CN105420332A

CN105420332A - 一种雨生红球藻高产虾青素的方法

Info

Publication number: CN105420332A
Application number: CN201510908701.XA
Authority: CN
Inventors: 吕和鑫; 夏锋; 崔相敢; 韩培培; 王世磊; 贾士儒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明涉及一种雨生红球藻高产虾青素的方法，⑴稳定期培养；⑵扩大培养藻细胞，培养至待细胞密度不再继续升高；⑶胁迫培养，用于雨生红球藻虾青素的积累，培养温度为18-33℃，光照强度为无遮挡太阳光，太阳光强度在10000Lux以上。本发明提供的高产虾青素的方法中在高光条件下使用等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，可以更大限度的增加虾青素的产量，而且使用双层滤布过滤，既可以去除培养过程中引入的虫害，又方便培养末期雨生红球藻细胞的采收。

Description

一种雨生红球藻高产虾青素的方法

技术领域

本发明属于红球藻生产虾青素领域，涉及一种雨生红球藻高产虾青素的方法。

背景技术

虾青素，是从河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，化学名称是3,3′-二羟基-4,4′-二酮基β-胡萝卜素，晶体为褐红色。虾青素是具有抗氧化活性的类胡萝卜素，与胡萝卜素及维生素E等相比，虾青素具有更强的生物活性，是属于人体安全的物质。虾青素的抗氧化活性比β-胡萝卜素高约10倍，比维生素E高约500倍，虾青素已被认为是“超级维生素E”，而且其具有着色功能，在水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景。目前，雨生红球藻是自然界中天然虾青素含量最高的生物来源，他是一种普遍存在的绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属，这种藻在适宜它生长的条件下广泛存在于自然界中。在国外已有几家大公司利用雨生红球藻进行天然虾青素的工业化生产，但我国尚未形成生产规模。目前国际市场的价格为每千克2500美元，全球每年有1亿美元以上的市场容量。因此，开发雨生红球藻生产天然虾青素具有极大的市场前景。

虽然雨生红球藻是目前最好的虾青素工业生产来源，但它生长缓慢，培养过程中容易被其他生物污染，为了优化工业生产过程，提高虾青素的产量，需要为天然虾青素的生产提供优良培养方法，以提高工业产量。

根据检索，发现有以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：

1、专利(200910099708.6)“一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法”，该方法通过三角烧瓶、塑料桶或尼龙袋、水泥池的三步培养法，比较简易，但每步都需要控制各种理化环境参数，较为繁琐。

2、专利(02138827.X)“一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法”，该方法虽然采用一步培养法较为简便，但只采用通CO₂诱导细胞积累虾青素比较慢，而且采收方法较为麻烦。

3、专利(201210561399.1)“一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法”，该方法包括固定化转化细胞的制备、固定化转化细胞与营养生长细胞相结合、相关的环境条件控制等，诱导效果明显，运行稳定可靠。但该方法需要制备固定化细胞，比较麻烦，不适于大规模培养。

4、专利(200610154678.0)“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”，该方法中整个培养装置由设置在固定架上的光生物反应器系统、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置浮沉控制装置，可以不需建立人工培养池和其他设施，而利用自然水体进行大规模雨生红球藻培养。但该方法需要在密闭光式生物反应器中进行，且需要在自然水体进行培养，实行起来较为困难，生产虾青素的成本高，产量小。

5、文章“雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨”，该文章发现缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利，但其只限于实验室研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种与常规虾青素生产藻株相比其虾青素生成能力更高且生长速度更快，并由此能够有效提高虾青素产率的雨生红球藻高产虾青素的方法。

本发明实现目的的技术方案是：

一种雨生红球藻高产虾青素的方法，步骤如下：

⑴先在带有遮阳网的管道或者塑料袋中进行高密度培养，温度为18-33℃，光照强度为1000-2500Lux，培养5-8天，待藻细胞进入稳定期；

⑵接入跑道池中培养，跑道池中为BBM完全培养基，用于进一步扩大培养藻细胞，培养至待细胞密度不再继续升高；

⑶将跑道池中藻细胞收集接入等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，用于雨生红球藻虾青素的积累，培养温度为18-33℃，光照强度为无遮挡太阳光，太阳光强度在10000Lux以上；

⑷在3到5天胁迫培养后，细胞颜色不再加深，细胞体积不再继续增大，鞭毛脱落丧失游动能力，即可收集细胞，然后破碎，提取虾青素。

而且，所述细胞收集方法是：将跑道池中的藻细胞抽入到铺有双层滤布的培养池中。第一层300目滤布用来除虫，第二层1000目滤布用来收集细胞，滤液通过培养池底部流出培养池，藻细胞留在滤布上，随后添加一定体积等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养。

而且，所述的诱变方法的步骤是：

⑴取适量培养至对数期的雨生红球藻藻液，离心收集用磷酸缓冲液洗涤两次，然后在藻悬液内加入甲基磺酸乙酯，避光并使该藻细胞与其接触4h；

⑵加入1ml5％的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养；

⑶将诱变处理后的藻株接种于固体培养基上，筛选培养基上生长快速且藻落较大的藻株，即得到生长速率快且高产虾青素的诱变藻株。

而且，所述的诱变藻株在BBM、BG-11等自养培养基中良好生长。

而且，经过胁迫培养后，其虾青素的含量可达干重的5％以上，生长速率比原藻株提高达30％以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明提供的高产虾青素的方法中在高光条件下使用等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，可以更大限度的增加虾青素的产量，而且使用双层滤布过滤，既可以去除培养过程中引入的虫害，又方便培养末期雨生红球藻细胞的采收。

2、本方法相比来说更为简易，而且本方法在高光照的条件下，进一步使用等盐度的氮磷硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，可以进一步增加细胞虾青素的含量与产量。

3、本发明诱导的藻株是以雨生红球藻的原藻株为材料，采用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变，筛选而得。其特征是该藻株经过发酵法培养后，虾青素的含量可达干重的5％以上，生长速率比原藻株提高达30％以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能，是生产天然虾青素的优良藻株，可以作为工业生产来源，进行天然虾青素的工业化生产

附图说明

图1雨生红球藻绿色游动时期扫描电镜照片(左上角图片为原藻株绿色时期时细胞)(HB712)；

图2雨生红球藻红色不动时期扫描电镜照片(左上角图片为原藻株红色时期时细胞)(HB712)。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本申请采用的藻株为雨生红球藻HB712，其公开于“雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨，陈兴才等，中国食品学报，第6卷第4期，2006年8月”

一种雨生红球藻高产虾青素的方法，步骤如下：

1、培养基的处理

种子培养基配置好以后，121℃灭菌20min，冷却至室温后进行接种；生产用培养基采用漂白粉过夜处理，有效氯的浓度为100-300mg/L，处理后用等当量的硫代硫酸钠中和培养基中的次氯酸，利用残氯试纸检测培养基中残氯是否符合标准，检验合格后方可接种。

2、雨生红球藻的培养方式

⑴先在带有遮阳网的管道或者塑料袋中进行高密度培养，温度为18-33℃，光照强度为1000-2500Lux，培养5天待藻细胞进入稳定期；

⑵接入跑道池中培养，跑道池中为BBM完全培养基，用于进一步扩大培养藻细胞，待细胞密度不再继续升高后，将藻细胞(雨生红球藻HB712)抽入到铺有双层滤布的培养池中；

⑶第一层滤布(300目)用来除虫，第二层滤布(1000目)用来收集细胞，滤液通过培养池底部流出培养池，藻细胞留在滤布上，随后添加4吨等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基(培养基成分：196.89mg/L氯化钠、120.37mg/L氯化钾、61.86mg/L六水氯化镁、25mg/L二水氯化钙、50mg/LEDTA、31mg/L氢氧化钾、4.98mg/L七水亚硫酸铁、11.42mg/L硼酸、8.82mg/L七水硫酸锌、1.44mg/L四水氯化锰、0.71mg/L三氧化钼、1.57mg/L无水硫酸铜、0.49mg/L六水硝酸钴，pH8.0左右)进行胁迫培养，用于雨生红球藻虾青素的积累。

⑷培养温度为18-33℃，光照强度为无遮挡太阳光(10000Lux以上)。在3到5天胁迫培养后，细胞颜色不再加深，细胞体积不再继续增大，鞭毛脱落丧失游动能力，因此全都沉在滤布上，同时培养液挥发逐渐减少，直接收集滤布即可将藻细胞全部收集。

3、目标产物虾青素的诱导及提取测定：

⑴取2ml变红的藻液，加丙酮反复研磨至无色，将丙酮挥发干，用乙腈甲醇(3:1，v/v)溶液将色素重新溶解并收集，4000rpm离心5min，收集上清，用比色管定容至5ml。加入1ml0.1M的NaOH甲醇溶液，4℃皂化反应12h，目的是将样品中的虾青素酯分解成游离的虾青素以便测定。

⑵利用高效液相色谱法(HPLC)测定上述皂化反应液。色谱条件如下，色谱柱是BDSHYPERSILC18(250×4.6mm,5.0μm,Thermo)；流动相是乙腈：甲醇＝3:1(v/v)；洗脱时间为10min；流速为1ml/min；检测波长为476nm；进样量为20μl；柱温为25℃。根据各组分的色谱行为的光谱特性进行定性分析，根据不同浓度的虾青素标准品所绘制的标准曲线方程计算样品中虾青素的含量。

⑶虾青素标准曲线的绘制：将虾青素标品用乙腈甲醇溶液(3:1，v/v)溶解，配置成100mg/l的标准储备液，然后使用乙腈甲醇溶液稀释，分别稀释成5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l。按照上述的液相条件进行测定，以虾青素浓度为横坐标x，HPLC峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线。经计算，在5-100mg/l时，其线性方程为y＝3.382-1.178，R²＝0.9996，说明虾青素在这个范围内线性良好，可用于虾青素含量的计算。

⑷上述测定结果显示：虾青素含量如下：

	生长速率(每天)	生长速率提高值(％)	虾青素含量(mg/g)	虾青素提高值(％)
					原始	0.063d^-1	____	26.83±3.22	____
E16	0.083d^-1	提高31.75％	58.51±0.96	提高118.49％

本发明还提供一种以原藻株为出发藻株通过诱变处理筛选出的诱变藻株的方法，步骤如下：

1、诱变藻株的获得

采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变，在无菌的BBM固体培养基(250mg/L硝酸钠、175mg/L磷酸二氢钾、75mg/L磷酸氢二钾、75mg/L七水硫酸镁、25mg/L二水氯化钙、25mg/L氯化钠、50mg/LEDTA、31mg/L氢氧化钾、4.98mg/L七水亚硫酸铁、11.42mg/L硼酸、8.82mg/L七水硫酸锌、1.44mg/L四水氯化锰、0.71mg/L三氧化钼、1.57mg/L无水硫酸铜、0.49mg/L六水硝酸钴、1.5％的琼脂，pH8.0左右)上平板涂布，筛选生长速度快，藻落大的单藻落。经过生长速率的测定，虾青素产量的验证。结果筛选出生长速率快且虾青素产量高的藻株TUSTE16。

2、以下描述诱变藻株TUSTE16的形态

⑴形态特征

所述的雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)TUSTE16具有典型的绿藻门团藻目的特征性结构。在无菌的BBM液体培养基中，适宜条件下培养时，其营养细胞大小约10-25μm，近圆形，绿色，有鞭毛，扫描电镜观察细胞壁有明显的缺损(参见图1)。接种后1天进入对数生长期。在营养生长后期，将细胞接入等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养细胞逐渐停止生长，运动细胞由绿色经黄色变成深红色最后变成红褐色，此时细胞明显变大，约为25-35μm，扫描电镜观察细胞壁仍有明显的缺损(参见图2)。细胞内色素颗粒由细胞核周围向四周扩散直至占据细胞的绝大部分区域，鞭毛消失，整个细胞要比原藻株红。

⑵培养特征：

最适培养温度为24℃，最适光照强度为1200Lux，光照时间为全天，在BBM、BG-11等自养培养基中生长。

⑶生理生化性质

①培养温度：在18-33℃，最适温度为24℃；

②光照强度：在1000-2500Lux，最适光强为1200Lux；

③光照时间：全天

3、诱变菌株TUSTE16的生长速率的测定：

⑴培养基为BBM培养基，藻种的接种量由细胞的OD值为标准，实验中采取OD₆₆₉在0.240左右。

⑵每5天取一次样，用紫外分光光度计测其OD₆₆₉，以公式μ＝(lnNt-lnN₀)/(t-t₀)计算生长速率(μ为生长速率)，Nt为t时间的OD₆₆₉，N₀为起始时OD₆₆₉。

⑶测得诱变藻株TUSTE16的比生长速率比原藻株有提高，并且显微镜观察其生长初期细胞形态与原藻株相似，很快进入指数生长期。诱导虾青素积累后，细胞相比原藻株更快的变红。

Claims

1.一种雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于：所述细胞收集方法是：将跑道池中的藻细胞抽入到铺有双层滤布的培养池中。第一层300目滤布用来除虫，第二层1000目滤布用来收集细胞，滤液通过培养池底部流出培养池，藻细胞留在滤布上，随后添加一定体积等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养。

3.生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特征在于：所述的诱变方法的步骤是：

4.根据权利要求3所述的生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特征在于：所述的诱变藻株在BBM、BG-11等自养培养基中良好生长。

5.根据权利要求3所述的生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特征在于：经过胁迫培养后，其虾青素的含量可达干重的5％以上，生长速率比原藻株提高达30％以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能。