CN110484451B - 一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，步骤如下：⑴雨生红球藻培养在培养基中，培养温度为22±1℃，光照，培养过程中不断通入无菌混合空气，培养雨生红球藻至对数生长期末期；⑵使用NaNO3浓度为0.01‑0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释，培养温度22±1℃；光照，当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时，即收集微藻细胞，并提取虾青素。本方法使微藻的培养和转化周期明显缩短，同时显著提高了微藻细胞光能利用和转化效率以及虾青素含量，而且降低了细胞贴壁性和生理代谢所受的干扰，所添加的物料也得到了最优利用。

Description

一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，尤其是一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是一种脂溶性类胡萝卜素，是目前为止在自然界有机体中发现的抗氧化能力最强的物质，它清除自由基和单线态氧淬灭的能力远远高于维生素E，比玉米黄质、番茄红素及β-胡萝卜素等常见抗氧化物质的抗氧化能力也要高10倍以上。此外虾青素还有良好的着色效果，可以进入生物体并贮存在组织中，使水产养殖动物的肌肉和皮肤呈现鲜亮的颜色，被原国家农业部指定为水产动物的唯一着色剂。虾青素还具有提高机体免疫力、延缓衰老以及消除炎症的功效，因此广泛应用于功能性食品、保健品和化妆品的添加剂。目前每年虾青素的全球贸易额超过4亿美元，而且市场仍在不断扩大。虾青素的来源主要有化学合成和生物提取两种方式，化学合成成本高昂，且产物结构、功能与天然虾青素有一定差别。生物提取来源主要有甲壳类废弃物、红法夫酵母和微藻，甲壳类废弃物中虾青素含量低且提取成本高，不适合工业化生产；而红法夫酵母中的虾青素含量也不到0.5％，规模化开发的费效比不高；相比而言，绿藻门的雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是自然界中天然虾青素含量最高的生物，虾青素可以占到细胞干重的1.5％-5.0％，而且全为生物活性更高的反式虾青素，另外提取方法相对简单、成本较低，因此被公认为生产天然虾青素的最佳生物反应器。雨生红球藻的生活史大体可以分为绿色营养细胞和红色厚壁细胞两个阶段，在绿色营养细胞阶段，当环境条件适宜时微藻快速增殖，细胞主要积累叶绿素和叶黄素等色素，当外界环境条件不利时，微藻细胞壁增厚并大量积累虾青素，并逐渐转变为红色不动孢子。目前国内外学界和工业界均把雨生红球藻作为生产天然虾青素的最重要来源之一，开展了大量理论研究和生产实践，旨在通过优化培养和诱导条件，提高雨生红球藻的生物量和虾青素水平。
通过对比，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
一种提高雨生红球藻中虾青素含量的方法(CN 108410939 A)，公开了在封闭式光反应器中，使用BG-11培养基，控制温度25-30℃，光强为100μmol/m2·s，通入无菌的混合气体(CO2的体积浓度为2-10％，其余为空气)，培养雨生红球藻至对数生长期末期。用灭菌的缺氮BG-11培养基作为稀释溶液，将对数生长期的雨生红球藻培养液稀释到细胞浓度0.1-0.5g/L后，添加乙醇胺至终浓度为50-400mg/L，然后开始诱导培养，培养过程中给与光照和混合，光强为50-1000μmol/m2·s，控制培养温度25-35℃。培养7-14天后，当雨生红球藻培养液由绿转红且镜检红色不发生明显改变时采收藻细胞，虾青素含量比正常培养条件下提高了53-221％，产量提高了52-206％。
单纯补充CO2对雨生红球藻固碳速率的提升作用有限，并且使培养液的pH逐渐降低，不利于雨生红球藻由绿色营养细胞阶段向红色厚壁细胞阶段的转变；
乙醇胺通过增加碳源供给并抑制微藻光合作用，促进了雨生红球藻细胞积累虾青素，但是其生物安全性未知，作为微藻产物合成调节剂有一定的风险；
培养过程中只是对光照强度进行设定而没有对光的波长进行区分、管理，光能利用和转化效率不高；
在红色厚壁细胞阶段使用缺氮BBM培养基培养雨生红球藻，虽然有利于微藻细胞积累虾青素，但是微藻细胞的生理代谢活动会受到一定程度的影响。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，该方法使微藻的培养和转化周期明显缩短，同时显著提高了微藻细胞光能利用和转化效率以及虾青素含量，而且降低了细胞贴壁性和生理代谢所受的干扰，所添加的物料也得到了最优利用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，步骤如下：
⑴雨生红球藻绿色营养细胞阶段：雨生红球藻培养在培养基中，所述培养基为BBM培养基，其中添加终浓度为0.01-0.04mol/L的NaHCO3、终浓度为0.4-1mmol/L的3-羟基丁酸乙酯；
培养温度为22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为700nm红光+白光的混合光照，总光照强度为45-60μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝1:1-3:1；
培养过程中不断通入无菌混合空气，通气速率为0.5L/min；其中，无菌混合空气的成分为：空气体积分数98％，CO2体积分数2％；
培养雨生红球藻至对数生长期末期，得到细胞密度达1.4×107-4.5×107cells/mL的藻液；
⑵雨生红球藻红色厚壁细胞阶段：使用NaNO3浓度为0.01-0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL；其中，所述低氮BBM培养基中添加终浓度为0.1-0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.1-0.3mol/L的NaCl；
培养温度22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为450nm蓝光+白光的混合光照，总光照强度为180-200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝1:1-3:1；
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时，即收集微藻细胞，并提取虾青素；
其中，所述BBM培养基、低氮BBM培养基、NaHCO3、3-羟基丁酸乙酯、FeSO4和NaCl使用前均经过高温121℃蒸汽灭菌20min。
而且，所述步骤⑴中NaHCO3的终浓度为0.02mol/L，3-羟基丁酸乙酯的终浓度为0.8mmol/L。
而且，所述3-羟基丁酸乙酯在使用时用蒸馏水配成终浓度为2mmol/L的母液，置于棕色试剂瓶中避光保存，使用时稀释成相应浓度的工作液。
而且，所述光照通过LED灯带提供。
而且，所述步骤⑴中光照时总光照强度为55μmol/m2·s。
而且，所述光照时的光源光强采用照度计测定。
而且，所述步骤⑵中低氮BBM培养基中添加终浓度为0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.3mol/L的NaCl。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法对雨生红球藻前期的绿色营养细胞生长和后期红色厚壁细胞积累虾青素两个阶段分别进行科学优化，前期通过综合运用“BBM培养基培养+生长刺激物质(3-羟基丁酸乙酯)添加+光照管理+综合碳源补充(CO2+NaHCO3)”手段，促进雨生红球藻细胞大量增殖，然后通过“细胞密度稀释+低氮BBM培养基培养+Fe2+、高盐和高光协同诱导”促使雨生红球藻迅速转化为大量积累虾青素的红色厚壁细胞。整个过程通过对雨生红球藻培养和诱导条件的科学优化与综合管理，使微藻的培养和转化周期明显缩短，同时显著提高了微藻细胞光能利用和转化效率以及虾青素含量，而且降低了细胞贴壁性和生理代谢所受的干扰，所添加的物料也得到了最优利用。
2、本发明方法综合运用“BBM培养基培养+生长刺激物质(3-羟基丁酸乙酯)添加+光照管理+综合碳源补充(CO2+NaHCO3)”手段，提高了雨生红球藻的生长速率和细胞密度，至对数生长期细胞密度可达2.1×107-4.5×107cells/mL，另外将微藻从绿色营养细胞向红色厚壁细胞转化的周期缩短了4-6天；
通过对光源的光照强度和波长进行优化组合，提高了光能转化效率，同时降低了雨生红球藻细胞的贴壁性，促进了微藻对光能的吸收、利用；
通过综合运用“细胞密度稀释+低氮BBM培养基培养+Fe2+、高盐和高光协同诱导”手段，雨生红球藻积累虾青素含量达到33.78-44.91mg/L，同时让微藻生理代谢所受的影响降到最低。
3、本发明方法在雨生红球藻的绿色营养细胞培养阶段，通过补充CO2和NaHCO3提高碳源供给，显著提高了微藻细胞的光合固碳速率，并且解决了单纯补充CO2造成培养基pH逐渐降低而不利于虾青素积累的问题，另外添加具有生物安全性的3-羟基丁酸乙酯(GB2760--1996规定为允许使用的食品用香料)显著提高了雨生红球藻生长速率，缩短了雨生红球藻细胞的转化周期。在雨生红球藻绿色营养细胞阶段使用“700nm红光+白光”的混合光照(总光强为45-60μmol/m2·s)，明显提高了微藻的生长速率且降低了细胞的贴壁性，在红色厚壁细胞阶段使用“450nm蓝光+白光”的混合光照(总光强为180-200μmol/m2·s)，显著促进微藻细胞积累虾青素，通过对微藻不同培养阶段的光照强度和光波波长进行综合管理，提高了光能利用和转化效率。在低氮BBM培养基中使用Fe2+、高盐和高光协同诱导雨生红球藻迅速转化为大量积累虾青素的红色厚壁细胞，使微藻生理代谢所受的影响降到最低。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，步骤如下：
⑴雨生红球藻绿色营养细胞阶段：雨生红球藻培养在培养基中，所述培养基为BBM培养基，其中添加终浓度为0.01-0.04mol/L的NaHCO3、终浓度为0.4-1mmol/L的3-羟基丁酸乙酯；
培养温度为22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为700nm红光+白光的混合光照，总光照强度为45-60μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝1:1-3:1；
培养过程中不断通入无菌混合空气，通气速率为0.5L/min；其中，无菌混合空气的成分为：空气体积分数98％，CO2体积分数2％；
培养雨生红球藻至对数生长期末期，得到细胞密度达1.4×107-4.5×107cells/mL的藻液；
⑵雨生红球藻红色厚壁细胞阶段：使用NaNO3浓度为0.01-0.03mol/L的低氮BBM培养基(低氮BBM培养基为普通BBM培养基中含有较低浓度的NaNO3)将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL；其中，所述低氮BBM培养基中添加终浓度为0.1-0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.1-0.3mol/L的NaCl；
培养温度22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为450nm蓝光+白光的混合光照，总光照强度为180-200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝1:1-3:1；
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时，即收集微藻细胞，并提取虾青素；
其中，所述BBM培养基、低氮BBM培养基、NaHCO3、3-羟基丁酸乙酯、FeSO4和NaCl使用前均经过高温121℃蒸汽灭菌20min。
较优地，所述步骤⑴中NaHCO3的终浓度为0.02mol/L，3-羟基丁酸乙酯的终浓度为0.8mmol/L。
较优地，所述3-羟基丁酸乙酯在使用时用蒸馏水配成终浓度为2mmol/L的母液，置于棕色试剂瓶中避光保存，使用时稀释成相应浓度的工作液。
较优地，所述光照通过LED灯带提供。
较优地，所述步骤⑴中光照时总光照强度为55μmol/m2·s。
较优地，所述光照时的光源光强采用照度计测定。
较优地，所述步骤⑵中低氮BBM培养基中添加终浓度为0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.3mol/L的NaCl。
虾青素提取和测定方法可以如下：量取5mL藻液离心并弃上清液，加入5mL超纯水清洗并重复两次，然后用氢氧化钾和甲醇混合水溶液(含质量浓度5％KOH+质量浓度30％甲醇)破坏叶绿素5min。离心后向提取液中加5滴乙酸降低pH，弃去上清液，然后加5mL超纯水清洗两次，再用二甲基亚砜抽提至藻团呈白色，色素提取完全为止。使用紫外-可见分光光度计测定抽提液在490nm波长下的吸光度OD490，根据以下公式计算虾青素含量c：
Figure BDA0002157040120000051
式中，Va为二甲基亚砜体积，Vb为藻液体积。
本发明中的相关实施例：
实施例1
培养过程在3L大三角瓶中进行，每瓶装液量2L。在BBM培养基中添加浓度为0.02mol/L的NaHCO3，浓度为0.6mmol/L的3-羟基丁酸乙酯。培养温度设定为22±1℃。光暗比设定为12hL：12hD，采用“700nm红光+白光”的混合光照，总光照强度为50μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝2:1。培养过程中不断通入无菌混合空气(空气体积分数98％，CO2体积分数2％)，通气速率为0.5L/min。培养雨生红球藻至对数生长期末期，微藻细胞密度达2.7×107cells/mL。
使用NaNO3浓度为0.02mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL。低氮BBM培养基中添加浓度为0.2mol/L的FeSO4和0.2mol/L的NaCl。培养温度设定为22±1℃。光暗比为12hL：12hD，采用“450nm蓝光+白光”的混合光照，总光照强度为190μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝2:1。
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞，测得虾青素含量为36.55mg/L。
实施例2
培养过程在3L大三角瓶中进行，每瓶装液量2L。在BBM培养基中添加浓度为0.03mol/L的NaHCO3，浓度为0.8mmol/L的3-羟基丁酸乙酯。培养温度设定为22±1℃。光暗比设定为12hL：12hD，采用“700nm红光+白光”的混合光照，总光照强度为55μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝3:1。培养过程中不断通入无菌混合空气(空气体积分数98％，CO2体积分数2％)，通气速率为0.5L/min。培养雨生红球藻至对数生长期末期，微藻细胞密度达4.5×107cells/mL。
使用NaNO3浓度为0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL。低氮BBM培养基中添加浓度为0.3mol/L的FeSO4和0.3mol/L的NaCl。培养温度设定为22±1℃。光暗比为12hL：12hD，采用“450nm蓝光+白光”的混合光照，总光照强度为200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝3:1。
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞，测得虾青素含量为44.91mg/L。
实施例3
培养过程在3L大三角瓶中进行，每瓶装液量2L。在BBM培养基中添加浓度为0.04mol/L的NaHCO3，浓度为1mmol/L的3-羟基丁酸乙酯。培养温度设定为22±1℃。光暗比设定为12hL：12hD，采用“700nm红光+白光”的混合光照，总光照强度为60μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝3:1。培养过程中不断通入无菌混合空气(空气体积分数98％，CO2体积分数2％)，通气速率为0.5L/min。培养雨生红球藻至对数生长期末期，微藻细胞密度达4.2×107cells/mL。
使用NaNO3浓度为0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL。低氮BBM培养基中添加浓度为0.3mol/L的FeSO4和0.3mol/L的NaCl。培养温度设定为22±1℃。光暗比为12hL：12hD，采用“450nm蓝光+白光”的混合光照，总光照强度为200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝3:1。
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞，测得虾青素含量为41.24mg/L。
实施例4
培养过程在3L大三角瓶中进行，每瓶装液量2L。在BBM培养基中添加浓度为0.02mol/L的NaHCO3，浓度为0.8mmol/L的3-羟基丁酸乙酯。培养温度设定为22±1℃。光暗比设定为12hL：12hD，采用“700nm红光+白光”的混合光照，总光照强度为55μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝2:1。培养过程中不断通入无菌混合空气(空气体积分数98％，CO2体积分数2％)，通气速率为0.5L/min。培养雨生红球藻至对数生长期末期，微藻细胞密度达3.8×107cells/mL。
使用NaNO3浓度为0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL。低氮BBM培养基中添加浓度为0.2mol/L的FeSO4和0.2mol/L的NaCl。培养温度设定为22±1℃。光暗比为12hL：12hD，采用“450nm蓝光+白光”的混合光照，总光照强度为200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝2:1。
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞，测得虾青素含量为39.73mg/L。
现有技术对比例：
一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法(CN 106434817 A)，公开了使用BG-11培养基对雨生红球藻进行扩培，初始接种浓度0.05g/L，控制温度20-25℃，光强70μmol/m2·s，通入含有1.5％CO2的混合空气进行光自养培养，10天后收集藻液并缓慢加入浓度为10M的NaOH将藻液pH调至12，控制温度20-30℃，在低光或无光条件下搅拌0.5小时，然后浓缩藻液。将浓缩藻液接种至缺氮的BG-11培养基，置于室外光生物反应器中连续培养12天，然后镜检并收集藻细胞，测得虾青素浓度为35.3mg/L。
由此可以看出，本发明方法能够得到比现有技术高的虾青素产量。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (7)

1.一种促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴雨生红球藻绿色营养细胞阶段：雨生红球藻培养在培养基中，所述培养基为BBM培养基，其中添加终浓度为0.01-0.04mol/L的NaHCO3、终浓度为0.4-1mmol/L的3-羟基丁酸乙酯；
培养温度为22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为700nm红光+白光的混合光照，总光照强度为45-60μmol/m2·s，其中红光光强：白光光强＝1:1-3:1；
培养过程中不断通入无菌混合空气，通气速率为0.5L/min；其中，无菌混合空气的成分为：空气体积分数98％，CO2体积分数2％；
培养雨生红球藻至对数生长期末期，得到细胞密度达1.4×107-4.5×107cells/mL的藻液；
⑵雨生红球藻红色厚壁细胞阶段：使用NaNO3浓度为0.01-0.03mol/L的低氮BBM培养基将处于对数生长期末期的藻液稀释至5×105cells/mL；其中，所述低氮BBM培养基中添加终浓度为0.1-0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.1-0.3mol/L的NaCl；
培养温度22±1℃；
光照，光暗比为12hL：12hD，采用波长为450nm蓝光+白光的混合光照，总光照强度为180-200μmol/m2·s，其中蓝光光强：白光光强＝1:1-3:1；
当雨生红球藻培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时，即收集微藻细胞，并提取虾青素；
其中，所述BBM培养基、低氮BBM培养基、NaHCO3、3-羟基丁酸乙酯、FeSO4和NaCl使用前均经过高温121℃蒸汽灭菌20min。
2.根据权利要求1所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述步骤⑴中NaHCO3的终浓度为0.02mol/L，3-羟基丁酸乙酯的终浓度为0.8mmol/L。
3.根据权利要求1所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述3-羟基丁酸乙酯在使用时用蒸馏水配成终浓度为2mmol/L的母液，置于棕色试剂瓶中避光保存，使用时稀释成相应浓度的工作液。
4.根据权利要求1所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述光照通过LED灯带提供。
5.根据权利要求1所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述步骤⑴中光照时总光照强度为55μmol/m2·s。
6.根据权利要求1所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述光照时的光源光强采用照度计测定。
7.根据权利要求1至6任一项所述的促进雨生红球藻生长和积累虾青素的方法，其特征在于：所述步骤⑵中低氮BBM培养基中添加终浓度为0.3mol/L的FeSO4，添加终浓度为0.3mol/L的NaCl。
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