den meisten Fällen muß die Extraktion an aufgebrochenem Zellmaterial ausgeführt werden. So kann das aufgebrochene Zellmaterial, welches trocken oder feucht sein kann, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, wie etwa Petrolether, welcher geeigneterweise im Fall von feuchtem Zellmaterial verwendet wird, da der Petrolether eine von der Wasserphase getrennte Phase bildet. Andere geeignete organische Lösungsmittel sind Aceton oder Alkohole, wie etwa Methanol oder Ethanol, Ether, Ketone und chlorierte Kohlenwasserstoffe. Durch die Extraktion wird Astaxanthin in dem organischen Lösungsmittel gelöst. Das Astaxanthin kann durch Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung, wie etwa durch Verdampfen in einem Rieselfilmverdampfersystem vor dem Trocknen erhalten werden. Ein Astaxanthinkonzentrat in dem organischen Lösungsmittel kann jedoch auch für bestimmte Zwecke geeignet sein. Ein Konzentrat kann als solches bei der Herstellung von Futter oder Nahrungsmitteln verwendet werden oder das Konzentrat kann verdünnt und in verdünntem Zustand zur Herstellung von Futter oder Nahrungsmitteln verwendet werden, zum Beispiel zum Imprägnieren von Futter oder Nahrungsbestandteilen mit der Lösung oder durch Verwenden der Lösung (oder des Konzentrats) zum Färben von Nahrungsbestandteilen, wie etwa Ölen oder Fetten.
  • Das Astaxanthin kann auch durch Verwendung von Kohlendioxid unter überkritischen Bedingungen aus den Hefezellen extrahiert werden. Das Kohlendioxid kann gegebenenfalls in Kombination mit geeigneten Schleppmitteln, wie etwa organische Lösungsmittel, insbesondere Lösungsmittel der vorgenannten Typen, oder Lösungsmittel, wie etwa Chloroform oder Acetonitril, oder Eisessig, verwendet werden. Die der überkritischen Extraktion ausgesetzten Hefezellen können feuchte oder trockene ganze Hefezellen oder aufgebrochene, z.B. homogenisierte, Hefezellen sein.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren ganzer astaxanthinhaltiger Zellen aus der Kultur ist, die Hefecreme zu filtrieren, zum Beispiel auf einer Filterpresse oder einem sich drehenden Trommelfilter, um einen Filterkuchen zu erhalten, z.B. mit einem Trockenmassegehalt von etwa 25–35%. Der Filterkuchen kann darauf geeigneterweise zu Strängen extrudiert werden, zum Beispiel Stränge mit einem Durchmesser von ungefähr 0,5–2,0 mm in einem mit einer durchlöcherten Platte ausgerüsteten Extruder, um aus Hefeteilchen bestehende Stränge zu erhalten. Die Stränge werden vorzugsweise unmittelbar in die heiße Luft in einem Wirbelbett extrudiert, wo sie getrocknet werden. Die Verdampfung in dem Wirbelbett wird vorzugsweise so geregelt, daß die Temperatur der Hefeteilchen unter 50°C, wie etwa 30–40°C, gehalten wird, und das Verfahren wird beendet, wenn der Wassergehalt auf unter 10 Gew.-%, vorzugsweise unter 8%, bestimmt durch den Hefetrockenmassegehalt (das Verfahren wird in den Beispielen beschrieben), heruntergebracht ist. Wahlweise kann das Trocknen in einem Schalentrockner unter denselben Bedingungen wie in dem Wirbelbett ausgeführt werden. Das getrocknete ganze Zellmaterial kann darauf in einer Kugelmühle, wie etwa eine Coball®-Mühle, zerkleinert werden, wonach es der Extraktion unterzogen wird.
  • Gemäß einem besonderen Verfahren kann ganzes, getrocknetes, zum Beispiel wie vorstehend beschrieben erhaltenes Zellmaterial mit einer öligen Phase, wie etwa ein eßbares Öl oder Fett, wie etwa Sojabohnenöl oder Fischöl, oder einem weiteren organischen Lösungs mittel, wie etwa ein Lösungsmittel des vorstehend erörterten Typs, vermischt werden. Die Temperatur ist vorzugsweise im Bereich von 20–30°C. Das aus dem Zellmaterial erhaltene Gemisch und die ölige Phase oder das organische Lösungsmittel können in einer Mühle, wie etwa eine Kugelmühle, z.B. eine Kugelmühle wie etwa eine Coball®-Mühle, gemahlen werden, um die Zellen aufzubrechen und Astaxanthin aus den Zellen freizusetzen. Die sich daraus ergebende Suspension kann als solche in Futter verwendet werden oder die das Astaxanthin enthaltende ölige Phase kann vor Gebrauch von den Zellresten getrennt werden. Die Trennung wird geeigneterweise durch Zentrifugation in einer schnellaufenden Zentrifuge ausgeführt, dasselbe Prinzip, welches bei der Trennung von Bakterien von Würze angewandt wird. Eine weitere Möglichkeit ist selbstverständlich, durch die vorstehend erörterten Verfahren erhaltenes getrocknetes, aufgebrochenes Zellmaterial mit einer öligen Phase auf ähnliche Weise zu mischen, um das Astaxanthin in die ölige Phase zu extrahieren und die Trennung wie vorstehend beschrieben auszuführen. Die ölige Phase kann auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben zum Färben von Futter verwendet werden.
  • Im Gegensatz zu den meisten herkömmlichen Extraktionsverfahren, welche wie vorstehend angegeben an aufgebrochenem Zellmaterial ausgeführt werden müssen, ist gefunden worden, daß Eisessig erfolgreich zum Extrahieren von Astaxanthin aus ganzen, nicht aufgebrochenen Hefezellen verwendet werden kann. Somit kann gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Astaxanthin aus ganzen Hefezellen mit einem Eisessig umfassenden Lösungsmittel extrahiert werden, wobei die Extraktion vorzugsweise bei einer Temperatur über dem Gefrierpunkt des Lösungsmittels ausgeführt wird, z.B. im Bereich von 20–100°C, vorzugsweise im Bereich von 20–80°C, und bevorzugter im Bereich von 20–60°C. Es wird angenommen, daß es möglich ist, eine selektivere Extraktion von Astaxanthin zu erreichen, wenn die Extraktion bei niedrigeren Temperaturen ausgeführt wird, da die gleichzeitige Extraktion von Fett und anderen extrahierbaren Bestandteilen bei diesen niedrigen Temperaturen eingeschränkt ist. Die Konzentration von Eisessig im Lösungsmittel liegt vorzugsweise im Bereich von 5–100, 10–70. Die Extraktion mit Eisessig führt zu einer Extraktion des Pigments der Zellen von etwa 70–90%, d.h. im wesentlichen alles Pigment und der Astaxanthininhalt der Hefe zellen findet sich im Eisessigextrakt. Außerdem enthält der Extrakt normalerweise etwa 30–35% Hefetrockenmasse. Geeigneterweise befindet sich die der Extraktion mit Eisessig ausgesetzte Hefe in der Form getrockneter Hefe, z.B. Hefe, welche filtriert und nachfolgend in ein Wirbelbett extrudiert worden ist, worin sie getrocknet wird, da auf diese Weise behandelte Hefezellen während der Extraktionsbehandlung nicht aufbrechen (solange die Extraktionsbehandlung keine heftige mechanische Behandlung der Hefezellen umfaßt). Dies erleichtert die nachfolgende Trennung des das Pigment enthaltenden Extrakts von den Hefezellen, verglichen mit der Extraktion aufgebrochener oder homogenisierter Zellen, welche aufgrund ihrer verhältnismäßig kleinen Größe im Vergleich mit nicht aufgebrochenen Zellen in hohem Ausmaß dazu neigen, die Poren des eingesetzten Filters zu verstopfen. Die Eisessigextraktion wird in Beispiel 9 veranschaulicht. Die Extraktion feuchter Hefezellen mit Eisessig kann sich auch als nützlich erweisen.
  • Sowohl das extrahierte Astaxanthin als auch das ganze getrocknete Zellmaterial werden vorzugsweise unter sauerstoffarmen Bedingungen aufbewahrt, um das Astaxanthin vor Zersetzung zu schützen. So werden die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder das extrahierte Astaxanthin vorzugsweise mittels Antioxidantien, wie etwa Butylhydroxyanisol (BHA), Butylhydroxytoluol (BHT), Vitamin E oder Ascorbinsäure, Ascorbinsäure-(II)-sulfat- oder -(II)-phosphatester oder Ascorbylpalmitat, und/oder Emulgatoren, wie etwa Monoglyceride oder Sorbitanester, geschützt und werden geeigneterweise unter luftdichten Bedingungen aufbewahrt.
  • Die Hefezellen nach Anspruch 1 oder Hefezellteile, welche Astaxanthin in einer Menge von wenigstens 600 μg pro g Hefetrockenmasse enthalten, bestimmt wie vorstehend erläutert, sind für Tierfutter brauchbar, in Kombination mit anderen Futtermittelbestandteilen. Vorzugsweise machen die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Hefezellteile höchstens 10 Gew.-% der Trockenmasse der gesamten Tierfutterzusammensetzung, vorzugsweise höchstens 5% und bevorzugter höchstens 3% aus. Diese Werte sind auf das endgültige, an die Tiere zu verabfolgende Futter berechnet. Es ist ferner möglich, Futtervormischungen mit einer höheren Hefezellenkonzentration herzustellen. Die Hefezellen oder Hefezellteile oder das Astaxanthin werden gegebenenfalls mit Emulgatoren vermischt, welche befähigt sind, das Astaxanthin in Wasser dispergierbar zu machen. Außerdem können die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Hefezellteile mittels der vorstehend angeführten Antioxidantien und/oder Emulgatoren gegen Oxidation geschützt werden und/oder das Tierfutter kann in luftdichte und gegebenenfalls evakuierte Behälter verpackt werden.
  • Die astaxanthinhaltigen getrockneten Hefezellen können auch für sich zur Verwendung als Futterbestandteil verpackt werden, wobei die endgültige Futtermischung am Ort der Verwendung zubereitet wird oder die Hefezellen als solche an Tiere verabfolgt werden, welche sonst mit normalen oder angepaßten Futtermischungen gefüttert werden.
  • Die Hefezellen oder Hefezellteile werden geeigneterweise und normalerweise mit anderen Ernährungsbestandteilen gemischt, welche vorzugsweise aus Proteinen und Kohlenhydratquellen, Fetten oder Ölen und Mikronährstoffen, wie etwa Vitamine und Mineralien, ausgewählt sind. Als Beispiele für Proteinquellen können Casein, Albumin, Klebereiweiß, Fischmehle, konzentrierte Fischreste (Fischleimmehl und Blutmehl) angeführt werden. Als Beispiele für Kohlenhydratquellen können gelatinisierte Stärke, extrudierter Weizen, Molassen, Pflanzenmehle und Maisstärke angeführt werden. Die Fettbestandteile im Futter können zum Beispiel Fischöl und Dorschtran und/oder Pflanzenöle, wie etwa Maisöl, sein. Die Mineralien können z.B. aus anorganischen oder einfachen organischen Verbindungen von Calcium, Phosphor, Natrium, Kalium, Chlor, Magnesium, Kupfer, Mangan, Zink, Kobalt und Selen ausgewählt sein. Als Beispiele von Vitaminen können Vitamin B12, Prolin, Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin K, Thiamin, Ascorbinsäure, Riboflavin, Pyridoxin, Pantothensäure, Niacin, Hiotin, Cholin und Inosit angeführt werden.
  • Die Erfindung macht es ferner möglich, Lebensmittel oder Futter bereitzustellen, welche Astaxanthin enthalten, das aus Phaffia rhodozyma-Hefezellen zum Beispiel durch irgendeines, der vorstehend beschriebenen Verfahren extrahiert worden ist, vorzugsweise aus Hefezellen gemäß der Erfindung oder gemäß dem Verfahren der Erfindung produzierten Hefezellen. Das Astaxanthin kann sowohl im Gemisch mit den vorstehend beschriebenen Futterbestandteilen und auch im Gemisch mit anderen Nahrungsmittel- oder Nährstoffbestandteilen als auch im Gemisch mit anderen Farbstoffen verwendet werden. So ist aus Hefezellen extrahiertes Astaxanthin allein oder in Kombination mit anderen Farbstoffen zur Verwendung in eßbaren Ölen, Butter, Margarine, Backfett, Mayonnaise, Pasteten, Suppen, Snackprodukten, Produkten auf Surimigrundlage, Desserts, Eiscreme, Süßwaren, Backwaren und Getränken gut geeignet. Wenn das Astaxanthin in Nahrungsmitteln verwendet wird, welche hauptsächlich aus Wasser oder Wasserphasen bestehen, wird das Astaxanthin vorzugsweise mit einem vorstehend erörterten Emulgator vermischt, welcher das Astaxanthin in der Wasserphase dispergierbar macht, ohne Neigung zu kristallisieren und ohne die Notwendigkeit, eine Ölphase zum Lösen des Astaxanthins zuzusetzen.
  • Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Füttern von Tieren, um eine rötliche Pigmentierung ihres Fleisches und/oder von Produkten, die von den Tieren erzeugt werden, zu erhalten, welches das Verabreichen eines Futters an die Tiere umfaßt, welches Phaffia rhodozyma-Hefezellen nach Anspruch 1 oder Zellteile, die Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse enthalten, bestimmt nach dem vorstehend angegebenen Verfahren, oder aus derartigen Hefezellen oder Zellteilen extrahiertes Astaxanthin enthält.
  • Die Menge des das Astaxanthin oder die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Zellteile enthaltenden Futters, welches an die Tiere verabreicht wird, hängt von der betreffenden Tierart und von der Pigmentierungswirkung ab, welche mittels des Astaxanthins zu erhalten gewünscht wird. Offensichtlich ist das zu befolgende Prinzip, daß das Tier eine normale empfohlene Tagesration Makro- und Mikronährstoffe und außerdem Astaxanthin in einer Form und in einer Menge haben sollte, welche zur gewünschten Pigmentierung des in Frage kommenden tierischen Fleisches oder Tierprodukts führt. In einigen Fällen hängt die Menge des zu verabreichenden Astaxanthins von der Jahreszeit ab; so ist es zum Beispiel normalerweise nicht bevorzugt, Astaxanthin oder andere Carotinoide an Kühe während der Sommerzeit zu verabreichen, um eine Pigmentierung der Butter zu erhalten, da die Butterpigmentierung normalerweise als ausreichend angesehen wird, wenn die Kühe grasen. Auch die Menge, in welcher das das Astaxanthin enthaltende Futter oder die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Zellteile den Tieren verabreicht werden, kann in einigen Fällen von der Jahreszeit abhängen. So ist zum Beispiel im Fall von Fischen wie Lachs oder Seeforelle die von den Fischen während der Winterzeit verzehrte Futtermenge verhältnismäßig niedrig, was im Gegensatz zu der von den Fischen während der Sommerzeit verzehrten Menge steht. Eine geeignete, an die Fische verabreichte Futtermenge kann jedoch etwa 1,5% des Fischkörpergewichts pro Tag sein, was den vom California State Department of Fish and Game gegebenen Empfehlungen entspricht.
  • Wenn Geflügel nach dem vorstehend angegebenen Verfahren gefüttert wird, um das Gelbe der von dem Geflügel erzeugten Eier und/oder das Fleisch oder die Haut des Geflügels zu pigmentieren, kann das Futter aus herkömmlichen Geflügelfutterbestandteilen bestehen, wovon eines ein Beispiel ist, das vorzugsweise sowohl aus Protein- und Kohlenhydratquellen, wie etwa Sojabohnenmehl, Sojabohnenprotein, Cellulose, Stärke, und Fettquellen, wie etwa Sojabohnenöl, Vitaminen, wie etwa eine Gesamtvitaminmischung, und Mineralien, wie etwa ein Gemisch für Geflügel gebräuchlicher Mineralienbestandteile, als auch Calciumquellen für die Eierschalen besteht, wobei die Calciumquellen vorzugsweise Calciumcarbonat und Calciumhydrogenphosphat sind. Eine kleine Menge Natriumchlorid kann ebenfalls vorhanden sein. Das Futter kann in einer herkömmlichen Dosierung verabreicht werden.
  • Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht:
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Erhaltung der Kulturen
  • Kulturen von Phaffia rhodozyma werden auf zwei Wegen erhalten:
    • 1) Auf Agarschrägen (YM-Agar). Die Schrägen werden eine Woche bei 20°C inkubiert und 1 Monat bei 4°C gehalten, in YM-Brühe erneut kultiviert, bevor neue Schrägen hergestellt wurden.
    • 2) Kryokonservierung bei –80°C. Aus Kryogläschen oder Agarschrägen wurden die Stämme in 50 ml YM-Brühe in einer 250 ml Schüttelflasche eingeimpft. Die Schüttelflasche wird auf einem Umlaufschüttler (150 Upm) 4–5 Tage bei 20°C geschüttelt. Die Hefezellen werden absitzen gelassen und die Flüssigkeit wird dekantiert. Der Bodensatz wird mit Glycerin auf eine Konzentration von 20% vermischt, in Kryogläschen abgefüllt und in einer Gefriertruhe bei –80°C gelagert.
  • Bestimmung des Hefetrockenmassegehalts
  • 5 ml einer Hefezellkultur werden in einem austarierten Sarstedtröhrchen (welches bei 110°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet worden war) 5 Minuten bei 10000 × g zentrifugiert und zwei Mal in entmineralisiertem Wasser gewaschen. Die Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt und das Gewicht des Röhrchens mit den Zellen wird nach dem Trocknen bei 110°C bis zur Gewichtskonstanz gemessen, was das Gewicht der Hefezellen ergibt (Y g). Der Hefetrockenmassegehalt (YDMC) wird darauf berechnet als: YDMC (g/l) = Y/5,00 × 1000
  • Der angegebene Gehalt ist der Mittelwert aus zwei Bestimmungen.
  • Spektrophotometrische Analyse zur Gesamtpigmentbestimmung
  • Der Gesamtpigmentgehalt in einem Methanolextrakt wird spektrophotometrisch mittels λmax und dem Beerschen Gesetz bestimmt, wie von B.H. Davies, "Carotenoids", in T.W. Goodwin (Hrsg.), Chemistry and Biochemistry of plant pigments, New York, 1976, Bd. 2, S. 149, beschrieben. Das eingesetzte Spektrophotometer ist ein Shimadzu Aufzeichnungsspektrometer UV 260 für sichtbares Licht und UV. Der Pigmentgehalt wird durch Anwenden der nachstehenden Formeln 1, 1a, 2, 2a und der Extinktionskoeffizienten der nachstehenden Tabelle 1 berechnet.
  • TABELLE 1 Extinktionskoeffizienten des Astaxanthinstandards in verschiedenen Lösungsmitteln, hergestellt wie für die Standardlösung vorstehend angegeben
    Figure 00270001
  • Pigementextraktion und -analyse – Verfahren 1
  • Etwa 30 ml der Hefekultur wurden in Sarstedtröhrchen überführt und 5 Minuten bei 10000 × g zentrifugiert. Die Hefezellen wurden in entmineralisiertem Wasser gewaschen und in etwa 20 ml Methanol suspendiert. Die Methanolsuspension wurde in eine Glaskugelmühle des Typs Bead Beater (Biospec Products Inc., USA), in welcher der Rotor mit Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,4 mm (etwa 15 g Glasskugeln) bedeckt war, gegeben, daß das freibleibende Kugelmühlenvolumen eingenommen wurde. Die Zerkleinerungsbehandlung wurde durch 5 Mal Laufenlassen der Mühle für 1 Minute in Intervallen von 30 Sekunden durchgeführt, wobei Eiswasser im Kühlmantel enthalten war, um sicherzustellen, daß die Temperatur der Zerkleinerungsbehandlung unter 20°C gehalten wurde. Unmittelbar nach der Zerkleinerungsbehandlung wurde ein Teil des Homogenisats in Sarstedtröhrchen überführt und die Hefetrockenmasse wurde wie vorstehend beschrieben, aber ohne Zentrifugation bestimmt. Eine bekannte Menge (b g) des Homogenisats wurde in einen 10 ml-Meßkolben überführt und Lösungsmittel wurde zugesetzt, um 10 ml zu ergeben. Die Absorption wurde in dieser Lösung gemessen.
  • Der Gesamtpigmentgehalt in μg pro g Hefetrockenmasse wird bestimmt durch:
    Figure 00280001
    E = Absorption bei λmax in dem verwendeten Lösungsmittel in einer 1 cm-Küvette
    E 1% / 1 cm = Absorption einer 1%igen (Gew./Vol.) Lösung in einer 1 cm-Küvette
    b = g Extrakt
    D = mg Hefetrockenmasse/g Extrakt
  • Pigmentextraktion und -analyse – Verfahren 2
  • Eine vorbestimmte Menge der Hefekultur (a ml) wurde in Sarstedtröhrchen überführt und 5 Minuten bei 10000 × g zentrifugiert. Die Hefezellen wurden in entmineralisiertem Wasser gewaschen und in etwa 20 ml Methanol suspendiert. Die Methanolsuspension wurde in eine Glaskugelmühle des Typs Head Beater (Biospec Products Inc., USA), in welcher der Rotor mit Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,4 mm (etwa 15 g Glaskugeln) bedeckt war, gegeben, daß das freibleibende Kugelmühlenvolumen eingenommen wurde. Die Zerkleinerungsbehandlung wurde durch 5 Mal Laufenlassen der Mühle für 1 Minute in Intervallen von 30 Sekunden durchgeführt, wobei Eiswasser im Kühlmantel enthalten war, um sicherzustellen, daß die Temperatur der Zerkleinerungsbehandlung unter 20°C gehalten wurde. Unmittelbar nach der Zerkleinerungsbehandlung wurde die Flüssigkeit in einen 50 ml-Meßkolben überführt. Die Glaskugeln werden in der Mühle mit 4 × 8 ml Methanol gewaschen. Die Fraktionen werden gesammelt und gemischt und Methanol wird zugesetzt um 50 ml zu ergeben. Der Methanolextrakt wird vor der Pigmentanalyse filtriert. Die Hefetrockenmasse in der Kultur wird wie vorstehend bestimmt.
  • Der Gesamtpigmentgehalt pro ml Probe wird bestimmt durch:
    Figure 00290001
    X' = μg Pigment/ml Probe
    a = Probenvolumen in ml
    E = Absorption bei λmax in dem verwendeten Lösungsmittel in einer 1 cm-Küvette
    E 1% / 1 cm = Absorption einer 1%igen (Gew./Vol.) Lösung in einer 1 cm-Küvette
  • Der Gesamtpigmentgehalt pro g Hefetrockenmasse wird bestimmt durch:
    Figure 00290002
    Y = μg Pigment/g Hefetrockenmasse
    YDMC = g Hefetrockenmasse/l Kulturbrühe
  • HPLC-Analyse zur Astaxanthinbestimmung – Verfahren 1
    • HPLC-Daten:
    • Ausrüstung:
    • Säulen: LKB Ultropac-Vorsäule, Lichrosorb RP 18 7 μm, 4 × 30 mm LKB Ultropac-Säule, Lichrosorb RP 18 5 μm, 4 × 250 mm
    • Detektor: LKB 2151 variabler Wellenlängenmonitor
    • Integrator: Waters 740 Datenmodul
    • Controller: LKB 2152 HPLC-Controller
    • Pumpen: LKB 2150 HPLC-Pumpen
    • Autosampler: LKB 2157 Autosampler mit veränderbarer Schleife
    • manuelle Inj.: Rheodyne 20 μl Schleife
    • Lösungsmittel: A: 860 ml Acetonitril + 100 ml Wasser + 40 ml Ameisensäure B: 960 ml Essigsäureethylester + 40 ml Ameisensäure Alle Lösungsmittel waren von HPLC-Qualität
    • Durchfluß: 1,0 ml/min
    • Gradienten: 0-100 B 20 Minuten, linearer Gradient 100-0% B 10 Minuten, linearer Gradient
    • Detektor: 471 nm
    • Temperatur: Umgebungstemperatur
    • Standardlösung: 5 mg reines, von Hoffmann-La Roche geliefertes Astaxanthin (Schmp. 220–222°C, Absorption einer 1%igen (Gew./Vol.) Acetonlösung in einer 1 cm-Küvette 2100) (nachstehend als Astaxanthinstandard bezeichnet) werden ausgewogen und in 500 ml Aceton gelöst.
  • Zur HPLC-Analyse werden 20 μl der betreffenden Probe in den HPLC-Chromatographen eingespritzt.
  • HPLC-Analyse zur Astaxanthinbestimmung – Verfahren 2
    • HPLC-Daten:
    • Ausrüstung:
    • Säulen: Supelco-Vorsäule Supelco LC 18 – DB, Teilchengröße 5 μm Säulenabmessungen 4,6 × 250 cm
    • Detektor: LKB 2151 variabler Wellenlängenmonitor
    • Integrator: Waters 740 Datenmodul
    • Controller: LKB 2152 HPLC-Controller
    • Pumpen: LKB 2150 HPLC-Pumpen
    • Autosampler: LKB 2157 Autosampler mit veränderbarer Schleife
    • manuelle Inj.: Rheodyne 20 μl Schleife
    • Lösungsmittel: A: 400 ml Tetrahydrofuran 400 ml Methanol 200 ml 0,02 M Glycinpuffer pH = 2,6 B: 1000 ml Tetrahydrofuran Alle Lösungsmittel sind von HPLC-Qualität. Der Puffer wird vor Gebrauch durch ein 0,22 μm-Filter sterilfiltriert
    • Detektor: 480 nm
    • Temperatur: Raumtemperatur
    • Gradienten und Durchfluß:
      Figure 00320001
      Standardlösung: 5 mg Astaxanthinstandard werden ausgewogen und in 500 ml Tetrahydrofuran gelöst.
  • Zur HPLC-Analyse werden 20 μl der betreffenden Probe in den HPLC-Chromatographen eingespritzt.
  • Sarstedtröhrchen
  • Mit einem Polypropylenstopfen ausgerüstete, von Hounisens Laboratory, Århus, Dänemark, gelieferte Polypropylenzentrifugenröhrchen des Typs 55533.
  • Chemikalien
  • Im Laboratoriumsmaßstab verwendete Chemikalien waren von analytischer Reinheit. Bei den Fermentationen verwendete Chemikalien waren von Lebensmittelqualität.
  • Die Glukose- und Saccharosekonzentrationen wurden unter Verwendung von Testbestecken (Best. Nr. 139041) von Boehringer Mannheim analysiert.
  • Medium für Schüttelflaschenkultivierungen und Agarplatten Von Difco Laboratories Incorporated geliefertes YM- (Yeast Morphology) Medium (Difco Manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology, 10. Auflage, Detroit, 1984).
  • Kryogläschen
  • Polypropylenröhrchen mit einem Volumen von 2,0 ml des von Technunc, Roskilde, Dänemark, gelieferten Typs 363401.
  • BEISPIEL 1
  • Mutagenisierung
  • In jedem Fall wurde die Mutagenisierungsbehandlung so ausgeführt, um einen Überlebensgrad der behandelten Kultur von 1–5% zu erhalten. Geeignete Mutanten wurden durch visuelles Vergleichen der Intensität der roten Farbe der Mutanten ausgewählt, wenn sie als einzelne Kolonien auf Agarplatten plattiert wurden.
  • UV-Bestrahlung
  • Eine eben trübe, vier Tage alte Kultur von ATCC 24261, welche bei 20–22°C in YM-Medium gezüchtet war, wurde in einer 0,9%igen NaCl-Lösung auf Konzentrationen von 10–1, 100–1,5, 10–2, 10–2,5 beziehungsweise 10–3 verdünnt und jeweils 0,3 ml dieser Verdünnungen wurden auf Agarplatten plattiert, um 100–300 Kolonien enthaltende Agarplatten zu erhalten. Die Platten wurden darauf 30 Sekunden in einer Entfernung von 20 cm von der Strahlungsquelle (Vilbert Lourmat VL 30 LC) ultravioletter Strahlung bei 254 nm ausgesetzt und anschließend 10 Tage bei 20–22°C kultiviert, wonach die Farbe der sich daraus ergebenden Kolonien verglichen wurde.
  • EMS- (Methansulfonsäureethylester) Behandlung
  • 2 × 15 ml einer vier Tage alten Kultur von ATCC 24261, welche bei 20–22°C in YM-Medium bei einer Temperatur von 20–22°C auf einem Schüttelbrett gezüchtet war, wurde 15 Minuten bei 1250 × g in einer MSE Major-Zentrifuge zentrifugiert und das Pellet wurde in 2 × 15 ml steriler 0,9%iger NaCl-Lösung in 200 ml-Zentrifugenröhrchen suspendiert. Eine der Zellsuspensionen wurde als Kontrolle eingesetzt. Der anderen Zellsuspension wurde 1 g EMS (Serva 28755) zugesetzt. Nach 30 Minuten Behandlung bei 20°C wurden 150 ml kalte, sterile 0,9%ige NaCl-Lösung zugesetzt. Die Hefezellen wurden zwei Mal in steriler 0,9%igem NaCl gewaschen und in 0,9%igem NaCl suspendiert. Die Hefezellensuspension wurde darauf verdünnt und auf dieselbe Weise wie vorstehend für die UV-Behandlung beschrieben auf Agarplatten plattiert. Einer der isolierten Mutanten wurde am 6. April 1987 beim CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) unter der Zugangs-Nr. 224-87 hinterlegt.
  • Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
  • Etwa 25 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (Aldrich Chemie BDR) wurden einem austarierten, graduierten 10 ml-Zylinder zugesetzt, welcher mit einem Glasstopfen versehen war. Wasser wurde zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erhalten und das N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin wurde darin durch Schütteln gelöst. 10 × 1 ml Vorratslösung wurden von dieser Lösung erhalten.
  • 2 × 20 ml einer vier Tage alten Kultur von CBS 224-87 (der durch die vorstehende EBS-Behandlung erhaltene Mutant), welche bei 20–22°C in YM-Medium auf einem Schüttelbrett gezüchtet war, wurde in Sarstedtröhrchen überführt und zwei Zentrifugationsdurchläufen unterzogen. Das Pellet wurde in 1,5 ml 0,9%iger NaCl-Lösung suspendiert und 1 ml der vorstehend hergestellten Vorratslösung wurde zugesetzt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 20–22°C wurden die Hefezellen 5 Mal in 10 ml kalter, steriler 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen, wodurch das N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin entfernt wurde. Die Hefezellen wurden darauf verdünnt und auf dieselbe Weise wie vorstehend für die UV-Behandlung beschrieben auf Agarplatten plattiert. Einer der isolierten Mutanten wurde am 6. April 1987 beim CBS unter der Zugangs-Nr. 225-87 hinterlegt.
  • Rückisolierung
  • CBS 225-87 ist wie nachstehend beschrieben der Isolierung unterzogen worden. Hefezellen aus einem gefriergetrockneten Gläschen werden in YM-Medium suspendiert und 5 Tage bei 20–22°C inkubiert.
  • Die Kultur wird auf YM-Platten plattiert und 10 Tage bei 20–22°C inkubiert und neue Kolonien werden isoliert. Eine der Kolonien wird am 23. März 1988 beim CBS unter der Zugangs-Nr. 215-88 hinterlegt.
  • BEISPIEL 2
  • Bestimmung des Astaxanthingehalts von Phaffia rhodozyma Wildtyp-Stämmen und in Beispiel 1 hergestellten Mutanten Die Hefezellenkultivierung und die im vorliegenden Beispiel beschriebene Astaxanthinbestimmung stellen auf der einen Seite die Bedingungen, unter welchen die Zellen gezüchtet werden, und auf der anderen Seite die Bedingungen dar, unter welchen Astaxanthin in dem vorgenannten Standardverfahren des Anmelders zum Bestimmen der einem Hefestamm innewohnenden Befähigung zum Produzieren von Astaxanthin bestimmt wird. Diese sind dieselben Standardbedingungen, wie sie in den Ansprüchen erwähnt werden.
  • Schüttelflaschenkultivierung
  • 100 μl einer 4 Tage alten Kultur von ATCC 24261, welche in YM-Medium bei 20–22°C auf einem Schüttelbrett gezüchtet war, wurde in 50 ml YM-Medium eingeimpft, welches in einer 500 ml-Schüttelflasche mit 2 Schikanen enthalten war. Die Kultur wurde dem Wachstum auf einem Schüttelbrett unter kreisförmigem Schütteln bei 150 Upm über 5 Tage bei 20–22°C und einer Sauerstofftransferrate von mindestens 30 mMol/l/Stunde ausgesetzt, wodurch eine Dichte der Hefezellenkultur von 0,6% erhalten wurde.
  • Pigmentanalyse
  • Der Astaxanthingehalt in dem Extrakt wurde durch die folgenden drei Verfahren festgestellt.
    • 1. Ein Aceton-, Methanol- und Ethanolextrakt, welche alle wie für die Methanolextraktherstellung beschrieben hergestellt worden waren, wurde dem spektrophotometrischen Scannen unterzogen und die in Tabelle 1 angegebenen λmax-Werte wurden erhalten.
    • 2. Einer Hälfte von 10 ml eines auf dieselbe Weise wie vorstehend hergestellten Methanolextrakts wurden etwa 50 mg Kaliumborhydrid zugesetzt, um das Astaxanthin zu reduzieren, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Die Absorptionen des Extrakts und der mit Kaliumborhydrid behandelten Probe wurden im Spektrophotometer mit veränderlichen Wellenlängen gemessen. Das freie Astaxanthin zeigte einen breiten Peak bei 480 nm und das reduzierte Astaxanthin zeigte zwei Peaks bei 450 und 476 nm, welche den in der Literatur angegebenen Werten entsprechen.
    • 3. Die Retentionszeit der astaxanthinhaltigen Extrakte bei der HPLC unter den vorstehend definierten Standardbedingungen wurde mit der Retentionszeit der vorstehend definierten Standardlösung verglichen, d.h. die Peaks der astaxanthinhaltigen Probe der Erfindung bei der HPLC unter Standardbedingungen wurden mit den Peaks der Standardlösung bei der HPLC verglichen. Die Retentionszeiten wurden als identisch befunden.
  • Sowohl die Mutantenstämme der Erfindung (CBS 224-87 und CBS 225-87) als auch alle bekannten hinterlegten Astaxanthin produzierenden P. rhodozyma-Stämme wurden auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben gezüchtet und analysiert. Der Gesamtpigmentgehalt und der Astaxanthingehalt der Stämme werden nachstehend in Tabelle 2 angegeben.
  • Die Gesamtpigmentanalysen wurden gemäß dem Verfahren "Pigmentextraktion und -analyse – Verfahren 1" durchgeführt. Astaxanthin wurde gemäß der "HPLC-Analyse zur Astaxanthinbestimmung – Verfahren 1" analysiert.
  • TABELLE 2
    Figure 00370001
  • Die Werte sind die Mittelwerte von 4 unabhängigen Messungen. Es ist anzumerken, daß die Mutantenstämme der Erfindung einen beträchtlich erhöhten Astaxanthingehalt zeigen.
  • BEISPIEL 3 (REFERENZ)
  • Fermentation
  • Die Fermentationen wurden als Zulauffermentationen unter Kohlenhydrateinschränkung in sorgfältig gewaschenen und sterilisierten 4 m3-Fermentern vom Bubble Column-Typ mit einem stationären Belüftungssystem ausgeführt, welches aus durchlöcherten Luftleitungen bestand. Die Fermenter wurden mit pH-Elektroden, Einlässen für den pH regelnde Mittel und schaumunterdrückende Mittel und Alkoholdetektoren Zum Messen von Alkohol in der Abluft ausgerüstet. Die Mäntel der Fermenter waren thermostatisiert.
  • Die Ausgangswürze hat die folgende Zusammensetzung: 20 g/l Molassen, 0,6 g/l Diammoniumsulfat, 0,8 g/l Diammoniumhydrogenphosphat und 0,125 g/l Magnesiumsulfat, welche bereits 30 Minuten im Fermenter zusammen mit einer geeigneten Menge Wasser (30 l im 100 l-Übertragungsfermenter und 2000 l im 4 m3-Produktionsfermenter) aufgekocht waren, bevor der betreffende Fermenter beimpft wurde. Das Medium, welches dem Fermenter bei der Zulauffermentierung zugeführt wurde, wurde zwei verschiedenen Vorratsbehältern entnommen, d.h. einem Chemikalienvorratsbehälter, welcher aus 10 kg Diammoniumsulfat, 5,6 kg Diammoniumhydrogenphosphat und 80 l Wasser bestand, und einem Molassenvorratsbehälter, welcher aus 450 kg Molassen und 1000 l Wasser bestand, welches im Autoklaven behandelt worden war. 0,1 mg Desthiobiotin und 1,6 kg Magnesiumsulfat wurden dem Fermenter direkt zugeführt, bevor der Rest des Mediums zugeführt wurde. Alle Chemikalien waren von Lebensmittelqualität. Die Molassen waren Zuckerrübenmolassen von De Danske Sukkerfabrikker.
  • Die Belüftung während der Fermentierung betrug 8,4 m3/Minute. Contraspum 210 (Zschimmer & Schwartz) wurde als schaumunterdrückendes Mittel eingesetzt und Schwefelsäure wurde als den pH regelndes Mittel eingesetzt.
  • Hefezellen des Stammes ATCC 24261 wurden vermehrt, indem sie von einer Schräge in ein Reagenzglas mit einem Durchmesser von 2 cm überführt wurden, welches 5 ml YM-Medium enthielt, in welchem die Zellen 4 Tage auf einem Schüttelbrett unter ausreichender Belüftung bei einer Temperatur von 20–22°C kultiviert wurden, wonach die Kultur in 2 l-Erlenmeyerkolben überführt wurden, welche 1 l YM-Medium enthielten. Nach 3 Tagen Inkubation auf einem Schüttelbrett und unter ausreichender Belüftung bei einer Temperatur von 20–22°C wurde 1 l der Kultur in einen 100 l-Fermenter überführt, welcher 30 l Ausgangswürze enthielt. Die Kultur wurde einem Ansatzwachstum bei 20–22°C ausgesetzt, bis ein Hefetrockenmassegehalt von 1 g/l erhalten wurde. Danach wurde die Nährstoffzufuhr begonnen und die Zulauffermentierung wurde bei 20–22°C ausgeführt. Nach 2 Tagen Wachstum wurden 30 l der Kultur unter sterilen Bedingungen mittels einer peristaltischen Pumpe in den 4 m3-Fermenter überführt, welcher 2000 l Ausgangswürze enthielt. Die Kultur wurde einem Ansatzwachstum bei 20–22°C ausgesetzt, bis in der Kultur ein Hefetrocken massegehalt von 1 g/l erhalten war. Darauf wurde die Molassezufuhr begonnen und 38 Stunden fortgesetzt, wonach der Molassenvorratsbehälter geleert war. Die Chemikalien wurden während der ersten 24 Stunden verhältnisgleich zu den Molassen zugeführt. Die Zulauffermentierung wurde bei einer Temperatur von 20–22°C ausgeführt. Die Molassenmenge in dem Molassenvorratsgefäß wurde so eingestellt, daß ein Hefetrockenmassegehalt von nicht mehr als etwa 4% in der fermentierten Würze erhalten wurde.
  • Die Molassenzufuhr zum Fermenter während der Zulauffermentierung wurde mit dem Ziel des Erreichens einer spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit der Hefezellen von μ = 0,15 Stunde–1 eingestellt und wurde gemäß der Ethanolkonzentration in der Würze weiter geregelt, welche niedriger als 0,1 Vol.-% sein sollte. So wurde die Ethanolkonzentration laufend gemessen und wenn sie als zu hoch befunden wurde, wurde die Molassenzuführungsrate erniedrigt, bis erneut ein annehmbarer Ethanolgehalt erhalten war.
  • Die Belüftung der fermentierten Würze wurde 16 Stunden bei 20–22°C ohne irgendeine Nähstoffzufuhr fortgesetzt.
  • Die Zusammensetzung sowohl der Hefezellen als auch der Gesamtpigmentgehalt und der Astaxanthingehalt wurden zum Zeitpunkt 0, d.h. gerade bevor die Nährstoffzufuhr zu dem 4 m3-Fermenter begonnen wurde, nach 38 Stunden, wenn die Fermentierung und das Wachstum beendet waren, und nach 16 Stunden Belüftung der fermentierten Würze gemessen. Der Gesamtpigmentgehalt und der Astaxanthingehalt wurden wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt und die Zusammensetzung der Hefezellen wurde durch herkömmliche Techniken bestimmt. So wurden der Gesamtstickstoffgehalt durch Kjeldahlanalyse bestimmt, der Trehalosegehalt wurde wie in Journ. Am. Chem. Soc. 72, 1950, S. 2059, beschrieben bestimmt und der Phosphorsäuregehalt wurde wie in Water and Wastewater, American Public Health Association, Inc., S. 199 (1960) beschrieben bestimmt. Die Ethanolanalyse wurde durch Boidins Verfahren zur Bestimmung geringer Alkoholmengen (vgl. Annal. de la brasserie et de la distillerie, 1924–25, S. 177) ausgeführt. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 3 angegeben.
  • Die Gesamtpigmentanalyse wurde gemäß Verfahren 1 durchgeführt. Die Astaxanthinanalyse durch HPLC wurde gemäß Verfahren 1 durchgeführt.
  • TABELLE 3 Zulauffermentierung von ATCC 24261
    Figure 00400001
  • BEISPIEL 4 (REFERENZ)
  • Auf eine ähnliche Weise wie dem in Beispiel 3 beschriebenen Versuch wurden mit dem Stamm 24261 Zulauffermentationen durchgeführt, wobei die einzigen Unterschiede waren, daß das Ausgangswürzevolumen 1000 l betrug, die Impfkultur im 4 m3-Fermenter 6 × 1 l ATCC 24261 war, welche wie vorstehend angegeben vermehrt worden war, und der Chemikalienvorratsbehälter aus 0,5 kg Diammoniumsulfat, 2,8 kg Diammoniumhydrogenphosphat und 80 l Wasser bestand, und der Molassenvorratsbehälter aus 250 kg Molassen und 1000 l Wasser bestand. Während der Zulauffermentation wurde der Nährstoff die ersten 65 Stunden dem Fermenter zugeführt, wonach die Nährstoffzufuhr beendet wurde und die Kultur 72 Stunden der Belüftung ausgesetzt wurde.
  • Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 4 angegeben.
  • TABELLE 4 Zulauffermentierung von ATCC 24261
    Figure 00410001
  • BEISPIEL 5
  • Versuche mit dem Mutantenstamm CBS 225-87 der Erfindung wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 beschrieben mit einem Ausgangswürzevolumen von 1000 l durchgeführt, wobei die Impfkultur 6 × 1 l CBS 225-87 betrug, welche durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren vermehrt worden war, und mit einem Chemikalienvorratsbehälter, welcher aus 5 kg Diammoniumsulfat, 2,8 kg Diammoniumhydrogenphosphat und 80 l Wasser bestand. Kein Alkohol wurde während der Zulauffermentation gebildet und der Nährstoff wurde zwischen den Stunden 0–57 zugeführt, wonach die Kultur der Belüftung ohne Nährstoffzufuhr ausgesetzt wurde. Die Hefezellenzusammensetzung zur Stunde 80 betrug 6,5% Stickstoff in der Hefetrockenmasse, 2,5% Phosphorpentoxid in der Hefetrockenmasse und 6,6% Trehalose in der Hefetrockenmasse. Das Gesamtpigment, das Astaxanthin und die Hefetrockenmasse wurden während der Zuführungsfermentation bestimmt und ergab die nachstehend in Tabelle 5 angegebenen Werte: TABELLE 5 Zulauffermentierung von CBS 225-87
    Figure 00420001
  • Der Gesamtpigment- und Astaxanthingehalt in μg/ml ist aus dem analysierten Trockenmassengehalt und den μg/g-Werten des Gesamtpigments und Astaxanthins berechnet worden.
  • BEISPIEL 6
  • Der Pigment- und Astaxanthingehalt von CBS 215-88 und den Wildtyp-Stämmen CBS 5905 und ATCC 24261 wurden bestimmt.
  • Schüttelflaschenkultivierungen
  • Von einer Agarschräge wurden Hefezellen in YM-Medium eingeimpft und 2 Tage bei 20–22°C inkubiert. 1 ml der Kultur wurde in 50 ml YM-Medium eingeimpft; welches in 250 ml-Schüttelflaschen mit 4 Schikanen enthalten war. Die Kultur wurde 5 Tage dem Wachstum bei 20–22°C auf einem Schüttelbrett unter kreisförmigem Schütteln bei 150 Upm ausgesetzt.
  • Quantitative Bestimmungen des Gesamtpigments wurden gemäß Verfahren 2 durchgeführt. Die Astaxanthinbestimmung wurde gemäß Verfahren 2 durchgeführt.
  • Berechnungsbeispiele (für CBS 215-88):
  • Das Gesamtpigment im Methanolextrakt wurde durch spektrophotometrische Analyse bestimmt. Die Absorption des 50 ml-Extrakts abzüglich der Methanolabsorption wurde zu E = 1,189 gemessen. Das Probenvolumen war 29 ml. Der Gesamtpigmentgehalt im Hefeextrakt berechnete sich nach Formel (2) wie folgt: X' = 1,160 × 50/2100/29 × 10000 μg/ml = 9,52 μg/ml
  • Die Hefetrockenmasse wurde zu 6,7 g/l bestimmt. Der Gesamtpigmentgehalt pro g Hefetrockenmasse wird durch Formel (2a) wie folgt bestimmt: Y = 9,52/7,1 × 1000 μg/g = 1340 μg/g
  • Die Astaxanthinkonzentration im Methanol wurde durch HPLC-Analyse zu 6,4 μg/ml bestimmt entsprechend: 6,2 μg/ml/7,1 g/l = 880 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse
  • Alle Stämme wurden auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben gezüchtet und analysiert. Der Gesamtpigment- und Astaxanthingehalt des Stamms sind in Tabelle 6 angegeben. TABELLE 6
    Figure 00440001
  • BEISPIEL 7
  • Die Zulauffermentation des Mutantenstamms CBS 215-88 der Erfindung wurde unter Verwendung von Maisquellfeststoff und Sucrose als Kohlenhydratquellen in demselben 4 m3-Fermenter wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die aus
    10 kg Maisquellfeststoff
    12 – Sucrose
    10 – Diammoniumsulfat
    3 – Kaliumdihydrogenphosphat
    1 – Magnesiumsulfat
    0,05 g Biotin
    300 ml Antischaum-Contraspum 210
    1000 l Wasser
    bestehende Ausgangswürze wurde bei pH 4,6 durch eine Stunde Dampfeinblasen bei 95°C sterilisiert und nach Kühlen auf 22°C wurden 6 × 1 l wie vorstehend angegeben vermehrtes CBS 215-88 als Impfkultur zugesetzt. Nach 35 Stunden Belüftung (4,2 m3/Minute) wurde die Zufuhr der Sucroselösung (0,30 g/l) begonnen. Die Zugabegeschwindigkeit betrug 2,3 l/Stunde. Die Belüftung wurde auf 8,4 m3/Minute erhöht und der pH-Regler eingeschaltet (Sollwert 4,0). Wenn sich die Sucrosekonzentration in dem Medium nach 28 Stunden auf etwa 1 g/l erniedrigte, wurde die Sucrosezufuhr auf 7,3 l/Stunde erhöht und 24 Stunden bei diesem Wert gehalten. Danach wurde die Sucrosezufuhr beendet und die Belüftungsrate wurde auf 4,2 m3/Minute verringert und 72 Stunden fortgesetzt. Das Gesamtpigment und Astaxanthin wurden während der Zulauffermentierung bestimmt und ergab die in Tabelle 7 angegebenen Werte.
  • TABELLE 7
    Figure 00450001
  • Die Hefezellen wurden mittels Zentrifugation in einer De Laval OA5M-Zentrifuge von dem Medium getrennt und zwei Mal mit Wasser gewaschen. Die Hefe wurde mittels Filtration in einem FILTROX-Filter, Typ VARIOX 40/40 cm von der Hefecreme getrennt und der Filterkuchen mit 26,3% Trockenmasse wurde durch ein 1 mm-Sieb in einen Laborwirbelbetttrockner (GLATT, Haltingen-Binzen, Bd.) extrudiert und 90 Minuten bei 30°C getrocknet. Die getrocknete Hefe (91,6 Trockenmasse) enthielt
    1360 μg Gesamtpigment/g Hefetrockenmasse
    und
    1080 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse.
  • BEISPIEL 8
  • Nachgeschaltete Verarbeitung
  • Durch das Verfahren von Beispiel 3 erhaltene Hefezellen wurden durch Zentrifugation in einer De Laval OA5M-Zentrifuge aus der fermentierten Würze isoliert. Die Zellen wurden zwei Mal mit Wasser gewaschen und eine Hefecreme mit 13% Hefetrockenmasse wurde erhalten. Der pH der Hefecreme wurde durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt und Natriumbenzoat wurde der Hefecreme in einer Konzentration von 0,2% (Gew./Vol.) zugesetzt. Während der Behandlung der isolierten Hefezellen befanden sich diese unter einer Stickstoffabdeckung, um eine wesentliche Oxidation des Astaxanthins der Hefezellen zu verhindern, und die Temperatur wurde bei etwa 10°C gehalten.
  • Die Hefecreme wurde drei Durchgängen durch ein System unterzogen, welches aus einem APV-Gaulin MC4-Homogenisator bestand, der mit einem Zellbruchventil und einem Wärmetauscher versehen war, wo die Hefecreme bei einem Druck von 700 bar der Zerkleinerung ausgesetzt wurde, wodurch sich die Temperatur um 10–15°C erhöhte, und nachfolgendem Kühlen, um eine Temperatur von 15°C zu erhalten. Die Hefecreme wurde in dem System mit einer Geschwindigkeit von 250 l/h im Kreis geführt.
  • Der Astaxanthingehalt in den zerkleinerten Zellen wurde wie folgt bestimmt: 0,5 ml homogenisierte Hefecreme wurden ausgewogen und in ein Sarstedtröhrchen überführt und mit 5 ml Aceton geschüttelt. Die Probe wurde zentrifugiert, in einen graduierten 10 ml-Zylinder überführt und 3 Mal mit dazwischenliegenden Zentrifugationen und quantitativen Überführungen mit Aceton gewaschen. Der Gesamtpigmentgehalt wurde durch Verfahren 1 bestimmt und der Astaxanthingehalt wurde durch HPLC-Verfahren 1 bestimmt, und der Gehalt wurde auf den Trockenmassegesamtgehalt in der Probe bezogen, welcher durch das vorstehend in "Materialien und Verfahren" erläuterte Verfahren bestimmt wurde. Durch Vergleichen des extrahierbaren Astaxanthingehalts in der gemäß dem vorliegenden Beispiel homogenisierten Hefecreme mit dem durch Verfahren 1 bestimmten Gehalt in der Hefecreme, wo die Zellen vollständig zerkleinert wurden, wurde der Zerkleinerungsgrad bei dem vorliegenden Beispiel als mehr als 90% der gesamten Zellen bestimmt.
  • Den auf diese Weise zerkleinerten Zellen, welche mit Stickstoff bedeckt waren, wurde 7% Natriumcaseinat unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 45°C zugesetzt. Das Hefezellenhomogenisat wurde darauf im Gemisch mit Natriumcaseinat dem Sprühtrocknen in einem Sprühturm vom Typ Anhydro ausgesetzt, bei welchem die Einlaßtemperatur 180°C betrug. Die Hefezellenmasse wurde durch Verwendung eines Sprührades versprüht und die Temperatur des Luftauslasses des Sprühturms war etwa 90°C. Das sich daraus ergebende Hefepulver wurde mittels eines Zyklons gewonnen. Der Wassergehalt in dem Hefepulver war weniger als 10 Gew.-%.
  • BEISPIEL 9
  • Extraktion des Gesamtpigments mit Eisessig
  • 20 g nicht aufgebrochene Phaffia rhodozyma-Hefezellen (welche filtriert und nachfolgend in ein Wirbelbett extrudiert worden waren, worin sie getrocknet worden waren), welche einen Trockenmassegehalt von 95% besaßen und 523 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse enthielten, wurde in eine Säule von 12 cm Länge und einem Innendurchmesser von 2,4 cm eingebracht. Die Säule war mit einem Kühlmantel ausgerüstet, worin Wasser mit einer Temperatur von 75°C im Kreis geführt wurde. Am Boden der Säule war eine geringe Menge säuregewaschenen Sandes (ein Sandfilter) auf einer Watteschicht angeordnet. Die Hefezellen wurden mit 5 × 100 ml Eisessig bei einer Temperatur von 75°C extrahiert und die Astaxanthinmenge sowohl in jedem der Extrakte als auch in dem extrahierten Hefezellenmaterial (einschließlich etwa 100 ml in der Säule verbliebenem Eisessig) wurde bestimmt. Das extrahierte Hefezellenmaterial war zur Trockene eingedampft worden (unter Ergeben von 16,16 g Material), bevor die Astaxanthinbestimmung durchgeführt wurde. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 8 angegeben.
  • TABELLE 8
    Figure 00480001
  • Somit wurden 77,9% (8143,6/10460 × 1000 des Astaxanthingehalts der Hefezellen durch Extraktion freigesetzt.
  • BEISPIEL 10
  • Aufbrechen der Hefezellen durch Homogenisierung in einer Kugelmühle
  • Phaffia rhodozyma-Hefezellen, welche in einem Wirbelbett getrocknet worden waren und von welchen gefunden wurde, daß sie 336 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse enthielten, wurden in Sojabohnenöl in einer Konzentration von 40% (Gew./Gew.) suspendiert. Die Suspension wurde in eine Kugelmühle (CoBall®-Mühle, Typ MSZ-12) gepumpt, welche Zirkoniumkugeln (0,1–1,5 mm) enthielt und eine Kugelfüllung von 70–75% besaß. Die Rotorgeschwindigkeit war 13 m/sec. Proben wurden nach jedem Durchlauf genommen und der Astaxanthingehalt der Proben wurde mit der HPLC analysiert. Die Temperatur in der Kugelmühle wurde bei 40–50°C gehalten.
  • Eine Suspension der vorstehenden getrockneten Hefezellen in 75% Wasser wurde ähnlich in der Kugelmühle behandelt. Bei dieser Behandlung war die Rotorgeschwindigkeit 15 m/sec.
  • Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 angegeben, worin der Astaxanthingehalt als μg/g Hefetrockenmasse angegeben ist.
  • TABELLE 9
    Figure 00490001
  • Zum Vergleich wurden nur 23 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse gefunden, wenn die getrocknete Hefe mit Sojabohnenöl oder Wasser ohne gleichzeitige Homogenisierung behandelt wurde.
  • Durch den Versuch wird gezeigt, daß etwa 3 Durchläufe in der Kugelmühle ausreichend sind, um ein im wesentlichen vollständiges Aufbrechen der Hefezellen zu erhalten.
  • BEISPIEL 11
  • Fischfütterung
  • Fischfutter mit verschiedenen Astaxanthingehalten wurde hergestellt. Das Fischfutter wurde aus handelsüblichem Ecoline 16-Fischfutter von Dans Ørredfoder, Brande, Dänemark, hergestellt, welches ein Gemisch von Fischmehl, Sojamehl, Fischöl, extrudiertem Weizen, Lezithin und Vitaminen in Form einer Vormischung ist. Wechselnde Mengen Astaxanthin wurden diesem Futter zugesetzt. Das Astaxanthin wurde aus P. rhodozyma-Hefezellen erhalten, welche auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 gezüchtet worden waren, und welche sprühgetrocknet worden waren. Die sprühgetrockneten Hefezellen wurden aus 28 kg homogenisierter Hefecreme hergestellt, welche mit 0,475 kg Natriumcaseinat vermischt worden war, welches bei etwa 50°C in 2,7 kg Wasser gelöst wurde. 0,068 kg GRINDTEK MOR 50, welches 2 g Ascorbylpalmitat und 1 g Tocopherole aus Sojabohnen enthielt, wurde in der Natriumcaseinatlösung suspendiert. Die Natriumcaseinatlösung (welche Antioxidantien enthielt), wurde mit der homogenisierten Hefecreme vermischt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 8 sprühgetrocknet. Das sprühgetrocknete Produkt (92,6% Trockenmasse) enthielt etwa 674 μg Astaxanthin/g Hefetrockenmasse. Das sprühgetrocknete Produkt wurde dem handelsüblichen Fischfutter zugesetzt, um die wechselnden Astaxanthinkonzentrationen im Fischfutter (Futter A–D) zu erhalten, welche nachstehend aus Tabelle 10 sichtbar werden.
  • Ein synthetisches Astaxanthin (Futter E) enthaltendes Fischfutter wurde als Kontrolle eingesetzt. Futter E enthielt synthetisches Astaxanthin in einer 40 ppm entsprechenden Menge.
  • Futter A–E hatten die folgende Zusammensetzung: TABELLE 10 Fischfutter
    Figure 00510001
  • Etwa 60 Regenbogenforellen, jede mit einem Gewicht von etwa 400 g, wurden bei den Versuchen mit jedem der Fischfutter A–E verwendet. Die Fische wurden in Käfigen gehalten und unbegrenzt gefüttert. Das Wasser hatte eine Temperatur im Bereich von 2,5–14°C, wobei die niedrigeren Temperaturen im letzten Teil des Fischfütterungsversuchs lagen.
  • Astaxanthinextraktion aus Fischen
  • Die verwendete Ausrüstung ist eine in Laboratoriumsversuchen herkömmlicherweise verwendete Ausrüstung.
  • Eine Regenbogenforelle ohne Haut wurde in Stücke geschnitten und 15 g Fleisch wurden in ein Zentrifugenröhrchen (100 ml) eingewogen. 15 ml Tetrahydrofuran wurden als Extraktionsmittel zugesetzt. Das Fleisch wurde in einem ULTRATURAX-Mischer weiter zerteilt und nachfolgend zentrifugiert. Der Tetrahydrofuranextrakt wurde in einen 50 ml-Meßkolben überführt. Das Zurückbleibende wurde 2–3 Minuten mit 10 ml Tetrahydrofuran auf einem Beschallungsbad gewaschen und zen trifugiert und die Tetrahydrofuranphase wurde in den Meßkolben überführt, welchem zusätzliches Tetrahydrofuran bis 50 ml zugesetzt wurde. 10 ml von diesen 50 ml wurden der Verdampfung bei einer Temperatur von 40°C unter einer Stickstoffabdeckung ausgesetzt. Der Eindampfrückstand wurde erneut in 1 ml mobiler Phase gelöst und vor der weiteren Analyse durch ein 0,45 μm-Filter filtriert. HPLC-Analyse
    Säule: LiChrosorb RP-18, 5 μm, 250 × 4,6 mm
    mobile Phase: 40 ml Ameisensäure
    60 ml Wasser
    384 ml Essigsäureethylester
    516 ml Acetonitril
    Durchfluß: 10 ml/min
    Einspritzung: 20 μl-Schleife, Rheodyne 7120
    Pumpe: Waters 510
    Detektor: Waters 481, UV-Spektrophotometer, 471 nm
    Integrator: Waters 740
  • Bestimmung der Farbe des Fisches
  • Die Farbe des Fischfleisches wurde durch das L*a*b*-Farbbestimmungsverfahren durch Verwendung eines Minolta Chroma Meters II bestimmt. Der L*-Wert bezeichnet die Helligkeitskomponente, der a*-Wert (welcher von –60 bis +60 reicht) bezeichnet die Rot/Grün-Komponente (die negativen Werte bezeichnen die Grünkomponente und die positiven Werte bezeichnen die Rot-Komponente) und der b*-Wert (welcher von –60 bis +60 reicht) bezeichnet die Blau/Gelb-Komponente der Farbe. Nur der a*-Wert ist in Tabelle 11 angegeben.
  • Regenbogenforellenfleisch ohne Haut wurde in einem Mischer homogenisiert, um eine homogene Masse zu erhalten, welche in eine kleine Petrischale (mit einer Höhe von 1 cm und einem Durchmesser von 3,5 cm) verbracht wurde, um deren gesamtes Volumen einzunehmen. Die Oberfläche der Masse in der Petrischale wurde geglättet und mit einer Glasplatte bedeckt und war darauf zur Analyse bereit.
  • In der folgenden Tabelle 11 werden die Daten der Fischfütterungsversuche angegeben: TABELLE 11
    Figure 00530001
    TABELLE 11 – Fortsetzung Analyse 23 Tage gefütterter Fische
    Figure 00540001
    TABELLE 11 – Fortsetzung Analyse 30 Tage gefütterter Fische
    Figure 00550001
    TABELLE 11 – Fortsetzung Analyse 43 Tage gefütterter Fische
    Figure 00560001
    TABELLE 11 Analyse 72 Tage gefütterter Fische
    Figure 00570001
  • Die Ergebnisse zeigen, daß das Astaxanthin jedes der Fischfutter A–E von den Fischen absorbiert worden ist und daß das Fischfleisch mit zunehmenden Mengen Astaxanthin im Futter (Futter A–D) und mit zunehmender Fütterungszeit (wie durch den a*-Wert beobachtet (welcher die rote Komponente der Farbe bezeichnet)) eine zunehmende Rotpigmentierung erhält.
  • Weiter zeigen die vorstehenden Ergebnisse an, daß die Anwesenheit von Astaxanthin im Futter das Wachstum der Fische nicht beeinflußt.
  • Die Fische wurden auch der visuellen Untersuchung unterzogen und es wurde gefunden, daß sie im allgemeinen von einer attraktiven roten Farbe waren. Nach 43 Tagen Fütterung wurde im wesentlichen kein Unterschied in der Pigmentierung von mit Futter D und E (welche etwa 40 ppm gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Astaxanthin beziehungsweise 40 ppm synthetisches Astaxanthin enthielten) gefütterten Fischen beobachtet. Nach 72 Tagen Fütterung wurde im wesentlichen kein Unterschied in der Pigmentierung der mit Futter C, D und E (welche etwa 20 ppm gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Astaxanthin, 40 ppm gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Astaxanthin beziehungsweise 40 ppm synthetisches Astaxanthin enthielten) gefütterten Fischen beobachtet.
  • BEISPIEL 12 (REFERENZ)
  • Fischpastete
  • Eine Fischpastete (lachsähnlich), in welcher Astaxanthin dazu verwendet wird, die rote Farbe zu verleihen, kann gemäß dem folgenden Rezept hergestellt werden:
    Kabeljauabschnitte 71%
    Öl 3%
    Zwieback 4%
    Grindsted-Protein 177 1%
    Stärke 1%
    Astaxanthin 0,001%
    Wasser, Konservierungsstoffe
    und Gewürze bis auf 100%
  • Das Astaxanthin wurde in der Ölphase dispergiert. Das Grinsted-Protein 177, die Stärke und die anderen trockenen Zutaten wurden gemischt und die Fische wurden zu einer Kolloidmühle gegeben.
  • Darauf wurden die Ölphase, die trockenen Zutaten und Wasser zugesetzt und die Verarbeitung wurde in der Kolloidmühle etwa 10 Minuten fortgesetzt. Die Pastete wurde in Dosen gefüllt und einer Wärmebehandlung ausgesetzt.
  • Rote Sauce
  • Eine rote Sauce mit einer attraktiven roten Farbe kann durch herkömmliche Verfahren aus den folgenden Zutaten zubereitet werden:
    Öl 30,0%
    Estragonessig 12,3%
    Tomatenpaste 8,0%
    Mayodan DC 0,3%
    Zucker 8,0%
    Salz 0,8%
    Astaxanthin 0,01–0,5%
    Wasser, Konservierungsstoffe
    und Gewürze bis auf 100%

Claims (14)

  1. Phaffia rhodozyma Hefezelle, welche eine Hefezelle ist, die zu dem Hefestamm, der unter der Hinterlegungsnummer 225-87 CBS hinterlegt ist, oder dem Hefestamm, der unter der Hinterlegungsnummer 215-88 CBS hinterlegt ist, gehört, oder eine Mutante oder ein Derivat davon, oder eine Mutante oder ein Derivat des Hefestammes, der unter der Hinterlegungsnummer 224-87 CBS hinterlegt ist, welche bzw. welches ihre bzw. seine Fähigkeit zur Produktion von Astaxanthin beibehalten hat, und, wenn sie bzw. es unter Bedingungen, welche eine Sauerstofftransferrate von mindestens 30 mmol/l/h umfassen, auf Difco YM Medium bei 20–22°C fünf Tage lang in 500 ml Schüttelflaschen mit zwei Schikanen, welche 50 ml Medium enthalten und bei 150 U/min kreisförmig geschüttelt werden, kultiviert wird, wobei die Impfkultur 100 μl einer 4 Tage alten YM-Kultur ist, Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse produziert, bestimmt durch HPLC-Analyse eines Methanolextraktes der Hefe, welcher hergestellt wird, indem eine Suspension von 0,2 g Hefetrockenmasse in 20 ml Methanol 5 × 1 Minute lang in Intervallen von einer halben Minute aufgebrochen wird, wobei das Aufbrechen bei einer Temperatur von maximal 20°C in einer Glaskugelmühle, welche 15 g Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,4 mm enthält, durchgeführt wird, wobei die Glaskugelmühle mit einem Kühlmantel mit Eiswasser ausgestattet ist, wobei reines Astaxanthin als Standard verwendet wird.
  2. Hefezelle nach Anspruch 1, welche, wenn sie unter den in Anspruch 1 angegebenen Bedingungen kultiviert wird, Astaxanthin in einer Menge von mindestens 700 μg pro g Hefetrockenmasse, vorzugsweise mindestens 1000 μg pro g Hefetrockenmasse, produziert, bestimmt durch das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.
  3. Verfahren zum Produzieren von astaxanthinhaltigen Phaffia rhodozyma Hefezellen oder Zellteilen oder Astaxanthin, welches das Kultivieren von Astaxanthin produzierenden Phaffia rhodozyma Hefezellen wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 be ansprucht unter aeroben Bedingungen in einem Medium, das Kohlenhydratquellen, assimilierbare Stickstoff- und Phosphorquellen, Mikronährstoffe und Biotin oder Desthiobiotin enthält, bei einer Temperatur im Bereich von 15–26°C, um eine Biomasse zu erhalten, die Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse, bestimmt durch das in Anspruch 1 angegebene Verfahren, enthält, und wahlweise das Durchführen von einem oder mehreren der folgenden Schritte in willkürlicher Reihenfolge umfasst: – Ernten der Zellen aus der Kultur, um eine Hefecreme zu erhalten, – Öffnen der Zellen, z.B. Aufbrechen der Zellwände mittels mechanischer, chemischer und/oder enzymatischer Behandlung und/oder Behandeln der Zellen durch Beschallung, Autolyse, Osmolyse und/oder Plasmolyse wahlweise mit Zugabe von geeigneten Mitteln wie Detergenzien, Säuren, Basen, Enzymen, autolysefördernden Substanzen, osmolytischen Mitteln wie Salzen und/oder plasmolytischen Mitteln, – Homogenisieren der Zellen, um ein Homogenisat zu erhalten, – Trocknen der Zellen, der Zellfragmente oder des Homogenisats, vorzugsweise bis zu einem Wassergehalt von maximal 12 Gew.-%, vorzugsweise maximal 10 Gew.-%, – Extrahieren von Astaxanthin aus den Zellen, den Zellfragmenten oder dem Homogenisat.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Kultivierung als Fedbatch-Fermentation unter Bedingungen durchgeführt wird, wo im Wesentlichen kein Alkohol gebildet wird, und wahlweise wo die gesamte Konzentration von Glucose und Saccharose maximal 8 g/l, vorzugsweise 5 g/l und am meisten bevorzugt 1 g/l ist, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20–22°C, die Fermentation oder ein Teil davon in einem Medium durchgeführt wird, welches Melasse und/oder Saccharose und Stickstoffquellen wie Diammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydroxid oder Harnstoff, Phosphorquellen wie Ammoniumphosphat und Phosphorsäure und zu gegebene Mikronährstoffe oder Mineralsalze wie Magnesiumsulfat, Zinksulfat und Biotin oder Desthiobiotin umfasst, wobei die Melasse wahlweise dem Medium getrennt von den anderen Komponenten zugeführt wird.
  5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 oder 4, worin die Kultivierung eine Wachstumsphase unter Bedingungen, welche im Wesentlichen ausreichend im Hinblick auf im Wesentlichen alle Wachstumsbedingungen sind, und eine nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase unter Bedingungen, wo das Wachstumsmedium unter fortgesetzter Belüftung an mindestens einem Wachstumsfaktor Mangel hat, so dass die Produktion von Astaxanthin während der nachfolgenden Phase gefördert wird, umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase eine Dauer von mindestens etwa 16 Stunden, wie 16–24 Stunden hat, die nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase vorzugsweise so eingerichtet ist, dass die Astaxanthinproduktion auf mindestens das 1,2fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, vorzugsweise auf mindestens das 1,3fache, wie etwa das 1,4fache und noch mehr bevorzugt das 1,5fache der Produktion, die ohne die nachfolgende Phase erhalten wird, gesteigert wird, wobei die nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase vorzugsweise im Wesentlichen ohne jede Zugabe eines Nährstoffes oder Mikronährstoffes zu dem Medium durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6, worin die Konzentration von Astaxanthin in der Biomasse mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse, vorzugsweise mindestens 700 μg pro g Hefetrockenmasse, bestimmt durch das in Anspruch 1 angegebene Verfahren, beträgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die erhaltene Konzentration von Astaxanthin in der Biomasse mindestens 600, vorzugsweise mindestens 800, mehr bevorzugt mindestens 1000 μg pro g Hefetrockenmasse, ist, wobei die Konzentration durch das in Anspruch angegebene analytische Verfahren bestimmt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4–8, worin die Hefezellen, im Anschluss an die Kultivierung und die wahlfreie nachfolgende wachstumsbeschränkte Phase, einer oder mehreren der folgenden Behandlungen unterworfen werden: – Aufbrechen der Zellen durch Aussetzen der Zellen einem erhöhten Druck und dann Abfallenlassen des Druckes und anschließendes Unterwerfen der aufgebrochenen Zellen einer Ultrafiltration oder Verdampfung, um die aufgebrochenen Hefezellen zu konzentrieren, – Aufbrechen der Zellen durch Aussetzen der Zellen einem erhöhten Druck und dann Abfallenlassen des Druckes und anschließendes Sprühtrocknen oder Trommeltrocknen der aufgebrochenen Zellen, – Filtration, um einen Filterkuchen zu erhalten, der dann extrudiert wird, wonach das Extrudat getrocknet wird, z.B. in einem Fließbett oder durch Trocknen in Schalen, – Mischen von Trockenmaterial aus ganzen Zellen, welches in einem Fließbett oder durch Trocknen in Schalen getrocknet wurde, mit einer öligen Phase wie einem essbaren Öl oder Fett und Mahlen des Gemisches in einer Mühle wie einer Kugelmühle, um die Zellen aufzubrechen und Astaxanthin in die ölige Phase freizusetzen, – Extrahieren von aufgebrochenen Zellen, die vorzugsweise homogenisiert sind, mit organischen Lösungsmitteln wie Petrolether, Aceton, oder einem Alkohol wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, um in dem organischen Lösungsmittel gelöstes Astaxanthin zu erhalten, und dann wahlweise Entfernen des Lösungsmittels wie etwa durch Verdampfung, – Extrahieren von ganzen Zellen mit einem Lösungsmittel, welches Eisessig umfasst, um in dem eisessighaltigen Lösungsmittel enthaltenes Astaxanthin zu erhalten, – Superkritische Extraktion von aufgebrochenen oder ganzen feuchten oder trockenen Zellen mit Kohlendioxid, wahlweise in Kombination mit organischen Lösungsmitteln, z.B. von der oben erwähnten Art.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Behandlungen unter sauerstoffbeschränkten Bedingungen wie in einer Inertatmosphäre, z.B. der Inertatmosphäre, die mittels Wasserdampf und/oder mittels Stickstoff und/oder Kohlendioxid hergestellt wird, durchgeführt werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die Extraktion der ganzen Hefezellen und des eisessighaltigen Lösungsmittels bei einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunkts des Lösungsmittels, z.B. im Bereich von 20–100°C, vorzugsweise im Bereich von 20–80°C und noch mehr bevorzugt im Bereich von 20–60°C durchgeführt wird.
  12. Tierfutter umfassend Phaffia rhodozyma Hefezellen nach Anspruch 1 oder Hefezellteile, welche Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse enthalten, bestimmt durch das in Anspruch 1 angegebene Verfahren, in Kombination mit andern Futtermittelbestandteilen, vorzugsweise Tierfutter, worin die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Hefezellteile maximal 10 Gew.-% der Trockenmasse der gesamten Tierfutterzusammensetzung, vorzugsweise maximal 5% und noch mehr bevorzugt maximal 3% ausmachen, wobei die anderen Bestandteile vorzugsweise ausgewählt sind aus Protein- und Kohlenhydratquellen wie Fischmehl, Molke, Blutmehl, Pflanzenmehle, Fetten wie Fischöl und Pflanzenöle, Vitaminen und Mineralstoffen.
  13. Tierfutter nach Anspruch 12, worin die astaxanthinhaltigen Hefezellen oder Hefezellteile Hefezellen nach Anspruch 1 oder Teile davon oder Hefezellen oder Hefezellteile, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 3–11 produziert werden, sind.
  14. Verfahren zum Füttern von Tieren, um eine rötliche Pigmentierung ihres Fleisches und/oder von Produkten, die von den Tieren erzeugt werden, zu erhalten, welches das Verabreichen eines Futters an die Tiere umfasst, welches Phaffia rhodozyma Hefezellen nach Anspruch 1 oder 2 oder Zellteile enthält, die Astaxanthin in einer Menge von mindestens 600 μg pro g Hefetrockenmasse enthalten, bestimmt nach dem in Anspruch 1 angegebenen Verfahren, wobei die Tiere vorzugsweise Fische, insbesondere Lachs oder Lachsforelle (sea trout), Kühe zum Pigmentieren ihrer Butter oder Geflügel zum Pigmentieren ihrer Eidotter sind.
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