CN109642203A - 光合成微藻类的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够比以往更有效地获得叶黄素的光合成微藻类的培养方法。本发明的培养方法是包括细胞数增加工序(A)和增加光合成微藻类中的叶黄素含量的工序(B)的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)是对包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类进行光照射(a)的工序，所述工序(B)是对进行了所述细胞数增加工序(A)的光合成微藻类进行光照射(b)的工序，所述光照射(a)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射，所述光照射(b)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射，所述光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射。

Description

光合成微藻类的培养方法
技术领域
本发明涉及包含叶黄素的光合成微藻类的培养方法。
背景技术
现在叶黄素用于各种用途。
已知作为叶黄素的一种的虾青素是红色的类胡萝卜素的一种，具有强大的抗氧化作用。因此，虾青素在食用色素、化妆品、健康食品等中使用。
虾青素也能够化学合成，但天然来源的虾青素被广泛使用。天然来源的虾青素从磷虾、北极甜虾等虾类、红发夫酵母(phaffia rhodozyma)、藻类等中提取。
已知虾类或红发夫酵母的虾青素含量低。因此，研究了通过培养藻类来获得虾青素的方法。已知藻类、例如红球藻属适应氮源枯竭、强光这样的外部环境变化(胁迫)而胞囊化，在藻体内蓄积虾青素。现在利用商用化的红球藻属的虾青素生产中，采取利用蓄积虾青素之前的具有绿色鞭毛的游动孢子状的细胞(green stage，绿色细胞阶段)增加细胞数，然后通过胁迫使胞囊细胞(red stage，红色细胞阶段)细胞内蓄积虾青素的方法。然而已知该游动细胞的培养中维持喜好弱光条件等培养环境是困难的(例如，参照非专利文献1)。
另外，作为通过培养红球藻属等藻类来获得虾青素的方法进行了各种研究(例如，参照专利文献1～4)。
例如，专利文献1中公开了由光合成微藻类制造叶黄素的方法，包括：将含有叶黄素的光合成微藻类接种在营养培养基中使其增殖的工序，使增殖而得的微藻类胞囊化的工序。
专利文献2中公开了对胞囊化了的绿藻以25000μmol/(m3·s)以上的光合成有效光光量子通量进行光照射的绿藻的制造方法。
专利文献3中公开了对藻类分别独立地重复照射红色光照明光和蓝色光照明光的藻类的培养方法。
专利文献4中公开了在培养藻类在藻体内生产虾青素时联合使用蓝色LED和红色LED来进行虾青素生产培养期间的光照射。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2005/116238号
专利文献2：日本特开2007-97584号公报
专利文献3：国际公开2013/021675号
专利文献4：国际公开2015/151577号
非专利文献
非专利文献1：北村晃利以及另外2人，“Haematococcus属緑藻によるアスタキサンチンの商業生産(利用红球藻属绿藻的虾青素的商业生产)”、生物工学、公益社团法人日本生物工学会、2015年、第93卷第7号383-387页
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1～4中，为了有效获得虾青素等叶黄素进行了各种研究，但要求能够更有效地获得叶黄素的光合成微藻类的培养方法。
因此，本发明的目的是提供能够比以往更有效地获得叶黄素的光合成微藻类的培养方法。
用于解决课题的手段
本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过对胞囊化了的光合成微藻类以特定的模式进行光照射，能够解决上述课题。
即，涉及本发明的例如以下[1]～[10]。
[1]光合成微藻类的培养方法，是包括细胞数增加工序(A)和增加光合成微藻类中的叶黄素含量的工序(B)的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)是对包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类进行光照射(a)的工序，所述工序(B)是对进行了所述细胞数增加工序(A)的光合成微藻类进行光照射(b)的工序，
所述光照射(a)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射，
所述光照射(b)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射，
所述光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射。
[2]根据[1]所述的光合成微藻类的培养方法，将所述光照射(b)中的蓝色光的光量与所述光照射(a)中的蓝色光的光量之差作为ΔB、将所述光照射(b)中的红色光的光量与所述光照射(a)中的红色光的光量之差作为ΔR时，ΔR-ΔB＞0。
[3]根据[1]或[2]所述的光合成微藻类的培养方法，所述光照射(a)是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)、以及使用蓝色LED的光照射(VI)中的至少1种光照射，
所述光照射(b)是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、以及交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)中的至少1种光照射。
[4]根据[1]～[3]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)中使用的包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，是包含以干燥质量换算计为3～9质量％的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类。
[5]根据[1]～[4]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，在所述工序(A)和工序(B)中，将光合成微藻类的叶黄素含量保持在以干燥质量换算计为2质量％以上。
[6]根据[1]～[5]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，在所述光照射(a)和光照射(b)中，光合成有效光量子通量密度为750μmol/(m2·s)以上。
[7]根据[1]～[6]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)进行3～7天，所述工序(B)进行4～10天，工序(A)与工序(B)合计进行7～17天。
[8]根据[1]～[7]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，叶黄素的生产率(mg/(L·天))为20mg/(L·天)以上，所述叶黄素的生产率是通过工序(B)获得的光合成微藻类的培养液每1L的叶黄素的量(mg)除以进行工序(A)和(B)的合计时间(天)而得的。
[9]根据[1]～[8]的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述叶黄素是虾青素，所述光合成微藻类是红球藻属的绿藻类。
[10]光合成微藻类的培养液，是通过[1]～[9]的任一项所述的培养方法获得的，叶黄素含量为300mg/L以上。
发明的效果
提供能够比以往更有效地获得叶黄素的光合成微藻类的培养方法。
附图说明
图1显示实施例1、比较例1的培养液中的总氮浓度的经时变化。
图2显示实施例1、比较例1的培养液中的细胞数的经时变化。
图3显示实施例1、比较例1的培养液中的虾青素浓度的经时变化。
图4显示实施例1、比较例1的细胞内的虾青素浓度的经时变化。
具体实施方式
接下来对于本发明进行具体说明。
本发明的光合成微藻类的培养方法包括：对包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类进行光照射(a)的细胞数增加工序(A)，和对进行了所述细胞数增加工序(A)的光合成微藻类进行光照射(b)的增加光合成微藻类中的叶黄素含量的工序(B)。本发明中，所述光照射(a)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射，所述光照射(b)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射，所述光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射。以下对于本发明进行详细说明。
(包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类)
本发明中使用包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类。作为本发明中使用的光合成微藻类，只要包含叶黄素，并进行了胞囊化即可。
(光合成微藻类)
作为本发明中使用的光合成微藻类，只要是具有生产叶黄素的能力，能够胞囊化，并且能够进行光合成的藻类，就不特别限制。作为光合成微藻类，绿藻类从叶黄素的生产率的观点考虑是优选的。
作为绿藻类，优选使用例如，属于红球藻属(Haematococcus)的绿藻类。作为红球藻属的绿藻类，可列举雨生红球藻(H.pluvialis)、湖泊红球藻(H.lacustris)、海角红球藻(H.capensis)、Haematococcus droebakensi(H.droebakensi)、Haematococcuszimbabwiensis(H.zimbabwiensis)等。
作为雨生红球藻(H.pluvialis)，可列举委托美国德克萨斯大学藻类保藏设施保藏的UTEX2505株、保藏于丹麦的哥本哈根大学的Scandinavian Culture Center forAlgae and Protozoa,Botanical Institute的K0084株等。
作为湖泊红球藻(H.lacustris)，可列举委托独立行政法人国立环境研究所保藏的NIES144株、NIES2263株、NIES2264株、NIES2265株、委托ATCC保藏的ATCC30402株和ATCC30453株或UTEX 16株和UTEX 294株等。
作为海角红球藻(H.capensis)，可列举UTEX LB1023株等。
作为Haematococcus droebakensi(H.droebakensi)，可列举UTEX LB55株。
作为Haematococcus zimbabwiensis(H.zimbabwiensis)，可列举UTEXLB1758株等。
其中，作为光合成微藻类，更优选使用湖泊红球藻、雨生红球藻。
(叶黄素)
叶黄素是类胡萝卜素的一种。作为叶黄素，可列举虾青素、角黄素、玉米黄质、金盏花红素、金盏花黄质、隐黄质等。
本发明的培养方法通过工序(A)而不必使用难以培养的浮游细胞(未胞囊化的光合成微藻类)进行细胞增殖，因此即使在强光的照射下光合成微藻类的细胞数也增加。工序(A)中增加的细胞中已经包含叶黄素，所以在细胞不受损伤的条件下通过工序(B)而各光合成微藻类的各细胞中所具有的叶黄素含量增加，因此，本发明的培养方法能够获得大量的叶黄素。
所得的叶黄素主要根据光合成微藻类的种类而决定，没有特别限定，但从叶黄素的有效活用的观点，优选具有高抗氧化作用的虾青素。作为能够获得虾青素的光合成微藻类，可列举例如，前述的红球藻属的绿藻类，优选湖泊红球藻、雨生红球藻。
(胞囊化)
光合成微藻类中存在例如，通过光照射、营养饥饿状态、氧化物存在等胁迫而在细胞内蓄积叶黄素等，并休眠胞子化的藻类。
将进入该休眠状态称为胞囊化。本发明中，胞囊化也包括从进入休眠状态开始蓄积叶黄素的状态到完全胞囊化成为休眠胞子的状态的任一状态。
(包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类的叶黄素含量)
作为本发明中使用的包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，优选使用以在含有叶黄素的状态下形成子细胞、通过子细胞释放而能够在细胞增殖之后立即通过光照射胁迫而生成叶黄素的方式，以某种程度蓄积叶黄素的光合成微藻类。
具体地，所述工序(A)中使用的、包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，优选为包含以干燥质量换算计为3～9质量％的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类。即，本发明中被光照射的光合成微藻类，优选在就要进行光照射之前的时刻、换言之在光照射(a)开始时刻包含以干燥质量换算计为3～9质量％的叶黄素，在光照射中，叶黄素量变化。获得包含较多叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类一般较难，因而作为包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，更优选包含以干燥质量换算计为3～7质量％的叶黄素。
此外，作为使用包含较多叶黄素、例如包含以干燥质量换算计为超过7质量％且为9质量％以下的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类来实施本发明的制造方法的方法，可以例示通过使用包含以干燥质量换算计为3～7质量％的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类实施本发明的制造方法，从而获得包含以干燥质量换算计为超过7质量％且为9质量％以下的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，使用所得的包含以干燥质量换算计为超过7质量％且为9质量％以下的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，再次实施本发明的制造方法的方法。
此外，光合成微藻类的叶黄素含量可以由使指定量的光合成微藻类干燥后的质量和指定量的光合成微藻类所含的叶黄素含量求出。
〔工序(A)〕
本发明的光合成微藻类的培养方法具有对前述的包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类进行光照射(a)的细胞数增加工序(A)。
工序(A)除了进行后述的光照射(a)以外，可以与例如现有公知的增加光合成微藻类的细胞数时进行的培养方法同样地进行，无特别限制。
例如，作为工序(A)，可列举将包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类接种在培养基中，进行光照射(a)的方法。
工序(A)优选进行3～7天，更优选进行4～6天。此外，工序(A)中，通常总是进行光照射(a)，但在确认工序的进展状况时等也可以短时间不进行光照射(a)。但是，在短时间不进行光照射的情况下，工序(A)中不进行光照射的时间合计优选为工序(A)的5％以下。
作为工序(A)中使用的包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类的量，无特别限制，但相对于后述的培养基每1L，通常为0.05～5g，优选为0.3～2g。在所述范围能够更有效地获得叶黄素，因而优选。
工序(A)中光合成微藻类的细胞数增加。本发明者们推测光合成微藻类的细胞数增加的理由如下。包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类在工序(A)中，一边利用培养基中的营养素一边进行光合成，从而形成包含2～32个子细胞的胞囊细胞。由该细胞释放含有叶黄素的子细胞。这样，考虑在工序(A)中，光合成微藻类的细胞数增加。
〔工序(B)〕
本发明的光合成微藻类的培养方法具有对进行了所述细胞数增加工序(A)的光合成微藻类进行光照射(b)的增加光合成微藻类中的叶黄素含量的工序(B)。工序(B)中，通过进行光照射(b)，各个光合成微藻类中的叶黄素含量增加。
工序(B)除了进行后述的光照射(b)以外，例如，在使现有公知的光合成微藻类的叶黄素含量增加时，可以与促进胞囊化时进行的培养方法同样地进行，无特别限制。
例如，作为工序(B)，可列举在进行工序(A)之后，不取出光合成微藻类而直接进行光照射(b)的方法；在进行工序(A)之后，取出光合成微藻类，然后接种在新的培养基中，进行光照射(b)的方法。
工序(B)优选进行4～10天，更优选进行6～8天。此外，工序(B)中，通常总是进行光照射(b)，但在确认工序的进展状况时等也可以短时间不进行光照射(b)。但是，在短时间不进行光照射的情况下，工序(B)中不进行光照射的时间合计优选为工序(B)的5％以下。
另外，本发明的培养方法中，工序(A)与工序(B)合计优选进行7～17天，更优选进行10～14天。
工序(B)中，光合成微藻类中的叶黄素含量增加。本发明者们推测叶黄素含量增加的理由如下。认为通过工序(A)而细胞数增加了的光合成微藻类在工序(B)中在营养饥饿且光照射的胁迫下进行胞囊化，在光合成微藻类的各细胞内，更多的叶黄素生成并蓄积，因而叶黄素含量增加。
本发明的培养方法中，这样发生光合成微藻类的细胞数增加，以及接着细胞数增加而各细胞内的叶黄素量增加，因此能够有效获得叶黄素。
此外，本发明的培养方法中，在工序(A)和工序(B)中，优选将光合成微藻类的叶黄素含量保持在以干燥质量换算计为2质量％以上，更优选保持在2.5质量％以上，进一步优选保持在2.8质量％以上。即，工序(A)和工序(B)中，为了在含有叶黄素的状态下释放子细胞，不由于光照射的损伤而死灭，能够通过光照射的胁迫而生成叶黄素，优选总是维持光合成微藻类的叶黄素含量优选为以干燥质量换算计为2质量％以上、更优选为2.5质量％以上、进一步优选为2.8质量％以上。此外，工序(A)和工序(B)中，对光合成微藻类的叶黄素含量的上限没有特别限定，但通常以干燥质量换算计为15质量％以下。
本发明的培养方法中，如前所述，工序(A)中细胞数增加，在细胞数增加时，干燥质量换算的光合成微藻类的叶黄素含量降低。通过在细胞数增加的工序(A)中也使得干燥质量换算的光合成微藻类的叶黄素含量为所述范围，能够更有效地获得叶黄素，因而优选。
(光照射(a)和光照射(b))
工序(A)中，进行光照射(a)。光照射(a)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射。光照射(a)优选是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)、以及使用蓝色LED的光照射(VI)中的至少1种光照射。
工序(B)中，进行光照射(b)。光照射(b)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射。此外，所述包含蓝色光的LED与包含红色光的LED可以是分别的LED，也可以是同一LED。即，例如，作为包含蓝色光的LED和包含红色光的LED，可以使用包含蓝色光和红色光的白色LED。光照射(b)优选是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、以及交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)中的至少1种光照射。
此外，在光照射(a)中进行光照射(I)的情况下，使用至少包含蓝色光的白色LED，在光照射(b)中进行光照射(I)的情况下，使用至少包含蓝色光和红色光的白色LED，在光照射(b)中进行光照射(II)的情况下，使用至少包含红色光的白色LED。
本发明中光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射。此外，“使用不同光源的光照射”是指满足“在光照射(a)和光照射(b)中，进行作为至少一部分光源，使用发射波长不同光源(LED)的光照射”和“在光照射(a)中进行同时使用发射波长不同的多种光源的光照射，在光照射(b)中进行同时使用发射波长不同的多种光源的光照射，在光照射(a)和光照射(b)中使用的光源(发射波长)的组合相同的情况下，进行光照射(a)中的各光源的强度比与光照射(b)中的各光源的强度比不同的光照射”的至少一方。此外，“使用不同光源的光照射”并不意味着光源的光量、光源(LED)的个数等不同。
更详细地，所谓使用不同光源，在至少一方的光照射使用多种光源作为光源的情况下，只要光源的至少一部分不同即可。例如在光照射(a)中使用白色LED的情况下，在光照射(b)中使用白色LED和蓝色LED的情况、使用白色LED和红色LED的情况都成为使用不同光源的光照射。作为别的例子，在光照射(a)中使用白色LED和蓝色LED的情况下，在光照射(b)中使用白色LED的情况、使用白色LED和红色LED的情况、使用蓝色LED和红色LED的情况都成为使用不同光源的光照射。在光照射(a)利用蓝色LED和红色LED而交替照射蓝色光和红色光的情况下，由于光照射(a)是仅照射蓝色光和仅照射红色光的组合，因而将光照射(b)同时照射蓝色光和红色光时视为利用不同光源的光照射。
另外，作为使用不同光源的别的例子，在光照射(a)和光照射(b)中进行使用蓝色LED和红色LED的光照射的情况下，可列举在光照射(a)中蓝色LED的发光强度强于红色LED的发光强度，在光照射(b)中蓝色LED的发光强度弱于红色LED的发光强度的情况。
作为光照射(a)中进行光照射，优选为光照射(I)、光照射(II)、光照射(IV)、光照射(V)或光照射(VI)。光照射(a)中，蓝色光的照射是有效的，优选使用蓝色LED、白色LED。作为光照射(a)，从容易控制的观点考虑，优选为光照射(I)、光照射(II)、光照射(IV)或光照射(VI)。
作为光照射(b)中进行的光照射，优选为光照射(III)、光照射(IV)或光照射(V)。光照射(b)中，蓝色光和红色光的照射是有效的，优选将红色LED与蓝色LED、白色LED一起使用。作为光照射(b)，从容易控制的观点考虑，优选为光照射(III)、或光照射(IV)。
蓝色LED是峰波长为400～490nm的LED(发光二极管)，优选为峰波长为430～470nm的LED。作为蓝色LED，例如，可以使用昭和电工制(GA2RT450G)等。
红色LED是峰波长为620～690nm的LED(发光二极管)，优选为峰波长为645～675nm的LED。作为红色LED，例如，可以使用昭和电工制(HRP-350F)等。
作为白色LED，可列举蓝色LED芯片、与激发光为蓝色光、发射波长为黄色光的荧光体组合而成的白色LED；蓝色LED芯片、与激发光为蓝色光、发射波长为黄色光的荧光体、和发射波长为黄色以外(例如，红色、绿色、蓝绿色)的荧光体组合而成的白色LED；具有蓝、红、绿的各LED芯片的白色LED等。作为白色LED，例如，可以使用日亚化学制(NESW146A)、株式会社ビームテック制(LTN40YD)等。
对光照射(a)和光照射(b)的光量(强度)分别不特别限定，例如优选光合成有效光量子通量密度(Photosynthetic Photon Flux Density：PPFD)为750μmol/(m2·s)以上，更优选为1000μmol/(m2·s)以上，特别优选为1200μmol/(m2·s)以上。作为光合成有效光量子通量密度的上限，不特别限定，但从仪器容易获得的观点、能量效率的观点，通常为30000μmol/(m2·s)以下、优选为20000μmol/(m2·s)以下。此外，光照射时同时使用发射波长不同的二种LED的情况下，上述光量为使用的LED的合计光量。
光照射(a)中，进行作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射。光照射(a)中的波长400～490nm的蓝色光的光量(PPFD)，在总光量(PPFD)为100％时，优选为5％以上、更优选为10％以上、进一步优选为15％以上。作为上限，没有特别限定，也可以为100％。在作为光源使用蓝色LED的情况下，波长400～490nm的蓝色光的光量(PPFD)通常成为80～100％。所述范围中，光合成微藻类的细胞数的增加适当地进行，因而优选。
光照射(b)中，进行作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射。光照射(b)中的波长400～490nm的蓝色光的光量(PPFD)，在将总光量(PPFD)作为100％时，优选为5％以上、更优选为10％以上、进一步优选为15％以上。另外，光照射(b)中的、波长620～690nm的红色光的光量(PPFD)，在总光量(PPFD)为100％时，优选为5％以上、更优选为10％以上、进一步优选为15％以上。作为上限，没有特别限定，在使用蓝色LED和红色LED作为光源的情况下，波长400～490nm的蓝色光的光量与波长620～690nm的红色光的光量的合计可以为100％。所述范围中，光合成微藻类的叶黄素含量适当地增加，因而优选。
在从工序(A)向工序(B)的变化、即从光照射(a)向光照射(b)的变化中，优选存在蓝色光的光量减少、或红色光的光量增加的至少一方的变化，更优选存在两方的变化。如果所述变化存在，则光照射(a)中光合成微藻类的细胞数的增加进行，光照射(b)中叶黄素含量适当地增加，因而优选。
在光照射(a)向光照射(b)的变化中蓝色光的光量减少的情况下，优选光照射(b)中照射的总光线的光量中的蓝色光的比例由光照射(a)中照射的总光线的光量中的蓝色光的比例减少3％以上，更优选减少30％以上，特别优选减少40％以上。
在从光照射(a)向光照射(b)的变化中红色光的光量增加的情况下，优选光照射(b)中照射的总光线的光量中的红色光的比例由光照射(a)中照射的总光线的光量中的红色光的比例增加10％以上，更优选增加15％以上，特别优选增加25％以上。
另外，将所述光照射(b)中的蓝色光的光量与所述光照射(a)中的蓝色光的光量之差作为ΔB(光照射(b)中的蓝色光的光量-光照射(a)中的蓝色光的光量)、将所述光照射(b)中的红色光的光量与所述光照射(a)中的红色光的光量之差作为ΔR(光照射(b)中的红色光的光量-光照射(a)中的红色光的光量)时，ΔR-ΔB＞0从叶黄素含量的观点考虑是优选的。
此外，在进行光照射(V)的情况下，使用红色LED进行光照射时，蓝色光的光量成为0％，在使用蓝色LED进行光照射时，红色光的光量成为0％。在进行光照射(V)的情况下，进行光照射(V)时的使用蓝色LED的光照射的时间、与使用红色LED的光照射的时间成为后述的范围即可。
光合成有效光量子通量密度在所述范围内时，光量充分，因而能够有效地进行光合成微藻类的增殖和叶黄素的生成，是优选的。此外，如果对不充分含有叶黄素的光合成微藻类以高的光合成有效光量子通量密度进行光照射，则有时在细胞数增加之前细胞发生损伤而死灭，但本发明的培养方法如上所述使用包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，因此即使以高的光合成有效光量子通量密度进行光照射，细胞数也增加，是优选的。
此外，光照射(a)和光照射(b)的光量既可以相同也可以不同。工序(A)中光照射(a)的光量从容易控制的观点考虑可以是一定的，也可以根据细胞密度而使其变化以控制成最适的光量。另外，工序(B)中光照射(b)的光量从容易控制的观点考虑可以是一定的，也可以根据细胞密度而使其变化以控制成最适的光量。
作为各光照射(光照射(II)、(III)和(IV))中同时使用发射波长不同的二种LED的情况中的光量(强度)的比，无特别限制。如果将用于光照射的任意色的LED作为X色LED、将与用于光照射的X色LED不同发射波长的LED作为Y色LED，则X色LED与Y色LED的强度比(光合成有效光量子通量密度的比)通常为1:20～20:1,优选为1:15～15:1，更优选为1:10～10:1。
光照射(V)如前所述是交替使用蓝色LED和红色LED的光照射。即，光照射(V)中，交替进行使用蓝色LED的光照射和使用红色LED的光照射。光照射(V)中，使用各LED的光照射分别各自独立进行一定时间。
光照射(V)中，将使用蓝色LED的光照射和使用红色LED的光照射分别进行至少1次。如果将使用蓝色LED的光照射作为IB，使用红色LED的光照射作为IR，则作为光照射(V)，可列举例如，以IB、IR的顺序分别进行1次的光照射、或将以IB、IR的顺序进行的光照射作为1步并将该步进行至少一次。
光照射(V)中，作为进行IB的时间与进行IR的时间的比，没有特别限定。在作为光照射(a)进行光照射(V)的情况下，进行IB的时间与进行IR的时间的比(IB:IR)通常为1:1～250:1。另外，在作为光照射(b)进行光照射(V)的情况下，进行IB的时间与进行IR的时间的比(IB:IR)通常为1:1～1:250。
此外，所述进行IB的时间在进行多次使用蓝色LED的光照射的情况下，是指工序(A)或工序(B)中进行的使用蓝色LED的光照射的合计时间，所述进行IR的时间在进行多次使用红色LED的光照射的情况下，是指工序(A)或工序(B)中进行的使用红色LED的光照射的合计时间。
此外，光照射(a)是选自光照射(I)～(VI)的至少1种光照射，但光照射(a)可以是选自光照射(I)～(VI)的1种光照射，光照射(a)也可以是选自光照射(I)～(VI)的2种以上的光照射。作为光照射(a)，选自光照射(I)～(VI)的1种光照射从容易控制的观点考虑是优选的。
所谓光照射(a)为选自光照射(I)～(VI)的2种以上的光照射，可列举将选自光照射(I)～(VI)的2种以上的光照射同时进行的方式、依次进行的方式。
此外，光照射(b)是选自光照射(I)～(V)中的至少1种光照射，但光照射(b)可以是选自光照射(I)～(V)中的1种光照射，光照射(b)也可以是选自光照射(I)～(V)中的2种以上的光照射。作为光照射(b)，选自光照射(I)～(V)中的1种光照射从容易控制的观点考虑是优选的。
所谓光照射(b)为选自光照射(I)～(V)中的2种以上的光照射，可列举将选自光照射(I)～(V)中的2种以上的光照射同时进行的方式、依次进行的方式等。
此外，如前所述本发明中，光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射，但在光照射(a)和光照射(b)的至少一方进行所述2种以上的光照射的情况下，光照射(a)和光照射(b)中只要一部分使用不同光源即可。例如，在光照射(a)中进行光照射(I)和光照射(II)的情况下，光照射(b)仅为光照射(I)的情况、仅为光照射(II)的情况、进行光照射(I)与光照射(III)或(IV)的情况、进行光照射(II)与光照射(III)或(IV)的情况等，成为使用不同光源的光照射。
另外，如前所述在光照射(a)和光照射(b)中都进行光照射(IV)的情况下，将光照射(a)与光照射(b)中蓝色LED与红色LED的发光强度不同的情况也看作使用不同光源。
以下，对于进行工序(A)、工序(B)时的除了光照射(a)、光照射(b)以外的条件进行说明。
(培养基)
作为用于本发明的光合成微藻类的培养方法的培养基，无特别限制。
作为培养基，通常使用包含光合成微藻类的增殖所需的氮、微量金属的无机盐(例如，磷、钾、镁、铁等)等的液体状的培养基。
作为培养基，具体可使用VT培养基、C培养基、MC培养基、MBM培养基、MDM培养基等培养基(参照藻类研究法千原光雄·西泽一俊编、共立出版(1979))、OHM培养基、BG-11培养基和它们的改进培养基等。
在细胞数增加工序(A)中，光合成微藻类的细胞数增加、即增殖。作为细胞数增加工序(A)中使用的培养基，优选使用添加了成为适合增殖的氮源的成分的培养基，例如氮浓度为0.03g/L以上、优选为0.03～0.5g/L、更优选为0.05～0.5g/L的培养基。
所述范围中能够有效进行细胞数的增加，并且即使在工序(B)中直接使用工序(A)中使用的培养基的情况下，也能够充分增加光合成微藻类所具有的叶黄素含量，因而优选。
此外，工序(B)中通常也使用培养基，但作为用于工序(B)的培养基，可以直接使用工序(A)中所用的培养基，也可以变更培养基。作为用于工序(B)的培养基，从增加光合成微藻类所具有的叶黄素含量的观点，优选使用基本不包含成为氮源的成分的培养基，例如氮浓度小于0.02g/L、优选小于0.01g/L的培养基。
此外，在直接使用工序(A)中所用的培养基的情况下，在工序(A)中细胞数的增加停止、或基本停止的时刻，培养基所含氮浓度通常变成小于0.02g/L。另外，在工序(A)与工序(B)变更培养基的情况下，工序(B)中只要采用上述氮浓度的培养基即可。
通过上述范围，能够在工序(B)中充分增加光合成微藻类所具有的叶黄素含量，因而优选。
(培养条件)
对工序(A)和工序(B)中的培养条件无特别限制，一般使用用于光合成微藻类的培养的温度、pH。
光合成微藻类的培养例如在15～35℃进行，优选在20～30℃进行，更优选在22～28℃进行。培养中的pH优选保持在6.0～10.0，更优选保持在7.0～9.0。
工序(A)和工序(B)中优选供给二氧化碳。二氧化碳通过将含有1～5V/V％浓度的二氧化碳的气体以例如0.2～2vvm吹入来供给。此外，作为含有二氧化碳的气体，可以使用二氧化碳与空气的混合气体、二氧化碳与氮气体的混合气体。
在使用扁平培养瓶等扁平培养槽的情况下，通过所述二氧化碳的供给将培养液进行搅拌，对微藻类均匀地进行光照射。此外，培养液的搅拌也可以另外使用搅拌机来进行。
(培养装置)
工序(A)和工序(B)中使用的培养装置只要是能够对光合成微藻类、通常为包含光合成微藻类的培养液进行光照射的装置即可，无特别限制，通常具有能够供给含有二氧化碳的气体的线路。
作为培养装置，例如，小规模的情况使用扁平培养瓶，大规模的情况使用由玻璃制、塑料制等的透明板构成的扁平培养槽、具备照明器带有搅拌机的罐型培养槽、管型培养槽、空气室型培养槽、中空圆筒型培养槽等。另外，优选使用密闭容器。
(培养方法)
在本发明的光合成微藻类的培养方法中，适宜选择并组合上述培养基、培养条件、培养装置等，进行工序(A)和工序(B)。作为进行工序(A)和工序(B)的方法，大致分为二种方法。第一种方法是将工序(A)和工序(B)在同一培养基中进行的方法，即，一阶段培养法。第二种方法是进行工序(A)之后将光合成微藻类与培养基分离，使用分离而得的光合成微藻类和新的培养基进行工序(B)的方法，即二阶段培养法。所述一阶段培养法在工序(A)与工序(B)中培养基相同，因而操作容易，另外，工序(A)与工序(B)连续地进行，因而不易混入杂菌，因而优选。所述二阶段培养法在工序(A)、工序(B)中能够分别选择最适的培养基的方面是优选的。所述一阶段培养法不适合连续培养，通常作为分批式培养进行。
(生产率和培养液)
本发明的光合成微藻类的培养方法由于具有工序(A)、工序(B)，因而能够比以往更有效地获得叶黄素。
具体地，通过工序(B)得到的光合成微藻类的培养液每1L的叶黄素的量(mg)除以进行工序(A)和(B)的合计时间(天)而得的叶黄素的生产率(mg/(L·天))优选为20mg/(L·天)以上，更优选为30mg/(L·天)以上，特别优选为40mg/(L·天)以上。作为生产率，越高越优选，作为其上限无特别限制，本发明的培养方法中，叶黄素的生产率通常为100mg/(L·天)以下。
本发明的光合成微藻类的培养方法中，通常使用液体状的培养基，因而得到光合成微藻类的培养液。通过本发明的培养方法获得的光合成微藻类的培养液每1L培养液优选叶黄素含量为300mg/L以上，更优选为400mg/L以上，特别优选为500mg/L以上。作为叶黄素含量，越高越优选，作为其上限无特别限制，但得到的光合成微藻类的培养液的叶黄素含量通常为1000mg/L以下。
本发明的光合成微藻类的培养方法中得到的光合成微藻类优选包含以干燥质量换算计为4～15质量％的叶黄素，更优选包含5～12质量％以上。
(叶黄素的回收)
在本发明的光合成微藻类的培养方法中，叶黄素在光合成微藻类内蓄积。因此，叶黄素的回收在回收光合成微藻类之后，通过以现有公知的方法为代表的方法无特别限制地从光合成微藻类回收。作为从光合成微藻类回收叶黄素的方法，可列举例如，机械地破坏光合成微藻类之后通过有机溶剂、超临界二氧化碳进行提取的方法。
实施例
接着对于本发明显示实施例进一步详细说明，但本发明不受这些限定。
(光合成微藻类)
作为光合成微藻类使用湖泊红球藻NIES-144株。
(培养液中的虾青素浓度的测定)
在BioMasher(手动匀浆器)IV(株式会社ニッピ制)中取指定量的培养液，加入丙酮并用FastPrep-24(フナコシ株式会社制)破碎细胞提取虾青素。
离心分离后，将上清适宜用丙酮稀释后，测定474nm中的吸光度，由虾青素在丙酮中的吸光系数(A1％＝2100)计算出培养液中的虾青素浓度(mg/L)。
(干燥藻体质量的测定)
将指定量的培养液使用预先用恒温干燥器制成恒量的GS25玻璃纤维滤纸(アドバンテック东洋株式会社制)进行吸滤，用离子交换水洗涤后，在105℃的恒温干燥器中干燥2小时。然后，在干燥器中冷却到室温，然后测定其质量，从而求出培养液中的干燥藻体质量(mg/L)。
(细胞内的虾青素浓度的计算)
通过所述培养液中的虾青素浓度(mg/L)除以培养液中的干燥藻体质量(mg/L)，计算出细胞内的虾青素浓度(质量％)(干燥质量换算)。
(培养液中的总氮浓度(mg/L)的测定)
制作从指定量的培养液通过离心分离将细胞作为沉淀除去而得的上清，使用全氮测定试剂盒143C191(东亚ディーケーケー株式会社制)、手提式简易全氮·全磷计TNP-10(东亚ディーケーケー株式会社制)测定该上清中的总氮浓度。
(细胞数的测定)
对于指定量的培养液的细胞数，使用改良Neubauer血细胞计数板在显微镜下数出细胞数，从而计算出培养液中的细胞数(cells/mL，个细胞/mL)。
〔实施例1〕
在1.0L容量扁平培养瓶(烧瓶厚约38mm其中包含玻璃厚)中加入表1所示的培养基400ml，高压釜灭菌后，以0.50g/L接种胞囊化了的湖泊红球藻NISE-144。接种的湖泊红球藻NISE-144的单位干燥质量的虾青素含量为4.8质量％。
表1
成分 g/L
KNO<sub>3</sub> 0.7
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.07
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.131
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.063
柠檬酸(酐) 0.0105
柠檬酸铁(III)铵 0.0105
EDTA·2Na 0.00175
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 0.035
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.005
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.0032
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.0004
Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.000004
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.000014
(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.000026
<工序A>
在从扁平培养瓶的两面使用蓝色LED(昭和电工制、GA2RT450G)(作为发射波长，包含以PPFD换算为98％的波长400～490nm的蓝色光)进行光照射(光照射(a))的同时，从培养瓶的底面通过以0.5vvm通气包含3V/V％二氧化碳的空气进行搅拌，在25℃进行培养。
照射的光的强度使用光量子计(LI-COR社制、LI-250A)在扁平培养瓶的表面进行测定，调整至光合成有效光量子通量密度(PPFD)为两面合计1300μmol/(m2·s)。
开始光照射之后第5天，培养液中的总氮浓度变为小于20mg/L。判断该时刻细胞数的增加所需的氮源被充分消耗。
＜工序B＞
接着，在PPFD不变的条件下将光源从蓝色LED变更为白色LED(株式会社ビームテック制、LTN40YD)(作为发射波长，包含以PPFD换算为19％的波长400～490nm的蓝色光，包含以PPFD换算为14％的波长620～690nm的红色光)和红色LED(昭和电工制、HRP-350F)(作为发射波长，包含以PPFD换算为96％的波长620～690nm的红色光)(光量子通量密度的比为5:1)(实施例1-1)、或者蓝色LED和红色LED(光量子通量密度的比为1:1)(实施例1-2)(光照射(b))，培养开始后进行12天(变更光源后7天)培养。
对培养液进行适宜取样，进行pH、培养液中的细胞数、培养液中的虾青素浓度、培养液中的干燥藻体质量、和培养液中的总氮浓度的测定。由测定的培养液中的虾青素浓度、培养液中的干燥藻体质量进行细胞内的虾青素浓度的计算。pH在全培养期间中为7.5～8.5。
对于培养液中的细胞数、培养液中的虾青素浓度、培养液中的干燥藻体质量，在培养结束后，由实验开始当初的培养液量、实验结束时扁平培养瓶中残留的培养液量、中途取样的培养液量，通过计算求出通过通气搅拌而蒸发的水分，认为期间水分以一定速度蒸发而对值进行修正。
培养液中的总氮浓度的经时变化、培养液中的细胞数的经时变化、培养液中的虾青素浓度的经时变化、细胞内的虾青素浓度的经时变化分别示于图1、图2、图3和图4。
培养液中的氮被消耗直至第5天。细胞数到第4天显示增殖，然后基本显示一定或微增，第12天的细胞数实施例1-1、1-2均为约8×105cells/ml。培养液中的虾青素浓度在第5天为约120mg/L，然后，实施例1-1、1-2均增加，第12天实施例1-1变为530mg/L(虾青素的生产率：44mg/(L·天))，实施例1-2变为540mg/L(虾青素的生产率：45mg/(L·天))。细胞内的虾青素浓度在培养开始当初为4.8质量％，第3天减少到最低的2.9质量％，然后转为上升，第12天实施例1-1变为7.1质量％，实施例1-2变为8.4质量％。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔比较例1〕
从扁平培养瓶的两面以PPFD为两面合计1300μmol/(m2·s)的方式使用白色LED(比较例1-1)或蓝色LED(比较例1-2)进行光照射，中途不变更光源，除此以外，与实施例1同样地进行培养。
培养液中的总氮浓度的经时变化、培养液中的细胞数的经时变化、培养液中的虾青素浓度的经时变化、细胞内的虾青素浓度的经时变化分别示于图1、图2、图3和图4。
培养液中的氮被消耗直至第5天。细胞数到第4天显示增殖，然后基本变成一定，第12天的细胞数比较例1-2为约7×105cells/ml，比较例1-1为约3.8×105cells/ml。比较例1-1中为比较例1-2的一半左右的细胞数。
培养液中的虾青素浓度在第5天，比较例1-2为约120mg/L，比较例1-1白色为约160mg/L。然后，比较例1-1、1-2均缓缓增加，第12天比较例1-2变为245mg/L(虾青素的生产率：20mg/(L·天))，比较例1-1变为330mg/L(虾青素的生产率：28mg/(L·天))。细胞内的虾青素浓度在培养开始当初为4.8质量％，第3天比较例1-2减少到最低2.9质量％、比较例1-1减少到最低2.7质量％，然后转为上升，第12天比较例1-2变为7.1质量％，比较例1-1变为7.0质量％。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔实施例2〕
将培养开始时使用的光照射(a)的光源从蓝色LED变更为白色LED，除此以外，与实施例1同样地进行培养。
此外，在光照射开始经过5天后，将光照射(b)的光源变更为白色LED和红色LED(光量子通量密度的比为5:1)的实施例作为实施例2-1，将光源变更为蓝色LED和红色LED(光量子通量密度的比为1:1)的实施例作为实施例2-2。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔实施例3〕
将培养开始时使用的光照射(a)的光源从蓝色LED变更为白色LED和蓝色LED(光量子通量密度的比为5:1)，除此以外，与实施例1同样地进行培养。
此外，在光照射开始经过5天后，将光照射(b)的光源变更为白色LED和红色LED(光量子通量密度的比为5:1)的实施例作为实施例3-1，将光源变更为蓝色LED和红色LED(光量子通量密度的比为1:1)的实施例作为实施例3-2。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔实施例4〕
将培养开始时使用的光照射(a)的光源从蓝色LED变更为蓝色LED和红色LED(光量子通量密度的比为1:1)，除此以外，与实施例1同样地进行培养。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔实施例5〕
在光照射开始经过5天后将使用的光照射(b)的光源变更为白色LED，除此以外，与实施例1同样地进行培养。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
〔实施例6〕
将实施例1中从培养开始进行5天的使用蓝色LED的光照射(a)变更为从培养开始进行4天的、将使用蓝色LED的21小时的光照射与使用红色LED的0.1小时的光照射交替地连续进行的光照射，将光源变更为蓝色LED和红色LED的时间从光照射开始经过5天后变更为经过4天后，将光源变更后的光照射从7天变更为8天，除此以外，与实施例1-2同样地进行培养(实施例6-1)。
将实施例1中从培养开始进行5天的使用蓝色LED的光照射(a)变更为从培养开始进行4天的、将使用蓝色LED的92小时的光照射与使用红色LED的4小时的光照射交替进行光照射，将光源变更为蓝色LED和红色LED的时间从光照射开始经过5天后变更为经过4天后，将光源变更后的光照射从7天变更为8天，除此以外，与实施例1-2同样地进行培养(实施例6-2)。
光源的种类、培养12天后的培养液中的虾青素浓度、虾青素的生产率示于表2。
表2
基于上述的各实施例、比较例中使用的各光源的蓝色光、红色光的比例，各实施例、比较例的工序A、B中的各光源之间的光量子通量密度的比，计算出各实施例、比较例中的光照射(a)、光照射(b)中的蓝色光的比例(％)和红色光的比例(％)，计算出ΔB、ΔR、ΔR-ΔB，与各实施例的培养后的培养液中的虾青素浓度(mg/L)(表3中表述为Ax浓度)一起示于表3。
此外，各实施例、比较例中，工序A与工序B之间PPFD不变，因而所述蓝色光的比例(％)和红色光的比例(％)的增减与光量的增减一致，ΔR-ΔB的大小关系无论用具体的光量来求，还是用比例来求都是一致的。

Claims (10)

1.光合成微藻类的培养方法，是包括细胞数增加工序(A)和增加光合成微藻类中的叶黄素含量的工序(B)的光合成微藻类的培养方法，
所述工序(A)是对包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类进行光照射(a)的工序，
所述工序(B)是对进行了所述细胞数增加工序(A)的光合成微藻类进行光照射(b)的工序，
所述光照射(a)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED的光照射，
所述光照射(b)是作为光源使用包含波长400～490nm的蓝色光的LED和包含波长620～690nm的红色光的LED的光照射，
所述光照射(a)与光照射(b)是使用不同光源的光照射。
2.根据权利要求1所述的光合成微藻类的培养方法，将所述光照射(b)中的蓝色光的光量与所述光照射(a)中的蓝色光的光量之差作为ΔB、将所述光照射(b)中的红色光的光量与所述光照射(a)中的红色光的光量之差作为ΔR时，ΔR-ΔB＞0。
3.根据权利要求1或2所述的光合成微藻类的培养方法，
所述光照射(a)是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)、以及使用蓝色LED的光照射(VI)中的至少1种光照射，
所述光照射(b)是选自作为光源使用白色LED的光照射(I)、使用白色LED和蓝色LED的光照射(II)、使用白色LED和红色LED的光照射(III)、使用蓝色LED和红色LED的光照射(IV)、以及交替使用蓝色LED和红色LED的光照射(V)中的至少1种光照射。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)中使用的包含叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类，是包含以干燥质量换算计为3～9质量％的叶黄素的胞囊化了的光合成微藻类。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，在所述工序(A)和工序(B)中，将光合成微藻类的叶黄素含量保持在以干燥质量换算计为2质量％以上。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，在所述光照射(a)和光照射(b)中，光合成有效光量子通量密度为750μmol/(m2·s)以上。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述工序(A)进行3～7天，所述工序(B)进行4～10天，工序(A)与工序(B)合计进行7～17天。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，叶黄素的生产率为20mg/(L·天)以上，所述叶黄素的生产率是通过工序(B)获得的光合成微藻类的培养液每1L的叶黄素的量除以进行工序(A)和(B)的合计时间而得的，其单位为mg/(L·天)，所述叶黄素的量的单位为mg，所述时间的单位为天。
9.根据权利要求1～8的任一项所述的光合成微藻类的培养方法，所述叶黄素是虾青素，所述光合成微藻类是红球藻属的绿藻类。
10.光合成微藻类的培养液，是通过权利要求1～9的任一项所述的培养方法获得的，叶黄素含量为300mg/L以上。
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