CN115044527B - 一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，包括：制备雨生红球藻种子液；配制肌醇母液；将配制好的肌醇母液添加至制备的后续用于诱导的藻液中；将添加有肌醇的诱导藻液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，进行培养，诱导藻细胞积累虾青素。本发明公开了肌醇新的应用领域，且操作方法简单易行、经济可行性高，实验所用藻种为自己筛选的雨生红球藻株，可按常规方法进行培养，且培养完藻的上清液可以直接用于灌溉农田，同时提高废液利用率。本发明方法简单可行，经济性高，并显著提高了雨生红球藻中虾青素的产量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用。
背景技术
目前，虾青素(Astaxanthin)是一种胡萝卜素含氧衍生物，与其他类胡萝卜素(β-胡萝卜素、叶黄素等)相似，具有相近的代谢和生理功能，其中抗氧化性是它们最大的共性。而虾青素的特殊分子结构决定了其极强的抗氧化特性。除此之外，虾青素的脂溶性和水溶性决定了其能够在生物体内被大量吸收，因此其在保健品、化妆品和药品等方面具有巨大的应用前景与空间。目前虾青素的来源主要有生物提取天然虾青素和化学法合成。虾青素存在三种立体异构体，分别是3S、3’S、3R，3’S以及3R、3’R。虽然三种立体异构体结构相似，但来源却不同：具有3S、3’S结构的虾青素主要来源于单细胞绿藻，主要为雨生红球藻；而3R、3’R型虾青素则主要由红色酵母细胞合成与累积。而化学合成的虾青素主要是由这三种不同结构的虾青素以1：2：1的比例混合存在的。化学合成的虾青素抗氧化性和稳定性显著低于天然虾青素，而且人工合成中的中间反应产物会掺杂在虾青素中，影响其安全性，且FDA已经明确规定化学合成的虾青素不得进入保健品市场。但雨生红球藻生产虾青素存在着生产成本高产量低等问题。肌醇是一种天然的六倍环己烷醇，是某些微生物的生长因子和真核生物的许多二级信使的结构成分。肌醇及其衍生物参与磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)信号通路，作为信号分子和关键代谢产物行使双重功能，在植物的生长和胁迫应答过程中起协调作用，作为一种类糖环醇，肌醇通过影响细胞结构，改变代谢途径，在植物生长发育过程中发挥核心作用，且肌醇价格十分低廉。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的从雨生红球藻提取虾青素的技术，提取成本高，且提取的的虾青素产量少；而化学合成虾青素安全性低，提取的虾青素抗氧化性与稳定性不佳。
解决以上问题及缺陷的难度为：制备雨生红球藻种子液及诱导过程中易染菌；优化用于诱导的肌醇最优浓度过程繁琐，需不断摸索。
解决以上问题及缺陷的意义为：肌醇相较于其他化学诱导剂价格十分低廉，节约成本的同时显著提高了雨生红球藻中天然虾青素的含量，并且操作简单可行。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用。
本发明是这样实现的，一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用。
进一步，所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU。
进一步，所述应用方法包括：
步骤一，制备雨生红球藻种子液；配制肌醇母液；将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中；
步骤二，将添加有肌醇的藻液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，进行培养，诱导藻细胞积累虾青素。
进一步，步骤一中，所述制备雨生红球藻种子液包括：对雨生红球藻进行培养直至对数生长期后期，令细胞浓度达到106cells/mL，利用培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，并作为后续诱导藻液。
进一步，所述培养基为：缺氮的BG-11培养基。
进一步，所述雨生红球藻培养包括：在温度25℃、光强2500～2800lux的持续光照条件下进行雨生红球藻的培养。
进一步，步骤一中，所述配制肌醇母液包括：用去离子水将肌醇配成浓度为70mmol/L的母液。
进一步，步骤一中，所述将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中包括：添加有肌醇的后续诱导藻液中肌醇浓度为200μmol/L。
进一步，步骤二中，所述培养包括：于日光灯光照下、27～28℃培养13天。
进一步，所述光照强度为17000～19000lux。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明公开了肌醇新的应用领域，且操作简单易行、经济可行性高，实验所用藻种为自己筛选的雨生红球藻株，可按常规方法培养，且培养完藻的上清液可以直接用于灌溉农田，提高废液利用率。本发明大幅度提高了虾青素的产量，添加200μmol/L的肌醇的实验组的虾青素产量比没有加肌醇的对照组提高了1.62倍，达到28.24mg/g。本发明方法简单可行，经济性高，并显著提高了雨生红球藻中虾青素的产量。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法流程图。
图2是本发明实施例提供的微藻的虾青素含量对比示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以
解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法包括：如图1所示，本发明实施例提供的肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法包括：
S101，在温度25℃、光强2500～2800lux的持续光照条件下进行雨生红球藻的培养直至对数生长期后期，令细胞浓度达到106cells/mL；
S102，利用缺氮的BG-11培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，并作为后续诱导藻液；
S103，用去离子水将肌醇配成浓度为70mmol/L的母液；将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中；
S104，将添加有肌醇的藻液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，于日光灯17000～19000lux的光照下、27～28℃培养13天，诱导藻细胞积累虾青素。
本发明实施例提供的将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中包括：添加有肌醇的后续诱导藻液中肌醇浓度为200μmol/L。
本发明实施例提供的雨生红球藻为雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU。
下面结合具体实施对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法，具体步骤如下：(1)种子液的制备：在25℃、光强为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU，培养到达对数生长期后期、细胞浓度达到106cells/mL，利用BG-11培养基稀释说明书5细胞浓度到3.5×105cells/mL，作为诱导藻液；(2)诱导雨生红球藻积累虾青素：用去离子水配成70mmol/L的肌醇母液，取350mL步骤(1)已经稀释好的诱导藻液，将已配置好的肌醇母液添加到用于诱导的藻液中，使肌醇终浓度达到100μmol/L后停止添加肌醇母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，日光灯光照强度为18000lux，温度27℃培养13天，连续光照及肌醇诱导藻细胞积累虾青素。按照实施例1的方法，再进行三组平行实验，其他条件与实施例1相同，连续光照及肌醇的诱导，使藻细胞积累虾青素。
本实施例培养完的藻液利用干重法测定生物量、分光光度法检测藻细胞的虾青素含量，其具体步骤为：(1)生物量浓度测定：取10mL藻液离心后弃上清，收集于提前称重的1.5mL离心管中，进行冷冻干燥，直至获得恒重。按照如下公式计算：生物量(g/L)＝干重(g)/体积(L)(2)虾青素浓度测定：取5mL藻液，以3500×g的转速离心10min，加入2ml30％甲醇(含有5％KOH)的混合液后混匀，65℃水浴15min。将混合液以3500×g的转速离心5min后去除上清，并用去离子水清洗2遍。加入5ml二甲基亚砜(DMSO)，200W超声破碎直至藻体发白，离心后取上清测定其在490nm处的吸光度值。按照如下公式计算：虾青素浓度(mg/L)＝4.5×A×Va/Vb其中，A代表490nm处的吸光度值；Va代表加入的DMSO的体积；Vb代表藻液的体积。(3)虾青素含量的计算：虾青素含量(mg/g)＝虾青素浓度(mg/L)/细胞生物量(g/L)检测结果：当肌醇浓度为100μmol/L时，微藻的虾青素含量最高为27.01mg/g。且培养完藻的培养基无污染，可以直接排放。
实施例2
肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法，具体步骤如下：(1)种子液的制备：在25℃、光强为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU，培养到达对数生长期后期、细胞浓度达到106cells/mL，利用BG-11培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，作为诱导藻液；(2)诱导雨生红球藻积累虾青素：用去离子水配成70mmol/L的肌醇母液，取350mL步骤(1)已经稀释好的诱导藻液，将已配置好的肌醇母液添加到用于诱导的藻液中，使肌醇终浓度达到200μmol/L后停止添加肌醇母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，日光灯光照强度为18000lux，温度27℃培养13天，连续光照及肌醇诱导藻细胞积累虾青素。
按照实施例2的方法，再进行三组平行实验，其他条件与实施例2相同，连续光照及肌醇的诱导，使藻细胞积累虾青素。按照实施例1的检测结果，当肌醇浓度为200μmol/L时，微藻的虾青素含量最高为28.24mg/g。且培养完藻的培养基无污染，可以直接排放。实施例3肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法，具体步骤如下：(1)种子液的制备：在25℃、光强为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU，培养到达对数生长期后期、细胞浓度达到106cells/mL，利用BG-11培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，作为诱导藻液；(2)诱导雨生红球藻积累虾青素：用去离子水配成70mmol/L的肌醇母液，取350mL步骤(1)已经稀释好的诱导藻液，将已配置好的肌醇母液添加到用于诱导的藻液中，使肌醇终浓度达到400μmol/L后停止添加肌醇母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，日光灯光照说明书7强度为18000lux，温度27℃培养13天，连续光照及肌醇诱导藻细胞积累虾青素。
按照实施例3的方法，再进行三组平行实验，其他条件与实施例3相同，连续光照及肌醇的诱导，使藻细胞积累虾青素。按照实施例1的检测结果，当肌醇浓度为400μmol/L时，微藻的虾青素含量最高为14.55mg/g。且培养完藻的培养基无污染，可以直接排放。
实施例4
肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用方法，具体步骤如下：(1)种子液的制备：在25℃、光强为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU，培养到达对数生长期后期、细胞浓度达到106cells/mL，利用BG-11培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，作为诱导藻液；(2)诱导雨生红球藻积累虾青素：用去离子水配成70mmol/L的肌醇母液，取350mL步骤(1)已经稀释好的诱导藻液，将已配置好的肌醇母液添加到用于诱导的藻液中，使肌醇终浓度达到800μmol/L后停止添加肌醇母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，日光灯光照强度为18000lux，温度27℃培养13天，连续光照及肌醇诱导藻细胞积累虾青素。
按照实施例4的方法，再进行三组平行实验，其他条件与实施例4相同，连续光照及肌醇的诱导，使藻细胞积累虾青素。按照实施例1的检测结果，当肌醇浓度为800μmol/L时，微藻的虾青素含量最高为13.5mg/g。且培养完藻的培养基无污染，可以直接排放。
对比例(1)种子液的制备：在25℃、光强为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU，培养到达对数生长期后期、细胞浓度达到106cells/mL，利用BG-11培养基稀释说明书8细胞浓度到3.5×105cells/mL，作为诱导藻液；(2)诱导雨生红球藻积累虾青素：取350mL步骤(1)已经稀释好的诱导藻液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，日光灯光照强度为18000lux，温度27℃培养13天，诱导藻细胞积累虾青素。按照实施对比例的方法，再进行三组平行实验，其他条件与对比例相同，连续光照及肌醇的诱导，使藻细胞积累虾青素。按照实施对比例的检测结果，当肌醇浓度为0μmol/L时，微藻的虾青素含量最高为17.43mg/g。且培养完藻的培养基无污染，可以直接排放。
利用分光光度法测定对比实例和实施例1-4微藻的虾青素含量，见图1，图中的含量是每个实施例中的三个平行实验取均值，结果表明：利用肌醇MI作为诱导剂，诱导雨生红球藻积累虾青素，利用分光光度法测定雨生红球藻中虾青素的含量，结果显示：(1)实施例2中藻细胞积累虾青素的量第十三天达到最高峰(2)实施例1、2中藻细胞积累虾青素的量均高于对比例中没有加入肌醇MI的情况；但是实施例3、4当肌醇浓度达到400与800μmol/L时，MT对微藻积累虾青素没有促进作用，藻细胞积累虾青素的量低于对比例中没有加入肌醇MI的情况；说明，当肌醇MI浓度为100～200μmol/L时，肌醇MI对微藻积累虾青素具有促进作用，在微藻培养的第13天，当肌醇MI浓度为200μmol/L时，微藻内虾青素含量达到最大为28.24mg/g，是对比例空白对照组的1.62倍。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、CD或DVD-ROM的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，利用缺氮的BG-11培养基稀释雨生红球藻细胞浓度到3.5×105cells/mL，并作为后续诱导藻液；然后于日光灯光照强度为17000～19000lux、27～28℃的条件下结合肌醇诱导培养13天，所述肌醇浓度为100～200μmol/L，所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株HaematococcuspluvialisLUGU。
2.如权利要求1所述肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，所述应用包括：
步骤一，制备雨生红球藻种子液；配制肌醇母液；将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中；
步骤二，将添加有肌醇的藻液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入无菌空气，进行培养，诱导藻细胞积累虾青素。
3.如权利要求2所述肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，步骤一中，所述制备雨生红球藻种子液包括：对雨生红球藻进行培养直至对数生长期后期，令细胞浓度达到106cells/mL，利用培养基稀释细胞浓度到3.5×105cells/mL，并作为后续诱导藻液。
4.如权利要求3所述肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，所述雨生红球藻培养包括：在温度25℃、光强2500～2800lux的持续光照条件下进行雨生红球藻的培养。
5.如权利要求3所述肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，步骤一中，所述配制肌醇母液包括：用去离子水将肌醇配成浓度为70mmol/L的母液。
6.如权利要求3所述肌醇在促进雨生红球藻生产虾青素中的应用，其特征在于，步骤一中，所述将配制好的肌醇母液添加至制备的后续诱导藻液中包括：添加有肌醇的后续诱导藻液中肌醇浓度为200μmol/L。
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