WO2018043146A1 - 光合成微細藻類の培養方法 - Google Patents

光合成微細藻類の培養方法 Download PDF

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WO2018043146A1
WO2018043146A1 PCT/JP2017/029513 JP2017029513W WO2018043146A1 WO 2018043146 A1 WO2018043146 A1 WO 2018043146A1 JP 2017029513 W JP2017029513 W JP 2017029513W WO 2018043146 A1 WO2018043146 A1 WO 2018043146A1
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WO
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light irradiation
light
led
photosynthetic microalgae
xanthophyll
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PCT/JP2017/029513
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English (en)
French (fr)
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松本　陽子
正治 石倉
廣志 鈴木
Original Assignee
昭和電工株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/02—Photobioreactors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C12M31/10—Means for providing, directing, scattering or concentrating light by light emitting elements located inside the reactor, e.g. LED or OLED
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing photosynthetic microalgae containing xanthophyll.
  • Astaxanthin a kind of xanthophyll
  • red carotenoid a kind of red carotenoid and is known to have a strong antioxidant effect.
  • astaxanthin is used in food coloring, cosmetics, health foods and the like.
  • Astaxanthin can be chemically synthesized, but naturally derived astaxanthin is widely used.
  • Naturally-derived astaxanthin is extracted from shrimps such as krill and flax shrimp, faffia yeast, algae and the like.
  • Non-Patent Document 1 Various studies have been made on methods for obtaining astaxanthin by culturing algae such as Haematococcus (see, for example, Patent Documents 1 to 4).
  • Patent Document 1 discloses a method for producing xanthophyll from photosynthetic microalgae, which includes a step of inoculating and growing a photosynthetic microalgae containing xanthophyll in a nutrient medium, and a step of cystizing the proliferated microalgae. Yes.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing green algae in which cystized green algae are irradiated with light at a photosynthesis effective photon flux input amount of 25,000 ⁇ mol / (m 3 ⁇ s) or more.
  • Patent Document 3 discloses a method for culturing algae in which red light illumination light and blue light illumination light are repeatedly and independently irradiated to algae.
  • Patent Document 4 discloses that when culturing algae to produce astaxanthin in the algae, the light irradiation during the astaxanthin production culture period is performed in combination with a blue LED and a red LED.
  • Patent Documents 1 to 4 various studies have been made in order to efficiently obtain xanthophylls such as astaxanthin, but a method for culturing photosynthetic microalgae capable of obtaining xanthophylls more efficiently has been demanded. .
  • an object of the present invention is to provide a method for culturing photosynthetic microalgae capable of obtaining xanthophyll more efficiently than before.
  • the present inventors have found that the above-described problems can be solved by irradiating cystized photosynthetic microalgae with light in a specific pattern. That is, the present invention relates to the following [1] to [10], for example.
  • Light irradiation (a) is performed on the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll, and the photosynthesis microalgae subjected to the cell number increase step (A) is irradiated with light ( b) a method for culturing photosynthetic microalgae, comprising the step (B) of increasing the xanthophyll content in the photosynthetic microalgae,
  • the light irradiation (a) is light irradiation using an LED containing blue light having a wavelength of 400 to 490 nm as a light source
  • the light irradiation (b) is light irradiation using an LED containing blue light having a wavelength of 400 to 490 nm and an LED containing red light having a wavelength of 620 to 690 nm as a light source,
  • the method for culturing photosynthetic microalgae wherein the light irradiation (a) and the
  • Light irradiation (I) using a white LED as a light source light irradiation (II) using a white LED and a blue LED, light irradiation using a white LED and a red LED (III) ), Light irradiation using a blue LED and a red LED (IV), light irradiation using a blue LED and a red LED alternately (V), and light irradiation using a blue LED (VI)
  • the light irradiation (b) as a light source is light irradiation (I) using a white LED, light irradiation (II) using a white LED and a blue LED, light irradiation (III) using a white LED and a red LED, blue [1] or [2], which is at least one kind of light irradiation selected from light irradiation (IV) using an LED and a red LED, and light irradiation (V) using a blue LED
  • the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll used in the step (A) are cystized photosynthetic microalgae containing 3 to 9% by mass of xanthophyll in terms of dry mass, [1] to [3 ] The culture
  • the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae is maintained at 2% by mass or more in terms of dry mass, and the photosynthetic microscopic material according to any one of [1] to [4] Algae culture method.
  • step (A) is performed for 3 to 7 days
  • step (B) is performed for 4 to 10 days
  • step (A) and the step (B) are performed for 7 to 17 days.
  • [8] Xanthophyll obtained by dividing the amount (mg) of xanthophyll per 1 L of the photosynthetic microalgae culture solution obtained in step (B) by the total period (day) in which steps (A) and (B) are performed.
  • a method for culturing photosynthetic microalgae capable of obtaining xanthophyll more efficiently than before is provided.
  • the time-dependent change of the total nitrogen concentration in the culture solution of Example 1 and Comparative Example 1 is shown.
  • the time-dependent change of the cell number in the culture solution of Example 1 and Comparative Example 1 is shown.
  • the time-dependent change of the astaxanthin concentration in the culture solution of Example 1 and Comparative Example 1 is shown.
  • concentration of Example 1 and Comparative Example 1 is shown.
  • the present invention will be specifically described.
  • the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll were subjected to the light irradiation (a) cell number increasing step (A) and the cell number increasing step (A).
  • the step (B) of increasing the xanthophyll content in the photosynthetic microalgae that is subjected to light irradiation (b) is included in the photosynthetic microalgae.
  • the light irradiation (a) is light irradiation using an LED containing blue light having a wavelength of 400 to 490 nm as a light source
  • the light irradiation (b) is blue light having a wavelength of 400 to 490 nm as a light source.
  • the light irradiation (a) and the light irradiation (b) are light irradiation using different light sources.
  • cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll is used.
  • the photosynthetic microalgae used in the present invention only needs to contain xanthophyll and be cystized.
  • the photosynthetic microalgae used in the present invention is not particularly limited as long as it is capable of producing xanthophyll, can be cystized, and can be photosynthesized.
  • the photosynthetic microalgae green algae are preferable from the viewpoint of xanthophyll productivity.
  • green algae belonging to the genus Haematococcus are preferably used.
  • examples of the green algae of the genus Haematococcus include Haematococcus pluvialis, H. lacustris, H. capensis, Hematococcus droebakes, H. -Zimbabiensis (H. zimbabiensis) etc. are mentioned.
  • Haematococcus pluvialis H. pluvialis
  • the UTEX2505 strain deposited at the University of Texas Algae Preservation Facility, the University of Copenhagen, Scandinavian Culture Center, Algae and Protozoa, Botanical Institute, etc. Can be mentioned.
  • NIES 144, NIES 2263, NIES 2264, NIES 2265, ATCC 30402 and 30453, or UTEX deposited with the National Institute for Environmental Studies 16 strains and 294 strains.
  • Haematococcus capensis examples include UTEX LB1023 strain.
  • Haematococcus droebakensi H. droebakensi
  • Haematococcus capensis examples include UTEX LB1023 strain.
  • Haematococcus droebakensi examples include UTEX LB55 strain.
  • Hematococcus zimbabwiensis examples include UTEX LB1758 strain.
  • Photosynthetic microalgae examples include UTEX LB1758 strain.
  • Haematococcus lactoris and Haematococcus prubiaris are more preferably used.
  • Xanthophyll is a kind of carotenoid.
  • Examples of xanthophylls include astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, adonilvin, adonixanthin, and cryptoxanthin.
  • the culture method of the present invention does not require cell growth using suspended cells (photosynthetic microalgae that are not cysted) that are difficult to culture in the step (A), the photosynthetic microalgae can be obtained even under strong light irradiation. Cell number increases. Since the xanthophyll is already contained in the cells increased in the step (A), the xanthophyll content in each cell of each photosynthetic microalgae is increased by the step (B) without damaging the cells. Therefore, the culture method of the present invention can obtain a large amount of xanthophyll.
  • the xanthophyll obtained is mainly determined by the type of photosynthetic microalgae and is not particularly limited, but is preferably astaxanthin having a high antioxidant action from the viewpoint of effective utilization of xanthophyll.
  • the photosynthetic microalgae capable of obtaining astaxanthin include the aforementioned green algae of the genus Haematococcus, and Haematococcus lactoris and Hematococcus prubiaris are preferable.
  • Nanodia Among photosynthetic microalgae, for example, there are algae that accumulate xanthophyll and the like in cells and become dormant spores due to stress such as light irradiation, nutrient starvation, and the presence of oxides.
  • cystation includes any state from a state of entering a dormant state and starting to accumulate xanthophyll into a complete cyst and becoming dormant spores.
  • Xanthophyll content of cysted photosynthetic microalgae containing xanthophyll As the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll used in the present invention, a daughter cell is formed while containing xanthophyll, and xanthophylls can be generated by stress of light irradiation immediately after cell growth by daughter cell release. It is preferable to use photosynthetic microalgae that accumulate xanthophylls to some extent.
  • the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll used in the step (A) is preferably cystized photosynthetic microalgae containing 3 to 9% by mass of xanthophyll in terms of dry mass. That is, the photosynthetic microalgae irradiated with light in the present invention preferably contains 3 to 9% by mass of xanthophyll in terms of dry mass at the time immediately before light irradiation, in other words, at the start of light irradiation (a). During light irradiation, the amount of xanthophyll varies.
  • cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll contain 3 to 7% by mass of xanthophyll in terms of dry mass.
  • cystized photosynthetic microalgae containing a large amount of xanthophyll for example, exceeding 7% by mass and containing not more than 9% by mass in terms of dry mass
  • cystized photosynthetic microalgae containing 3 to 7% by mass in terms of conversion cystized photosynthesis containing xanthophyll in excess of 7% by mass and not more than 9% by mass in terms of dry mass
  • cystized photosynthetic microalgae obtained by obtaining microalgae and containing the obtained xanthophyll in excess of 7 mass% and 9 mass% or less in terms of dry mass can be exemplified.
  • the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae can be determined from the mass when the predetermined amount of photosynthetic microalgae is dried and the xanthophyll content contained in the predetermined amount of photosynthetic microalgae.
  • the method for culturing photosynthetic microalgae of the present invention includes a cell number increasing step (A) in which light irradiation (a) is performed on the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll.
  • the step (A) can be performed, for example, in the same manner as the culture method performed when increasing the number of cells of conventionally known photosynthetic microalgae except that the light irradiation (a) described later is performed, and there is no particular limitation.
  • the step (A) includes a method of inoculating a medium with cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll and performing light irradiation (a).
  • Step (A) is preferably performed for 3 to 7 days, more preferably 4 to 6 days.
  • the light irradiation (a) is usually always performed, but the light irradiation (a) may not be temporarily performed when confirming the progress of the process.
  • the total time during which light irradiation is not performed in the step (A) is preferably 5% or less of the step (A).
  • the amount of the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll used in the step (A) is not particularly limited, but is usually 0.05 to 5 g, preferably 0.3 to 2 g, per 1 L of the medium described later. It is. In the said range, since a xanthophyll can be obtained more efficiently, it is preferable.
  • step (A) the number of photosynthetic microalgae increases.
  • the present inventors speculated that the reason why the number of photosynthetic microalgae increased was as follows.
  • step (A) the cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll is converted into cyst cells containing 2 to 32 daughter cells by photosynthesis using nutrients in the medium. Daughter cells containing xanthophyll are released from these cells.
  • the number of photosynthetic microalgae cells is considered to increase.
  • the step (B) of increasing the xanthophyll content in the photosynthetic microalgae subjected to light irradiation (b) is performed on the photosynthetic microalgae subjected to the cell number increasing step (A).
  • the step (B) the xanthophyll content in individual photosynthetic microalgae is increased by performing light irradiation (b).
  • the culture method is performed when promoting cystation.
  • the culture method is performed when promoting cystation.
  • the method of performing the light irradiation (b) as it is after performing the step (A), taking out the photosynthetic microalgae. Thereafter, a method of inoculating a new medium and performing light irradiation (b) can be mentioned.
  • Step (B) is preferably performed for 4 to 10 days, more preferably 6 to 8 days.
  • the light irradiation (b) is usually always performed, but the light irradiation (b) may not be temporarily performed when confirming the progress of the process.
  • the total time during which light irradiation is not performed in step (B) is preferably 5% or less of step (B).
  • the step (A) and the step (B) are preferably performed for 7 to 17 days, more preferably for 10 to 14 days.
  • step (B) the xanthophyll content in the photosynthetic microalgae increases.
  • the present inventors speculated that the reason that the xanthophyll content is increased is as follows.
  • the photosynthetic microalgae with an increased number of cells undergo cystation due to nutrient starvation and light irradiation stress in the step (B), and further xanthophylls are generated and accumulated in each cell of the photosynthetic microalgae. Therefore, it is thought that xanthophyll content increases.
  • xanthophyll can be efficiently obtained because the cell number of photosynthetic microalgae increases and the amount of xanthophyll in each cell increases following the increase in cell number.
  • the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae is preferably maintained at 2% by mass or more in terms of dry mass, and is at least 2.5% by mass. It is more preferable to keep it, and it is more preferable to keep it at 2.8% by mass or more. That is, in step (A) and step (B), daughter cells are released while containing xanthophyll, so that xanthophyll can be generated by light irradiation stress without being killed by light irradiation damage.
  • the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae is preferably maintained at 2% by mass or more, more preferably 2.5% by mass or more, and more preferably 2.8% by mass or more in terms of dry mass. Is preferred.
  • the upper limit of the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae is not particularly limited, but is usually 15% by mass or less in terms of dry mass.
  • the number of cells increases in the step (A), and when the number of cells increases, the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae in terms of dry mass decreases. Also in the step (A) in which the number of cells increases, it is preferable that the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae in terms of dry mass falls within the above range because xanthophyll can be obtained more efficiently.
  • light irradiation (a) and light irradiation (b) In the step (A), light irradiation (a) is performed.
  • the light irradiation (a) is light irradiation using an LED containing blue light having a wavelength of 400 to 490 nm as a light source.
  • the light irradiation (a) is a light irradiation using a white LED as a light source (I), a light irradiation using a white LED and a blue LED (II), a light irradiation using a white LED and a red LED (III), blue Light irradiation (IV) using LED and red LED, light irradiation (V) using blue LED and red LED alternately, and light irradiation (VI) using blue LED, at least one kind of light irradiation It is preferable that
  • step (B) light irradiation (b) is performed.
  • the light irradiation (b) is light irradiation using an LED containing blue light having a wavelength of 400 to 490 nm and an LED containing red light having a wavelength of 620 to 690 nm as a light source.
  • the LED containing blue light and the LED containing red light may be different LEDs or the same LED. That is, for example, as an LED including blue light and an LED including red light, a white LED including blue light and red light can be used.
  • Light irradiation (b) includes light irradiation using a white LED as a light source (I), light irradiation using a white LED and a blue LED (II), light irradiation using a white LED and a red LED (III), blue Light irradiation (IV) using an LED and a red LED and light irradiation (V) using a blue LED and a red LED alternately are preferable.
  • a white LED including at least blue light is used in the light irradiation (a).
  • a white LED including at least blue light is used in the light irradiation (b).
  • at least A white LED including blue light and red light is used in the light irradiation (b).
  • a white LED including at least red light is used in the light irradiation (b).
  • light irradiation (a) and light irradiation (b) are light irradiations using different light sources.
  • Light irradiation using different light sources means “light irradiation using light sources (LEDs) having different emission wavelengths as light sources (a) and (b). What is performed "and" Light irradiation using a plurality of light sources having different emission wavelengths in light irradiation (a) at the same time and light irradiation using a plurality of light sources having different emission wavelengths in light irradiation (b) are performed.
  • the intensity ratio of each light source in the light irradiation (a) and the light irradiation (b) Means that at least one of “irradiation with different intensity ratio of each light source is performed” is satisfied. Note that “light irradiation using different light sources” does not mean that the light amount of the light sources, the number of light sources (LEDs), and the like are different.
  • using different light sources means that when at least one light irradiation uses a plurality of light sources as light sources, at least a part of the light sources may be different.
  • a white LED is used in the light irradiation (a)
  • a light using a different light source is used even when a white LED and a blue LED are used in the light irradiation (b). It becomes irradiation.
  • white LED and blue LED are used in light irradiation (a)
  • white LED and red LED when white LED and red LED are used, blue is used. Even when an LED and a red LED are used, light irradiation using different light sources is performed.
  • the light irradiation (a) alternately irradiates blue light and red light by the blue LED and the red LED
  • the light irradiation (a) is a combination of irradiation of only blue light and irradiation of only red light.
  • (b) is simultaneous irradiation of blue light and red light, it is regarded as light irradiation by different light sources.
  • the light irradiation (a) and the light irradiation (b) when the light irradiation using the blue LED and the red LED is performed, the light irradiation (a) There is a case where the emission intensity is stronger than the emission intensity of the red LED and the emission intensity of the blue LED is lower than the emission intensity of the red LED in the light irradiation (b).
  • the light irradiation performed in the light irradiation (a) is preferably light irradiation (I), light irradiation (II), light irradiation (IV), light irradiation (V) or light irradiation (VI).
  • blue light irradiation is effective, and it is preferable to use a blue LED or a white LED.
  • the light irradiation (a) is preferably light irradiation (I), light irradiation (II), light irradiation (IV) or light irradiation (VI) from the viewpoint of ease of control.
  • the light irradiation performed in the light irradiation (b) is preferably light irradiation (III), light irradiation (IV) or light irradiation (V).
  • irradiation with blue light and red light is effective, and it is preferable to use a red LED together with a blue LED or a white LED.
  • the light irradiation (b) is preferably light irradiation (III) or light irradiation (IV) from the viewpoint of ease of control.
  • the blue LED is an LED (light emitting diode) having a peak wavelength of 400 to 490 nm, and preferably an LED having a peak wavelength of 430 to 470 nm.
  • the blue LED for example, Showa Denko (GA2RT450G) can be used.
  • the red LED is an LED (light emitting diode) having a peak wavelength of 620 to 690 nm, preferably an LED having a peak wavelength of 645 to 675 nm.
  • the red LED for example, Showa Denko (HRP-350F) can be used.
  • a white LED As a white LED, a white LED, a blue LED chip, and a combination of a blue LED chip and a phosphor whose excitation light is blue light and whose emission wavelength is yellow light, and the excitation light is blue light and its emission wavelength is Examples include a white LED having a blue LED, a blue LED, and a white LED having a blue, red, and green LED chip in combination with a phosphor that is yellow light and a phosphor having an emission wavelength other than yellow (for example, red, green, and blue-green). it can.
  • the white LED for example, Nichia Corporation (NESW146A), tiltc Corporation (LTN40YD), or the like can be used.
  • the amount of light (intensity) of the light irradiation (a) and the light irradiation (b) is not particularly limited.
  • the photosynthetic photon flux density (PPFD) is 750 ⁇ mol / (m 2 ⁇ s) or more. It is preferably 1,000 ⁇ mol / (m 2 ⁇ s) or more, and more preferably 1,200 ⁇ mol / (m 2 ⁇ s) or more.
  • the upper limit of the photosynthetic effective photon flux density is not particularly limited, but is usually 30,000 ⁇ mol / (m 2 ⁇ s) or less, preferably 20,000 ⁇ mol / (m) from the viewpoint of availability of equipment and energy efficiency. 2 ⁇ s) or less.
  • the light amount is the total light amount of the used LEDs.
  • the light irradiation (a) light irradiation is performed using an LED including blue light having a wavelength of 400 to 490 nm as a light source.
  • the light quantity (PPFD) of blue light having a wavelength of 400 to 490 nm is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and further preferably 15%, assuming that the total light quantity (PPFD) is 100%. That's it.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be 100%.
  • the amount of blue light (PPFD) with a wavelength of 400 to 490 nm is usually 80 to 100%. In the said range, since the increase in the cell number of photosynthetic microalgae advances suitably, it is preferable.
  • light irradiation is performed using an LED including blue light having a wavelength of 400 to 490 nm and an LED including red light having a wavelength of 620 to 690 nm as a light source.
  • the amount of light (PPFD) of blue light having a wavelength of 400 to 490 nm in the light irradiation (b) is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and further preferably 15% when the total light amount (PPFD) is 100%. That's it.
  • the light amount (PPFD) of red light having a wavelength of 620 to 690 nm in the light irradiation (b) is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and further preferably, when the total light amount (PPFD) is 100%. 15% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but when a blue LED and a red LED are used as the light source, the total amount of blue light with a wavelength of 400 to 490 nm and red light with a wavelength of 620 to 690 nm is 100. %. In the said range, since the xanthophyll content of photosynthetic microalgae increases suitably, it is preferable.
  • step (A) Whether the amount of blue light decreases or the amount of red light increases in the change from step (A) to step (B), that is, from light irradiation (a) to light irradiation (b).
  • at least one change is present, and more preferably both changes are present. If the change is present, the number of photosynthetic microalgae is increased by light irradiation (a), and the xanthophyll content is preferably increased by light irradiation (b).
  • the ratio of the blue light in the total light amount irradiated in the light irradiation (b) is the light irradiation. From the ratio of the blue light in the amount of all the rays irradiated in (a), it is preferable to reduce by 3% or more, more preferably to reduce by 30% or more, and particularly preferably to reduce by 40% or more.
  • the proportion of red light in the total light amount irradiated in light irradiation (b) is the light irradiation. From the ratio of red light in the total amount of light irradiated in (a), it is preferably increased by 10% or more, more preferably increased by 15% or more, and particularly preferably increased by 25% or more.
  • the difference between the amount of blue light in the light irradiation (b) and the amount of blue light in the light irradiation (a) is expressed as ⁇ B (the amount of blue light in the light irradiation (b) minus the blue light amount in the light irradiation (a)).
  • the difference between the amount of red light in the light irradiation (b) and the amount of red light in the light irradiation (a) is ⁇ R (the amount of red light in the light irradiation (b) ⁇ light irradiation (light amount of light)). From the viewpoint of xanthophyll content, it is preferable that ⁇ R ⁇ B> 0.
  • the light quantity of blue light will be 0%, and light irradiation is performed using blue LED. In this case, the amount of red light is 0%.
  • the time of light irradiation using a blue LED and the time of light irradiation using a red LED when performing light irradiation (V) are within the ranges described below. It only has to be.
  • the photosynthetic effective photon flux density is within the above range, the amount of light is sufficient, so that it is possible to efficiently grow photosynthetic microalgae and generate xanthophyll.
  • the cells may be damaged and killed before the number of cells increases, but the culture method of the present invention Since cystized photosynthetic microalgae containing xanthophyll are used as described above, the number of cells is preferably increased even when light irradiation is performed at a high photosynthesis effective photon flux density.
  • the light quantity of light irradiation (a) and light irradiation (b) may be the same, or may differ.
  • the amount of light irradiation (a) may be constant from the viewpoint of ease of control, or may be varied so as to be controlled to an optimum amount of light according to the cell density.
  • the light amount of the light irradiation (b) may be constant from the viewpoint of ease of control, or may be varied so as to be controlled to an optimum light amount according to the cell density. Good.
  • each light irradiation (light irradiation (II), (III) and (IV)), there is no particular limitation on the ratio of the amount of light (intensity) when two types of LEDs having different emission wavelengths are used simultaneously.
  • an LED of an arbitrary color used for light irradiation is an X color LED and an LED having a light emission wavelength different from that of the X color LED used for light irradiation is a Y color LED
  • the intensity ratio between the X color LED and the Y color LED (photosynthesis effective)
  • the ratio of the photon flux density is usually 1:20 to 20: 1, preferably 1:15 to 15 to 1, more preferably 1:10 to 10: 1.
  • Light irradiation (V) is light irradiation using blue LEDs and red LEDs alternately as described above. That is, in light irradiation (V), light irradiation using a blue LED and light irradiation using a red LED are alternately performed. In light irradiation (V), light irradiation using each LED is performed separately for a certain period of time.
  • light irradiation using a blue LED and light irradiation using a red LED are each performed at least once.
  • light irradiation using a blue LED is I B
  • light irradiation using a red LED is I R
  • light irradiation (V) is, for example, light performed once in the order of I B and I R.
  • Irradiation or light irradiation performed in the order of I B and I R is one step, and light irradiation in which the step is performed at least once is exemplified.
  • time to perform the I B is not particularly limited as the ratio of the time for I R.
  • time and the ratio of performing I R (I B: I R ) is usually 1: 1 to 250: 1.
  • the ratio of the time for performing I B to the time for performing I R (I B : I R ) is usually 1: 1 to 1: 250.
  • the time to perform the I B, when performed multiple times with light irradiation using a blue LED means the total time of light irradiation using a blue LED that performed in step (A) or step (B)
  • the time of performing the I R, when performed multiple times with light irradiation using a red LED means the total time of light irradiation using a red LED that performed in step (a) or step (B).
  • the light irradiation (a) is at least one kind of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (VI), but the light irradiation (a) is selected from the light irradiations (I) to (VI).
  • the light irradiation (a) may be two or more light irradiations selected from the light irradiations (I) to (VI).
  • the light irradiation (a) is preferably one type of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (VI) from the viewpoint of ease of control.
  • the light irradiation (a) is two or more kinds of light irradiations selected from the light irradiations (I) to (VI).
  • the light irradiation (b) is at least one kind of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (V), but the light irradiation (b) is selected from the light irradiations (I) to (V).
  • the light irradiation (b) may be two or more light irradiations selected from the light irradiations (I) to (V).
  • the light irradiation (b) is preferably one type of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (V) from the viewpoint of ease of control.
  • the light irradiation (b) is two or more types of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (V). Two or more types of light irradiation selected from the light irradiations (I) to (V) are used.
  • light irradiation (a) and light irradiation (b) are light irradiations using different light sources, but at least one of light irradiation (a) and light irradiation (b).
  • different light sources may be used in part of the light irradiation (a) and the light irradiation (b). For example, when light irradiation (I) and light irradiation (II) are performed in light irradiation (a), when light irradiation (b) is only light irradiation (I), only light irradiation (II) is performed.
  • light irradiation (I) and light irradiation (III) or (IV) In the case of light irradiation (I) and light irradiation (III) or (IV), light irradiation (II) and light irradiation (III) or (IV) are different. Light irradiation is performed using a light source.
  • both the light irradiation (IV) is performed, and in the light irradiation (a) and the light irradiation (b), a blue LED and a red LED are used. Even if the emission intensities of the light sources differ, it is considered that different light sources were used.
  • conditions other than the light irradiation (a) and the light irradiation (b) when performing the step (A) and the step (B) will be described.
  • a culture medium used for the cultivation method of the photosynthetic microalgae of this invention.
  • a liquid medium containing nitrogen necessary for the growth of photosynthetic microalgae inorganic salts of trace metals (for example, phosphorus, potassium, magnesium, iron, etc.) is used.
  • a medium such as VT medium, C medium, MC medium, MBM medium, MDM medium (see Algae Research Method Mitsuo Chihara and Kazutoshi Nishizawa, Kyoritsu Shuppan (1979)), OHM medium, BG-11 medium and modified medium thereof are used.
  • the number of photosynthetic microalgae increases, that is, grows.
  • a medium to which a component serving as a nitrogen source suitable for growth is added, for example, the nitrogen concentration is 0.03 g / L or more, preferably 0.03 to 0.5 g / L. More preferably, a medium of 0.05 to 0.5 g / L is used.
  • the number of cells can be increased efficiently, and even when the medium used in step (A) is used as it is in step (B), the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae is sufficient. It is preferable because it can be increased.
  • step (B) a medium is usually used, but as the medium used in step (B), the medium used in step (A) may be used as it is, or the medium may be changed.
  • the medium used in the step (B) from the viewpoint of increasing the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae, a medium containing almost no nitrogen source component, for example, the nitrogen concentration is less than 0.02 g / L, preferably It is preferable to use a medium of less than 0.01 g / L.
  • the concentration of nitrogen contained in the medium is usually 0.02 g / L when the increase in the number of cells is stopped or almost stopped in step (A). Less than.
  • the above range is preferable because the xanthophyll content of the photosynthetic microalgae can be sufficiently increased in the step (B).
  • step (A) and step (B) carbon dioxide is preferably supplied.
  • Carbon dioxide is supplied by blowing a gas containing carbon dioxide having a concentration of 1 to 5 V / V%, for example, at 0.2 to 2 vvm.
  • a gas obtained by mixing carbon dioxide and air, or a gas obtained by mixing carbon dioxide and nitrogen gas can be used.
  • the culture solution is stirred by the supply of carbon dioxide, and light irradiation is uniformly performed on the microalgae.
  • the culture device used in the step (A) and the step (B) is not particularly limited as long as it is a device capable of irradiating light to a culture solution containing a photosynthetic microalgae, usually a photosynthesis microalgae. It has a line capable of supplying the contained gas.
  • a culture apparatus for example, in the case of a small scale, a flat culture bottle, in the case of a large scale, a flat culture tank composed of a transparent plate made of glass or plastic, a tank type with a stirrer equipped with an illuminator A culture tank, a tube type culture tank, an air dome type culture tank, a hollow cylindrical culture tank, or the like is used. Moreover, a sealed container is preferably used.
  • step (A) and step (B) are performed by appropriately selecting and combining the above-mentioned medium, culture conditions, culture apparatus and the like.
  • the first method is a method in which step (A) and step (B) are performed in the same medium, that is, a one-stage culture method.
  • the second method is a method of performing the step (B) using the separated photosynthetic microalgae and a new medium after separating the photosynthetic microalgae and the medium after performing the step (A), That is, a two-stage culture method.
  • the one-stage culture method is easy to operate because the medium is the same in step (A) and step (B), and step (A) and step (B) are performed continuously. It is preferable because it is difficult for contamination to occur.
  • the two-stage culture method is preferable in that an optimum medium can be selected in each of the steps (A) and (B).
  • the one-stage culture method is not suitable for continuous culture, and is usually performed as a batch culture.
  • Xanthophyll productivity (mg / (L ⁇ day)) is preferably 20 mg / (L ⁇ day) or more, more preferably 30 mg / (L ⁇ day) or more, and particularly preferably 40 mg / (L -Day) or more. The higher the productivity, the better.
  • the upper limit is not particularly limited, but in the culture method of the present invention, the productivity of xanthophyll is usually 100 mg / (L ⁇ day) or less.
  • a culture solution of photosynthetic microalgae can be obtained.
  • the culture solution of photosynthetic microalgae obtained by the culture method of the present invention preferably has a xanthophyll content of 300 mg / L or more, more preferably 400 mg / L or more, and particularly preferably 500 mg / L per liter of the culture solution. That's it.
  • the xanthophyll content is preferably as high as possible, and the upper limit thereof is not particularly limited, but the xanthophyll content of the culture solution of the photosynthetic microalgae obtained is usually 1000 mg / L or less.
  • the photosynthetic microalgae obtained by the method for culturing photosynthetic microalgae of the present invention preferably contains 4 to 15% by mass of xanthophyll in terms of dry mass, more preferably 5 to 12% by mass or more.
  • xanthophyll is accumulated in the photosynthetic microalgae. For this reason, the xanthophyll is collected from the photosynthetic microalgae without any particular limitation, including a conventionally known method, after the photosynthetic microalgae are collected.
  • Examples of a method for recovering xanthophyll from photosynthetic microalgae include a method of mechanically destroying photosynthetic microalgae and then extracting with an organic solvent and supercritical carbon dioxide.
  • a predetermined amount of the culture solution is suction filtered using GS25 glass fiber filter paper (manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.), which has been made constant in a constant temperature dryer in advance, washed with ion-exchanged water, and then 2 times in a constant temperature dryer at 105 ° C. Dry for hours. Then, after cooling to room temperature in a desiccator, the mass (mg / L) of dry algae in the culture solution was determined by measuring the mass.
  • a supernatant obtained by removing cells as a precipitate by centrifugation from a predetermined amount of the culture solution is prepared, and the total nitrogen concentration in the supernatant is determined as a total nitrogen measuring reagent kit 143C191 (manufactured by Toa DKK Corporation), portable simple total nitrogen / total It was measured using a phosphorus meter TNP-10 (manufactured by Toa DKK Corporation).
  • the number of cells (cells / mL) in the culture solution was calculated by counting the number of cells in a predetermined amount of the culture solution using a modified Neubauer hemocytometer under a microscope.
  • Example 1 400 ml of the medium shown in Table 1 is put into a 1.0 L capacity flat culture bottle (flask thickness of about 38 mm, including glass thickness), and after autoclaving, the cystized Hematococcus lactoris NISE-144 is 0.50 g / L. Inoculated as follows. The astaxanthin content per dry mass of the inoculated Haematococcus lactoris NISE-144 was 4.8% by mass.
  • the intensity of irradiated light is measured on the surface of a flat culture bottle using a photonometer (LI-COR, LI-250A), and the photosynthesis effective photon flux density (PPFD) is 1,300 ⁇ mol / (total on both sides). m 2 ⁇ s).
  • the total nitrogen concentration in the culture broth was less than 20 mg / L. At this point, it was determined that the nitrogen source needed to increase the number of cells was sufficiently consumed.
  • the light source is changed from a blue LED to a white LED (manufactured by Benc Co., Ltd., LTN40YD) (the emission wavelength includes 19% of blue light having a wavelength of 400 to 490 nm in terms of PPFD, and a wavelength of 620 to 690 nm.
  • Red light (contains 14% in terms of PPFD) and red LED (Showa Denko, HRP-350F) (the emission wavelength includes 96% of red light having a wavelength of 620 to 690 nm in terms of PPFD) (the ratio of photon flux density is 5 1) (Example 1-1), or blue LED and red LED (ratio of photon flux density is 1: 1) (Example 1-2) (light irradiation (b)) and culture Culturing was performed for 12 days after the start (7 days after changing the light source).
  • the culture solution was appropriately sampled, and the pH, the number of cells in the culture solution, the astaxanthin concentration in the culture solution, the dry alga mass in the culture solution, and the total nitrogen concentration in the culture solution were measured.
  • the intracellular astaxanthin concentration was calculated from the measured astaxanthin concentration in the culture broth and the dry algal mass in the culture broth.
  • the pH was 7.5-8.5 throughout the entire culture period.
  • Nitrogen in the culture was consumed by the fifth day.
  • the number of cells showed proliferation until the 4th day, and thereafter it was almost constant or slightly increased, and the number of cells on the 12th day was about 8 ⁇ 10 5 cells / ml in both Examples 1-1 and 1-2.
  • the concentration of astaxanthin in the culture solution was about 120 mg / L on the 5th day, and then increased in both Examples 1-1 and 1-2.
  • the concentration of astaxanthin in Example 1-1 was 530 mg / L Property: 44 mg / (L ⁇ day)), and in Example 1-2, 540 mg / L (productivity of astaxanthin: 45 mg / (L ⁇ day)).
  • the intracellular astaxanthin concentration was 4.8% by mass at the beginning of the culture and decreased to the lowest of 2.9% by mass on the third day. 0.1% by mass, and 8.4% by mass in Example 1-2.
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Nitrogen in the culture was consumed by the fifth day.
  • the number of cells showed growth until the 4th day, and thereafter became almost constant, and the number of cells on the 12th day was about 7 ⁇ 10 5 cells / ml in Comparative Example 1-2, and about 3.8 ⁇ in Comparative Example 1-1. 10 5 cells / ml. In Comparative Example 1-1, the number of cells was about half that of Comparative Example 1-2.
  • Astaxanthin concentration in the culture broth was about 120 mg / L in Comparative Example 1-2 and about 160 mg / L in Comparative Example 1-1 on the fifth day. Thereafter, both Comparative Examples 1-1 and 1-2 gradually increased. On the 12th day, Comparative Example 1-2 was 245 mg / L (astaxanthin productivity: 20 mg / (L ⁇ day)), Comparative Example 1-1. To 330 mg / L (productivity of astaxanthin: 28 mg / (L ⁇ day)). The intracellular astaxanthin concentration was 4.8% by mass at the beginning of the culture, and decreased to 2.9% by mass in Comparative Example 1-2 and 2.7% by mass in Comparative Example 1-1 on the third day.
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Example 2 Incubation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the light source for light irradiation (a) used at the start of the culture was changed from a blue LED to a white LED. In addition, after 5 days from the start of light irradiation, an example in which the light source for light irradiation (b) was changed to a white LED and a red LED (ratio of photon flux density 5: 1) was taken as Example 2-1, and the light source was blue Example 2-2 was changed to LED and red LED (ratio of photon flux density is 1: 1). Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Example 3 Culture was carried out in the same manner as in Example 1 except that the light source for light irradiation (a) used at the start of culture was changed from blue LED to white LED and blue LED (ratio of photon flux density was 5: 1).
  • An example in which an LED and a red LED (ratio of photon flux density is 1: 1) was taken as Example 3-2.
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Example 4 Incubation was carried out in the same manner as in Example 1-1 except that the light source for light irradiation (a) used at the start of culture was changed from blue LED to blue LED and red LED (ratio of photon flux density was 1: 1). .
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Example 5 Culture was performed in the same manner as in Example 1 except that the light source for light irradiation (b) used 5 days after the start of light irradiation was changed to a white LED.
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • Example 6 In Example 1, light irradiation (a) using a blue LED performed for 5 days from the start of culture was performed for 4 hours from the start of culture, and light irradiation for 21 hours using a blue LED and 0 using a red LED. .1 hour light irradiation is changed to light irradiation performed alternately and continuously, and the light source is changed to blue LED and red LED after 5 days from the start of light irradiation, after 4 days, The culture was performed in the same manner as in Example 1-2 except that the light irradiation after changing the light source was changed from 7 days to 8 days (Example 6-1).
  • Example 1 light irradiation (a) using a blue LED performed for 5 days from the start of culture was performed for 4 days from the start of culture, and light irradiation for 92 hours using a blue LED and 4 using a red LED. Change the time of light irradiation to light irradiation performed alternately, change the light source to blue LED and red LED after 5 days from the start of light irradiation, change after 4 days, light after the light source change Culturing was performed in the same manner as in Example 1-2 except that the irradiation was changed from 7 days to 8 days (Example 6-2).
  • Table 2 shows the types of light sources, astaxanthin concentration in the culture solution after 12 days of culture, and astaxanthin productivity.
  • the ratio of the blue light and the red light of each light source used in each of the above examples and comparative examples were calculated, and ⁇ B, ⁇ R, ⁇ R ⁇ B were calculated.
  • Table 3 shows the astaxanthin concentration (mg / L) (expressed as Ax concentration in Table 3) in the culture solution after culturing. In each example and comparative example, the PPFD is not changed between the process A and the process B.
  • the increase / decrease in the ratio (%) of the blue light and the ratio (%) of the red light is equal to the increase / decrease in the light quantity.
  • the magnitude relationship of ⁇ R ⁇ B is the same regardless of whether it is obtained with a specific light amount or a ratio.

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Abstract

本発明は、従来よりも効率的にキサントフィルを得ることが可能な、光合成微細藻類の培養方法を提供する。本発明の培養方法は、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類に、光照射（ａ）を行う細胞数増加工程（Ａ）および、前記細胞数増加工程（Ａ）が行われた光合成微細藻類に、光照射（ｂ）を行う光合成微細藻類中のキサントフィル含有量を増加させる工程（Ｂ）を含む光合成微細藻類の培養方法であり、前記光照射（ａ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、前記光照射（ｂ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、前記光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射である。

Description

光合成微細藻類の培養方法
　本発明は、キサントフィルを含む光合成微細藻類の培養方法に関する。
　現在キサントフィルは、様々な用途に使用されている。
　キサントフィルの一種であるアスタキサンチンは、赤色のカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。このため、アスタキサンチンは、食材用色素、化粧品、健康食品などに使用されている。
　アスタキサンチンは、化学合成することも可能であるが、天然由来のアスタキサンチンが広く使用されている。天然由来のアスタキサンチンは、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出されている。
　エビ類あるいはファフィア酵母のアスタキサンチン含有量は低いことが知られている。このため、藻類を培養することにより、アスタキサンチンを得る方法が検討されている。藻類、例えば、ヘマトコッカスは、窒素源枯渇や強光といった外部環境の変化（ストレス）に応じてシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積することが知られている。現在商用化されているヘマトコッカスによるアスタキサンチン生産はアスタキサンチンを蓄積する前の緑色の鞭毛をもつ遊走子状の細胞（グリーンステージ）で細胞数を増やし、その後ストレスによりシスト細胞（レッドステージ）細胞内にアスタキサンチンを蓄積させる方法がとられている。しかしながらこの遊走細胞の培養は弱光条件を好むなど培養環境の維持が難しいことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
　また、ヘマトコッカス等の藻類を培養することにより、アスタキサンチンを得る方法としては、様々な検討がされている（例えば、特許文献１～４参照）。
　例えば、特許文献１では、キサントフィルを含有する光合成微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程、増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む、光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法が開示されている。
　特許文献２では、シスト化した緑藻に、２５，０００μｍｏｌ／（ｍ3・ｓ）以上の光合成有効光量子束投入量で光照射を行う、緑藻の製造方法が開示されている。
　特許文献３では、藻類に赤色光照明光と、青色光照明光とを別個独立に、繰り返し照射する藻類の培養方法が開示されている。
　特許文献４では、藻類を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させる際に、アスタキサンチン生産培養期間の光照射を、青色ＬＥＤと、赤色ＬＥＤとを併用して行うことが開示されている。
国際公開２００５／１１６２３８号 特開２００７‐９７５８４号公報 国際公開２０１３／０２１６７５号 国際公開２０１５／１５１５７７号
北村晃利、他2名、「Haematococcus属緑藻によるアスタキサンチンの商業生産」、生物工学、公益社団法人　日本生物工学会、２０１５年、　第９３巻　第７号　ｐ．３８３－３８７
　特許文献１～４では、アスタキサンチン等のキサントフィルを効率的に得るために、種々の検討がされているが、より効率的にキサントフィルを得ることが可能な光合成微細藻類の培養方法が求められていた。
　そこで、本発明は、従来よりも効率的にキサントフィルを得ることが可能な、光合成微細藻類の培養方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を行ったところ、シスト化した光合成微細藻類に特定のパターンでの光照射を行うことにより、上記課題を解決することができることを見出した。
　すなわち、本発明の、例えば以下の［１］～［１０］に関する。
　［１］　キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類に、光照射（ａ）を行う細胞数増加工程（Ａ）および、前記細胞数増加工程（Ａ）が行われた光合成微細藻類に、光照射（ｂ）を行う光合成微細藻類中のキサントフィル含有量を増加させる工程（Ｂ）を含む光合成微細藻類の培養方法であり、
　前記光照射（ａ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、
　前記光照射（ｂ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、
　前記光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射である、光合成微細藻類の培養方法。
　［２］　前記光照射（ｂ）における青色光の光量と、前記光照射（ａ）における青色光の光量との差をΔＢとし、前記光照射（ｂ）における赤色光の光量と、前記光照射（ａ）における赤色光の光量との差をΔＲとしたとき、ΔＲ－ΔＢ＞０である、［１］に記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［３］　前記光照射（ａ）が光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）並びに青色ＬＥＤを用いた光照射（ＶＩ）から選択される少なくとも１種の光照射であり、
　前記光照射（ｂ）が光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、並びに青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）から選択される少なくとも１種の光照射である、［１］または［２］に記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［４］　前記工程（Ａ）で用いられる、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類が、キサントフィルを乾燥質量換算で３～９質量％含むシスト化した光合成微細藻類である、［１］～［３］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［５］　前記工程（Ａ）および工程（Ｂ）において、光合成微細藻類のキサントフィル含有量を、乾燥質量換算で２質量％以上に保つ、［１］～［４］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［６］　前記光照射（ａ）および光照射（ｂ）において、光合成有効光量子束密度が、７５０μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上である、［１］～［５］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［７］　前記工程（Ａ）が３～７日間行われ、前記工程（Ｂ）が４～１０日間行われ、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とを合わせて７～１７日間行われる、［１］～［６］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［８］　工程（Ｂ）により得られた光合成微細藻類の培養液１Ｌ当たりの、キサントフィルの量（ｍｇ）を工程（Ａ）および（Ｂ）が行われる合計の期間（ｄａｙ）で除した、キサントフィルの生産性（ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））が、２０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以上である、［１］～［７］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［９］　前記キサントフィルがアスタキサンチンであり、光合成微細藻類が、ヘマトコッカス属の緑藻類である、［１］～［８］のいずれかに記載の光合成微細藻類の培養方法。
　［１０］　［１］～［９］のいずれかに記載の培養方法により得られたキサントフィル含有量が３００ｍｇ／Ｌ以上である光合成微細藻類の培養液。
　従来よりも効率的にキサントフィルを得ることが可能な、光合成微細藻類の培養方法が提供される。
実施例１、比較例１の培養液中の全窒素濃度の経時変化を示す。 実施例１、比較例１の培養液中の細胞数の経時変化を示す。 実施例１、比較例１の培養液中のアスタキサンチン濃度の経時変化を示す。 実施例１、比較例１の細胞内のアスタキサンチン濃度の経時変化を示す。
　次に本発明について具体的に説明する。
　本発明の光合成微細藻類の培養方法は、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類に、光照射（ａ）を行う細胞数増加工程（Ａ）および、前記細胞数増加工程（Ａ）が行われた光合成微細藻類に、光照射（ｂ）を行う光合成微細藻類中のキサントフィル含有量を増加させる工程（Ｂ）を含む。本発明において、前記光照射（ａ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、前記光照射（ｂ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、前記光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射である。以下、本発明について詳細に説明する。
　（キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類）
　本発明には、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類が用いられる。本発明に用いられる光合成微細藻類としては、キサントフィルを含んでおり、シスト化していればよい。
　（光合成微細藻類）
　本発明に用いられる光合成微細藻類としては、キサントフィルを生産する能力があり、シスト化可能であり、かつ光合成をすることができる藻類であれば、特に制限はない。光合成微細藻類としては、緑藻類が、キサントフィルの生産性の観点から好ましい。
　緑藻類としては、例えば、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する緑藻類が好ましく用いられる。ヘマトコッカス属の緑藻類としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）としては、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ａｌｇａｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｚｏａ，　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、ＮＩＥＳ２２６３株、ＮＩＥＳ２２６４株、ＮＩＥＳ２２６５株、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株あるいはＵＴＥＸ　１６株および同２９４株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ　ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）としては、ＵＴＥＸ　ＬＢ５５株が挙げられる。
　ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ　ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
　これらの中でも、光合成微細藻類としては、ヘマトコッカス・ラクストリス、ヘマトコッカス・プルビアリスがより好ましく用いられる。
　（キサントフィル）
　キサントフィルとは、カロテノイドの一種である。キサントフィルとしては、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、クリプトキサンチンなどが挙げられる。
　本発明の培養方法は、工程（Ａ）によって、培養が難しい浮遊細胞（シスト化していない光合成微細藻類）を用いて細胞増殖を行う必要が無いため、強い光の照射下でも、光合成微細藻類の細胞数が増加する。工程（Ａ）で増加した細胞にはすでにキサントフィルが含まれているため、細胞がダメージを受けることなく、工程（Ｂ）により、各光合成微細藻類の各々の細胞中に有するキサントフィル含有量が増加するため、本発明の培養方法は、大量のキサントフィルを得ることができる。
　得られるキサントフィルは、主に光合成微細藻類の種類によって決まり、特に限定は無いが、高い抗酸化作用を持つアスタキサンチンであることが、キサントフィルの有効活用の点から好ましい。アスタキサンチンを得ることが可能な光合成微細藻類としては、例えば、前述のヘマトコッカス属の緑藻類が挙げられ、ヘマトコッカス・ラクストリス、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましい。
　（シスト化）
　光合成微細藻類の中には、例えば、光照射、栄養飢餓状態、酸化物の存在などのストレスにより、細胞内にキサントフィルなどを蓄積し、休眠胞子化する藻類が存在する。
　この休眠状態に入ることをシスト化という。本発明において、シスト化とは、休眠状態に入りキサントフィルを蓄積し始めた状態から完全にシスト化し休眠胞子となった状態のいずれの状態も含む。
　（キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類のキサントフィル含有量）
　本発明に用いるキサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類としては、キサントフィルを含有したまま娘細胞を形成し、娘細胞放出による細胞増殖後すぐに光照射のストレスによるキサントフィル生成が可能となる様に、キサントフィルをある程度蓄積する光合成微細藻類を用いることが好ましい。
　具体的には、前記工程（Ａ）で用いられる、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類が、キサントフィルを乾燥質量換算で３～９質量％含むシスト化した光合成微細藻類であることが好ましい。すなわち、本発明において光照射される光合成微細藻類は、光照射を行う直前の時点、言い換えると光照射（ａ）開始時点においてキサントフィルを乾燥質量換算で３～９質量％含んでいることが好ましく、光照射中には、キサントフィル量は変動する。キサントフィルを多く含むシスト化した光合成微細藻類を得ることは一般には難しいため、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類としては、キサントフィルを乾燥質量換算で３～７質量％含むことがより好ましい。
　なお、キサントフィルを多く含む、例えば乾燥質量換算で、７質量％を超えて９質量％以下含むシスト化した光合成微細藻類を用いて本発明の製造方法を実施する方法としては、キサントフィルを、乾燥質量換算で３～７質量％含むシスト化した光合成微細藻類を用いて、本発明の製造方法を実施することにより、キサントフィルを乾燥質量換算で７質量％を超えて９質量％以下含むシスト化した光合成微細藻類を得て、得られたキサントフィルを乾燥質量換算で７質量％を超えて９質量％以下含むシスト化した光合成微細藻類を用いて、再度本発明の製造方法を実施する方法が例示できる。
　なお、光合成微細藻類のキサントフィル含有量は、所定量の光合成微細藻類を乾燥させた際の質量および、所定量の光合成微細藻類に含まれるキサントフィル含有量から求めることができる。
　〔工程（Ａ）〕
　本発明の光合成微細藻類の培養方法は、前述のキサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類に、光照射（ａ）を行う細胞数増加工程（Ａ）を有する。
　工程（Ａ）は、後述の光照射（ａ）が行われる以外は、例えば、従来公知の光合成微細藻類の細胞数を増やす際に行われる培養方法と同様に行うことができ、特に制限は無い。
　例えば、工程（Ａ）としては、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類を、培地に接種し、光照射（ａ）を行う方法が挙げられる。
　工程（Ａ）は好ましくは３～７日間行われ、より好ましくは４～６日間行われる。なお、工程（Ａ）では、通常は常に光照射（ａ）が行われるが、工程の進捗状況を確認する際等に、一時的に光照射（ａ）が行われなくてもよい。但し、一時的に光照射が行われない場合には、工程（Ａ）において光照射が行われない時間の合計は、工程（Ａ）の５％以下であることが好ましい。
　工程（Ａ）で用いられるキサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類の量としては、特に制限は無いが、後述の培地１Ｌあたり、通常は０．０５～５ｇであり、好ましくは０．３～２ｇである。前記範囲では、より効率的にキサントフィルを得ることができるため好ましい。
　工程（Ａ）では光合成微細藻類の細胞数が増加する。光合成微細藻類の細胞数が増加する理由は、以下の通りであると本発明者らは推測した。キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類は、工程（Ａ）では、培地中の栄養素を利用しながら光合成することにより２～３２個の娘細胞を含んだシスト細胞となる。この細胞からキサントフィルを含有する娘細胞が放出される。このようにして、工程（Ａ）では、光合成微細藻類の細胞数が増加すると考えられる。
　〔工程（Ｂ）〕
　本発明の光合成微細藻類の培養方法は、前記細胞数増加工程（Ａ）が行われた光合成微細藻類に、光照射（ｂ）を行う光合成微細藻類中のキサントフィル含有量を増加させる工程（Ｂ）を有する。工程（Ｂ）では、光照射（ｂ）を行うことにより、個々の光合成微細藻類中のキサントフィル含有量が増加する。
　工程（Ｂ）は、後述の光照射（ｂ）が行われる以外は、例えば、従来公知の光合成微細藻類のキサントフィル含有量を増加させる際、シスト化を促進する際に行われる培養方法と同様に行うことができ、特に制限は無い。
　例えば、工程（Ｂ）としては、工程（Ａ）を行った後、光合成微細藻類を取り出すことなく、そのまま光照射（ｂ）を行う方法、工程（Ａ）を行った後、光合成微細藻類を取り出した後、新たな培地に接種し、光照射（ｂ）を行う方法が挙げられる。
　工程（Ｂ）は好ましくは４～１０日間行われ、より好ましくは６～８日間行われる。なお、工程（Ｂ）では、通常は常に光照射（ｂ）が行われるが、工程の進捗状況を確認する際等に、一時的に光照射（ｂ）が行われなくてもよい。但し、一時的に光照射が行われない場合には、工程（Ｂ）において光照射が行われない時間の合計は、工程（Ｂ）の５％以下であることが好ましい。
　また、本発明の培養方法では、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とを合わせて、好ましくは７～１７日間行われ、より好ましくは１０～１４日間行われる。
　工程（Ｂ）では、光合成微細藻類中のキサントフィル含有量が増加する。キサントフィル含有量が増加する理由は、以下の通りであると本発明者らは推測した。工程（Ａ）により、細胞数が増えた光合成微細藻類は、工程（Ｂ）で栄養飢餓かつ光照射のストレスでシスト化が進み、光合成微細藻類の各細胞内で、さらなるキサントフィルが生成され蓄積されるため、キサントフィル含有量が増加すると考えられる。
　本発明の培養方法では、このようにして、光合成微細藻類の細胞数増加と、細胞数増加に続いて各細胞内のキサントフィル量の増加とが起こるため、効率的にキサントフィルを得ることができる。
　なお、本発明の培養方法では、工程（Ａ）および工程（Ｂ）において、光合成微細藻類のキサントフィル含有量を、乾燥質量換算で２質量％以上に保つことが好ましく、２．５質量％以上に保つことがより好ましく、２．８質量％以上に保つことがさらに好ましい。すなわち、工程（Ａ）および工程（Ｂ）においては、キサントフィルを含有したまま娘細胞が放出され、光照射のダメージにより死滅することなく、光照射のストレスによるキサントフィル生成が可能となる様に、常に光合成微細藻類のキサントフィル含有量が、好ましくは乾燥質量換算で２質量％以上、より好ましくは２．５質量％以上となるように、さらに好ましくは２．８質量％以上となるように維持することが好ましい。なお、工程（Ａ）および工程（Ｂ）において、光合成微細藻類のキサントフィル含有量の上限は、特に限定は無いが、通常は乾燥質量換算で１５質量％以下である。
　本発明の培養方法では、前述のように工程（Ａ）において細胞数が増加し、細胞数が増加する際に、乾燥質量換算の光合成微細藻類のキサントフィル含有量が低下する。細胞数が増加する工程（Ａ）においても、乾燥質量換算の光合成微細藻類のキサントフィル含有量が前記範囲となるようにすることにより、より効率的にキサントフィルを得ることができるため好ましい。
　（光照射（ａ）および光照射（ｂ））
　工程（Ａ）では、光照射（ａ）が行われる。光照射（ａ）は、光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射である。光照射（ａ）は、光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）、並びに青色ＬＥＤを用いた光照射（ＶＩ）から選択される少なくとも１種の光照射であることが好ましい。
　工程（Ｂ）では、光照射（ｂ）が行われる。光照射（ｂ）は、光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射である。なお、前記青色光を含むＬＥＤと、赤色光を含むＬＥＤとは、別のＬＥＤであっても、同一のＬＥＤであってもよい。すなわち、例えば、青色光を含むＬＥＤおよび赤色光を含むＬＥＤとして、青色光と、赤色光とを含む、白色ＬＥＤを用いることができる。光照射（ｂ）は、光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、並びに青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）から選択される少なくとも１種の光照射であることが好ましい。
　なお、光照射（ａ）において、光照射（Ｉ）を行う場合には、少なくとも青色光を含む白色ＬＥＤが用いられ、光照射（ｂ）において、光照射（Ｉ）を行う場合には、少なくとも青色光と、赤色光とを含む白色ＬＥＤが用いられ、光照射（ｂ）において光照射（ＩＩ）を行う場合には、少なくとも赤色光を含む白色ＬＥＤが用いられる。
　本発明では、光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射である。なお、「異なる光源を用いた光照射」とは、「光照射（ａ）と光照射（ｂ）とでは、少なくとも一部の光源として、発光波長が異なる光源（ＬＥＤ）を用いた光照射が行われること」および「光照射（ａ）において発光波長が異なる複数の光源を同時に用いた光照射が行われ、光照射（ｂ）において発光波長が異なる複数の光源を同時に用いた光照射が行われ、光照射（ａ）と光照射（ｂ）とに用いられる光源（発光波長）の組み合わせが同じである場合において、光照射（ａ）における、各光源の強度比と、光照射（ｂ）における、各光源の強度比とが異なる光照射が行われること」の少なくとも一方を満たすことを意味する。なお、「異なる光源を用いた光照射」とは、光源の光量や、光源（ＬＥＤ）の本数等が異なることを意味するものではない。
　より詳細には、異なる光源を用いるとは、少なくとも一方の光照射が光源として複数の光源を用いる場合には、光源の少なくとも一部が異なればよい。例えば光照射（ａ）において白色ＬＥＤを用いた場合には、光照射（ｂ）において、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた場合、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた場合も、異なる光源を用いた光照射となる。別の例としては、光照射（ａ）において、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた場合には、光照射（ｂ）において、白色ＬＥＤを用いた場合、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた場合、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた場合も、異なる光源を用いた光照射となる。光照射（ａ）が、青色ＬＥＤと赤色ＬＥＤによる青色光と赤色光を交互に照射する場合は、光照射（ａ）は青色光のみ照射と赤色光のみの照射の組合せであるから、光照射（ｂ）が青色光と赤色光の同時照射であるときは異なる光源による光照射とみなす。
　また、異なる光源を用いる別の例としては、光照射（ａ）および光照射（ｂ）において、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射が行われる場合において、光照射（ａ）では青色ＬＥＤの発光強度が赤色ＬＥＤの発光強度よりも強く、光照射（ｂ）では青色ＬＥＤの発光強度が赤色ＬＥＤの発光強度よりも弱い場合が挙げられる。
　光照射（ａ）で行われる光照射としては、光照射（Ｉ）、光照射（ＩＩ）、光照射（ＩＶ）、光照射（Ｖ）または光照射（ＶＩ）であることが好ましい。光照射（ａ）では、青色光の照射が効果的であり、青色ＬＥＤや白色ＬＥＤを用いることが好ましい。光照射（ａ）としては、制御の容易さの観点から、光照射（Ｉ）、光照射（ＩＩ）、光照射（ＩＶ）または光照射（ＶＩ）であることが好ましい。
　光照射（ｂ）で行われる光照射としては、光照射（ＩＩＩ）、光照射（ＩＶ）または光照射（Ｖ）であることが好ましい。光照射（ｂ）では、青色光および赤色光の照射が効果的であり、赤色ＬＥＤを、青色ＬＥＤや白色ＬＥＤと共に用いることが好ましい。光照射（ｂ）としては、制御の容易さの観点から、光照射（ＩＩＩ）、または光照射（ＩＶ）であることが好ましい。
　青色ＬＥＤとは、ピーク波長が４００～４９０ｎｍのＬＥＤ（発光ダイオード）であり、好ましくはピーク波長が４３０～４７０ｎｍのＬＥＤである。青色ＬＥＤとしては例えば、昭和電工製（ＧＡ２ＲＴ４５０Ｇ）等を用いることができる。
　赤色ＬＥＤとは、ピーク波長が６２０～６９０ｎｍのＬＥＤ（発光ダイオード）であり、好ましくはピーク波長が６４５～６７５ｎｍのＬＥＤである。赤色ＬＥＤとしては例えば、昭和電工製（ＨＲＰ－３５０Ｆ）等を用いることができる。
　白色ＬＥＤとしては、青色ＬＥＤチップと、励起光が青色光であり、発光波長が黄色光である蛍光体とを組み合わせた白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤチップと、励起光が青色光であり、発光波長が黄色光である蛍光体、および発光波長が黄色以外（例えば、赤色、緑色、青緑色）の蛍光体を組み合わせた白色ＬＥＤ、青、赤、緑の各ＬＥＤチップを有する白色ＬＥＤ等を挙げることができる。白色ＬＥＤとしては例えば、日亜化学製（ＮＥＳＷ１４６Ａ）、株式会社ビームテック製（ＬＴＮ４０ＹＤ）等を用いることができる。
　光照射（ａ）および光照射（ｂ）の光量（強度）はそれぞれ、特に限定されないが、例えば光合成有効光量子束密度（Photosynthetic Photon Flux Density：ＰＰＦＤ）が７５０μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上であることが好ましく、１，０００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上であることがより好ましく、１，２００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上であることが特に好ましい。光合成有効光量子束密度の上限としては、特に限定されないが、機器入手の容易さの観点、エネルギー効率の観点から通常は３０，０００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以下、好ましくは２０，０００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以下である。なお、光照射の際に、発光波長の異なる二種類のＬＥＤを同時に用いる場合には、上記光量は、用いたＬＥＤの合計の光量である。
　光照射（ａ）では、光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射が行われる。光照射（ａ）における、波長４００～４９０ｎｍの青色光の光量（ＰＰＦＤ）は、全光量（ＰＰＦＤ）を１００％とすると、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上である。上限としては、特に限定は無いが、１００％であってもよい。光源として青色ＬＥＤを用いた場合には、波長４００～４９０ｎｍの青色光の光量（ＰＰＦＤ）は、通常８０～１００％となる。前記範囲では、光合成微細藻類の細胞数の増加が好適に進むため好ましい。
　光照射（ｂ）では、光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射が行われる。光照射（ｂ）における、波長４００～４９０ｎｍの青色光の光量（ＰＰＦＤ）は、全光量（ＰＰＦＤ）を１００％とすると、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上である。また、光照射（ｂ）における、波長６２０～６９０ｎｍの赤色光の光量（ＰＰＦＤ）は、全光量（ＰＰＦＤ）を１００％とすると、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上である。上限としては、特に限定は無いが、光源として、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた場合には、波長４００～４９０ｎｍの青色光の光量と、波長６２０～６９０ｎｍの赤色光の光量との合計が１００％であってもよい。前記範囲では、光合成微細藻類のキサントフィル含有量が好適に増えるため好ましい。
　工程（Ａ）から、工程（Ｂ）への変化、すなわち、光照射（ａ）から光照射（ｂ）への変化においては、青色光の光量が減少するか、赤色光の光量が増加するかの、少なくとも一方の変化が存在することが好ましく、両方の変化が存在することがより好ましい。前記変化が存在すると、光照射（ａ）で光合成微細藻類の細胞数の増加が進み、光照射（ｂ）でキサントフィル含有量が好適に増えるため好ましい。
　光照射（ａ）から光照射（ｂ）への変化において、青色光の光量が減少する場合には、光照射（ｂ）において照射される全光線の光量中の青色光の割合が、光照射（ａ）において照射される全光線の光量中の青色光の割合から、３％以上減少することが好ましく、３０％以上減少することがより好ましくし、４０％以上減少することが特に好ましい。
　光照射（ａ）から光照射（ｂ）への変化において、赤色光の光量が増加する場合には、光照射（ｂ）において照射される全光線の光量中の赤色光の割合が、光照射（ａ）において照射される全光線の光量中の赤色光の割合から、１０％以上増加することが好ましく、１５％以上増加することがより好ましくし、２５％以上増加することが特に好ましい。
　また、前記光照射（ｂ）における青色光の光量と、前記光照射（ａ）における青色光の光量との差をΔＢ（光照射（ｂ）における青色光の光量－光照射（ａ）における青色光の光量）とし、前記光照射（ｂ）における赤色光の光量と、前記光照射（ａ）における赤色光の光量との差をΔＲ（光照射（ｂ）における赤色光の光量－光照射（ａ）における赤色光の光量）としたとき、ΔＲ－ΔＢ＞０であることが、キサントフィル含有量の観点から好ましい。
　なお、光照射（Ｖ）を行った場合には、赤色ＬＥＤを用いて光照射を行っている際には、青色光の光量は、０％となり、青色ＬＥＤを用いて光照射を行っている際には、赤色光の光量は、０％となる。光照射（Ｖ）を行う場合には、光照射（Ｖ）を行っている際の、青色ＬＥＤを用いた光照射の時間と、赤色ＬＥＤを用いた光照射の時間とが、後述の範囲になればよい。
　光合成有効光量子束密度が前記範囲内では、光量が充分であるため、効率的に光合成微細藻類の増殖およびキサントフィルの生成が可能であり好ましい。なお、キサントフィルを充分含有していない光合成微細藻類に高い光合成有効光量子束密度で光照射を行うと、細胞数が増える前に細胞にダメージが起こり、死滅することがあるが、本発明の培養方法は、上述のようにキサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類を用いるため、高い光合成有効光量子束密度で光照射を行っても、細胞数が増え好ましい。
　なお、光照射（ａ）および光照射（ｂ）の光量は、同じであっても、異なっていてもよい。工程（Ａ）の中で光照射（ａ）の光量は、制御の容易さの観点から一定であってもよく、細胞密度に応じて最適な光量に制御されるように変動させてもよい。また、工程（Ｂ）の中で光照射（ｂ）の光量は、制御の容易さの観点から一定であってもよく、細胞密度に応じて最適な光量に制御されるように変動させてもよい。
　各光照射（光照射（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ））において、発光波長の異なる二種類のＬＥＤを同時に用いる場合における光量（強度）の比としては特に制限は無い。光照射に用いる任意の色のＬＥＤをＸ色ＬＥＤとし、光照射に用いるＸ色ＬＥＤとは異なる発光波長のＬＥＤをＹ色ＬＥＤとすると、Ｘ色ＬＥＤとＹ色ＬＥＤとの強度比（光合成有効光量子束密度の比）は、通常１：２０～２０：１であり、好ましくは１：１５～１５～１であり、より好ましくは１：１０～１０：１である。
　光照射（Ｖ）は、前述のように青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射である。すなわち、光照射（Ｖ）では、青色ＬＥＤを用いた光照射と赤色ＬＥＤを用いた光照射とを交互に行う。光照射（Ｖ）では、各ＬＥＤを用いた光照射が、それぞれ一定期間別個独立に行われる。
　光照射（Ｖ）では、青色ＬＥＤを用いた光照射および赤色ＬＥＤを用いた光照射をそれぞれ少なくとも１回行われる。青色ＬＥＤを用いた光照射をＩBとし、赤色ＬＥＤを用いた光照射をＩRとすると、光照射（Ｖ）としては、例えば、ＩB、ＩRの順で、それぞれ１回行われる光照射、またはＩB、ＩRの順で行われる光照射を１ステップとし、少なくとも一回該ステップが行われる光照射が挙げられる。
　光照射（Ｖ）では、ＩBを行う時間と、ＩRを行う時間との比としては特に限定は無い。光照射（ａ）として、光照射（Ｖ）を行う場合には、ＩBを行う時間と、ＩRを行う時間との比（ＩB：ＩR）は、通常は１：１～２５０：１である。また、光照射（ｂ）として、光照射（Ｖ）を行う場合には、ＩBを行う時間と、ＩRを行う時間との比（ＩB：ＩR）は、通常は１：１～１：２５０である。
　なお、前記ＩBを行う時間は、青色ＬＥＤを用いた光照射を複数回行う場合には、工程（Ａ）または工程（Ｂ）で行われる青色ＬＥＤを用いた光照射の合計時間を意味し、前記ＩRを行う時間は、赤色ＬＥＤを用いた光照射を複数回行う場合には、工程（Ａ）または工程（Ｂ）で行われる赤色ＬＥＤを用いた光照射の合計時間を意味する。
　なお、光照射（ａ）は、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される少なくとも１種の光照射であるが、光照射（ａ）は、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される１種の光照射であってもよく、光照射（ａ）は、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される２種以上の光照射であってもよい。光照射（ａ）としては、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される１種の光照射であることが、制御の容易さの観点から好ましい。
　光照射（ａ）が、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される２種以上の光照射であるとは、光照射（Ｉ）～（ＶＩ）から選択される２種以上の光照射を同時に行う態様、順番に行う態様等が挙げられる。
　なお、光照射（ｂ）は、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される少なくとも１種の光照射であるが、光照射（ｂ）は、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される１種の光照射であってもよく、光照射（ｂ）は、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される２種以上の光照射であってもよい。光照射（ｂ）としては、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される１種の光照射であることが、制御の容易さの観点から好ましい。
　光照射（ｂ）が、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される２種以上の光照射であるとは、光照射（Ｉ）～（Ｖ）から選択される２種以上の光照射を同時に行う態様、順番に行う態様等が挙げられる。
　なお、前述のように本発明では、光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射であるが、光照射（ａ）および光照射（ｂ）の少なくとも一方において、前記２種以上の光照射が行われた場合には、光照射（ａ）および光照射（ｂ）において、一部でも異なる光源を用いればよい。例えば、光照射（ａ）において、光照射（Ｉ）および光照射（ＩＩ）が行われる場合には、光照射（ｂ）が、光照射（Ｉ）のみである場合、光照射（ＩＩ）のみである場合、光照射（Ｉ）と光照射（ＩＩＩ）または（ＩＶ）とを行った場合、光照射（ＩＩ）と、光照射（ＩＩＩ）または（ＩＶ）とを行った場合等は、異なる光源を用いた光照射となる。
　また、前記のように光照射（ａ）と光照射（ｂ）において、ともに光照射（ＩＶ）を行う場合であって、光照射（ａ）と光照射（ｂ）とでは青色ＬＥＤと赤色ＬＥＤの発光強度が異なる場合も、異なる光源を用いたとみなす。
　以下、工程（Ａ）、工程（Ｂ）を行う際の、光照射（ａ）、光照射（ｂ）以外の条件について説明する。
　（培地）
　本発明の光合成微細藻類の培養方法に用いる培地としては、特に制限がない。
　培地としては、通常は、光合成微細藻類の増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）などを含む、液体状の培地が用いられる。
　培地としては、具体的には、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（藻類研究法　千原光雄・西澤一俊編、共立出版（１９７９）を参照）、ＯＨＭ培地、ＢＧ－１１培地およびこれらの改変培地などが用いられる。
　細胞数増加工程（Ａ）では、光合成微細藻類の細胞数が増加、すなわち増殖する。細胞数増加工程（Ａ）で用いる培地としては、増殖に適した窒素源となる成分を添加した培地、例えば窒素濃度が、０．０３ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０３～０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～０．５ｇ／Ｌの培地を用いることが好ましい。
　前記範囲では、細胞数の増加を効率的に行うことができ、且つ、工程（Ｂ）において工程（Ａ）で用いた培地をそのまま使用した場合でも、光合成微細藻類が有するキサントフィル含有量を充分に増加させることができるため好ましい。
　なお、工程（Ｂ）においても、通常は培地を用いるが、工程（Ｂ）に用いる培地としては、工程（Ａ）で用いた培地をそのまま使用してもよく、培地を変更してよい。工程（Ｂ）に用いる培地としては、光合成微細藻類が有するキサントフィル含有量を、増加させる観点から、窒素源となる成分をほとんど含まない培地、例えば窒素濃度が、０．０２ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ未満の培地を用いることが好ましい。
　なお、工程（Ａ）で用いた培地をそのまま使用する場合には、工程（Ａ）において細胞数の増加が停止、あるいはほぼ停止した時点で、培地に含まれる窒素濃度は通常０．０２ｇ／Ｌ未満となる。また、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とで培地を変更する場合には、工程（Ｂ）において、上記窒素濃度の培地を採用すればよい。
　前記範囲では、工程（Ｂ）において、光合成微細藻類が有するキサントフィル含有量を充分に増加させることができるため好ましい。
　（培養条件）
　工程（Ａ）および工程（Ｂ）における培養条件には、特に制限はなく、一般に、光合成微細藻類の培養に用いられる温度、ｐＨが用いられる。
　光合成微細藻類の培養は、例えば１５～３５℃で行われ、好ましくは２０～３０℃で行われ、より好ましくは２２～２８℃で行われる。培養中のｐＨは、６．０～１０．０に保たれることが好ましく、７．０～９．０に保たれることがより好ましい。
　工程（Ａ）および工程（Ｂ）では、二酸化炭素が供給されることが好ましい。二酸化炭素は、１～５Ｖ／Ｖ％濃度の二酸化炭素を含有するガスを、例えば、０．２～２ｖｖｍとなるように吹き込むことで供給される。なお、二酸化炭素を含有するガスとしては、二酸化炭素と空気とを混合したガスや、二酸化炭素と窒素ガスとを混合したガスを用いることができる。
　扁平培養瓶等の扁平培養槽を用いる場合、前記二酸化炭素の供給により、培養液が撹拌され、微細藻類に対して光照射が均一に行われる。なお、培養液の撹拌は、別途撹拌機を用いて行ってもよい。
　（培養装置）
　工程（Ａ）および工程（Ｂ）に用いられる培養装置は、光合成微細藻類、通常は光合成微細藻類を含む培養液に光照射できる装置であればよく、特に制限は無いが、通常は二酸化炭素を含有するガスを供給可能なラインを有する。
　培養装置としては、例えば、小スケールの場合は、扁平培養瓶、大スケールの場合は、ガラス製、プラスチック製などの透明板で構成された扁平培養槽、照明器を備えた撹拌機つきのタンク型培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、密閉容器が好ましく用いられる。
　（培養方法）
　本発明の光合成微細藻類の培養方法では、上記培地、培養条件、培養装置などを適宜選択して組合せ、工程（Ａ）および工程（Ｂ）を行う。工程（Ａ）および工程（Ｂ）を行う方法としては、大きく分けて二つの方法がある。一つ目の方法は、工程（Ａ）および工程（Ｂ）を同一の培地で行う方法、すなわち、一段階培養法である。二つ目の方法は、工程（Ａ）を行った後、光合成微細藻類と、培地とを分離し、分離された光合成微細藻類と、新たな培地とを用いて工程（Ｂ）を行う方法、すなわち、二段階培養法である。前記一段階培養法は、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とで培地が同じであるため、操作が容易であり、また、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とが連続的に行われるため、雑菌の混入が起きづらいため好ましい。前記二段階培養法は、工程（Ａ）、工程（Ｂ）のそれぞれにおいて、最適な培地を選択できる点で好ましい。前記一段階培養法は、連続培養には不向きであり、通常は回分式の培養として行われる。
　（生産性および培養液）
　本発明の光合成微細藻類の培養方法は、工程（Ａ）、工程（Ｂ）を有するため、従来よりも効率的にキサントフィルを得ることが可能である。
　具体的には、工程（Ｂ）により得られた光合成微細藻類の培養液１Ｌ当たりの、キサントフィルの量（ｍｇ）を工程（Ａ）および（Ｂ）が行われる合計の期間（ｄａｙ）で除した、キサントフィルの生産性（ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））が、好ましくは２０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以上であり、より好ましくは３０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以上であり、特に好ましくは４０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以上である。生産性としては、高いほど好ましく、その上限としては特に制限は無いが、本発明の培養方法では、キサントフィルの生産性は、通常は１００ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以下である。
　本発明の光合成微細藻類の培養方法では、通常液体状の培地を用いるため、光合成微細藻類の培養液が得られる。本発明の培養方法で得られる光合成微細藻類の培養液は、培養液１Ｌあたり、好ましくはキサントフィル含有量が３００ｍｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは４００ｍｇ／Ｌ以上であり、特に好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以上である。キサントフィル含有量としては、高いほど好ましく、その上限としては特に制限は無いが、得られる光合成微細藻類の培養液のキサントフィル含有量は、通常は１０００ｍｇ／Ｌ以下である。
　本発明の光合成微細藻類の培養方法で得られる光合成微細藻類は、キサントフィルを乾燥質量換算で４～１５質量％含むことが好ましく、５～１２質量％以上含むことがより好ましい。
　（キサントフィルの回収）
　本発明の光合成微細藻類の培養方法では、キサントフィルが光合成微細藻類内に蓄積されている。このため、キサントフィルの回収は、光合成微細藻類を回収した後、従来公知の方法を始め、特に制限なく、光合成微細藻類から回収される。光合成微細藻類からキサントフィルを回収する方法としては、例えば、機械的に光合成微細藻類を破壊した後、有機溶媒、超臨界二酸化炭素により抽出する方法が挙げられる。
　次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　（光合成微細藻類）
　光合成微細藻類として、ヘマトコッカス・ラクストリスＮＩＥＳ－１４４株を用いた。
　（培養液中のアスタキサンチン濃度の測定）
　所定量の培養液をバイオマッシャーＩＶ（株式会社ニッピ製）にとり、アセトンを加えてＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（フナコシ株式会社製）で細胞を破砕しアスタキサンチンを抽出した。
　遠心分離後、上澄を適宜アセトンで希釈したのち、４７４ｎｍにおける吸光度を測定し、アスタキサンチンのアセトン中での吸光係数（Ａ1%＝２，１００）から、培養液中のアスタキサンチン濃度（ｍｇ／Ｌ）を算出した。
　（乾燥藻体質量の測定）
　所定量の培養液を、あらかじめ恒温乾燥器で恒量としておいたＧＳ２５ガラス繊維ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製）を用いて吸引濾過し、イオン交換水で洗浄したのち、１０５℃の恒温乾燥器で２時間乾燥した。その後、デシケーター中で室温まで冷却したのち、その質量を測定することにより、培養液中の乾燥藻体質量（ｍｇ／Ｌ）を求めた。
　（細胞内のアスタキサンチン濃度の算出）
　前記培養液中のアスタキサンチン濃度（ｍｇ／Ｌ）を、培養液中の乾燥藻体質量（ｍｇ／Ｌ）で除することにより、細胞内のアスタキサンチン濃度（質量％）（乾燥質量換算）を算出した。
　（培養液中の全窒素濃度（ｍｇ／Ｌ）の測定）
　所定量の培養液から遠心分離により細胞を沈殿として除いた上澄を作製し、この上澄中の全窒素濃度を全窒素測定試薬キット１４３Ｃ１９１（東亜ディーケーケー株式会社製）、ポータブル簡易全窒素・全りん計ＴＮＰ－１０（東亜ディーケーケー株式会社製）を用いて測定した。
　（細胞数の測定）
　所定量の培養液の細胞数を、改良ノイバウエル血球計算盤を用いて、顕微鏡下で細胞数をカウントすることにより、培養液中の細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を算出した。
　〔実施例１〕
　１．０Ｌ容量扁平培養瓶（フラスコ厚　約３８ｍｍ　ただしガラス厚を含む）に表１に示す培地を４００ｍｌ入れ、オートクレーブ滅菌後、シスト化したヘマトコッカス・ラクストリスＮＩＳＥ－１４４を０．５０ｇ／Ｌとなるように接種した。接種したヘマトコッカス・ラクストリスＮＩＳＥ－１４４の、乾燥質量あたりのアスタキサンチン含有量は４．８質量％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜工程Ａ＞
　扁平培養瓶の両面から青色ＬＥＤ（昭和電工製、ＧＡ２ＲＴ４５０Ｇ）（発光波長として、波長４００～４９０ｎｍの青色光をＰＰＦＤ換算で９８％含む）を用いて光照射（光照射（ａ））しながら、培養瓶の底面から３Ｖ／Ｖ％二酸化炭素を含む空気を０．５ｖｖｍで通気することにより撹拌し、２５℃で培養を行った。
　照射する光の強さは光量子計（ＬＩ－ＣＯＲ社製、ＬＩ－２５０Ａ）を用いて扁平培養瓶の表面で測定を行い、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）が両面合計で１，３００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）になるように調整した。
　光照射を開始してから５日目で、培養液中の全窒素濃度が、２０ｍｇ／Ｌ未満となった。この時点で、細胞数の増加に必要な窒素源が充分に消費されたと判断した。
＜工程Ｂ＞
　次いで、ＰＰＦＤは変えずに、光源を青色ＬＥＤから、白色ＬＥＤ（株式会社ビームテック製、ＬＴＮ４０ＹＤ）（発光波長として、波長４００～４９０ｎｍの青色光をＰＰＦＤ換算で１９％含み、波長６２０～６９０ｎｍの赤色光をＰＰＦＤ換算で１４％含む）および赤色ＬＥＤ（昭和電工製、ＨＲＰ－３５０Ｆ）（発光波長として、波長６２０～６９０ｎｍの赤色光をＰＰＦＤ換算で９６％含む）（光量子束密度の比が５：１）へ変更（実施例１‐１）、あるいは青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が１：１）へと変更（実施例１‐２）し（光照射（ｂ））、培養開始後１２日間（光源を変更後７日間）培養を行った。
　培養液は適宜サンプリングを行い、ｐＨ、培養液中の細胞数、培養液中のアスタキサンチン濃度、培養液中の乾燥藻体質量、および培養液中の全窒素濃度の測定を行った。測定した培養液中のアスタキサンチン濃度、培養液中の乾燥藻体質量から、細胞内のアスタキサンチン濃度の算出を行った。ｐＨは全培養期間中を通じて７．５～８．５であった。
　培養液中の細胞数、培養液中のアスタキサンチン濃度、培養液中の乾燥藻体質量については培養終了後、実験開始当初の培養液量、実験終了時の扁平培養瓶に残った培養液量、途中でサンプリングした培養液量から計算により通気撹拌により蒸発した水分を求め、期間中一定速度で水分が蒸発したと考えて値を補正した。
　培養液中の全窒素濃度の経時変化、培養液中の細胞数の経時変化、培養液中のアスタキサンチン濃度の経時変化、細胞内のアスタキサンチン濃度の経時変化を、それぞれ図１、図２、図３および図４に示す。
　培養液中の窒素は５日目までには消費された。細胞数は４日目まで増殖を示し、その後はほぼ一定、あるいは微増を示し１２日目の細胞数は、実施例１‐１、１‐２とも約８×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養液中のアスタキサンチン濃度は５日目で約１２０ｍｇ／Ｌであり、その後、実施例１‐１、１‐２とも増加し、１２日目で実施例１‐１で５３０ｍｇ／Ｌ（アスタキサンチンの生産性：４４ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））、実施例１‐２で５４０ｍｇ／Ｌ（アスタキサンチンの生産性：４５ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））となった。細胞内のアスタキサンチン濃度は培養開始当初４．８質量％であり、３日目で最も低い２．９質量％へと減少したが、その後上昇に転じ、１２日目で実施例１‐１で７．１質量％、実施例１‐２で８．４質量％となった。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔比較例１〕
　扁平培養瓶の両面からＰＰＦＤが両面合計で１，３００μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）となるように白色ＬＥＤ（比較例１‐１）あるいは青色ＬＥＤ（比較例１‐２）を用いて光照射し、途中で光源を変更しなかった以外は実施例１と同様にして培養を行った。
　培養液中の全窒素濃度の経時変化、培養液中の細胞数の経時変化、培養液中のアスタキサンチン濃度の経時変化、細胞内のアスタキサンチン濃度の経時変化を、それぞれ図１、図２、図３および図４に示す。
　培養液中の窒素は５日目までには消費された。細胞数は４日目まで増殖を示し、その後はほぼ一定となり１２日目の細胞数は、比較例１‐２で約７×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、比較例１‐１で約３．８×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった。比較例１‐１では比較例１‐２の半分程度の細胞数であった。
　培養液中のアスタキサンチン濃度は５日目で、比較例１‐２で約１２０ｍｇ／Ｌ、比較例１‐１白色で約１６０ｍｇ／Ｌであった。その後、比較例１‐１、１‐２とも徐々に増加し、１２日目で比較例１‐２で２４５ｍｇ／Ｌ（アスタキサンチンの生産性：２０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））、比較例１‐１で３３０ｍｇ／Ｌ（アスタキサンチンの生産性：２８ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））となった。細胞内のアスタキサンチン濃度は培養開始当初４．８質量％であり、３日目で最も低い比較例１‐２で２．９質量％、比較例１‐１で２．７質量％へと減少したが、その後上昇に転じ、１２日目で比較例１‐２で７．１質量％、比較例１‐１で７．０質量％となった。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔実施例２〕
　培養開始時に用いる光照射（ａ）の光源を青色ＬＥＤから白色ＬＥＤに変更した以外は実施例１と同様にして培養を行った。
　なお、光照射開始から５日経過後、光照射（ｂ）の光源を白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が５：１）へ変更した実施例を実施例２‐１とし、光源を青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が１：１）へ変更した実施例を実施例２‐２とした。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔実施例３〕
　培養開始時に用いる光照射（ａ）の光源を、青色ＬＥＤから白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤ（光量子束密度の比が５：１）に変更した以外は実施例１と同様にした培養を行った。
　なお、光照射開始から５日経過後、光照射（ｂ）の光源を白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が５：１）へ変更した実施例を実施例３‐１とし、光源を青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が１：１）とした実施例を実施例３‐２とした。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔実施例４〕
　培養開始時に用いる光照射（ａ）の光源を、青色ＬＥＤから青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤ（光量子束密度の比が１：１）に変更した以外は実施例１‐１と同様にして培養を行った。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔実施例５〕
　光照射開始から５日経過後に用いる光照射（ｂ）の光源を、白色ＬＥＤに変更した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
　〔実施例６〕
　実施例１において、培養開始から５日間行った青色ＬＥＤを用いた光照射（ａ）を、培養開始から４日間行われる、青色ＬＥＤを用いた２１時間の光照射と、赤色ＬＥＤを用いた０．１時間の光照射とを、交互に連続して行う光照射に変更し、光源を青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤへ変更するのを、光照射開始から５日経過後から、４日経過後に変更し、光源変更後の光照射を７日間から８日間に変更した以外は、実施例１‐２と同様にして培養を行った（実施例６‐１）。
　実施例１において、培養開始から５日間行った青色ＬＥＤを用いた光照射（ａ）を、培養開始から４日間行われる、青色ＬＥＤを用いた９２時間の光照射と、赤色ＬＥＤを用いた４時間の光照射とを、交互に行う光照射に変更し、光源を青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤへ変更するのを、光照射開始から５日経過後から、４日経過後に変更し、光源変更後の光照射を７日間から８日間に変更した以外は、実施例１‐２と同様にして培養を行った（実施例６‐２）。
　光源の種類、培養１２日後の培養液中のアスタキサンチン濃度、アスタキサンチンの生産性を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　上述の各実施例、比較例で使用した各光源の青色光、赤色光の割合、各実施例、比較例の工程Ａ、Ｂにおける、各光源間の光量子束密度の比に基づき、各実施例、比較例における光照射（ａ）、光照射（ｂ）における、青色光の割合（％）および赤色光の割合（％）を算出し、ΔＢ、ΔＲ、ΔＲ－ΔＢを算出し、各実施例の培養後の培養液中のアスタキサンチン濃度（ｍｇ／Ｌ）（表３中でＡｘ濃度と表記）と共に、表３に示した。
　なお、各実施例、比較例では、工程Ａと工程Ｂとで、ＰＰＦＤは変えていないため、前記青色光の割合（％）および赤色光の割合（％）の増減が、光量の増減と一致し、ΔＲ－ΔＢの大小関係は、具体的な光量で求めても、割合で求めても一致する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (10)

  1. 　キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類に、光照射（ａ）を行う細胞数増加工程（Ａ）および、前記細胞数増加工程（Ａ）が行われた光合成微細藻類に、光照射（ｂ）を行う光合成微細藻類中のキサントフィル含有量を増加させる工程（Ｂ）を含む光合成微細藻類の培養方法であり、
    　前記光照射（ａ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、
    　前記光照射（ｂ）が光源として、波長４００～４９０ｎｍの青色光を含むＬＥＤおよび波長６２０～６９０ｎｍの赤色光を含むＬＥＤを用いた光照射であり、
    　前記光照射（ａ）と光照射（ｂ）とが、異なる光源を用いた光照射である、光合成微細藻類の培養方法。
  2. 　前記光照射（ｂ）における青色光の光量と、前記光照射（ａ）における青色光の光量との差をΔＢとし、前記光照射（ｂ）における赤色光の光量と、前記光照射（ａ）における赤色光の光量との差をΔＲとしたとき、ΔＲ－ΔＢ＞０である、請求項１に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  3. 　前記光照射（ａ）が光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）並びに青色ＬＥＤを用いた光照射（ＶＩ）から選択される少なくとも１種の光照射であり、
    　前記光照射（ｂ）が光源として、白色ＬＥＤを用いた光照射（Ｉ）、白色ＬＥＤおよび青色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩ）、白色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＩＩ）、青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを用いた光照射（ＩＶ）、並びに青色ＬＥＤおよび赤色ＬＥＤを交互に用いた光照射（Ｖ）から選択される少なくとも１種の光照射である、請求項１または２に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  4. 　前記工程（Ａ）で用いられる、キサントフィルを含むシスト化した光合成微細藻類が、キサントフィルを乾燥質量換算で３～９質量％含むシスト化した光合成微細藻類である、請求項１～３のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  5. 　前記工程（Ａ）および工程（Ｂ）において、光合成微細藻類のキサントフィル含有量を、乾燥質量換算で２質量％以上保つ、請求項１～４のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  6. 　前記光照射（ａ）および光照射（ｂ）において、光合成有効光量子束密度が、７５０μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  7. 　前記工程（Ａ）が３～７日間行われ、前記工程（Ｂ）が４～１０日間行われ、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とを合わせて７～１７日間行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  8. 　工程（Ｂ）により得られた光合成微細藻類の培養液１Ｌ当たりの、キサントフィルの量（ｍｇ）を工程（Ａ）および（Ｂ）が行われる合計の期間（ｄａｙ）で除した、キサントフィルの生産性（ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ））が、２０ｍｇ／（Ｌ・ｄａｙ）以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  9. 　前記キサントフィルがアスタキサンチンであり、光合成微細藻類が、ヘマトコッカス属の緑藻類である、請求項１～８のいずれか一項に記載の光合成微細藻類の培養方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の培養方法により得られたキサントフィル含有量が３００ｍｇ／Ｌ以上である光合成微細藻類の培養液。
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