JP6158427B2 - アスタキサンチンの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アスタキサンチンの効率的な生産方法に関する。さらに詳しくは、アスタキサンチンを生産する微細藻を培養する際の光照射に関する。
アスタキサンチンは、赤橙色のカロテノイドの一種で、エビやカニなどの甲殻類や、鮭、イクラ、鯛、藻類など、主に海の生物に多く含まれる色素である。このアスタキサンチンは、強力な抗酸化作用を持つことが知られ、食品用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用される。
アスタキサンチンは、化学合成、又は、細菌、酵母、微細藻などの培養により生産されている。微細藻の中でもヘマトコッカス属の微細藻（以降、ヘマトコッカス藻）を培養して得られるアスタキサンチンは、細菌、酵母の乾燥重量あたりのアスタキサンチン含有量が2重量%以下であるのに対して、2重量%以上の高含量で培養することができ、またその安全性から世界中で生産されている。ヘマトコッカス藻などの光合成をする微細藻を利用したアスタキサンチンの生産にはその生育に適した光照射が必要である。
アスタキサンチンは、例えばヘマトコッカス藻、クロレラ、セネデスムスなどの微細藻によって生産される。特にヘマトコッカス藻は、外部環境の変化ストレスによってシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。アスタキサンチンの蓄積のためには、太陽光または人工光の照射が必要となる。人工光の光源としては蛍光灯、LED（light emitting diode）等が利用されている。
アスタキサンチンは、化学合成、又は、細菌、酵母、微細藻などの培養により生産されている。微細藻の中でもヘマトコッカス属の微細藻（以降、ヘマトコッカス藻）を培養して得られるアスタキサンチンは、細菌、酵母の乾燥重量あたりのアスタキサンチン含有量が2重量%以下であるのに対して、2重量%以上の高含量で培養することができ、またその安全性から世界中で生産されている。ヘマトコッカス藻などの光合成をする微細藻を利用したアスタキサンチンの生産にはその生育に適した光照射が必要である。
アスタキサンチンは、例えばヘマトコッカス藻、クロレラ、セネデスムスなどの微細藻によって生産される。特にヘマトコッカス藻は、外部環境の変化ストレスによってシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。アスタキサンチンの蓄積のためには、太陽光または人工光の照射が必要となる。人工光の光源としては蛍光灯、LED（light emitting diode）等が利用されている。
太陽光のみで培養した場合は、気温変動、日照時間変動に影響されるため、安定かつ効率的な生産が困難である。そのため、人工光の一つである蛍光灯を用いた培養が、古くから試みられている。
特許文献１には、人工光からなる40000ルクスの照度で光を照射しヘマトコッカス藻を培養した実施例において、乾燥藻体重量あたりのアスタキサンチン含有量として2重量％を得たと記載されている。
特許文献２には、光合成有効光量子束投入量25000μmol-photon/m3/s以上という非常に強い光強度の条件でヘマトコッカス藻を培養することで、21日間で乾燥藻体重量あたりのアスタキサンチン含有量6.8重量%、培養液あたりのアスタキサンチン生産量250mg/Lという高効率でアスタキサンチンが生産することができたと実施例に記載されているが、300mg/L以上のアスタキサンチン生産量を達成することはできていない。蛍光灯を用いてこのような非常に強い光合成有効光量子束投入量を得るためには、多くの電力量が必要であり、さらに蛍光灯により発生する熱を制御するための空調装置にかかる電力量も大きくなる。
特許文献１には、人工光からなる40000ルクスの照度で光を照射しヘマトコッカス藻を培養した実施例において、乾燥藻体重量あたりのアスタキサンチン含有量として2重量％を得たと記載されている。
特許文献２には、光合成有効光量子束投入量25000μmol-photon/m3/s以上という非常に強い光強度の条件でヘマトコッカス藻を培養することで、21日間で乾燥藻体重量あたりのアスタキサンチン含有量6.8重量%、培養液あたりのアスタキサンチン生産量250mg/Lという高効率でアスタキサンチンが生産することができたと実施例に記載されているが、300mg/L以上のアスタキサンチン生産量を達成することはできていない。蛍光灯を用いてこのような非常に強い光合成有効光量子束投入量を得るためには、多くの電力量が必要であり、さらに蛍光灯により発生する熱を制御するための空調装置にかかる電力量も大きくなる。
蛍光灯に代わり、低電力でかつ発熱量の少ない光源としてLEDが知られ、LEDを用いてアスタキサンチンを生産することが検討されている。
特許文献３では、各種波長のLEDを用いてヘマトコッカス藻からのアスタキサンチン生産を検討した結果、540nm以下の波長をもつ青色光LEDのみを照射することで、高いアスタキサンチン生産性を得ることに成功している。特に、470nmを中心波長とする青色光LEDを用いた場合、同光量子束密度の蛍光灯と比較して約2倍のアスタキサンチンを生産することができた。しかしながら、その時の培養液あたりのアスタキサンチン濃度は培養12日後で25mg/Lと小さいものであり、商業生産的に実用的とされる培養濃度に達していなかった。
特許文献４では、寒天プレート上のヘマトコッカス藻コロニーに青色光LEDと赤色光LEDを交互に照射することで、ヘマトコッカス藻の細胞数の増加が促進されることが記載されている。しかしながら、シスト化させた後のアスタキサンチン生産段階について言及されておらず、アスタキサンチンが生産されているかどうかも記載されていない。ヘマトコッカス藻は、生長したのちに、ストレスによりシスト化が起こり、アスタキサンチンを大量に蓄積することが知られているので、本文献ではアスタキサンチン生産がアップするかどうかは判断できない。
特許文献３では、各種波長のLEDを用いてヘマトコッカス藻からのアスタキサンチン生産を検討した結果、540nm以下の波長をもつ青色光LEDのみを照射することで、高いアスタキサンチン生産性を得ることに成功している。特に、470nmを中心波長とする青色光LEDを用いた場合、同光量子束密度の蛍光灯と比較して約2倍のアスタキサンチンを生産することができた。しかしながら、その時の培養液あたりのアスタキサンチン濃度は培養12日後で25mg/Lと小さいものであり、商業生産的に実用的とされる培養濃度に達していなかった。
特許文献４では、寒天プレート上のヘマトコッカス藻コロニーに青色光LEDと赤色光LEDを交互に照射することで、ヘマトコッカス藻の細胞数の増加が促進されることが記載されている。しかしながら、シスト化させた後のアスタキサンチン生産段階について言及されておらず、アスタキサンチンが生産されているかどうかも記載されていない。ヘマトコッカス藻は、生長したのちに、ストレスによりシスト化が起こり、アスタキサンチンを大量に蓄積することが知られているので、本文献ではアスタキサンチン生産がアップするかどうかは判断できない。
低電力でかつ発熱量の少ないLEDを用いて、540nm以下の波長をもつ青色光LEDのみで微細藻を培養した時よりもアスタキサンチン含有量が高く、かつアスタキサンチン濃度が100mg/L以上生産する培養方法が求められていた。
本発明は、省電力であり光を透過する部分の温度上昇を抑えることができるLEDを用いて、蛍光灯よりも効率の良いアスタキサンチンの生産することを目的とする。
上記目的を解決するために鋭意検討した結果、微細藻をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDの両方を同時に照射しながら培養することで効率よくアスタキサンチンを生産することを見出した。
本発明は以下の（１）〜（６）のアスタキサンチンの生産方法を要旨とする。
（１）微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、培養期間中の少なくともアスタキサンチン生産培養期間の光照射をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用して行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法。
（２）ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED の比が光量子束密度で1:19〜19:1である（１）のアスタキサンチン生産方法。
（３）ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ20μmol/m2/s以上であることを特徴とする（１）又は（２）のアスタキサンチン生産方法。
（４）微細藻がヘマトコッカス属であること特徴とする（１）ないし（３）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（５）培養液あたりのアスタキサンチン生産量が100mg/L以上である（１）ないし（４）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（６）培養液あたりのアスタキサンチン生産量が300mg/L以上である（５）のアスタキサンチン生産方法。
（７）アスタキサンチン含有量が300mg/L以上である微細藻の培養液。
（８）アスタキサンチン含有量が7.0重量％以上（乾燥藻体中）である微細藻の培養藻体。
上記目的を解決するために鋭意検討した結果、微細藻をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDの両方を同時に照射しながら培養することで効率よくアスタキサンチンを生産することを見出した。
本発明は以下の（１）〜（６）のアスタキサンチンの生産方法を要旨とする。
（１）微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、培養期間中の少なくともアスタキサンチン生産培養期間の光照射をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用して行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法。
（２）ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED の比が光量子束密度で1:19〜19:1である（１）のアスタキサンチン生産方法。
（３）ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ20μmol/m2/s以上であることを特徴とする（１）又は（２）のアスタキサンチン生産方法。
（４）微細藻がヘマトコッカス属であること特徴とする（１）ないし（３）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（５）培養液あたりのアスタキサンチン生産量が100mg/L以上である（１）ないし（４）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（６）培養液あたりのアスタキサンチン生産量が300mg/L以上である（５）のアスタキサンチン生産方法。
（７）アスタキサンチン含有量が300mg/L以上である微細藻の培養液。
（８）アスタキサンチン含有量が7.0重量％以上（乾燥藻体中）である微細藻の培養藻体。
本発明により、従来のアスタキサンチンの製造方法や装置を大きく変えることなく、アスタキサンチンを効率よく生産することができる。
本発明は微細藻を利用したアスタキサンチン生産方法に関し、ピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDを微細藻に照射する工程を含むことを特徴とする。
本発明では、アスタキサンチンを生産することができる微細藻を用いることができる。ここでいう微細藻は光合成をするものに限定される。微細藻としては、シアノバクテリア、紅藻、褐藻、緑藻、ケイ藻, 真正眼点藻などが知られているが、本発明の微細藻はアスタキサンチンを生産することができる微細藻に限定される。アスタキサンチンを生産する微細藻としては、ヘマトコッカス属に属する微細藻(ヘマトコッカス藻)が一般的に用いられる。
ヘマトコッカス藻では、ヘマトコッカス・ラクストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などを用いることができる。中でも、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
ヘマトコッカス属以外でもアスタキサンチンを生産する微細藻を用いることができる。例えば、クロレラ属であるクロレラ・ゾフィンギエンシス(Chlorella zofingiensis)、モノラフィデイウム属(Monoraphidium sp.)の微細藻、その他にVischeria helvetica、Coelastrella、Scenedesmus、Chlamydomonas nivalis、Protosiphon botryoides、Neochloris wimmeriなどを挙げることができる。
本発明では、アスタキサンチンを生産することができる微細藻を用いることができる。ここでいう微細藻は光合成をするものに限定される。微細藻としては、シアノバクテリア、紅藻、褐藻、緑藻、ケイ藻, 真正眼点藻などが知られているが、本発明の微細藻はアスタキサンチンを生産することができる微細藻に限定される。アスタキサンチンを生産する微細藻としては、ヘマトコッカス属に属する微細藻(ヘマトコッカス藻)が一般的に用いられる。
ヘマトコッカス藻では、ヘマトコッカス・ラクストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などを用いることができる。中でも、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
ヘマトコッカス属以外でもアスタキサンチンを生産する微細藻を用いることができる。例えば、クロレラ属であるクロレラ・ゾフィンギエンシス(Chlorella zofingiensis)、モノラフィデイウム属(Monoraphidium sp.)の微細藻、その他にVischeria helvetica、Coelastrella、Scenedesmus、Chlamydomonas nivalis、Protosiphon botryoides、Neochloris wimmeriなどを挙げることができる。
微細藻の培養に用いる培地としては特に制限がないが、培地の雑菌汚染を防止するために炭素源を含まない独立栄養培地を用いるのが好ましい。一般に、増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩、ビタミン類などを含む独立栄養培地が用いられる。例えば、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（藻類研究法 千原光雄・西澤一俊編、共立出版（1979）を参照）、ＢＧ−１１培地、およびこれらの改変培地などが用いられる。
また、培地中で微細藻を培養する際は、二酸化炭素を含む空気を通気することが好ましい。二酸化酸素を含まない空気を通気することでも培養できるが、微細藻の生育が遅くなるため、0.1〜5%の二酸化炭素、好ましくは0.5〜3%の二酸化炭素含む空気を通気し培養する。通気なしでも培養は可能であるが、良好な生育のためには通気量0.01〜3.0vvm、好ましくは0.015〜1vvm、またpHは5〜10、好ましくは6〜9である。
培養温度としては、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスを利用する場合を例に採れば、例えば10〜45℃ の範囲であり、好ましくは18〜38℃ の範囲である。また、培地のｐＨは、5.0〜9.5の範囲、好ましくは6.0〜9.0の範囲に調整される。
また、培地中で微細藻を培養する際は、二酸化炭素を含む空気を通気することが好ましい。二酸化酸素を含まない空気を通気することでも培養できるが、微細藻の生育が遅くなるため、0.1〜5%の二酸化炭素、好ましくは0.5〜3%の二酸化炭素含む空気を通気し培養する。通気なしでも培養は可能であるが、良好な生育のためには通気量0.01〜3.0vvm、好ましくは0.015〜1vvm、またpHは5〜10、好ましくは6〜9である。
培養温度としては、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスを利用する場合を例に採れば、例えば10〜45℃ の範囲であり、好ましくは18〜38℃ の範囲である。また、培地のｐＨは、5.0〜9.5の範囲、好ましくは6.0〜9.0の範囲に調整される。
アスタキサンチン生産のための光照射は、微細藻をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用する。微細藻の培養期間中、全期間、あるいは、一定期間、青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射することが必要である。特に、アスタキサンチン生産培養の時期（シスト細胞の時期）に青色光LEDと赤色光LEDを併用して照射することが重要である。青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射する場合は、同時に照射することで最も効率よくアスタキサンチンを生産することができるが、24時間以内に青色光LEDと赤色光LEDを交互に照射する方法でも効率よくアスタキサンチンを生産できる。あるいは青色光LEDと赤色光LEDを交互に点滅させるような照射方法でもよい。
光照射工程における光源としては、LED、電球、蛍光灯などを用いることができるが、LED以外の光源は、使用する光源の光の波長スペクトルが広域にわたるため、不要な光をカットすること必要があるため、効率が悪くなる。LEDを用いれば一部の光をカットするといった特別の手段を要することなく波長域を絞った光の照射が可能となるため、少ない照射エネルギーで効率よくアスタキサンチンを生産することが可能になる。LEDとして、有機EL照明を用いてもよい。
光照射工程における光源としては、LED、電球、蛍光灯などを用いることができるが、LED以外の光源は、使用する光源の光の波長スペクトルが広域にわたるため、不要な光をカットすること必要があるため、効率が悪くなる。LEDを用いれば一部の光をカットするといった特別の手段を要することなく波長域を絞った光の照射が可能となるため、少ない照射エネルギーで効率よくアスタキサンチンを生産することが可能になる。LEDとして、有機EL照明を用いてもよい。
LEDチップは効率的な照射が行えるように複数個備えられることが好ましい。光源を複数個使用する場合にはできるだけ均一な光の照射を可能にすべく、各光源が互いに均等な間隔をおいて配置されることが好ましい。また、青色光LEDと赤色光LEDの複数個のチップを独立したパネルにして照射をしても良いし、青色光LEDと赤色光LEDの複数個のチップを一定割合で同一パネルに埋め込んだパネルを用いて照射してもよい。
照射する青色光LEDの波長は、ピーク波長が420〜500nm範囲であり、好ましくは430〜490nm、赤色光LEDの波長は 620〜690nm範囲であり、好ましくは630〜680nmである。
青色光LED、赤色光LEDともピーク波長が異なる2種類以上の光を用いることもできる。例えばピーク波長が430nmと470nmの青色光LEDと630nmと660nmの赤色光LEDを用いて照射することもできる。
青色光LED、赤色光LED波長幅の狭い光を用いることが好ましい。アスタキサンチン生産に適した波長領域の光のみを選択して照射することで、より効率的なアスタキサンチン生産ができるからである。
照射する青色光LEDの波長は、ピーク波長が420〜500nm範囲であり、好ましくは430〜490nm、赤色光LEDの波長は 620〜690nm範囲であり、好ましくは630〜680nmである。
青色光LED、赤色光LEDともピーク波長が異なる2種類以上の光を用いることもできる。例えばピーク波長が430nmと470nmの青色光LEDと630nmと660nmの赤色光LEDを用いて照射することもできる。
青色光LED、赤色光LED波長幅の狭い光を用いることが好ましい。アスタキサンチン生産に適した波長領域の光のみを選択して照射することで、より効率的なアスタキサンチン生産ができるからである。
微細藻を培養中に同時照射するピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED のそれぞれの比は、同時照射するのであれば限定されないが、その比は光量子束密度で1:19〜19:1であり、好ましくは1:5〜5:1である。1:2.5〜5:1、さらに、1:2〜4:1が特に好ましい。
光の照射方法も特に限定されず、例えば連続的に照射したり、インターバルを設けて間欠的に照射したりすることができる。ここでの「間欠的に照射」にはパルス光による照射を含む。光の照射を間欠的に行なえば、消費電力を削減できる。
ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスなどのヘマトコッカス藻は、運動性があり細胞増殖がさかんな緑色の浮遊細胞の状態と、温度、強光、塩、水分量、栄養状態などの極端な環境変化のストレスによりシスト化するシスト細胞の状態がある。シスト化すると藻体内にアスタキサンチンを蓄積し、赤色になる。
ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDを用いた光照射は、浮遊細胞の状態でもシスト細胞の状態でも使用することができる。浮遊細胞はアスタキサンをわずかに生産するが、その生産速度は遅いため、どちらかというと良好な細胞分裂及び増殖を得るために有効である。シスト細胞の期間はアスタキサンチン生産速度が早く高濃度に蓄積するため、アスタキサンチンを効率よく生産することができる。
光の照射方法も特に限定されず、例えば連続的に照射したり、インターバルを設けて間欠的に照射したりすることができる。ここでの「間欠的に照射」にはパルス光による照射を含む。光の照射を間欠的に行なえば、消費電力を削減できる。
ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスなどのヘマトコッカス藻は、運動性があり細胞増殖がさかんな緑色の浮遊細胞の状態と、温度、強光、塩、水分量、栄養状態などの極端な環境変化のストレスによりシスト化するシスト細胞の状態がある。シスト化すると藻体内にアスタキサンチンを蓄積し、赤色になる。
ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDを用いた光照射は、浮遊細胞の状態でもシスト細胞の状態でも使用することができる。浮遊細胞はアスタキサンをわずかに生産するが、その生産速度は遅いため、どちらかというと良好な細胞分裂及び増殖を得るために有効である。シスト細胞の期間はアスタキサンチン生産速度が早く高濃度に蓄積するため、アスタキサンチンを効率よく生産することができる。
ヘマトコッカス藻の培養初期は運動性がある浮遊細胞が多く細胞密度も低いため光量子束密度が20μmol/m2/s以下でも良く増殖させることができる。浮遊細胞の状態で培養する際は、LED以外の光源を用いた場合でも良く増殖する。また、ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDの一方の波長のLEDのみでも培養することが可能である。
温度、強光、塩などでストレスをかけてヘマトコッカス藻をシスト化させた場合の培養時の光量子束密度は特に限定されないが、例えば、光透過幅(直径、厚さ)が70mm以下の培養装置であれば、ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDそれぞれが20μmol/m2/s以上、好ましくはそれぞれが50μmol/m2/s以上、さらに好ましくは100μmol/m2/s以上、150μmol/m2/s以上照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。それ以上の光透過幅の培養装置であれば、更に大きくしてもよい。すなわち、シスト細胞の状態のヘマトコッカス藻を培養する場合、青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。光量子束密度の上限は特にないが、エネルギーコストと効果のバランスから3000μmol/m2/s以下が好ましく、1000μmol/m2/s以下が特に、好ましい。
上記の培養により、培養液あたり、アスタキサンチン（フリー体として）を100mg/L以上の濃度で、好ましくは、300mg/L以上で、より好ましくは、400mg/L以上の濃度で含む培養液を得ることが可能になる。また、アスタキサンチン含有量が7.0重量％以上（乾燥藻体中）である微細藻の培養藻体を得ることができる。
温度、強光、塩などでストレスをかけてヘマトコッカス藻をシスト化させた場合の培養時の光量子束密度は特に限定されないが、例えば、光透過幅(直径、厚さ)が70mm以下の培養装置であれば、ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LEDそれぞれが20μmol/m2/s以上、好ましくはそれぞれが50μmol/m2/s以上、さらに好ましくは100μmol/m2/s以上、150μmol/m2/s以上照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。それ以上の光透過幅の培養装置であれば、更に大きくしてもよい。すなわち、シスト細胞の状態のヘマトコッカス藻を培養する場合、青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。光量子束密度の上限は特にないが、エネルギーコストと効果のバランスから3000μmol/m2/s以下が好ましく、1000μmol/m2/s以下が特に、好ましい。
上記の培養により、培養液あたり、アスタキサンチン（フリー体として）を100mg/L以上の濃度で、好ましくは、300mg/L以上で、より好ましくは、400mg/L以上の濃度で含む培養液を得ることが可能になる。また、アスタキサンチン含有量が7.0重量％以上（乾燥藻体中）である微細藻の培養藻体を得ることができる。
培養液からアスタキサンチンを回収する方法は特に限定されない。例えばアスタキサンチンを含む微細藻培養液をろ過、遠心処理などの固液分離手段により分離して微細藻細胞を集めたのち、乾燥（自然乾燥、ドラム乾燥、熱風式乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥など）することで微細藻の乾燥物を得ることができる。得られた微細藻の乾燥物は、アスタキサンチン（フリー体として）を1〜10質量％の濃度で含む。好ましくは、4〜10質量％の濃度で含む。
アスタキサンチンを含む湿藻体または上記乾燥物を破砕処理、抽出、回収することでアスタキサンチンを含む成分を得ることができる。アスタキサンチンの抽出・回収方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法が用いられる。例えば、微細藻の乾燥物を機械的に破壊した後に、アスタキサンチンが抽出される。抽出方法としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒や食用油脂を用いて抽出する化学的抽出方法、あるいは緑藻の乾燥物の圧搾などによる物理的抽出方法が挙げられる。あるいは、超臨界抽出法を用いて抽出・回収してもよい。抽出溶媒を留去して、アスタキサンチン含有油が得られる。
アスタキサンチンを含む湿藻体または上記乾燥物を破砕処理、抽出、回収することでアスタキサンチンを含む成分を得ることができる。アスタキサンチンの抽出・回収方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法が用いられる。例えば、微細藻の乾燥物を機械的に破壊した後に、アスタキサンチンが抽出される。抽出方法としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒や食用油脂を用いて抽出する化学的抽出方法、あるいは緑藻の乾燥物の圧搾などによる物理的抽出方法が挙げられる。あるいは、超臨界抽出法を用いて抽出・回収してもよい。抽出溶媒を留去して、アスタキサンチン含有油が得られる。
培養液へのLED光照射方式としては、リアクターに含まれる培養液の外側から照射する外照式照射とリアクターに含まれる培養液中にLEDを投入する内照式照射があるが、その方式に特に制限されず、どちらを使用することも可能である。なお、外照式照射の場合の光量子束密度は、容器の外表面で測定し、内照式照射の場合は培養液と接した容器表面で測定した値を用いる。外照式照射と内照式照射を併用しても構わない。
アスタキサンチン生産用微細藻培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用し培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、厚さ10〜50mm程度の扁平培養瓶、直径20〜70mm程度のガラスチューブが好ましく用いられる。大スケールの場合は、ビニール袋、ガラス製、プラスチック製などのチューブまたは透明板で構成され、必要に応じて照明器および撹拌機を備えた培養槽が用いられる。大スケールで培養する場合、好ましくは光透過幅(直径、厚さ)が400mm以下、さらに好ましくは70mm以下にすることが好ましい。このような培養槽としては、例えば、平板培養槽(フラットパネル培養藻)、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽、タンク型内照式培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も、密閉容器が好ましく用いられる。例えば、特開2012-29578に開示されているようなLEDの周囲にチューブを巻きつけるタイプや特開2014-39491に開示されているようなハイブリットタイプのリアクターを用いることができる。
アスタキサンチンの培養は屋外に設けられ太陽光を利用するタイプと室内に設けられ人工光を用いるタイプと両方を併用するタイプがある。太陽光を利用する方法はエネルギーコストがかからず安価に製造できるが、設備が粗放である場合、混雑物、混入物などにより品質が低下することがある。いずれのタイプであっても、本発明を利用することができる。自然光を利用する場合であっても、培養期間中の少なくともアスタキサンチン生産培養期間に、420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDによる照射を併用することにより、本発明の効果を得ることができる。
人工光のみで培養する場合は、少なくともアスタキサンチン生産培養期間は420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用する。増殖培養の期間は蛍光灯等他の光源を用いてもよいが、アスタキサンチン生産培養期間と同様に青色光と赤色光を併用してもよい。
青色光と赤色光の光量子束密度の比は1:19〜19:1であり、好ましくは1:5〜5:1である。さらに好ましくは、1:2.5〜5:1であり、1:2〜4:1が特に好ましい。
アスタキサンチン生産用微細藻培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用し培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、厚さ10〜50mm程度の扁平培養瓶、直径20〜70mm程度のガラスチューブが好ましく用いられる。大スケールの場合は、ビニール袋、ガラス製、プラスチック製などのチューブまたは透明板で構成され、必要に応じて照明器および撹拌機を備えた培養槽が用いられる。大スケールで培養する場合、好ましくは光透過幅(直径、厚さ)が400mm以下、さらに好ましくは70mm以下にすることが好ましい。このような培養槽としては、例えば、平板培養槽(フラットパネル培養藻)、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽、タンク型内照式培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も、密閉容器が好ましく用いられる。例えば、特開2012-29578に開示されているようなLEDの周囲にチューブを巻きつけるタイプや特開2014-39491に開示されているようなハイブリットタイプのリアクターを用いることができる。
アスタキサンチンの培養は屋外に設けられ太陽光を利用するタイプと室内に設けられ人工光を用いるタイプと両方を併用するタイプがある。太陽光を利用する方法はエネルギーコストがかからず安価に製造できるが、設備が粗放である場合、混雑物、混入物などにより品質が低下することがある。いずれのタイプであっても、本発明を利用することができる。自然光を利用する場合であっても、培養期間中の少なくともアスタキサンチン生産培養期間に、420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDによる照射を併用することにより、本発明の効果を得ることができる。
人工光のみで培養する場合は、少なくともアスタキサンチン生産培養期間は420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDを併用する。増殖培養の期間は蛍光灯等他の光源を用いてもよいが、アスタキサンチン生産培養期間と同様に青色光と赤色光を併用してもよい。
青色光と赤色光の光量子束密度の比は1:19〜19:1であり、好ましくは1:5〜5:1である。さらに好ましくは、1:2.5〜5:1であり、1:2〜4:1が特に好ましい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明において、アスタキサンチン量は以下の方法で測定した。
Luna 3μm Silicaカラムを用いたHPLCによるアスタキサンチンの定量
試料を一定量採取し、アセトンを加え破砕する。遠心分離により上清を回収する。上清に0.05M Tris-HCl バッファーとコレステロールエステラーゼ溶液を加え、37℃で45分間反応させ、アスタキサンチンをフリー体にする。アスタキサンチンを石油エーテルにて抽出し、溶媒留去、乾燥する。それをヘキサン：アセトン＝82:18に溶解しHPLC用試料溶液とする。下記のHPLC分析条件にて、測定する。アスタキサンチンは幾何異性体を有するので、それらのピークの面積から、アスタキサンチンの含有量を解析する。
HPLC分析条件
使用カラム：Luna 3μm Silica(2) 100A 150*4.6mm（Phenomenex社）
使用移動相溶媒：Hexane:Acetone=82:18(v/v)
装置起動用メソッド：A-JUNSOU
A-JUNSOUメソッドの設定内容
試料注入量：20μL
移動相流量：1.2mL/min
カラム温度：30℃
DAD：455nm, 467nm, 475nm
測定時間：13min
本発明において、アスタキサンチン量は以下の方法で測定した。
Luna 3μm Silicaカラムを用いたHPLCによるアスタキサンチンの定量
試料を一定量採取し、アセトンを加え破砕する。遠心分離により上清を回収する。上清に0.05M Tris-HCl バッファーとコレステロールエステラーゼ溶液を加え、37℃で45分間反応させ、アスタキサンチンをフリー体にする。アスタキサンチンを石油エーテルにて抽出し、溶媒留去、乾燥する。それをヘキサン：アセトン＝82:18に溶解しHPLC用試料溶液とする。下記のHPLC分析条件にて、測定する。アスタキサンチンは幾何異性体を有するので、それらのピークの面積から、アスタキサンチンの含有量を解析する。
HPLC分析条件
使用カラム：Luna 3μm Silica(2) 100A 150*4.6mm（Phenomenex社）
使用移動相溶媒：Hexane:Acetone=82:18(v/v)
装置起動用メソッド：A-JUNSOU
A-JUNSOUメソッドの設定内容
試料注入量：20μL
移動相流量：1.2mL/min
カラム温度：30℃
DAD：455nm, 467nm, 475nm
測定時間：13min
ヘマトコッカスの培養（増殖培養）
細胞数50万個/mlの浮遊細胞を含むヘマトコッカス・ラクストリス NIES144株（国立環境研究所微生物系統保存施設保存）培養液15mlとBG11改変A培地（表1）750mlを内径50mm、高さ500mmのガラス製透明培養容器４本にそれぞれ注入した。光量子束密度50μmol/m2/sになるように蛍光灯による連続光照射下、25℃ において1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養した。その結果、培養5日目でそれぞれ45万個/mlと浮遊細胞の増殖が認められた。
細胞数50万個/mlの浮遊細胞を含むヘマトコッカス・ラクストリス NIES144株（国立環境研究所微生物系統保存施設保存）培養液15mlとBG11改変A培地（表1）750mlを内径50mm、高さ500mmのガラス製透明培養容器４本にそれぞれ注入した。光量子束密度50μmol/m2/sになるように蛍光灯による連続光照射下、25℃ において1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養した。その結果、培養5日目でそれぞれ45万個/mlと浮遊細胞の増殖が認められた。
各種光源を用いたヘマトコッカスの培養（アスタキサンチン生産培養）
次に、それぞれ培養液中に2g/L濃度になるように塩化ナトリウムを添加後、７種類の光源を用いてそれぞれ光量子束密度300μmol/m2/sになるように光照射し、27℃で1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養しアスタキサンチン生産を行った。この時の光源は、蛍光灯、波長450nmの青色光LEDの単独照射、波長660nmの赤色光LEDの単独照射、波長450nmの青色光LEDと波長660nmの赤色光LEDの同時連続照射（青色光と赤色光の比は、1:2、1:1、2:1、4:1の4とおり）である。実験に用いた青色光LEDと赤色光LEDのスペクトルを図１に示した。14日間の培養の後、濾過法により乾燥藻体を得た。乾燥藻体の重量を測定し、培養液あたりの乾燥藻体重量を求めた。また、逆相HPLCにより乾燥藻体中のアスタキサンチン含有量と培養液あたりのアスタキサンチン生産量を求めた。
次に、それぞれ培養液中に2g/L濃度になるように塩化ナトリウムを添加後、７種類の光源を用いてそれぞれ光量子束密度300μmol/m2/sになるように光照射し、27℃で1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養しアスタキサンチン生産を行った。この時の光源は、蛍光灯、波長450nmの青色光LEDの単独照射、波長660nmの赤色光LEDの単独照射、波長450nmの青色光LEDと波長660nmの赤色光LEDの同時連続照射（青色光と赤色光の比は、1:2、1:1、2:1、4:1の4とおり）である。実験に用いた青色光LEDと赤色光LEDのスペクトルを図１に示した。14日間の培養の後、濾過法により乾燥藻体を得た。乾燥藻体の重量を測定し、培養液あたりの乾燥藻体重量を求めた。また、逆相HPLCにより乾燥藻体中のアスタキサンチン含有量と培養液あたりのアスタキサンチン生産量を求めた。
結果を表２に示す。
青色光LEDのみの光照射の場合は、蛍光灯と比較して乾燥藻体重量は2.4g/Lと低かったが、アスタキサンチン含有量が3.9重量%、培養液あたりのアスタキサンチン生産量が94mg/Lと高くなった。赤色光LEDのみの光照射の場合は、蛍光灯と比較して乾燥藻体重量は3.3g/Lと高かったが、アスタキサンチン含有量が1.3重量%と低く、培養液あたりのアスタキサンチン生産量は43mg/Lであった。
青色光LEDと赤色光LEDを同時照射した場合は、光量子束密度の青赤比1:2、1:1、2:1、4:1のいずれにおいても、蛍光灯と比較してアスタキサンチン生産量がそれぞれ131mg/L、162mg/L、155mg/L、156mg/Lと高くなった。青色光と赤色光を併用した場合、いずれにおても、蛍光灯、青色光単独、赤色光単独で用いた場合と比較して、アスタキサンチン生産量が大きく向上した。青色光：赤色光の比を１：２〜４：１にするのが好ましいことが分かった。特に、1:1の比で同時連続照射した結果は、乾燥藻体重量は蛍光灯と同じ3.3g/Lであるがアスタキサンチン含有量が4.9重量%であり、培養液あたりのアスタキサンチン濃度は162mg/Lと蛍光灯の2倍であり、青色光LEDのみの場合と比較して1.7倍であった。
以上より、培養期間中のうち、アスタキサンチン生産培養期間に青色光LEDと赤色光LEDを同時照射することにより、藻体中のアスタキサンチン含有量が高まり、その結果、培養液あたりのアスタキサンチンの生産量を高めることができることが確認された。
青色光LEDのみの光照射の場合は、蛍光灯と比較して乾燥藻体重量は2.4g/Lと低かったが、アスタキサンチン含有量が3.9重量%、培養液あたりのアスタキサンチン生産量が94mg/Lと高くなった。赤色光LEDのみの光照射の場合は、蛍光灯と比較して乾燥藻体重量は3.3g/Lと高かったが、アスタキサンチン含有量が1.3重量%と低く、培養液あたりのアスタキサンチン生産量は43mg/Lであった。
青色光LEDと赤色光LEDを同時照射した場合は、光量子束密度の青赤比1:2、1:1、2:1、4:1のいずれにおいても、蛍光灯と比較してアスタキサンチン生産量がそれぞれ131mg/L、162mg/L、155mg/L、156mg/Lと高くなった。青色光と赤色光を併用した場合、いずれにおても、蛍光灯、青色光単独、赤色光単独で用いた場合と比較して、アスタキサンチン生産量が大きく向上した。青色光：赤色光の比を１：２〜４：１にするのが好ましいことが分かった。特に、1:1の比で同時連続照射した結果は、乾燥藻体重量は蛍光灯と同じ3.3g/Lであるがアスタキサンチン含有量が4.9重量%であり、培養液あたりのアスタキサンチン濃度は162mg/Lと蛍光灯の2倍であり、青色光LEDのみの場合と比較して1.7倍であった。
以上より、培養期間中のうち、アスタキサンチン生産培養期間に青色光LEDと赤色光LEDを同時照射することにより、藻体中のアスタキサンチン含有量が高まり、その結果、培養液あたりのアスタキサンチンの生産量を高めることができることが確認された。
ヘマトコッカスの培養（増殖培養）
細胞数50万個/mlの浮遊細胞を含むヘマトコッカス・ラクストリス NIES144株培養液15mlとBG11改変B培地（表３）750mlを内径50mm、高さ500mmのガラス製透明培養容器に注入した。波長450nmの青色光LED (光量子束密度50μmol/m2/s)、波長660nmの赤色光(光量子束密度LED 30μmol/m2/s)による同時連続光照射下、25℃ において1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養した。その結果、培養4日目で36万個/mlの浮遊細胞の増殖が認められた。
細胞数50万個/mlの浮遊細胞を含むヘマトコッカス・ラクストリス NIES144株培養液15mlとBG11改変B培地（表３）750mlを内径50mm、高さ500mmのガラス製透明培養容器に注入した。波長450nmの青色光LED (光量子束密度50μmol/m2/s)、波長660nmの赤色光(光量子束密度LED 30μmol/m2/s)による同時連続光照射下、25℃ において1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養した。その結果、培養4日目で36万個/mlの浮遊細胞の増殖が認められた。
ヘマトコッカスの培養（アスタキサンチン生産培養）
次に、培養液中に2g/L濃度になるように塩化ナトリウムを添加後、波長450nmの青色光(光量子束密度LED 300μmol/m2/s)、波長660nmの赤色光LED (光量子束密度250μmol/m2/s)による同時連続光照射下、28℃で1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつアスタキサンチン生産を行った。21日間培養し、経時変化を観察した。濾過法により乾燥藻体を得、重量を測定し、培養液あたりの乾燥藻体重量を求めた。逆相HPLCによりアスタキサンチン含有量と培養液あたりのアスタキサンチン濃度を求めた。
次に、培養液中に2g/L濃度になるように塩化ナトリウムを添加後、波長450nmの青色光(光量子束密度LED 300μmol/m2/s)、波長660nmの赤色光LED (光量子束密度250μmol/m2/s)による同時連続光照射下、28℃で1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつアスタキサンチン生産を行った。21日間培養し、経時変化を観察した。濾過法により乾燥藻体を得、重量を測定し、培養液あたりの乾燥藻体重量を求めた。逆相HPLCによりアスタキサンチン含有量と培養液あたりのアスタキサンチン濃度を求めた。
塩化ナトリウムを添加後の培養日数と培養液あたりの乾燥藻体重量、アスタキサンチン含有量（重量％）、培養液あたりのアスタキサンチン生産量(mg/L)の結果を図２〜図４に示した。培養21日目で乾燥藻体重量は5.8g/L、乾燥藻体中のアスタキサンチン含有量は7.2重量%、アスタキサンチン生産量は418mg/Lであった。
本発明の方法により、低エネルギー使用量で、かつ、培養液あたりのアスタキサンチン生産量を高めることができる。
Claims (5)
- 微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、培養期間中の少なくともシスト化させた後のアスタキサンチン生産培養期間の光照射をピーク波長が420〜500nmの青色光LEDとピーク波長が620〜690nmの赤色光LEDをそれらの比を光量子束密度で１：１〜４：１の範囲になるように併用して行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法。
- ピーク波長420〜500nmの青色光LEDとピーク波長620〜690nmの赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ20μmol/m2/s以上であることを特徴とする請求項１のアスタキサンチン生産方法。
- 微細藻がヘマトコッカス属であること特徴とする請求項１又は２のアスタキサンチン生産方法。
- 培養液あたりのアスタキサンチン生産量が100mg/L以上である請求項１ないし３いずれかのアスタキサンチン生産方法。
- 培養液あたりのアスタキサンチン生産量が300mg/L以上である請求項４のアスタキサンチン生産方法。
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