CN111793667B - 一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，涉及微藻培养技术领域，本发明包括以下步骤：在雨生红球藻接种培养过程中加入γ‑氨基丁酸，待雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度进行培养。本发明的有益效果在于：在雨生红球藻培养过程中加入γ‑氨基丁酸，不仅可以延长雨生红球藻的绿色生长对数期，而且减少强光氧化损伤性死亡，提高了培养阶段藻细胞的生物量和叶绿素含量，最终提高虾青素的产量。

Description

一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法
技术领域
本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法。
背景技术
虾青素是一种强的抗氧化剂，雨生红球藻是自然界中天然虾青素最好的来源，虾青素是雨生红球藻在逆境胁迫下合成的，用来保护细胞免受生物或非生物胁迫带来的伤害，从而生存下来，如何提高虾青素的产量是目前研究的一个热点问题。
生物胁迫是由生物带来的介质引起的，如细菌、真菌等，而我们在日常培养过程中会尽量避免生物胁迫对藻细胞带来的伤害，在虾青素诱导阶段一般采用非生物胁迫的方式，如高温、高光、营养缺乏、辐射、化学品等刺激虾青素的合成。如公开号为CN104480178的专利公开胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法，第一阶段在三角烧瓶中培养，设置较低的温度和光照强度，第二阶段采用白塑料桶充气培养，提高温度和光照强度，并延长了光照时间，从而促进虾青素的积累。
但是当在合适条件培养下的藻细胞，突然转向不利条件下时，比如强光照刺激，会有大量的藻细胞因为耐受不住强光造成的氧化损伤而死亡，强光照对游动的绿色藻细胞造成不可逆的光氧化损伤，直接影响了藻细胞的培养密度，进而降低了虾青素的产量。
γ-氨基丁酸是一种小分子四碳非蛋白质氨基酸，作为功能性小分子被广泛关注于动物，植物，微生物中。最初，γ-氨基丁酸是在马铃薯块茎中发现的，后来人们转移注意力到动物的大脑中，发现γ-氨基丁酸是一种神经递质，而且以高浓度形式存在，是大脑中相同区域其他神经递质的1000倍左右。当植物在非生物胁迫下，发现γ-氨基丁酸浓度会迅速增加，来抵抗非生物胁迫对植物造成的伤害。在植物和微生物体系中，大量的研究也证明γ-氨基丁酸提高了植物和微生物对逆境的耐受能力，例如，高温，干旱，盐碱，强光照，病虫害等非生物胁迫条件。γ-氨基丁酸提高植物抗逆能力的机制也有研究，主要机制有γ-氨基丁酸通过提高细胞内过氧化物酶的活性来抵抗由于逆境条件下ROS的迅速增加造成的细胞损伤，或者通过提高叶绿素含量，提高细胞的光合作用活性，调节细胞内碳氮平衡等来促进植物生长，并提高植物抗逆性。但这些研究都是指植物内部产生γ-氨基丁酸而发生作用的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中强光照等不利环境因素导致的虾青素诱导初期藻细胞不可逆的氧化损伤性死亡问题，提供一种减少强光氧化损伤性死亡，并提高雨生红球藻虾青素产量的方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，包括以下步骤：在雨生红球藻接种培养过程中加入γ-氨基丁酸，待雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度进行培养。
有益效果：在雨生红球藻培养过程中加入γ-氨基丁酸，不仅可以延长延长雨生红球藻的绿色生长对数期，而且减少强光氧化损伤性死亡，提高了培养阶段藻细胞的生物量和叶绿素含量，最终提高虾青素的产量。
优选地，所述雨生红球藻培养采用的培养基为BBM培养基。
优选地，所述BBM培养基的配方如下：NaNO3:250mg/L,KH2PO4:175mg/L,K2HPO4:75mg/L,NaCl:25mg/L,EDTA:50mg/L,KOH:31mg/L,H3BO3:11.42mg/L,CaCl2·2H2O:5mg/L,MnCl2·4H2O:0.288mg/L,Co(NO3)2·6H2O:0.098mg/L,FeSO4·7H2O:0.996mg/L,MoO3:0.142mg/L,MgSO4·7H2O:75mg/L,ZnSO4·7H2O:8.82mg/L,CuSO4·5H2O:1.57mg/L。
优选地，所述雨生红球藻培养阶段的条件为白光光照强度40μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，培养温度为25℃。
优选地，所述雨生红球藻在虾青素诱导期的光照强度为120μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，培养温度为25℃。
优选地，所述γ-氨基丁酸在培养基中的终浓度为1-10mM。
优选地，所述γ-氨基丁酸在培养基中的终浓度为5mM。
有益效果：在培养基中加入不同浓度的γ-氨基丁酸，当提高γ-氨基丁酸的浓度到10mM时，虾青素产量提高更多，但是并没有提高到5mM处理浓度的两倍，所以相比较而言，从促产效率来说，5mM的γ-氨基丁酸是最适处理浓度。
优选地，所述γ-氨基丁酸经过0.22μm无菌滤膜过滤。
优选地，在雨生红球藻接种培养的同时加入γ-氨基丁酸，培养时间为14天。
优选地，所述雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度培养至完全变成红色包囊细胞。
优选地，所述雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度培养50天。
有益效果：由于GABA处理后促进了藻细胞的生长，藻细胞的诱导时间与细胞的浓度相关，细胞浓度越大，平均每个细胞接受到的光刺激变小，细胞间相互的遮挡变多，GABA处理后雨生红球藻细胞变成红色孢囊细胞的时间延长，从强光照诱导合成虾青素开始第50天，GABA处理的藻细胞在第50天完全变成红色孢囊细胞。
本发明的优点在于：在雨生红球藻培养过程中加入γ-氨基丁酸增强雨生红球藻细胞的抗逆性和光保护能力，不仅可以延长延长雨生红球藻的绿色生长对数期，增加藻细胞的生物量，保持细胞密度的不变甚至增加，在强光照诱导虾青素合成阶段，降低强光照转换过程中对雨生红球藻细胞造成的光氧化损伤，减少藻细胞的死亡，从而提高虾青素的产量。
附图说明
图1为本发明实施例2中不同浓度的GABA处理后雨生红球藻细胞的生长曲线；
图2为本发明实施例2中雨生红球藻生长过程中GABA对叶绿素含量的影响；
图3为本发明实施例2中强光照后GABA对虾青素产量及生物量的影响；
图4为本发明实施例2中强光照后GABA对藻细胞虾青素产量的影响的显微照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
提高雨生红球藻虾青素产量的方法
(1)在雨生红球藻接种培养的同时加入γ-氨基丁酸
a.雨生红球藻的培养
雨生红球藻购买于中国科学院水生生物研究所，株系FACHB-712(但是本专利不限于该株系)，采用的培养基是BBM培养基，培养基配方如下：NaNO3:250mg/L,KH2PO4:175mg/L,K2HPO4:75mg/L,NaCl:25mg/L,EDTA:50mg/L,KOH:31mg/L,H3BO3:11.42mg/L,CaCl2·2H2O:25mg/L,MnCl2·4H2O:1.44mg/L,Co(NO3)2·6H2O:0.49mg/L,FeSO4·7H2O:4.98mg/L,MoO3:0.71mg/L,MgSO4·7H2O:75mg/L,ZnSO4·7H2O:8.82mg/L,CuSO4·5H2O:1.57mg/L。
b.γ-氨基丁酸溶液的配制：将γ-氨基丁酸(GABA)与超纯水混合，配置成1mol/L的GABA母液，然后经过0.22μm的无菌滤膜过滤待用；
c.实验组培养条件为：雨生红球藻的初始接种浓度为1×105cells/mL,将GABA母液加入到含藻的BBM培养基中，γ-氨基丁酸的终浓度为5mM，绿色营养阶段采用LED白光光照，光照强度为40μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，温度为25℃，培养时间为14天；
d.对照组培养条件为：与实验组的区别为不加入GABA母液。
(2)待对照组雨生红球藻进入生长平台期时转强光照培养，诱导虾青素的合成，培养条件为：采用LED白光光照，光照强度为120μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，温度为25℃。
实施例2
对生长不同时期的雨生红球藻细胞进行取样分析
(1)测OD680的吸收值变化：于超净工作台中取不同培养时间后的藻细胞培养液3mL，放于离心管中，测680nm处的紫外吸收值，每隔2-3天取样一次，然后根据吸收值绘制雨生红球藻的生长曲线。
(2)测生长过程中叶绿素含量的变化：分别取不同生长时间的藻细胞培养液1mL在4000rpm条件下离心10min，去上清后加入1mL甲醇，黑暗条件下过夜，待藻细胞完全变白后，13000rpm离心5min后提取上清液进行紫外检测，检测范围400-750nm。然后根据公式算出叶绿素的浓度(测定方法采用Ritchie R J.Consistent Sets of SpectrophotometricChlorophyll Equations for Acetone,Methanol and Ethanol Solvents[J].Photosynthesis Research,2006,89(1):27-41.中甲醇提取叶绿素的方法计算公式，见Table-2)。
公式如下：[chl-a](μg/ml)＝-8.0962*OD652+16.5169*OD665；
[chl-b](μg/ml)＝27.4405*OD652-12.1688*OD665；
Total chl＝[chl-a]+[chl-b]；
其中[chl-a]表示叶绿素a，[chl-b]表示叶绿素b，Total chl表示叶绿素总量。
(3)测生长过程中虾青素含量的变化：绿色营养阶段培养14天后，对雨生红球藻进行强光照培养诱导虾青素的合成。
测定方法如下：取5mL藻液，4000rpm离心10min后去除上清，放在冷冻干燥仪中干燥过夜。取5mg藻粉加入1mL混合液I(30％甲醇+5％KOH)，放于75℃水浴15min，然后4000rpm离心5min去除上清，加入1mL混合液II(DMSO+1％冰醋酸)，继续75℃水浴15min后，10000rpm离心收集上清，重复加入混合液II，直至藻细胞变白，重复三次。将虾青素的提取溶液稀释10倍后在紫外488nm处测吸收。然后根据虾青素标准曲线即可算出虾青素浓度。
虾青素标准曲线的制作：取不同质量的虾青素标准品用混合液II配制成0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，2.5mg/L，3mg/L，4mg/L，5mg/L不同浓度，然后检测OD488的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，虾青素浓度为横坐标，绘制标准曲线并按照标准曲线计算样品中虾青素的浓度。
(4)测生长过程中生物量的变化：取5mL(V，mL)藻液，4000rpm离心10min后去除上清，放在冷冻干燥仪中干燥过夜，然后称干藻细胞的干重(M，mg)。
生物量＝＝M/V(g/L)。
测定结果：
(1)GABA对雨生红球藻生长的影响：测定结果如图1所示，GABA处理后的生长曲线显示，5mM GABA在培养后期(7天后)能够明显的促进藻细胞的生长。
(2)GABA对雨生红球藻细胞生长过程中叶绿素含量的影响：测定结果如图2所示，前10天叶绿素的含量无明显变化，这与OD680的吸收值变化的结果相似，而10天之后，GABA处理组与对照组的叶绿素含量产生差别，对照组叶绿素含量达到稳定，而GABA处理组的叶绿素含量持续增加到15天。说明GABA可以促进绿色生长后期营养不足条件下的叶绿素的合成，从而增强藻细胞的光合作用，促进藻细胞的生长，后期营养不足是因为随着培养时间的增加，培养基中的营养会被逐渐消耗掉，培养后期营养不足的条件下，藻细胞的生长也随即进入静止期或者平台期。
(3)GABA对虾青素含量和生物量的影响：测定结果如图3所示，GABA可以提高藻细胞在强光照条件下的耐受性，使得强光照对雨生红球藻细胞的氧化损伤减小，避免了光氧化损伤造成的大量藻细胞的死亡，在维持细胞密度不变甚至增加的同时，增加了虾青素的产量。在强光诱导20天时，对照组藻细胞的虾青素产量是20.57mg/L，5mMγ-氨基丁酸处理组的产量是28.78mg/L，只提高了0.39倍。在强光照诱导50天时，5mM GABA处理组的藻细胞的虾青素产量约是对照组的3.25倍。其中20天是指从强光照诱导合成虾青素开始计算的天数，50天是指从强光照诱导合成虾青素开始计算的天数。GABA处理的藻细胞在相同光诱导条件下，藻细胞变成红色孢囊细胞的时间会更长一点，诱导时间变长与细胞的浓度大有一定的关系，平均每个细胞接受到的光刺激变小，细胞间相互的遮挡变多，在强光照诱导第50天的时候GABA处理的藻细胞已经变成全部的红色孢囊细胞，而对照组藻细胞在20天时已经全部变成红色孢囊细胞。
(4)GABA缓解了强光照对雨生红球藻细胞的氧化损伤或死亡
将对照组和实验组光照36小时后对雨生红球藻取样于显微镜下观察，并拍摄显微照片，结果如图4所示，图4中A为对照组培养的雨生红球藻，图4中B为实验组培养的雨生红球藻，可以看出，GABA处理的藻细胞的细胞浓度明显高于对照组。对照组由于氧化损伤导致的死亡藻细胞数明显高于GABA处理组。
对比例
本对比例与实施例1的区别之处在于：γ-氨基丁酸在培养基中的终浓度为1mM、10mM。
1Mm GABA处理组的雨生红球藻与对照组的雨生红球藻生长没有太大区别，而且50天强光诱导后的虾青素产量也远低于对照组，产量仅为17.35mg/L。10Mm GABA处理组的藻细胞比5mM GABA处理组的藻细胞生长也没有太大差别，但是50天强光诱导后，虾青素产量是5mM GABA处理组虾青素产量的1.65倍，由于10mM处理浓度是5mM处理浓度的两倍，但是产量并没有提高到两倍甚至以上，所以选择5mM为最适GABA处理浓度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：包括以下步骤：在雨生红球藻接种培养过程中加入γ-氨基丁酸，待雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度进行培养；所述雨生红球藻在生长平台期时的光照强度为120μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，培养温度为25℃，所述γ-氨基丁酸在培养基中的终浓度为1-10mM。
2.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述雨生红球藻培养采用的培养基为BBM培养基。
3.根据权利要求2所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述BBM培养基的配方如下：NaNO3:250mg/L,KH2PO4:175mg/L,K2HPO4:75mg/L,NaCl:25mg/L,EDTA:50mg/L,KOH:31mg/L,H3BO3:11.42mg/L,CaCl2·2H2O:25mg/L,MnCl2·4H2O:1.44mg/L,Co(NO3)2·6H2O:0.49mg/L,FeSO4·7H2O:4.98mg/L,MoO3:0.71mg/L,MgSO4·7H2O:75mg/L,ZnSO4·7H2O:8.82mg/L,CuSO4·5H2O:1.57mg/L。
4.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述雨生红球藻培养阶段的条件为白光光照强度40μmol·m-2·s-1，光：暗比为16h:8h，培养温度为25℃。
5.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述γ-氨基丁酸在培养基中的终浓度为5mM。
6.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述γ-氨基丁酸经过0.22μm无菌滤膜过滤。
7.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：在雨生红球藻接种培养的同时加入γ-氨基丁酸，培养时间为14天。
8.根据权利要求1所述的外加添加剂提高雨生红球藻虾青素产量的方法，其特征在于：所述雨生红球藻进入生长平台期时提高光照培养强度培养50天。
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