KR960014619B1 - 아스타크산틴-생산 효모 세포, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

아스타크산틴-생산 효모 세포, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

아스타크산틴-생산 효모 세포, 그의 제조방법 및 용도
본 발명은 아스타크산틴-생산 효모 세포, 그의 생산방법, 배양 방법 및 효모 세포로부터 아스타크산틴을 분리하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 아스타크산틴-함유 효모 세포나 또는 이 효모 세포로부터 회수된 아스타크산틴이 함유된 식품이나 사료에 관계된 것일 뿐만 아니라 식품이나 사료의 제조방법 및 상기 사표를 동물에 급식하는 방법에 관한 것이기도 하다.
연어나 바다 송어와 같이 알을 낳기 위해 강을 거슬러 올라가는 소하성(溯河性)어류의 살빛이 붉은 것은 이 어류의 먹이에 존재하는 아스타크산틴과 같은 붉은 색소 때문인 것으로 알려져 있다. 이 어류는 자연조건에서는 갑각류나 기타 아스타크산틴을 함유하는 유기체로부터 그의 붉은색을 얻지만, 양식장에서 양식될때는, 이들 천연 색소원에 접할수 없게 되어 사료에 붉은 색소를 공급하지 않는 한 매혹적인 붉은 색을 얻을 수 없다.
그러므로, 갑각류의 배설물로부터 분리거나 합성적으로 제조한 아스타크산틴 뿐 아니라 칸타크산틴과 같은 기타 합성 홍색소들이 어류의 사료 성분이되어 왔다. 그러나, 몇몇 국가에서는, 동물의 사료에 칸타크산틴을 이용하는 것을 금지시키고 있으며, 합성 아스타크산틴의 제조 뿐 아니라 천연산 아스타크산틴의 분리공정은 다소 경비가 많이 들고 또한 종종 계절에 따라 변화되기도 한다.
다른 천연 아스타크산틴원들이 알려져있는데, 이들중에는 녹조류Chlamydomonas nivalis의 단세포군과같은 몇몇 단세포조류와 효모 Phaffia rhodozyma가 있다[Gert Knutson외,Pigmentering af laks med astaxanthin fra mikroalger, Norsk Fiskeopdraet nr. 3, pp. 4-6, 55(1980]. 이 유기체들이 생산하는 아스타크산틴은 소하성 어류에게 목적하는 홍색소를 부여하는 것으로 나타났다[ Eric A. Johnson외, Phaffia rhodozyma as an astaxanthin source in salmonid diets, Aqusculture, 20, pp. 123-134(1980) 및 JP-A 57-206342]. 그러나, 어류의 영양원으로서 효모 세포를 대량 사용하는 것은 이 사료가 충분히 변하지 않기 때문에 바람직스럽지 못하다. 다른 한편, 유기체가 생산하거나 영양적으로 허용되는 양의 효모 세포에 존재하는 아스타크산틴의 양은 목적하는 색깔을 얻기에 충분하지 못하며, 공지의 방법에 의한 효모로부터의 아스타크산틴의 분리는 다소 경비가 많이든다.
그러나, 만약 이 미생물들로부터 아스타크산틴을 더많이 생산시킬수 있다면, 계절 조건에 좌우됨이 없이 아스타크산틴을 유리하게 생산하는 것이 가능할 것이다.
본 발명은 아스크산틴을 충분히 고농도로 함유함으로써 소하성 어류나 고기(肉) 또는 그 생성물이 염색될 필요가 있는 기타 다른 동물의 사료로서 혹은 사료중에 사용될 수 있는 효모 세포를 제동한다. 본 발명은 또한 아스타크산틴을 함유하는 효모 세포, 특히 아스타크산틴 함양이 높은 상술한 효모 세포로부터 아스타크산틴을 수득하는 흥미있는 방법도 제공한다. 본 발명의 중요한 측면은 아스타크산틴 생산 세포 및/또는 아스타크산틴 생산능이 고유하게 개선된 변이 세포주 양식을 배양하는 방법에 기초한 것이다.
그러므로, 본 발명의 한가지 측면은 배플판을 2개 구비하고 Difco YM 배지 50ml를 함유하는 500ml용량의 쉐이크 플라스크에 산소 이동률을 적어도 30mmoles /1/시간으로 하고 20-22℃에서 5일간 효모 세포를 배양시킨 다음 150rpm으로 오비탈 와동시켰을 때, YM 배지중의 4일된 접종몰 1001가 건조 효모 1g당 적어도 300g의 아스타크산틴을 생산해내는 효모 세포에 관한 것으로 이때 생산량은 메탄올 20ml중에 건조효모 0.2g이 함유된 현탁액을 30분 간격으로 5×1분 동안 붕괴시켜 제조한 효모의 메탄올 추출물상에서 순수한 아스타크산틴을 스탠다으로 사용하여 HPLC 분석에 의해 측정한 것이며, 상기 붕괴공정은 직경이 0.4mm인 유리볼 15g을 함유하며 빙수가 있는 냉각 자켓이 구비되어 있는 볼 밀에서 최대 20℃의 온도에서 수행한다.
상술한 배양조건 및 측정조건은 수득된 결과가 문제시되는 효모의 고유한 아스타크산틴-생산능을 반영할 수 있도록 배양 방법 및 시험방법을 표준화하도록 주어진다.
이 방법은 출원인 회사가 수행한 몇가지 실험에 의해, 실제로 수행하기에 간편한 적합하면서도 재생성 있는 방법인 것으로 밝혀졌다. 이 측정법이 이제까지 문헌에서 사용된 방법과 동일하지 않음을 주의해야한다.
예컨데, Eric A. Johsone외, Astaxanthin formation by Yeast Phaffia rhodozyma, Journal of general m icrobiology 115, 1979, pp. 73-83과 같은 참조문헌에서 사용한 측정법은 1cm 큐빗중의 아세톤중의 1%(w/v)용액의 흡수도 1600에 기초한 반면, Hoffmann-La Roche사의 아스타크산틴 스탠다드를 측정하여 얻은 값은 2100이다. 이 값은 본 출원인의 회사의 자체 측정법 및 Hoffmann-La Roche사가 제출한 정보에 기초한 것이다.
또한, 공지의 결정방법은 효모의 총 색소 함량을 측정하는 반면 본 발명에서 사용되는 상술한 스탠다드법은 아스타크산틴 함량만을 측정한다. 상술한 스탠다드법에 의해 얻어진 값과 참고문헌에 언급된 값을 비교해볼 때, 참고문헌에 언급된 값이 상술한 스탠다드법에 의해 얻어진 값보다 휠씬 높을 것임에 주목해야 한다. 그러므로, 총 색소 함량을 참고문헌의 값고 비교할 경우에는 항상, 참고문헌에서 언급된 충 색소 함량에 1600/2100을 곱함으로써 흡광계수의 차이를 보정해야 한다.
상술한 배양조건은 출원인의 회상에 의해 재생가능하고 고유의 아스타크산틴-생산능 측정에 중요한 것으로 밝혀졌다.
효모 세포주의 고유의 아스타크산틴-생산능을 측정하는데 사용하는 배양조건 및 측정조건은 실시예와 관련하여 더욱 상세히 설명되어 있다. 본 발명에 따른 효모 세포는 Phaffia 속의 유일한 종인 Phaffia rhodozyma인 것이 바람직하다.
현재, Phaffia rhodozyma는 효모중에서 아스타크산틴을 유일하게 생산하는 것으로 알려져 있다. 야생형 P. rhodozyma는 낙엽송의 삼출물로부터 분리되는데 이러한 야생 효모의 예로는 ATCC에 수령번호 ATCC 24261로 기탁된 것을 들수 있다.
P. rhodozyma의 영양세포는 이형담자균과 같이 출아한다. 유협포자는 출아에 의해 발육하나 전균사제 및 적당한 포자형성은 일어나지 않는다. 유협포자는 영양 세포보다 지질함량이 더 많고 비교적 큰 구형세포이다. 이 핵균사체와 동포자생성을 관찰하려는 바램에서 여러 균주를 교잡시키려는 시도가 행해졌으나 성공적이지 못했다. 그러므로 P. rhodozyma는 분아균목의 Deuteromycotina 속으로 분류되었다(참조, M.W. Miller외, Phaffia, a new yeast genus in duteromycotina(Blastomycetes), International Journal of Systemic bacteriology 26: 2, 1976, pp. 286-291).
영양세포는 타원형(3.6-7.5)×(5.5-10.5)㎛으로서 액체 배지중에 개별적으로, 짝을 짓거나 몇몇 경우 짧은 사슬이나 작은 집락을 이루어 존재한다. 진짜 균사체는 발육하지 않으나, 미성숙 위균사는 존재할 수 있다. 출아는 포상의 동일한 지점에서 몇번씩 일어날 수 있다. P. rhodozyma는 여러층으로 이루어진 질긴 세포막을 가지며, 캡슐물질은 표면에 과립형태를 부여하여 상기의 집락을 형성시킨다.
생활사중 성의 순환은 관찰되지 않았다. 유협포자의 발육중, 영양세포는 출아에 의해 생성된다. 이러한 세포는 Aessosporon에 대해 기재된 바와같이 포자가 있는 전균사제로 고려될 수 없다(J.P.van der Walt, The perfect and inperfect states of Sporobolomyces salminicolor, J. Microbiol. Serol. 36, 1970, pp. 49-55 참고). 유협포자는 고노토콘터(gonotoconter 성적으로 격리된 포자)로 생각될수 없으며, 그들의 버드(芽)는 반수체(haploid) 세대로 볼 수없다. 핵을 염색하는 것에 의해서는 어떤 생육단계에서도 이배체화를 입증할수 없었다.(참고, M.W. Miller외, 상기 문헌) 그러므로, P. rhodozyma는 반수체인 것으로 생각되나, 입증된 바는아니다.
YM 한천에서 2-4주 배양시키면(Difco Laboratories Incorporated, Difco manual: 미생물용 탈수 배양 배지 및 시약, 10판, 디트로이트 1984), 스트링 컬취는 균주에 따라 연어빛 분홍색에 가까운 주황색이 된다.
P. rhodozyma는 27℃를 넘는 온도에서는 자라지 않는 특이성 성질을 갖는다. 이것은 D-글구코스, 말토오스, 수크로스 및 라피노스는 발효시키나 D-칼락토스와, 멜리비오스는 발효시키지 않는다. 가장 흔한 탄소원은 동화시키나; D-칼락토스, L-소르보스, 멜리보스, 락토오스, 글리세롤 및 구연사염은 동화하지 않는다. 이 효모는 비오틴이 첨가되지 않고서는 비타민이 없는 배지에서는 생육하지 못한다( M.W. Miller외, 상기 문헌).
요소를 포함한 가장 흔한 질소원은 동화시킨다. 질산염 칼륨과 에틸아민은 동화되지 않는다. 이 효모는 50중량%의 글루코스-효모 추출물 한천이나 10중량%의 염화 나트륨-효모 추출물 한천에서는 자라지 못한다. 이 효모에 의한 쵸크 한천에서의 산의 형성은 미미하며 액화 젤라틴에서도 마찬가지다. ml당 시클로헥시미드가 0.1g 존재할 경우 카제인 가수분해 탈극성 활성 및 생육은 없으나 이 효모는 pH와 무관한 전분형 화합물을 합성할 수 있다.
몰-% G＋C는 48.3±0.18인 것으로 측정되었다(참고, Miller외, 상기 문헌), P. rhodozyma는 회분-연속 발효시키면 탄수화물-및/또는 질소-제한 조건에서의 생육중 탄수화물 저장원으로서 트렉할로스를 생산한다. 이것은 출원인 회사가 발견한 새로운 관찰로서 지금까지 보고되지 않은 것이다.
P. rhodozyma는 몇가지 카르티노이들 생산하는데, 문헌에 다르면 이중 아스타크산틴이 83-87%를 차지하며, -카로틴은 2-2.5%, 에키네논은 2-4%, 그리고 피니코크산틴은 5-7%를 차지한다. 그러나, 실제로 P. rhodozyma가 생산하는 총 색소에 대한 아스타크산틴의 비율은 효모 세포의 배양 조건 뿐 아니라 색소 측정법에 의해서도 상당히 크게 변하는 것으로 밝혀졌으며 일반적으로 50-80%의 범위인 것으로 알려졌다.
Figure kpo00001
아스타크산틴은 포함하며, 모든 히드록실화 색소는 에스테르나 또는 다른 유도체와 달리 비- 결합성인 것으로 설명되어 왔다(Arthur G. Andrewes외, Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a redpigmented fermenting yeast, in Phytochemistry 15, 1976, pp. 1003-1007). 아스타크산틴에는 세가지 광학이성체가 있는데: (3S, 3'S),(3R,3'R) 및 (3S,3R)- 아스타크산틴만 생산하는 것으로 보고되어 왔다.(Arthur G. Andrews외, (3R,3'R)-astaxantin from the yeast Phaffia rhodozyma, 상기 문헌., pp.1009-1011). 본 발명에서는, 아스타크산틴은 아스타크산틴의 트랜스 뿐 아니라 시스-배열로드 이용된다.
개개의 P. rhodozyma세포내의 색소는 현미경으로 관찰할 경우 보이지 않는데, 이는 색소가 세포전체에 분산되어 있을지도 모름을 시사하는 것이다. 그러나, 색소가 세포의 특정부위에 직중되어 있을 가능성도 있다.
아스타크산틴은 산화된 카로티노이드이기 때문에 크산토필군에 속한다. 다른 카로티노이도와 유사하게, 아스타크산틴은 8개의 시소프레노이드 단위로 이루어진다. 억압된 이화산물인 아스타크산틴은 생합성에 의해, 이소펜테닐 피로푸스페이트가 다음에 도시된 바와같이 아세틸-CoA로부터 만들어진다.
Figure kpo00002
3가지 프레닐트랜스퍼라제 반응에 의해, 이소펜테닐 피로포스페이트는 다음에 도시된 바와같이 제라닐 피로포스페이트와 파르네실 피로포스페이트를 경유하여 제라닐 제라닐 피로포스페이트를 생성한다.
Figure kpo00003
2분자 제라닐 제라닐 피로포스페이트가 축합되어 피토엔이 형성되고, 이 피토엔은 탈수소화 단계와 고리형성을 경유하여, -카로틴으로부터 아스타크산틴을 생성한다. 생합성의 마지막 부분은 명확하게 밝혀지지 않았으나 Andrewes 등은(상기문헌) P. rhodozyma내의 색소 성분에 기초하여 다음과 같은 대사경로를 제시하였다.
Figure kpo00004
Figure kpo00005
제라닐 제라닐 피로포스페이트를 아스타크산틴으로 전환시키는 효소는 알려져 있지 않으며, 따라서 왜 P. rhodozyma가 (3R,3'R)-아스타크산틴을 생산하는지, 그리고 생합성중 이 단계에서 어떠한 조절단계가 있는지의 여부도 알려져 있지 않다. 다른 한편, P. rhodozyma이외의 이소프레노이드 생산 미생물에 있어서는 이소펜테닐 피로포스페이트로의 아세틸-CoA의 전환과 이에 참여하는 효소가 비교적 상세히 설명되어 있다. 이소펜테닐 피로포스페이트를 제라닐 제라닐 피로포스페이트로 전환시키는 효소와 프레닐트랜스퍼라제에 대해서는 그보다 덜 알려져 있다(이소펜테닐 피로포스테이트 이소머라제와 프레닐트랜스퍼라제(J.W.Porter, S.L.Spurgeon(편짐), Biosynthesis of isoprenoid compounds, New 쌕, 1981-1983).
P. rhodozyma의 단백질 함양은 배양조건에 따라 건조 효모의 25-50%에 달한다. 이것은 비교적 단백질 함량이 낮은 팬이다. 이와 대조적으로, 지질 함량은 매우 높다(14-27%) 핵산은 다른 효모와 유사하게 8%정도로 구성되며 아미노산 조성은 Saccharomyces cerevisiae와 같은 기타의 공지된 효모와 유사하므로 예컨데 메티오닌과 시스테인과 같은 어떤 아미노산의 함량은 매우 낮은 것으로 사료된다. (참고. Gerald Reed Henry J. Peppler, Yeast Technology, 1973, p. 329, AVI Publishing Company, Inc. 출판).
대량의 핵산으로 구성된 효모의 총 조성과 상기 사실이 상술한 바와같이 효모를 유일한 영양원으로 했을 때 동물의 영양원으로 되는 것은 만족스럽지 못하게 한다. 그러므로 어떠한 아미노산과 기타 영양성분을 첨가하지 않고는, 효모는 어류나 기타 동물의 주요한 영양성분으로 적합치 못하다 할 것이다.
일반적인 공지 조건에서 야생형 P. rhodozyma가 배양될 경우에 생산된 아스타크산틴의 총량은 효모 세포에 붉은색을 부여하기에는 충분하나 효모로부터 아스타크산틴을 경제적으로 회수하기에는 불충하다.
상술한 스탠다드법에 따라 분석할 때 고유의 아스타크산틴 생산능력이 건조 효모 1g당 300㎍ 이상인 P. rhodozyma종은 어떠한 문헌에도 기재되어 있지 않다. 실시예의 표 2 및 6참고, 그러나, 본 발명에 따라, 배양 및 측정을 상술한 스탠다드법으로 수행했을 때, 고유한 아스타크산틴 생산능력이 건조 효모 1g당 적어도 450㎍인, 예컨데 건조 효모 1g당 600㎍ , 바람직하게는 적어도 700㎍ , 더욱 바람직하게는 적어도 1000㎍ , 특히 2000㎍ 이상으로 고유하게 아스타크산틴을 생산하는 효모를 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효모 세포는 자연산 Phaffia rhodozyma를 변이시켜 생산해왔다. 그러므로, 본 발명의 한 측면은 효모 세포를 변이유발소로 처리하고 상술한 조건으로 배양시켰을 때 상술한 방법으로 측정시 건조 효모 1g당 아스카크산틴을 적어도 300g의 양으로 생상하는 결과된 변이주를 선택하는 것으로 이루어지는, 상술한 바와같이 고유의 아스타크산틴 생산능이 높은 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
변이는 1회 변이로 수행할 수 있으나, 각각의 변이 공정에 의해 아스타크산틴의 고유 생산능이 개선되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 2회 이상 변이를 연속 수행하는 것이 유리한 것으로 나타났다. 변이시키게 될 출발효모 세포는 보터 상술한 조건하에서 배양시켰을 때 상법에 의해 측정할 경우 건조 효모 1g당 아스타크산틴을 300g 미만으로 생산하는 효모 세포이지만, 변이처리의 정상적인 후보 세포는 가능한한 고유의 아스타크산틴 생산능이 높은 자연산 효모 세포가 될 것이다. 이러한 효모 세포는 Phaffia속, 특히 상술한 바와같은 Phaffia rhodozyma종에 속하는 효모 세포이다.
변이처리는 적합한 변이유발소를 사용하여 수행할 수 있다(본 명세서에서, 변이유발소는 변이효과를 나타내는 물질 뿐 아니라, UV 조사와 같은 변이유발효과를 갖는 처리와 같이 넓은 의미로 사용됨을 이해하여야 한다). 적합한 변이유발소의 예로는 브로모우라실, 아크리딘과 같은 뉴클레이티드 염기동족체, 에틸메탄술포네이트, UV 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘을 들수 있으나, 효과적인 변이유발소면 어느것이든지 변이처리에 적합한 것으로 사료된다.
종래의 변이기술에 따라, 변이처리후 가장 높은 아스타크산틴을 갖는 세포를 선택한다. 아스타크산틴이 색소라는 사실 때문에, 이러한 선별은 단일 콜로니를 단순히 관찰하는 것과 같이, 보통의 가시수단에 의해 비교적 손쉽게 수행하는 것이다.
또다른 대안방법은 예컨대 상술한 표준화 배양조건을 사용함에 의한 단일 클로니로부터의 배양체에 대한 분석을 수행하는 것이다.
본 발명에 따른 변이법에 의해 생상되어 고도의 아스타크산틴 생산능을 나타내는 2균주를 1987년 4월 6일 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlands(CBS)에 각각 기탁번호 224-87과 225-87로 기탁하였으며 CBS 225-87로부터 재분리한 1균주를 1988년 3월 23일 기탁번호 215-88로 CBS에 기탁하였는데, 본 발명의 한측면은 이 효모 균주들 뿐만아니라 이 균주들의 아스타크산틴-생산능을 실제로 유지하거나 이보다 향상된 이 균주들의 변이주 또는 유도체어도 관련된다.
본 발명은 또한 아스타크산틴-함유 효모 세포나 세포 부분, 또는 이 효모 세포나 세포 부분으로부터 유도된 아스타크산틴을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 탄수화물원, 동화가능한 질소원 및 인원, 미소영양원 및 바이오틴이나 데스티오바이오틴이 함유된 배지에서 호기적 조건하에서 15-25℃의 온도 범위로 아스타크산틴-생산 효모 세포를 배양하며, 상술한 방법으로 측정했을 때, 건조 효모 1g당 적어도 300㎍의 양으로 아스타크산틴을 함유하는 바이오매스를 얻는 것으로 이루어지는데, 다음의 단계들중 하나 또는 여러단계를 임의의 순서로 적당히 수행한다:
-배양체로부터 세포를 수확하여 유상(乳狀)효모를 얻고,
-기계적 화학적 및/또는 효소 처리에 의해 세포벽을 파열시키거나/또는 세척제,산,염기,효소, 자가분해 -촉진물질, 염과 같은 삼투분해제, 및/또는 원형질 이해 물질과 같은 적합한 물질을 임의로 첨가하여 세포를 초음파처리, 자가분해, 삼투분해 및/또는 원형질 애해 처리하는 것에 의해 세포를 개방시키고,
-세포를 균질화시켜 균질물을 얻고,
-수분함량이 최대 12중량%, 바람직하게는 최대 10중량%로 되도록 세포, 세포 단편 또는 균질물을 건조시키며,
-세포, 세포단면 또는 균질물로부터 아스타크산을 추출한다.
상술한 아스타크산틴의 양, 즉 건조 효모 1g당 300㎍이라는 양은 문헌에보고된 어떠한 아스타크산틴 농도보다는 높은 것이다. 비록 Johnson 등은(상기 문헌) 건조 효모 1g당 295㎍인 아스타크산틴 함량을 보고하였으나, 이값은 아스타크산틴 함량 뿐아니라 실제로 효모 세포의 총 색소 함량으로 된 값이다. 더욱이, 이 색소 함량은 본 출원인들에 의해 측정된 값(2100)보다 낮은 1cm 큐벳내의 아세톤중 1%(w/v) 용액의 흡수도 1600을 사용하여 측정한 것으로서 따라서 Johnson 등이 보고한 이 값은 건조 효모 1g당 총색소 295×1600/2100=225㎍에 지나지 않는다. 문헌으로부터의 이색소 함량은 본 발명에 따른 효모 균주의 총 색소 함량이 CBS 224-87 균주의 경우885㎍/g 건조 효모, CBS 225-87 균주의 경우 1176㎍/g 건조 효모, CBS 215-88 균주의 경우 1340㎍/g 건조 효모, 더욱 높게는 2000㎍/g 건조 효모의 양인 것과 비교되어야 한다.
본 발명의 효모 세포에 있어서 고도의 아스타크산틴 농도는 부분적으로는 후술하는 바와같은 특별한 배양조건을 사용하고 부분적으로는 고도의 아스타크산틴 생산능이 높은 효모균주, 바람직하게는 생산능이 상술한 바와 같은 효모 균주를 선택함으로써 수득될 수 있는데, 특히 특별한 배양 조건과 특별한 아스타크산틴 생산 효모 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
배양은 실제로 알코올이 생성되지 않는 조건하에서 연속-회분 발효에 의해 수행하는 것이 바람직하다. 상술한 바와같이,배양체의 온도는 15-26℃ 범위이다. 15℃ 미만에서는, 공업적 생산으로 허용될수 있기에는 너무 느리게 생육이 진행되며, 26℃를 초가하는 온도에서는 배양체의 생존률이 심하게 손상된다. 바람직한 온도 범위는 20-22℃이다.
발효 또는 적어도 그의 부분은 세포의 적합한 마크로- 및 마이크로 영양원, 예컨데 탄수화물원으로 사카로스나 당 밀, 코온스덮액, 황산디암모늄, 인산암모늄, 수산화암모늄이나 요소와 같은 질소원, 인산암모늄 및 인산과 같은 인원이 함유되어 있고 황산마그네슘, 황산아연 및 바이오틴이나 데스티오 바이오틴과 같은 마이크로 영양원 또는 무기염이 첨가된 배지중에서 정상적으로 수행된다. 당 밀이나 시카로스는 효모 생산에 사용되는 상법에 따라 다른 성분으로부터 개별적으로 배지에 공급하는 것이 바람직하다. 배지에 당 밀이 첨가되는 경우, 효모 세포의 생육이 발효기내의 당 또는 기타 생육억제 물질의 농도에 의해 영향받는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 발효를 조절하여 발효기내의 당 농도(글루코스와 시카로스의 총농도로 표시함)가 최대 8g/1, 바람직하게는 최대 5g/1, 더욱바람직하게는, 기껏해야 1g/1가 되게 하는 것이 유리할 것이다.
배양체는 전 발효공적중 통기를 시켜준다. 즉 호기조건하에서 배양시킨다. 호기적조건이라 함은 산소공급이 충분하여 실제로 발효도중 산소 제한이 일어나지 않게 함을 의미하는 것이다.
상술한 바와같이 본 발명의 특별한 측면에 따라, 얻어진 바이오매스(biomass)의 아스타크산틴 농도는 선택 조건하에서 배양시킴으로써 증가된다. 이러한 조건은 실제로 모든 생육 조건과 결과적인 생육-제한 단계에 관한 충분한 조건하에서의 생육 단계로 이루어진 배양을 포함한다. 생육-제한 단계는 바람직하게는 연속적인 통기하에서 생육 배지가 적어도 한 생육 인자를 빼앗김으로써 후속단계중 아스타크산틴 생산을 향상시키는 것으로 확립된다.
생육-제한 단계는 일반적으로 세포의 주요 부분의 성장이 정지되는 단게를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이 단계는 물론 배지가 적어도 하나의 생육인자를 제거당할 대 일어나나 또한 발효기내에 존재하는 세포량이 발효기의 통기능력을 휠씬 초과하는 경우 탄수화물 첨가기간의 마지막 부분동안에 관찰되기도 한다.
뒤따르는 생육-제한 단계가 어떻게해서 아스타크산틴 생산량을 그토록 놀랍게 증진시키는 효과를 발휘하는지는 알려져 있지 않으나(예컨데 후술한 샐시예중 얻어진 결과로서 건조 효모 1g당 231㎍에서 369㎍으로 상승). 아스타크산틴의 전구체가 생육 단계중 생산되고, 후속적인 생육-제한 단계가 아스타크산틴의 최종 생산성을 제공함으로써 아스타크산틴의 생산성이 향상되는 것으로 사료된다. 어떻든, 후속적인 생육-제한 단계중에 통기를 계속시켜야 한다는 것은 필수적인 것으로 여겨진다.
후속적인 생육-제한 단계의 지속기간은 적어도 16시간, 예컨데 16-24시간인 것이 바람직한데, 이는 지속기간이 짧을수록 얻을 수 있는 과외효과가 감소되는 경향이 있은 반면, 생육-제한 단계를 24시간보다 넘기게 될 경우 실제로 얻을 수 있는 효과가 없는 것으로 보이기 때문이다.
기능적 방식으로 표현하면, 생육-제한 단계의 조건은 후속 단계 없이 얻을 수 있는 아스타크산틴 생산성의 1.2배 이상, 예컨데 후속 단계없이 얻을 수 있는 생산성의 1.3배, 바람직하게는 1.4배, 더욱 바람직하게는 1.5배의 양으로 아스타크산틴 생산성을 향상시킬수 있게 작용되어야 한다.
후속적인 생육-제한 단계와 함께 특별히 배양시키게 될 효모 세포는 Phaffia속의 야생형 효모 세포, 특히 Phaffia rhodozyma종과 같이 후속적인 생육-제한 단계에 의해 그의 아스타크산틴 생산성이 증가되는 야생형 아스타크산틴 생산 효모 세포가 되겠으나, 반면에 상기 배양시킬 효모 세포는 아스타크산틴 생산능이 고유하고 개선된 효모 세포, 일반적으로 상술한 바와같이 변이 처리해서 얻은 효모 세포인 것이 바람직하다. 고유의 개선된 아스타크산틴 생산성을 갖는 이들 효모 세포의 경우, 생육- 제한단계로 구성되는 특별 배양법을 이용할 때, 바이오매스중의 아스타크산틴의 농도는 상술한 바와같이 측정했을 때, 건조 효모 1g당 적어도 600㎍, 바람직하게는 800㎍ 이상, 더욱 바람직하게는 1000㎍ 이상, 특히 1500㎍ 이상, 가장 바람직하게는 3000㎍ 이상이 된다.
일반적으로, 그리고 상법을 이용했을 경우, 효모 세포나 또는 효모 세포 부분의 총 색소 함량 및 아스타크산틴 함량은 ㎍/g 건조 효모로 나타낸다. 그러나, 총 색소 및 아스타크산틴 함량을 표시하는 다른 방식도 간편할 수 있다. 예컨데, 현탁액, 예컨데 생육배지 1ml당 존재하는 총 ㎍ 색소 및 아스타크산틴 함량으로 표시하는 것도 유용하다.
이렇게 함으로써, 아스타크산틴이나 총 색소를 회수하는 건조 효모 세포의 중량을 측정할 필요가 없게 된다. 그러므로, 효모 세포를 발효 또는 배양시키는 중에, 효모 세포의 아스타크산틴 및/또는 총 색소 함량을 쉽게 측정할 수 있다.
아스타크산틴 함량이 높은 효모 세포를 얻기 위해 상술한 바와같이, 배양시킨 후, 효모 세포를 분리하기위해 상술한 바와 같이 배양체를 후속처리하거나/또는 세포를 파열시키는 것과 같이 이들을 후속적으로 이용하기 위한 조건에 놓던지/또는 세포로부터 아스타크산틴을 추출할 수 있다.
다음에 이러한 처리의 중요한 예를 더욱 자세히 개재하였다: 세포는 가압처리한 후 다시 압력을 방출시킴으로써 파열시킨다.
세포는 밸브 균질기로 된 계를 통하게 함으로써 가압 및 압력 방출 처리하는데, 이 균질기에서는 밸브 균질기 전면에서 압력이 증가된다. 밸브 균질기는 일반적으로 세포 현탁액이 고압하에서 통과하게 되어 있는 공기분사기와 장해요소로 되어 있는데 밸브 통해 통과한 후 분사기가 이 장해요소를 치게된다. 세포 붕괴 밸브의 예는 본 명세서에서 참고로 된 1985년 3월의 APV Gaulin Technical Bulletin No. 74/9(APV Gaulin Iternational SA,P.O.Box 58, 1200 AB Hilnersum, 네델란드)에 기재되어 있다. 적합한 세포 붕괴 균질기의 예로는 상술한 바와같이 CR형 세포 붕괴 밸브가 구비된 APV Gaulin MC4 균질기를 들수 있다.
균질기는 열교환기와 연결되는데 이 열교환기에서 파열된 세포로 된 현탁액이 세포 붕괴 밸브로부터 통과한다. 밸브 전면의 세포 현탁액의 압력은 예컨데 약 400-1200bar, 즉 약 700bar이다. 이 처리는 열교환기내에서 균질물을 중간 중간 냉각시키면서 3회 반복할 수 있다.
후술하는 바와같이, 아스타크산틴 함량의 용도는 높은 정도까지 문제되는 동물의 소화계가 이용할 수 있는 세포함량에 의존하기 때문에 이들을 사료로 이용할때는 파열시키거나 다른 처리를 해야할 필요가 있다. 그러므로, 파열되지 않은 아스타크산틴 함유 세포가 포함된 사료를 어류에게 먹이는 경우 실제로 아무런 염색효과를 얻을 수 없다.
파열된 효모 세포를 초음파처리나 증발처리하여 파열 세포를 농축시킨다. 초음파처리는 예컨데 DeDanske Sukkerfabrikker사로부터 구입할 수 있는 랩단위계, 예컨데 RC 70타잎의 초음파처리막인 총 필터 면적 0.88m2의 필터 단위3개로 구성된 시스템 37에서 수행할 수 있다. 파열 세포를 농축하는 또다른 방법은 세포 현탁액으로부터 물을 진공 증발시키는 것이다.
파열된 세포는 분무 건조나 혹은 드럼 건조방식으로 건조시킨다. 건조시키기 전에, 항산화제 및/또는 유제, 카제이네이트나트륨과 같은 담체를 첨가하는 것이 바람직하다. 분무 건조는 예컨데, 파열된 세포 및 바람직하게는 수용액 형태의 가제이네이트나트륨과 같은 임의이 담체로 된 균질하게 혼합된 슬러리를 분무 건조시켜 수행한다. 분무 건조는 카제이네이트나트륨 수용액과 효모 슬러리를 카제이네이트나트륨 농도가 약 2-10%(w/v)되도록 혼합시켜 수행한다. 다음 얻어진 혼합물을 질소 분위기에서 교반시면서 정치시킨 다음 분무 전조탑으로 펌핑시키는데 이 건조탑내에서 혼합물은 건조온도, 예컨데 150-230℃, 즉 약 180℃로 처하게 하여 효모 세포 물질의 수분 함량을 최대 10중량% 이하로 감소시킨다. 다음 효모 세포 물질을 분무 휠을 이용하여 미립자화시킨다. 분무 건조 처리결과 얻은 분말상 효모 세포은 싸이클론을 이용하여 회수하거나 임의의 후속적으로 체로 거르거나 패킹시킨다. 적합한 분무 건조 장비의 예로는 Anhydro사의 EAK-1타잎 분무탑을 들수 있다. 다른 한편, 파열된 효모 세포를 드럼 건조, 예컨대 150-200℃의 온도에서 밀폐된 드럼 건조 장비내에서 건조시킬 수도 있다.
아스타크산틴은 고온에서 쉽게 분해되기 때문에, 파열된 효모 세포는 고온에서 가능한한 단시간 노출시켜야한다. 또한, 아스타크산틴은 산소에 민감하므로, 건조공정은 무산소 조건, 예컨데 수증기(효모 현탁액으로부터 증발된 수증기),질소, 및/또는 이산화탄소와 같은 불활성 분위기에서 수행한다.
건조에 앞서, 파열된 세포를 적합한 유제, 예컨데 소르비탄 모노스테아르산염이나 항 산화제, 부틸 히드록시톨루엔(BHT), 부틸 히드록시아니솔(BHA), 비타민 E, 아스코르브산, 아스코르브산의 (H) 황산염 또는 (H) 인산염 에스테르, 또는 아스코르빌 팔미트산염과 임의로 혼합시킨다.
건조된 파열 세포는 후술하는 바와 같이, 동물 사료의 성분으로 직접 이용할 수 있다.
효모 세포의 아스타크산틴 성분은 효모 세포로부터 실질적인 총 아스타크산틴 추추물을 확실히 얻을 수 있도록 하기위해 여러가지 추출제 및 추출공정을 이용하여 추출한다. 대부분의 경우,추출물은 파열된 세포물질내에서 수행하여야 한다. 그러므로, 건조하거나 습한 파열 세포 물질은 석유 에테르와 같은 유기용매로 추출할 수 있는데 이 석유 에테르는 수상과 별개의 상을 형성하므로 습한 세포 물질의 경우 적합하게 사용된다. 기타 적합한 유기 용매들은 아세톤이나 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 에테르, 케톤 및 염소화탄화수소들이다. 추출공정에 의해 아스타크산틴은 유기 용매에 용해된다. 아스타크산틴은 건조 공정 이전에 폴링 필름 증발계중에서 증발시킴으로서 용액으로부터 용매를 제거하여 얻을 수 있다. 그러나, 어떤 공정에는 유기 용매중의 아스타크산틴 농축물이 더 편리할 수 있다. 농축물은 그 자체로 사료나 식품 생산에 이용되거나, 또는 예컨데 용액과 함께 사료나 식품 성분에 혼합시키거나 오일이나 유지와 같은 식품 생산에 이용되거나, 또는 예컨데 용액과 함께 사료나 식품 성분에 혼합시키거나 오일이나 유지와 같은 식품 성분을 염색시키기위해 용액(또는 농축물)을 이용함으로써 사료나 식품 제조시 희석된 상태로 이용할 수 있다.
아스타크산틴은 또한 초임계조건하에서 이산화탄소를 이용함으로써 효모 세포로부터 추출할 수도 있다. 이산화탄소는 유기 용매, 특히 상기와 같은 용매나 또는 클로로포름이나 아세토니트릴과 같은 용매, 또는 빙초산과 같은 적합한 엔트레이터(entrainer)와 배합하여 이용할 수 있다. 초임계적으로, 추출될 효모 세포는 습하거나 건조한 전체 효모 세포, 또는 균질화된 파열 효모 세포일 수 있다.
배양체로부터 아스타크산틴-함유 세포를 분리하는 바람직한 방법은 예컨데 필터 압축기나 또는 회전 드럼필터상에서 유상 효모를 분리하여, 건조물 함량이 약 35-35%인 필터 케익을 얻는 것이다. 다음 필터 케익을 관통 플레이드가 구비된 직경 0.5-2.0mm의 사출기가 있는 스트링을로 적당히 사출시켜, 효모 입자로된 스트링을 얻는다.스트링은 유체베드내의 뜨거운 공기내로 직접 사출시키는 것이 바람직하며 이 베드내에서 건조된다. 유체 배드내에서의 증발은 효모 입자의 온도를 50℃ 미만, 예컨데 30-40℃ 로 유지하도록 조절하는 것이 바람직하며, 이 공정은 건조 효모 함량으로 측정할 때 수분 함량이 10중량%, 바람직하게는 8중량% 미만으로 저하되면 종결시킨다(이 공정은 실시예에 기재되어 있다). 다른 한편, 건조 공정은 유체 베드내에서 동일 조건하에서 트레이 건조기에서 수행할 수 있다. 다음 건조된 총 세포물질을 Caball
Figure kpo00006
밀과 같은 볼 스트링 밀에서 분쇄한 다음 추출한다.
특별한 방법에 따라, 예컨데 상술한 바와 같이 얻은 전 건조 세포물질을 대두유나 생선기름과 같은 식용유 또는 유지와 같은 유상과 또는 상술한 종류의 유기용매와 혼합시킨다. 온도는 20-30℃ 범위인 것이 바람직하다. 세포 물질 및 유상 또는 유기용매로부터 얻은 혼합물은 볼 밀, 예컨데 Caball
Figure kpo00007
밀과 같은 볼 스트링 밀에서 분쇄하여 세포를 붕괴시켜 세포로부터 아스타크산틴을 방출시킨다. 결과적인 현탁액은 그대로 사료에 이용되거나, 또는 아스타크산틴이 함유된 유상은 사용전 세포 잔사로부터 분리시킨다. 분리공정은 고속의 원심분리기내에서 윈심분리시켜 적합히 수행하며, 이것은 맥아즙으로부터 세균을 분리하는 것과 동일한 원리이다. 물론 또다른 가능성은 상술한 방법으로 얻은 파열된 건조 세포 물질과 유상을 유사한 방식으로 혼합시켜 아스타크산틴을 유상내로 추출하여 상술한 바와같이 분리시키는 것이다. 유상은 상술한 것과 같은 방식으로 사료를 물들이는데 쓰인다.
상술한 바와같이, 파열된 세포 물질에 수행하여야 하는 대부분의 종래의 추출공정과는 대조적으로, 전체의 비-파열된 효모 세포로부터 아스타크산틴을 추출하는데 빙초산을 성공적으로 이용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이렇게 하여, 본 발명의 한 측면에 따라, 빙초산이 함유된 용매로 전 효모 세포로부터 아스타크산틴을 추출할 수 있으며, 추출공정은 용매의 빙점을 초과하는 온도, 예컨데 20-100℃, 바람직하게는 20-80℃, 더욱 바람직하게는 20-60℃의 범위에서 수행한다. 부수적인 유지 및 기와 추출 가능한 성분의 추출이 이러한 저온에서 제한되기 때문에 추출을 저온에서 수행하는 겨우 아스타크산을 보다 선택적으로 추출할수 있는 것으로 사료된다. 용매중의 빙초산 농도는 5-100, 10-70 범위인 것이 바람직하다. 빙초산으로 추출하면 세포 색소의 약 70-90%가 추출된다. 즉, 다시말하면 실제로 효모 세포의 모든 세포와 아스타크산틴 성분이 빙초산 추출물 중에서 발견된다. 덧붙여, 추출물은 일반적으로 건조 효모의 약 30-35%을 함유한다. 빙초산으로 추출될 효모는 건조 효모 형태, 예컨데 여과되고 이어서 건조되는 유체 베드내에서 실제로 사출된 효모인 것이 접합한데, 그 이유는 이렇게 처리된 효모 세포가(추출 처리가 효모 세포의 격렬한 기계적 처리를 포함하지 않는 한) 추출 처리중에 붕괴되지 않을 것이기 때문이다. 이것은 비 파열 세포에 비해 비교적 크기가 작기 때문에 대다수 사용된 필터의 구멍을 막아버리는 경향이 있는 파열되거나 균질화된 세포를 추출시키는 것에 비해 효모 세포로부터 색소를 함유하는 추출물을 분리하는 공정을 용이하게 할 것이다. 빙초산 추출은 실시예9에 설명되어 있다. 빙초산으로 습한 효모 세포를 추출하는 것도 유용한 것으로 밝혀질 것이다.
추출된 아스타크산틴 뿐 아니라 전체의 건조 세포 물질은 아스타크산틴이 분해되는 것을 방지하기 위해 산소-결핍 조건하에서 유지하는 것이 바람직하다. 그러므로, 아스타크산틴-함유 효모 세포나 추출된 아스타크산틴은 부틸 히드록시아니솔(BHA), 부틸 히드록시톨루엔(BHT), 비타민 E 또는 아스코르브산, 아스코르브산의 (II) 황산염이나 (II) 인산염에스테르 ,또는 아스코르빌 팔미트산염과 같은 항 산화제 및/또는 모노글리세리드나 소르비탄에스테르와 같은 유제에 의해 보호하는 것이 바람직하며 밀폐 조건하에서 유지하는 것이 적합하다.
본 발명은 또한 상술한 바와같이 측정했을 때 건조 효모 1g당 아스타크산을 300g 이상 함유하는 효모 세포나 효모 세포 부분과 다른 사료 성분으로 배합된 동물사료에 관한 것이기도 하다. 아스타크산틴 함유 효모 세포나 효모 세포 부분과 다른 건조물의 최대 10중량%, 바람직하게는 5중량%, 더욱 바람직하게는 3중량%로 조성되는 것이 바람직하다. 이 값들은 동물에게 투여될 최정 사료에 대해 계산된 값이다. 또한 효모 세포가 고농도로 함유된 사료 예비 혼합물을 준비하는 것도 가능하다. 효모 세포나 효모 세포 부분 또는 아스타크산틴은 아스타크산틴을 물에 분산시킬수 있게 할 수 있는 유제와 임의로 혼합시킨다. 덧붙여, 아스타크산틴 함유 효모 세포나 효모 세포 부분은 항 산화제 및/또는 상술한 유제를 사용함으로써 산화로부터 보호할수 있으며/또는 동물사료를 에어-타이트 용기 및 임의로 진공 용기에 포장시킬수 있다.
아스타크산틴을 함유하는 건조 효모 세포는 또한 사료 성분, 즉 사용시 준비된 최종 사료 혼합물로 이용되도록 그 자체로 포장하거나, 또는 보통 또는 응용 사료 혼합물로 다르게 먹여질 동물에게 효모 세포를 그 자체로 투여할 수 있다.
함유 효모 세포나 효모 세포 부분은 단백질 및 탄수화물원, 지방이나 오일 및 비타민 및 무기질과 같은 마이크로 영양원 중에서 바람직하게 선택된 다른 영양 성분과 보통 적합하게 혼합시킨다. 단백질원의 예로는 카제인, 알부민, 밀의 글루텐, 어분(魚粉), 농축 어류 잔사(어교분 및 헐분)를 들수 있다. 탄수화물원의 예로는 제라틴화 전분, 사출 밀, 당밀, 야채분 및 옥수수 전분을 들수 있다. 사료중의 지방 성분으로는 여유 및 간유 및/또는 옥수수유와 같은 식물성유를 들 수 있다. 미네랄은 예컨데 칼슘, 인, 나트륨, 칼륨, 염소, 마그네슘, 구리, 망간, 아연, 코발트 및 셀레늄의 무기 또는 단순 유기 화합물중에서 선택한다. 비타민의 예로는 비타민 B12, 프롤린, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 티아민, 아스코르브산, 리보폴라빈, 피리독신, 판토텐산, 나이아신, 바이오틴, 콜린 및 이노시톨을 들 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 어떠한 방법, 바람직하게는 본 발명의 방법으로 생산된 효모 세포나 본 발명에 따른 효모 세포로부터의 추출된 아스타크산틴을 함유하는 식품 또는 사료에 관한 것이기도 하다. 아스타크산틴은 상술한 사료 성분과 혼합 사용될 수 있으며 또한 기타 식품 또는 영양분 뿐만 아니라 다른 착색제와 혼합하여 사용될 수도 있다. 이렇게 하여, 효모 세포로부터 추출된 아스타크산틴은 식용유, 버터, 마아가린,쇼트닝, 마요네즈, 파테스(pate's), 수우프, 스낵제품, 수리미(surimi)-제품, 후식, 아이스크림, 과자류, 구운제품, 및 음료에 단독으로 이용하거나 다른 착색제와 혼합 이용될 수 있다. 주로 물이나 수상으로 된 식품에 아스타크산틴을 사용할 경우, 상술한 바와 같이, 아스타크산틴을 결정화 경향없이 수상에 분산 가능하게 만들고 아스타크산틴을 용해시키기 위해 유상을 첨가할 필요없이 만드는 유제와 혼합시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상술한 방법으로 측정했을 때 건조 효모 1g당 아스타크산틴을 적어도 300㎍ 함유하는 효모 세포 또는 세포 부분이나 또는 이러한 효모 세포 또는 세포 부분으로부터 추출된 아스타크산틴을 함유하는 사료를 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 동물의 살코기 및/또는 동물이 생산해내는 생산물을 붉게염색시키기 위해 동물을 사육하는 방법에 관한 것이다.
동물에게 투여되는 아스타크산틴 또는 아스타크산틴 함유 효모 세포 또는 세포 또는 세포 부분의 양은 문제의 동물의 종에 따라 좌우되며 아스타크산틴에 의해 얻어지도록 요구되는 염색 효과에 따라 달라진다. 분명히, 따라야 할 원리는 동물에게 마크로- 및 마이크로 영양원과, 덧붙여 아스타크산틴을 문제의 동물의 살이나 또는 동물의 생산물을 바람직하게 염색 시키는 형태 및 양으로 정상적으로 추천되는 1일 급식량으로 투여하여야한다는 것이다. 몇가지 경우에 있어서, 투여될 아스타크산틴의 양은 계절에 좌우되기도 한다: 따라서, 예컨대, 버터를 염색하기 위해 소에게 아스타크산틴이나 기타 카로티노이드를 여름에 투여하는 것은 바람직스럽지 못한데, 그 이유는 버터의 염색은 소가 풀을 뜯을 때 적당한 것으로 사료되기 때문이다. 또한 동물에게 먹일 아스타크산틴이나 아스타크산틴-함유 효모 세포 부분이 함유된 사료의 양은 몇가지 경우 계절에 따라 좌우될 수 있다. 그러므로, 예컨대, 연어나 바다 송어의 경우, 이물고기가 겨울에 소모할 사료의양은 여름에 소모할 양보다 비교적 적다, 그러나, 이 어류에게 투여할 적합한 사료의 양은 캘리포니아 수산청이 추천한 바로는 물고기 체중의 약1.5%이다.
가금류가 생산하는 알의 난황 및/ 또는 가금류의 고기 또는 피부를 염색하기 위해 상술한 바와같은 방법으로 가금류에게 먹이를 줄때, 사료는 통상적인 가금류의 사료 성분으로 구성될 것이다. 이 사료의 예로는, 대두밀, 대두단백, 셀룰로오스, 전분과 같은 탄수화물원 및 단백질, 대두유와 같은 지방원, 총 비타민 믹스와 같은 비타민 및 가금류의 흔한 미네랄 성분 뿐 아니라 알 껍질을 위한 칼슘원(이때 칼슘원은 탄산칼슘 및 인산수소 칼슘이 바람직함)의 혼합물로 구성된 것을 들수 있다, 염화나트륨도 소량 존재할 수 있다. 사료는 통상적인 양으로 투여한다. 본 발명을 다음에 자세히 기재하였다.
재료 및 방법
배양체의 유지
Phaffia rhodozyma의 배양체는 2가지 방식으로 유지시킨다:
1) 사면 한천 배지(YM-한천)상에서, 새로운 사면 배지를 만들기 전에, 사면 배지를 20℃에서 1주일 배양시키고 그리고4℃에서1개월간 유지시킨 다음 YM-브로쓰에서 재배양시킨다.
2) -80℃에서 동결보존 동결용기나 사면 한천 배지로부터 균주를 250ml 진탕 플라스크중의 YM-브로쓰 50ml에 접종시킨다. 진탕 플라스크를 20℃에서 4-5일간 150rpm으로 오비트진탕기에서 유지시킨다. 효모 세포를 정착시키고 액체는 따라낸다. 침전물을 글리세롤과 혼합하여 20% 농도로 만들고, 동결용기에 분배한 다음 -80℃에서 냉동 보존기에 저장하였다.
건조 효모 함량 측정
무게를 잰 Sarstedt튜브(110℃에서 일정 무게로 건조시킴)중에서 효모 세포 배양체 5ml를 10,000×g로 5분간 원심분리시킨 다음 미네랄성분이 없는 물로 2회 세척하였다. 액체를 따라내고 세포와 튜브 무게를 110℃에서 일정 온도로 건조시킨후 측정하여 효모 세포의 무게(Yg)을 얻었다. 건조 효모 함량(yeast dry matter content: YDMC)는 다음과 같이 산출하였다.
YDMC(g/1)=Y/5.00×1,000
함량은 2회 측정치의 평균값으로 한다.
총 색소 측정을 위한 분광 광도계 분석
메탄올 추출물 중의 총 색소 함량은 B.H.Davies, Carotenoids, T.M. Goodwin(편집), Chemistry and Biochemistry of pigments, New York, 1976, Vol.2.p.149에 기재된 Beer'의 법칙과 max를 이용하여 분광 광도계로 측정하였다. 분광 광도계는 Shimadzu UV 가시광기록 분광 광도계 UV 260을 사용하였다. 색소 함량은 다음의 표 1의 흡광 계수와 공식 1.1a, 2, 2a를 이용하여 계산하였다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
=1cm 큐벳중의 1%(w.v)용액의 흡광도
색소 추출 및 분석-방법 1
효모 배양체 약 300ml를 Sarsteds 튜브에 옮기고 10,000×g에서 5분간 원심분리시켰다. 효모 세포를 탈미네랄수로 세척하고 메탄올 약 20ml에 현탁시켰다. 직경 0.4mm의 유리 볼(약 15g의 유리 볼)로 덮인 로터가 구비된 Bead Beater형 유리 볼 밑(Biospec Products Inc., USA)에, 메탄올 현탁액을 첨가하여 나머지 여분의 볼 밀 용량을 채웠다. 밀을 30초 간격으로 1분씩 5회 작동시켜 붕괴 처리를 하고, 냉각 쟈켓에 빙수를 넣어 붕괴 처리시의 온도가 20℃ 미만이 되도록 유지시켰다. 붕괴 처리 직후, 균질물의 일부를 Sarstedt 듀브에 옮기고, 건조 효모를 상술한 바와 같이, 그러나 원심분리키지 않고 측정하였다. 알려진 양(bg)의 균질물을 10ml 측정 플라스크에 옮기고 용매를 10ml 될 때까지 첨가하였다. 이 용액에서 흡광도를 측정하였다.
건조 효모 1g당 총 색소 함량 g은 다음과 같이 측정하였다:
Figure kpo00010
E=1cm 큐벳에 사용된 용매중에서 max에서의 흡광도
Figure kpo00011
=1cm 큐벳중의 1%(w/v) 용약의 흡광도
b=추출물의g
D=건조 효모 mg/g추출물
색소 추출 및 분석-방법 2
미리 측정한 양(aml)의 효모 배양체를 Sarsteds 튜브에 옮기고 10,000×g에서 5분간 원심분리시켰다. 효모 세포를 탈미네랄수로 세척하고 메탄올 약 20ml에 현락시켰다. 직경 0.4ml의 유리 볼(약 15g의 유리 볼)로 덮인 로터가 구비된 Bead Beater형 유리 볼 밀(Biospec Products Inc, USA)에, 메탄올 현탁액을 첨가하여 나머지 여분의 볼 밀 용량을 채웠다. 밀을 30초 간격으로 1분씩 5회 작동시켜 붕괴 처리를 하고, 냉각쟈켓에 빙수를 넣어 붕괴 처리시 온도를 20℃ 미만으로 유지하였다. 붕괴 처리직후, 약체를 50ml 측정 플라스크로 옮겼다. 유리 비이드를 4×8ml 메탄올로 밀 내에서 세척하였다. 분획을 수집 및 혼합한 다음 메탄올을 50ml 될 때까지 첨가하였다. 메탄올 추출물은 색소 분석 전에 여과한다. 배양체중의 건조 효모는 다음과같이 측정한다.
총.색소 함량/시료 ml를 다음과 같이 결정한다:
Figure kpo00012
a=시료 용량ml
E=1cm 큐벳중에 사용된 용매의xmax에서의 흡광도
E=1cm 큐벳중의 1%(w/v) 용액의 흡광도
건조 효모 1g당 총 색소 함량은 다음과 같이 결정한다:
Figure kpo00013
Y=색소 g/g 건조 효모
YDMC=건조 효모 g/1 배양 브로쓰
아스타크산틴 측정을 위한 HPLC 분석-방법 1
HPLC 자료:
기구:
컬럼: LKB Ultropac 예비컬럼, Lichrosorb RP 18 7μm,4×30mm
LKB Ultropac 컬럼Lichrosorb RP 18 5μm,4×250mm
검색기:LKB 2151 변환 파장 모니터
적분기:Waters 740 데이터 모듈
조절기:LKB 2152 HPLC 조절기
펌프:LKB 2150 HPLC펌프
자동 시료 채취기:변환 루프가 구비된 LKB 2157 자동 시료 채취기
메뉴얼 주사 : 레오다인 (Rheodyne)20㎕루프.
용매:A: 아세토니트릴 860ml＋물 100ml＋포름산 40ml
B: 에탈아세데이트 960ml＋포름산 40ml
모든 용매는 HPLC 품질의 것이 었음
유속1.0ml/분
구배:0-100% B 20분, 선형구배
100-0% B 20분, 선형구배
검색기:471nm
온도: 주변온도
스탠다스용액: Hoffman-La Roche사가 공급한 순수한 아스타크산틴(융점 220-222℃, 1cm 큐벳중의1%w/v 아세톤 용액의 흡광도 2100)(이하 아스타크산틴 스탠다드라 칭함) 5mg의 무게를 재고 아세톤 500ml에 용해시킨다.
HPLC 분석을 위해 문제의 시료 20μl를 HPLC 크로마토 그래프에 주사하였다.
아스타크산틴 측정을 위한 HPLC 분석 -방법 2
HPLC 자료:
기구:
컬럼:Supelco 예비컬럼
Supelco LC 18-DB, 입자크기 5μ
컬럼 차원 4.6×250cm
검색기:LKB 2151 변환 루프가 구비된 LKB 2157 자동 시료 채취기
매뉴얼 주사:레오다인 20μl 루프
용매:A:테트라히드로퓨란 400ml
메탄올 400ml
0.02M 글리신 완충액(pH=2.6) 200ml
B:테트라히드로퓨란 1000ml 완충액을 제외한 모든 용매는 HPLD 등급임.
완충약을 사용전 0.22μm 필터를 통과시켜 멸균 여과시킴.
검색시:480nm
온도:실온
구배 및 유속
Figure kpo00014
스탠다드용액: 아스타크산틴 스탠다드 5mg의 무게를 달고 테트라히드로퓨란 500ml에용해시킴.
HPLC 분석을 위해, 문제의 시료 20μl를 HPLC 크로마토 그래프에 주사한다.
Sarstedt 튜브
Hounisens Laboratory(Arhaus, Denmark) 공급 55533형의 폴리프로필렌 스토퍼가 구비된 폴리프로필렌원심분리 튜브
화학약품
실험실 규모에서 사용한 화학약품은 분석등급이 있다. 발효에 사용한 화학약품은 실품등급이었다. 글루코스와 사카로스 농도는 Boehringer Mannhein사의 키트(베스트 NO.139041)를 이용하여 분석하였다. 진탕 플라스크 배양 및 한천판용 배지
Difco Laboratories Incoporated사 제품 YM(효모 모폴로지) 배지(Difco 매뉴얼: 미생물용 탈수 배지 및시약, 10판, Detroit, 1984).
동결 용기 (Cryo vials)
Technunc(Roskilde, Denmark)사의 363401형의 2ml 용량 폴리프로필렌 튜브
변이처리
각각의 경우, 처리된 배양체의 생존률이 1-5%가 되도록 변이처리를 하였다. 한천판에 단일 콜로니로 플레이트시켰을 때 붉은 색의 강도를 육안으로 비교하여 적합한 변이주를 선택하였다.
UV-조사
20-22℃에서 YM 배지에서 생육된 ATCC 24261의 4일된 탁한 배양체를 각각 10 , 10 .5, 10 , 10 .5 및 10 의 농도가 되도록 0.9% Nacl 용액으로 희석하고, 이 희석물의 각 0.3ml를 한천판에 놓아 100-300개의 콜로니가 형성된 한천판을 얻었다. 다음 이 플레이트에 254nm의 자외선을 30초간 조사원(Vilbert Lourmat VL 30LC)으로부터 20cm의 거리에서 조사시킨 다음 20-22℃에서 10일간 배양시킨 후 결과적인 콜로니의 색깔을 비교하였다.
EMS(에틸-메탄-술폰산염)처리
20-22℃에서 와동 보오드상의 YM 배지상에서 생육시킨 ATCC 24261의 4일된 배양체 2×15ml를 MSE 주 원심분리기 내에 1250×g 15분간 원심분리시키고 펠렛을 200ml 원심분리관에서 살균된 .0.9% NaCl용액 2×15ml에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액중 하나를 콘트롤로 사용하였다. 다른 세포 현탁액에 EMS(Serva 28755) 1g을 첨가하였다. 이 세포 현탁액중 하나를 콘트롤로 사용하였다. 20℃에서 30분간 처리한후, 차가운 멸균 0.9% NaCl 용액 50ml를 첨가하였다. 효모 세포를 멸균 0.9% NaCl에 2회 세척하고 0.9% NaCl에 현탁시켰다. 다음 효모 세포 현탁액을 희석하고 상술한 방식으로 UV-처리를 위해 한천판에 놓았다. 분리된 변이주 중 하나를 1987년 4월 6일, 기탁 번호 224-87로 CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures)에 기탁하였다.
N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘 처리
N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘 약 25mg(Aldrich Chemie BDR)을 유리 스토퍼가 구비된 10ml 중량의 미터 실린더에 첨가하였다. 총 용량 10ml가 되도록 물을 공급하고, N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘을 와동시켜 용해시켰다. 원액 10×1ml를 이용액으로부터 얻었다.
20-22℃의 와동 보오드상에서 YM 배지내에서 생육시킨 4일된 CBS 224-87(상술한 EMS 처리에 의해 얻은 변이주) 2×20ml를 Sarstedt 튜브에 옮기고 원심분리 2회전시켰다. 펠렛을 0.9% 멸균 NaCl 용액 1.5ml에 현탁시키고 상술한 바와같이 제조된 원액 1ml를 첨가하였다. 20-22℃에서 1시간 정치시킨 후, 효모 세포를 차가운 멸균 0.9% NaCl 용액 10ml로 5회 세척함으로써, N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘을 제거하였다. 다음 효모 세포를 UV 처리시와 마찬가지로 희석하고 한천판에 플레이트시켰다. 분리된 변이주 중 하나를 1987년 4월 6일 기탁번호 225-87로 CBS에 기탁하였다.
재분리
CBS 225-87를 다음과 같이 분리시켰다. 동결 건조 용기로부터 호모 세포를 YM 배지에 현탁시키고 20-22℃에서 5일간 정치시켰다. 배양체를 YM판에 놓고 20-22℃에서 10일간 정치시켜 새로운 콜로니를 분리했다. 이콜리니들중 하나를 1988년 3월 23일 기탁번호 215-88로 CBS에 기탁하였다.
실시예 2
야생형 Phaffia rhodozyma 세포주 및 실시예 1에서 제조한 그의 변이주의 아스타크산틴 함량 측정
본 실시예에서 기재된 아스타크산틴 측정 및 효소 세포 배양은 효모 세포가 생육하는 조건 및 다른 한편, 효모 세포주의 고유의 아스타크산틴 생산능을 측정하기 위한 상술한 본 출원인의 스탠다드법으로 아스타크산틴을 측정하는 조건으로 이루어진다. 이 조건들은 청구범위에 언급될 스탠다드 조건과 동일하다.
진탕 플라스크 배양
20-22℃에서 와동 보오드상에서 YM 배지중에 생육시킨 4일된 ATCC 24261 배양체 100ml를 배플판이 2개 달린 500ml 용량의 진탕 플라스크중에 함유된 50ml YM 배지에 접종시켰다. 배양체를 20-22℃에서 5일간150rpm에서 오비탈 와동시키면서 와동 보오드에서 생육시키고 산소 이동률은 30mmoles/1/시간으로 함으로써, 밀도가 0.6%인 효모 세포 배양체를 얻었다.
색소분석
추출물중의 아스타크산틴 함량을 다음의 3가지 방법으로 동정하였다.
1.상술한 메탄올 추출물 제조물과 같이 제조한 아세톤, 메탄올 및 에탄올 추출물을 분광 광도계로 측정하고 표1의 max 값을 얻었다.
2.상술한 바와같이 제조한, 10ml 에탄올 추출물 절반에, 약 50mg 브로히드라이드 칼륨을 첨가하여 아스타크산틴을 환원시키고, 이 혼합물을 30분간 교반시켰다. 추출물 및 브로히드라이드 칼륨 시료의 흡광도를 분광 광도계로 여러 파장에서 측정하였다. 유리 아스타크산틴은 480nm에서 넓은 피크를 나타내고 환원된 아스타크산틴은 450nm 와 476nm에서 각각 피크를 나타냈는데, 이는 문헌에서 언급된 값에 상응하는 것이다.
3.상술한 바와같이 정의된 스탠다드 조건하에서 HPLC 중의 아스타크산틴-함유 추출물의 체류시간을 상술한 스탠다드 용액의 체류기간과 비교하였다. 즉, 스탠다드 조건하에서 HPLC 중의 아스타크산틴-함유 시료의 피크를 HPLC내의 스탠다드 용액의 피크와 비교하였다. 체류시간은 동일한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 변이주(CBS 224-87 및 CBS 225-87)뿐 아니라 공지의 기탁된 아스타크산틴 -생산 P. rhodozyma세포주도 상술한 바와같이 생육 및 분석시켰다. 균주들의 총 색소 함량 및 아스타크산틴 함량을 다음의 표2에 나타내었다.
총 색소 분석을 색소 추출 및 분석-방법 1에 따라 수행하였다. 이스타크산틴은 이스타크산틴 측정을 위한 HPLC 분석-방법 1에 따라 분석하였다.
Figure kpo00015
상기 값들은 4회의 독립적 측정결과를 평균낸 값이다. 본 발명의 변이주가 상당히 증가된 아스타크산틴 함량을 나타낸다.
실시예 3
발효
관통된 공기관으로 된 정체 통기 시스템이 구비된 Bubble column형의 완전히 세척 및 멸균시킨 4m 발효기 내에서 탄수화물 제한하에서 연속-회분 발효방식으로 발효를 수행하였다. 발효기에는 pH 막대, pH조절체와 거품 억제제용 입구, 그리고 배출된 공기중에서 알코올을 측정하기 위한 알코올 검색기가 구비되었다. 발효기 쟈켓은 자동온도조절기가 부착되었다.
출말 맥아즙의 조성은 다음과 같다: 당밀 20g/1, 황산디암모늄 0.6g/1, 인산수소 디암모늄 0.8g/1 및 황산마그네슘 0.125g/1. 이들은 모두 문제의 발효기에 접종시키기 전에 적합한 양의 물(100L 번식 발효기중 30L, 그리고 4m 생산 발효기중 2000L)과 함게 30분간 끊였다. 연속-희분석 발효공정중 발효기에 주입된 배지는 2가지 상이한 저장소, 즉, 황상디암모늄 10kg, 인산수소디암모늄 5.6kg 및 물 80L로 된 화학 저장소, 및 당밀 450Kg과 오토클라브 처리한 물 1000L로 된 당밀 저장소로부터 취하였다. 데이티오바이오틴 0.1mg과 황산마그네슘 1.6kg을 나머지 배지가 공급되기전에 발효기에 직접 공급하였다. 모든 화학 물질은 식품등급의 것이었다. 당밀은 De Danske Sukkerfabrikker사 제품의 최상급 사탕무우 당밀을 이용하였다.
발효공정중 통기는 8.4m /분으로 하였다. 거품 억제제로 contraspum 210(Zschimmer Schwartz사)를 사용하고, pH 조절제로는 황산을 이용하였다.
ATCC 24261 효모 세포주를 한천 사면 배지로부터 YM 배지 5ml가 함유된 직경 2cm의 시험관으로 옮겨 증식시켜고 이 시험관에서 세포는 20-22℃에서 충분히 통기시키면서 4일간 와동 보오드에서 배양시킨후, 배양체를 YM 배지 1리터가 함유된 2리터 용량의 Erlenmyer 플라스크로 옮겼다. 와동 보오드에서 3일간 배양시키고 20-22℃에서 충분히 통기시키면서, 배양체 1리터를 출발 맥아즙 30리터가 함유된 100리터의 발효기로 옮겼다. 건조 효모 함량이 1g/l로 될때까지 20-22℃에서 배양체를 회분 생육시켰다. 다음, 영양 공급을 시작하고, 20-22℃에서 연속-회분 발효를 수행하였다. 2일 생육시킨 후, 배양체 30리터를 멸균 조건하에서 출발 맥아즙 2000리터가 함유된 4m3 발효기로 연동 펌프에 의해 옮겼다. 배양체를 건조 효모 함량이1g/1로 될 때까지 20-22℃에서 회분 생육시켰다. 다음 당밀 공급을 시작하고 38시간 동안 계속하여 당밀 저장을 고갈시켰다. 처음 24시간 동안 당밀에 비례적으로 화학 물질을 공급하였다. 연속-회분 배양은 20-22℃에서 수행하였다. 당밀 저장소내의 당밀의 양은 건조 효모 함량이 발효된 맥아즙의 약 4%를 넘지 않도록 조절하였다.
연속-회분 발효중 발효기로의 당밀 공급은 효모 세포의 특이적 생육속도가 =0.15시간 이 되도록 조절하였으며 추가로 0.1용량% 미만이 되어야 하는 맥아즙내의 에탄올 농도에 따라 조절되었다. 이렇게 해서, 에탄올 농도를 자주 측정하고, 이 농도가 너무 높은 경우, 다시 허용가능한 에탄올 함량이 얻어질때까지 당밀 공급속도를 저하시켰다.
발효된 맥아즙의 동기는 20-22℃에서 다른 영양 공급없이 16시간 동안 계속하였다.
효모 세포 조성뿐 아니라 총 색소 함량 및 아스타크산틴 함량을 0시, 즉 4m 발효기에 영양분 공급을개시하기 직전에, 발효와 생육이 종결된 36시간 후에, 그리고 발효된 맥아즙을 16시간 동안 통기시킨 후에 측정하였다. 총 색소 함량 및 아스타크산틴 함량은 실시예 2에 기재된 바와같이 측정하였고, 효모 세포의 조성은 상법에 따라 측정하였다. 이렇게 해서, 총 질소함량을 Kjelahl법에 의해 측정하고 트레할로스 함량은 Journ, Am. Chem. Soc.72, 1950.p. 2059에 따라 측정하였으며, 인산 함량은 Water and Waste Water America Public Heaktg Association, Inc., p. 199(1960)에 기재한 바와같이 측정하였다. 에탄올 분석은 소량의 알코올 측정을 위한 Boidin' 방법에 따라 수행하였다(참고 Annal. de la brasserie de la distillerie, 1924-25, p. 177). 결과를 표3에 나타내었다.
총 색소 분석은 방법 1에 따라 수행하였다.
HPLC에 의한 아스타크산틴 분석은 방법 1에 따라 수행하였다.
Figure kpo00016
3
Figure kpo00017
실시예 5
실시예4와 동일한 방식으로 본 발명의 변이주 CBS 225-87을 가지고 실험을 수행하였다. 이때 출발 맥아즙 용량은 100리터, 접종물은 실시예 3에 기재된 방법으로 중식시킨 CBS-87 6x1 리터러 하고, 화학물질 저장소는 황산 디암모늄 5kg, 인산수소 디암모늄 2.8kg 및 물 80리터로 이루어졌다. 연속-회분 발효중 알코올은 생성되지 않았으며, 영양분은 0-57시간 사이에 공급하고 그 다음 영양분 공급없이 배양체를 통기시켰다. 80시간째에 효모 세포조성은 건조효모중 질소 6.5%, 펜톨시드인 2.5% 및 트레할로스 6.6%였다. 총색소, 아스타크산틴 및 건조효모는 연속-회분 발효중 측정하였으며 그 값을 표 5에 나타내었다.
Figure kpo00018
㎍/ml로 나타낸 총색소 및 아스타크산틴 함량은 분석된 건조효모 함량과 총색소 및 아스타크산틴의 g/g 값으로부터 산출한 것이다.
실시예 6
CBS 215-88 및 P. rhodozyma 변이주 DBT 406과 CBT 403, 야생형 균주 CBS 5905 및 ATCC 24261의 색소 및 아스타크산틴 함량을 측정하였다.
진탕 플라스크 함량
한천 슬로프로부터, 효모 세포를 YM-배지에 접종시키고 20-22℃에서 2일간 정지시켰다. 배양체 1ml를 배플판이 4개 구비된 250ml 용량의 진탕 프라스크에 함유된 50ml의 YM-배지에 접종시켰다. 20-22℃에서 5일간 150rpme로 오비탈 와동시키는 와동보오드에서 배양체를 생육시켰다.
총색소의 정량적 측정을 방법 2에 따라 수행하였다. 아스타크산틴 측정은 방법 2에 따랐다.
계산의 예9CBS 215-88의 경우):
메틴올 추출물중의 총색소를 분광광도계 분석에 의해 측정하였다. 추출물 50ml의 흡광도에서 메탄올의 흡광도를 뺀 값은 E=1.189로 측정하였다. 시료 용량은 29ml였다. 효모 추출물내의 총색소 함량은 다음 공식(2)으로 계산하였다:
X'=1.160×50/2100/29×10,000㎍/ml=9.52㎍/ml
건조효모는 6.7g/l로 측정되었다. 건조효모 1g당 총색소 함량은 다음과 같은 공식(2a)으로 계산하였다:
Y=9.52/7.1×10,000㎍/g=1340㎍/g
메탄올중의 아스타크산틴 농도는 HPLC 분석으로 측정하였으며 6.4g/ml으로서 다음에 상응한다:
6.2㎍/ml/7.1= 880㎍ 아스타크산틴/g 건조효모 모든 균주는 상술한 바와같이 생육 및 분석하였다. 균주의 총색소 및 아스타크산틴 함량을 표 6에 실었다.
Figure kpo00019
실시예 7
실시에 3에 기재된 바와같이 동일한 4m 발효기에서 탄수화물원으로서 옥수수 스디액과 수크로스를 이용하여 본 발명이 변이주 CBS 215-88은 연속-회분 발효시켰다. 출발 맥아즙은
10 kg 오수수 스덮액
12 - 수크로스
10 - 황산 디암모늄
3 - 인산이수소 칼륨
1 - 황산마그네슘
0.05 g 바이오틴
300 ml 거품제거 Contraspam 210
1000 l 물
로 이루어졌으며 95℃의 증가를 1시간동안 주사하여 pH 4.6에서 멸균시키고 22℃로 냉각시킨 후 상술한 바와같이 증식시킨 CBS 215-88 6×1리터를 접종물로서 첨가하였다. 35기간 통기(4.2m /분)시킨 후 수크로스용액 (0.3g/l) 공급개시하였다. 첨가속도는 2.3l/시간이었다. 통기물을 8.4m3/분을 증가시키고 pH-조절기를 작동시켰다(세트 포인트 4.0).28시간 후 배지중의 수크로스 농도가 약 1g/l로 감소될 때 수크로스 공급을 7.31시간으로 증가시키고 24시간동안 이 속도로 유지하였다. 다음, 스크로스 공급을 종결시키고 통기물을 4.2m /분으로 감소시켜 72시간동안 유지하였다. 총색소 및 아스타크산틴은 연속-회분 발효중 측정하여 그 값을 표 7에 나타내었다.
Figure kpo00020
Figure kpo00021
이렇게 해서, 효모 세포의 아스타크산틴 함량 77.9%(8143.6/10460×100%가 추출에 의해 방출되었다.
실시예 10
볼밀에서의 균질화에 의한 효모 세포의 파열
유체 베드중에서 건조시키고 건조효모 1g당 아스타크산틴을 336㎍ 함유하는 것으로 밝혀진 Phaffia rhodozyma효모 세포를40%(w/w) 농도로 대두유로 현탁시켰다. 지르코늄 볼(0.1-1.5mm)이 함유되어 있고 비드 충진률이 70-75%인 볼 밀(CoBall- 밀타잎 MSZ-12)에 현탁액을 펌핑하였다. 로터의 속도는 13m/초였다. 매 작동시킨 후에 시료를 채위하여 시료중의 아스타크산틴 함량을 HPLC로 측정하였다. 볼 밀내의 온도는 40-50℃로 유지하였다.
이와 유사하게, 75% 물중의 상기 건조 효모 세포의 현탁액을 볼밀에서 처리하였다. 이 처리시, 로터의 속도는 15m/초였다. 결과를 표 8에 나타냈으며, 여기서 아스타크산틴 함량은 ㎍/g 건조효모로 나타내었다.
Figure kpo00022
비교를 위해, 동시에 균질화 시키지 않고 대두유나 물로 건조효모를 처리했을때는 오직 아스타크산틴 23㎍/g 건조효모만이 발견되었다.
상기 실혐에 의해 효모 세포를 실제로 완전히 파열시키는데는 볼 밀에서 3번만 분쇄시키면 충분함이 드러났다.
실시예 11
어류 급식
아스타크산틴 함량이 여러가지인 어류의 사료를 준비하였다. 어류의 사료를 Dan나 rredfoder(Brande, Demark)사의 시판하는 어류사료 Ecoline 16으로부터 제조하였는데, 이것은 프리믹스형태의 어분, 대두밀, 어유, 사출밀, 레시틴 및 비타민의 혼합물이다. 이 사료에 아스타크산틴의 양을 달리하여 첨가하였다. 실시예 3과 같은 방식으로 생육되어 분무 건조된 P. rhodozyma효모 세포로부터 아스타크산틴을 얻었다. 분무 건조된 효모 세포는 약 50℃에서 2.7kg의 물에 용해된 카제이네이트 나트륨 0.475kg과 혼합된 균질화 유상효모 28kg으로부터 준비하였다. 팔미틴산 아스코르빌 2g과 대두유로부터의 트레할로스 1g을 함유하는 0.068kg의 GRINTEKMOR 50을 카제이테이트 나트륨 용액에 유화시켰다. 카제이테이트 나트륨 용액(항산화제 함유)을 균질화된 유상효모와 혼합시키고 이 혼합물을 실시예8에서 처럼 분무 건조시켰다. 분무 건조 생성물(92.6% 건조물)은 아스타크산틴 674㎍/g 건조효모를 함유하였다. 분무 건조된 생성물을 시판하는 어류 사료를 첨가하여 어류 사료중 다양한 농도의 아스타크산틴을 얻고 표 10에 나타내었다. (사료 A-D).
합성 아스타크산틴을 함유하는 어류 사료(사료 E)를 콘트롤로 사용하였다. 사료 E는 합성 아스타크산틴을 40ppm 함유하였다.
사료 A-E는 다음의 조성을 갖는다.
Figure kpo00023
무게가 약 400g인 무지개송어 약 60마리를 각 어류 사료 A-E 실험에 사용하였다. 어류를 우리에 가두고 임의의 양식하였다. 물의 온도는 2.5-14℃ 였으며, 저온은 어류 사육 실험의 마지막 단계에 적용하였다.
어류로부터의 아스타크산틴 추출
사용한 기구는 실험실에서 통상적으로 사용하는 장비로 한다. 비늘을 제거한 무지개 송어를 몇부분으로 갈라 원심 분리 튜브(100ml)에 살 15g을 넣었다. 추출제로서 테트라히드로퓨란 15ml를 첨가하였다. ULTRATURAX 믹서로 살을 더 잘게 나누고 이어서 원심분리하였다. 테트라히드로퓨란 추출물을 50ml까지 첨가하였다. 50ml중 10ml를 40℃에서 질소 커버하에서 증발시켰다. 증발 잔사를 이동상 1ml에 재용해시키고 추가 분석에 앞서 0.45㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
HPLC 분석
컬럼:Lichrosorb 게-18,5m, 250×4.6mm
이동성:40ml 포름산
60ml물
384ml 에틸아세테이트
516ml 아세토니트릴
유속: 10ml/분
주사: 20㎛루프, 레오다인 7120
펌프: Waters 510
검색기: Waters 481, UV-분광 광도계, 417nm
적분기: Waters 740
물고기 색깔 결정
물고기의 살색은 Minolta Chroma Meter Ⅱ를 이용하여 L*a*b*-색깔 결정법으로 측정하였다. L*-값은 광요소, a*-값은 (-60-+60범위)는 색의 청색/황색 요소를 가리킨다.
a*-값만을 표 Ⅱ에 실었다.
바늘을 제거한 무지개 송어의 살을 브랜더에서 균질화 시켜 균질환 매스를 얻고 이를 소형 페트리-디쉬(높이 1cm, 직경 3.5cm)에 총용량을 채우도록 담았다. 페트리-디쉬내의 매스 표면을 매끄럽게 하고 유리판으로 덮은 다음 분석 준비를 하였다.
다음의 표11에서, 어류 급식 실험의 자료를 나타내었다.
Figure kpo00024
Figure kpo00025
Figure kpo00026
Figure kpo00027
Figure kpo00028
표의 결과는 각 사료 A-E의 아스타크산틴이 물고기에 의해 흡수되고 어육의 사료(사료 A-D)내의 아스타크산틴 양이 증가되고 급식기간이 증가함에 따라 더욱 붉게 차가색됨을 나타낸다(a*-값(색의 붉은 요소를 가리킴)에 의해 관찰되는 바와 같음).
또한, 상기 결과는 사료중의 아스타크산틴의 존재가 어류의 생육에 아무런 결과를 미치지 않음을 가리킨다.
또한, 어류를 가시적으로 시험하자 일반적으로 매력적인 붉은 색을 띄는 것으로 나타났다. 43일 동안 급식한 후, 실제로 사료 D와 E(각각 본 발명에 따라 생산된 아스타크산틴과 합성 아스타크산틴을 40ppm식 함유)로 양식된 물고기의 색깔은 전혀 차이가 없는 것으로 나타났다. 72일간 급식한 후 사료 C,D 및 E(각각 본 발명에 따라 생산된 아스타크산틴 20ppm, 본 발명에 따라 생산된 아스타크산틴 40ppm, 및 합성 아스타크산틴 40ppm을 함유)로 양식된 물고기의 색깔은 차이가 없는 것으로 나타났다.
실시예 12
생성 파테
붉은 색을 내기 위해 아스타크산틴을 사용한 생선 파테(pate)(언어와 유사함)를 다음에 따라 조리하였다:
간찌꺼기 71%
기름 3%
러스크 4%
그라인드스테드 단백질177*) 1%
전분 1%
아스타크산틴 0.001%
물, 방부제 및 양념 100%까지
*)그라인드스테드 단백질 177은 그라인드스테드 단백질 100 75%와 알긴나트륨 25%의 혼합물임.
아스타크산팀을 유상에 분산시켰다. 그라인드스테드 단백질 177, 성분 및 기타 건조 전분을 혼합하고, 생선을 콜로이드 밀에 첨가하였다. 다음, 유상, 건조 성분 및 물을 첨가하고, 콜로이드 밀에서 약 10분간 공정을 진행시켰다. 파테를 통조림통에 채우고 열처리 하였다.
레드 드레싱
매력적인 붉은 색의 레드 드레싱은 다음의 성분으로부터 통상적인 방법으로 준비할 수 있다.
기름 30.0%
타라곤 식초 12.3%
토마토 페이스트 8.0%
마요단 DC*) 0.3%
당 8.0%
소금 0.8%
아스타크산틴 0.01-0.5%
물, 방부제 및 양념 100%까지
*)마요단 DC은 Grindsted Products A/S사 제품의 사소제 혼합물임.

Claims (17)

  1. 4일된 YM 배양체 100ml 접종물을 배플판이 2개 구비된 500mL 용량의 진탕 플라스크에 함유된 50mL Dicfo YM 배지에서 온도 20-22℃, 산소 이동률을 30mmoles/L/시간 이상으로 하여 5일간 생육시킨 다음 이를 150rpm으로 오비탈 와동시키는 경우, 건조효모 1g당 아스타크산틴을 300㎍ 이상의 양으로 생산하는 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포: 단, 여기서 측정은 직경 0.4mm의 유리볼 15g을 함유하고, 빙수와 함께 냉각 자켓이 구비된 유리볼 밑에서 건조효모 0.2g이 함유된 20mL 메탄올 현탁액을 최대 20℃에서 30초 간격으로 5×1분간 붕괴시켜 만든 효모의 추출물에 대해 순수한 아스타크산틴을 스탠다드로하여 HPLC 분석에 의해 수행한 것임.
  2. 제1항에 있어서, 효모 세포가 기탁번호 224-87 CBS, 기탁번호 225-87 CBS 또는 기탁번호 215-88 CBS로 기탁된 효모 세포주, 또는 아스타크산틴-생산능을 그대로 유지하는 이들의 변이주 또는 유도체인 것이 특징인 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포.
  3. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 제1항에서 언급된 조건으로 배양시켰을 때, 제1항에서 언급된 방법으로 측정할 경우 아스타크산틴을 건조효모 1g당 700㎍ 이상, 바람직하게는 건조효모 1g당 1000㎍ 이상, 특히 건조효모 1g당 1500㎍ 이상, 가장 바람직하게는 건조효모 1g당 2000㎍ 이상의 양으로 생산하는 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포.
  4. 호기적 조건하에서 탄수화물원, 질소 및 인의 동화가능한 원, 마이크로 영양원 및 바이오틴 또는 데스티오바이오틴을 함유하는 배지에서 15-26℃의 온도범위에서 아스타크산틴을 생산하는 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포를 배양한 다음, 다음의 단계, 즉, - 배양체로부터 세포를 수확하여 유상효모를 얻음, -세척제,산, 염기, 효소, 자기 분해- 촉진 물질, 염과 같은 삼투 분해 물질 및/또는 가수분해제를 임의로 첨가하여 세포를 기계적,화학적 및/또는 가수분해제를 임의로 첨가하여 세포를 기계적,화학적 및/또는 효소처리하거나/또는 세포에 초음파 처리, 자가 분해, 삼투 분해 및/또는 가수 분해 처리를 함으로써 예컨데 세포벽을 파열시켜 세포를 개방함. - 세포를 균질화시켜 균질을 얻음, - 세포, 세포단편, 또는 균질물을 수분함량이 최대 12중량%, 바람직하게는 최대 10중량%가되도록 건조시킴, -세포, 세포 단편 또는 균질물로부터 아스타크산틴을 추출함의 단계를 임의 순서로 수행하여, 제1항에서 언급한 방법을 측정할 대 건조효모 1g당 아스타크산틴을 600㎍ 이상의 양으로 함유하는 바이오매스를 얻는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 아스타크산틴- 함유 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포 또는 세포 단편 또는 아스타크산틴의 생산방법.
  5. 제4항에 있어서, 배양을 실제로 알코올이 생성되지 않고, 임의로 글루코스 및 사카로스의 총 농도가 최대 8g/L,바람직하게는 최대 5g/L 및 가장 바람직하게는 최대 1g/L이며 온도는 20-22℃인 조건하에서, 연속-회분 발효로 수행하고, 이 때 발효 또는 발효의 일부를 당밀 및/또는 사카로스 및 황산 디암모늄, 인산 암모늄, 수산화 암모늄 또는 요소와 같은 질소원, 인산 암모늄 및 인산과 같은 인원 및 황산 마그네슘, 황산아연 및 바이오틴이나 데스티오바이오틴과 같은 미네랄염 또는 부가적인 마이크로 영양원을 함유하는 배지에서 수행함을 특징으로 하는 방법(여기서 상기 당밀은 다른 성분들과 별도로 배지에 임의적으로 공급됨).
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 배양이 실제로 모든 생육조건에 대해 실질적으로 충분한 조건하에서의 생육 단게와 계속되는 통기하에서 생육배지가 적어도 한가지 생육 인자를 빼앗김으로써 후속적인 단계동안 아스타크산틴 생산이 촉진되는 조건하에서의 후속적인 생육-제한 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 후속적인 생육-제한 단계가 예컨데 16-24시간과 같이 적어도 약 16시간 동안 지속되고, 이 후속적인 생육-제한 단계가 이 후속적인 단게없이 얻어지는 경우의 아스타크산틴 생산량을 적어도 1.2배, 바람직하게는 적어도 1.3배,적어도 1.4배, 및 가장 바람직하게는 적어도 1.5배로 아스타크산틴 생산량을 증가시키며, 이 후속적인 생산 단계는 실제로 배지에 어떠한 영양분이나 또는 마이크로 영양분의 첨가없이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 배양될 호모 세포가 야생형 아스타크산틴-생산 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 바이오매스 중의 아스타크산틴의 농도가 제1항에서 언급된 방법으로 측정할 경우 건조효모 1g당 적어도 600㎍, 바람직하게는 건조효모 1g당 적어도 700㎍인 것이 특징인 방법.
  10. 제4항에 있어서, 배양될 효모가 제1항에서 청구된 효모 세포인 것이 특징인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 얻어진 바이오매스 중의 아스타크산틴 농도가 제1항에서 언급된 방법으로 측정할 경우 건조효모 1g당 적어도 600㎍, 바람직하게는 건조효모 1g당 적어도 800㎍, 더욱 바람직하게는 건조효모 1g당 적어도 1000㎍,특히 건조효모 1g당 적어도 1500㎍, 예컨데 건조효모 1g당 적어도 2000㎍, 가장 바람직하게는 건조효모 1g당 적어도 3000㎍인 것이 특징인 방법.
  12. 제4항에 있어서, 배양 후 및 임의로 후속적인 생육-제한 단계후에 효모 세포를 다음에 열거된 하나 또는 몇가지 단계로 처리하는 것이 특징인 방법:-세포에 압력을 가한다음 압력을 풀어서 세포를 파열시키고 이어서 파열된 세포를 원심분리 또는 증발시켜 파열된 세포를 농축시킴, 세포에 압력을 가한 다음 압력을 풀어서 세포를 파열시키고, 이어서 이 파열된 세포를 분무 건조되거나 드럼건조시킴., -세포를 여과하여 필터 커익을 얻은 다음 이를 사출시키고, 이 사출물을 예컨데 유체 베드에서 건조시키거나 또는 트레이 건조시킴. - 유체 베드 중에서 건조시키거나 또는 트레이 건조된 전 세포 건조물을 식용유나 지방과 같은 유상과 함께 혼합한 다음 볼 교반 밀과 같은 밀에서 이 혼합물을 분쇄하여 세포를 파열시켜 유상내로 아스타크산밀을 방출시킴. -바람직하게는 균질화된 파열 세포를 석유 에테르, 아세톤과 같은 유기 용매, 또는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올을 이용하여 추출함으로써 유기 용매중에 용해된 아스타크산틴을 얻은 다음, 예컨데 증발에 의해 용매를 임의로 제거함, - 빙초산으로된 용매로 전 세포를 추출하여 빙초산을 함유하는 용매 중에 함유된 아스타크산틴을 얻음, - 이산화탄소를 임의로 예컨데 상기 언급한 종류의 유기 용매와 배합하여, 파열되거나 습한 전 세포 또는 건조된 세포를 초임계적으로 추출함.
  13. 제12항에 있어서, 예컨데 수증기 및/또는 질소 및/또는 이산화탄소에 의해 확립된 불활성 분위기와 같은 산소- 제한 조건하에서 상기 처리를 수행함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 효모 전세포 및 빙초산 함유용매의 추출을 예컨데 20-100℃, 바람직하게는 20-80℃, 더욱 바람직하게는 20-60℃의 범위와 같이 용매의 빙점보다 높은 온도에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 기재된 방법으로 측정할 때, 건조효모 1g당 아스타크산틴을 적어도 600㎍ 이상의 양으로 함유하는 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포 또는 그 효모 세포의 부분과 기타 사료 성분, 바람직하게는 동물 사료로 이루어지며, 여기서 상기 아스타크산틴-함유 효모 세포 또는 효모 세포 부분은 총동물 사료 조성물 중량에 대해 10중량% 이하, 바람직하게는 5중량%이하, 더욱 바람직하게는 3중량%이하로 함유하고, 기타 성분은 어분, 유청, 혈분, 식물 성분과 같은 탄수화물원, 어유 및 식물성유와 같은 지방, 비타민 미네랄 중에서 선택되는 것이 특징인 동물 사료.
  16. 제15항에 있어서, 아스타크산틴-함유 효모 세포나 또는 효모 세포의 부분이 제1항에 따른 효모 세포이거나 그의 부분 또는 제9항에 따른 방법으로 생산된 효모 세포 또는 그의 부분인 것이 특징인 동물사료.
  17. 제1항에 언급된 방법으로 측정할 때 건조효모 1g당 아스타크산틴을 적어도 600㎍ 함유하는 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma) 효모 세포나 또는 그의 부분, 또는 이러한 효모 세포나 세포부분으로부터 추출된 아스타크산틴이 함유된 사료를 동물, 특히 바람직하게는 어류, 특히 연어나 바다 송어, 버터 염색을 위함 암소, 또는 난황 염색을 위한 가금류에게 투여하는 것으로 이루어지는, 동물의 고기 및/또는 동물이 생산하는 생산물을 붉게 염색하기 위한 동물의 급식 방법.
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