KR20060000307A - 신규한 베타-카로틴 생성 두날리에라 살리나（클로로파이세아）균주 및 이를 이용한 베타-카로틴의생산방법 - Google Patents

신규한 베타-카로틴 생성 두날리에라 살리나（클로로파이세아）균주 및 이를 이용한 베타-카로틴의생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea)) 균주를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 균주를 이용하여 베타-카로틴을 대량으로 제조하는 방법을 제공한다.
두날리엘라 살리나 (클로로파이세아), 베타-카로틴, 미세조류

Description

신규한 베타-카로틴 생성 두날리에라 살리나 （클로로파이세아）균주 및 이를 이용한 베타-카로틴의 생산방법{Beta-carotene producing Dunaliella salina （chlorophycea）and process for the production of beta-carotene using the same}
도 1은 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)의 현미경 사진이다.
도 2는 배양 중 초기 및 중기 대수기에서 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 두날리엘라 바르다빌의 균주와 비교한 현미경사진이다.
도 3는 다양한 염농도에서 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 배양한 후 세포의 형태 및 색깔을 관찰한 현미경 사진이다.
도 4는 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)와 두날리엘라 바르다빌의 생장 속도를 비교한 그래프이다(◆: 0.5M NaCl에서의 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아), ■: 0.5M NaCl에서 두날리엘라 바르다빌, ×: 4.5M에서의 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아), * : 4.5M에서의 두날리엘라 바르다빌).
도 5는 질소원 포함된 배지 및 질소원이 결핍된 배지에서 배양하면서 세포의 형태 및 세포 내 베타-카로틴의 축적을 관찰한 현미경 사진이다(a: 질소원 함유 배지액에서 생장한 균주, b: a의 정체기 단계의 세포, c: 질소원이 결여된 배지에서 배양 2주 후의 세포, d: 질소원이 결여된 배지에서 배양 3주 후의 세포).
본 발명은 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea)) 균주 및 이를 이용한 베타-카로틴의 생산방법에 관한 것이다.
두날리엘라는 진핵생물로서 광합성을 하는 유기체인 녹조류로서, 해수 보다 낮은 염농도에서부터 포화용액에 가까운 5M에 이르는 NaCl 농도의 넓은 범위에서 생존이 가능하다. 두날리엘라는 단세포 녹조류(unicellular green algae)로서 볼보칼레스(Volvocales) 목의 클로로파이캐(Chlorophycae) 과에 속하며 타원형의 두개의 편모를 가지며 세포 부피가 50 내지 100mm3에 이르는 전형적인 녹조류이지만 단단한 다당류 세포벽 없이 점막질의 얇은 탄성 세포막에 둘러 쌓여 있는 것이 특징이다(Ben-Amoz et al., 1990, Tibtech., 8, p121-125). 두날리엘라는 바다, 염농도가 높은 호수, 바다 근처 염전의 웅덩이 등의 넓은 지역에 분포하며, 상기 녹조류의 내염성은 삼투조절(osmoregulation)에 기인하는 것으로 알려져 있다(Avron, 1986, Trends in Biochem. Sci., 11, p5-6).
일반적으로 질소 함량이 낮고 햇빛이 강한 고염도의 호수에서 서식하는 두날리엘라는 베타-카로틴의 축적으로 인해 녹조류이지만 녹색 보다는 적색을 띠며 적절한 배양 조건하에서 배양하는 경우 클로로필의 틸라코이드 내부 공간 내의 유성 과립구에 베타-카로틴을 축적하는 것으로 보고되었다(Ben-Amotz et al., J. Phycol., 18, p529-537). 두날리엘라 살리나는 고온의 강한 빛에서 약 20 wt/vol% 이상의 NaCl 농도를 가지는 해수에 노출되어 스트레스를 받는 경우 상당량의 카로티노이드를 축적하는 것으로 알려져 있으며, 이는 카로티노이드가 청색 영역의 빛을 흡수하여 광합성에 중요한 엽록소인 클로로필 a(Chlorophyll a)를 보호하기 위한 것이라고 추측하고 있다.
카로티노이드는 당근, 시금치, 토마토, 고추 등의 녹황색 채소에 존재하는 밝은 황색 내지 오렌지색 내지 짙은 적색의 색소이다. 그 중 베타-카로틴은 카로티노이드 중에서 가장 흔한 색소로서, 체내에서 비타민 A로 전환된다. 비타민 A는 지용성 비타민으로 수용성 비타민과는 달리 간과 같은 조직에서 일정시간 저장된다. 비타민 A 자체는 다량 섭취하는 경우 독성을 나타낼 수 있지만 베타-카로틴은 필요한 만큼만 체내에서 전환되기 때문에 대량에서도 독성을 나타내지 않는 비타민 A의 공급원으로 알려져 있다. 베타-카로틴은 동물조직에서 산화로 인한 손상을 방지할 수 있는 항산화효과, 높은 영양가 및 특유의 색으로 인해 식품첨가제로 널리 사용되고 있을 뿐만 아니라 항암제, 피부 노화와 관련된 산화 방지제, 피부병 치료제, 항균제 등으로도 유용하게 사용되고 있다. 베타-카로틴은 당근, 시금치, 토마토 등의 식물에서 얻을 수 있지만, 필요로 하는 양에 비해 그 생산량이 부족하다.
베타-카로틴의 이러한 유용성에도 불구하고, 천연 베타-카로틴은 대량 생산되지 못하는 실정이다. 현재 베타-카로틴의 대표적인 생산 방법으로 녹황색 채소로부터 추출하여 얻는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 계절, 기후 변동 등에 영향을 받을 뿐만 아니라 장기간 소요되며 베타-카로틴의 수율 또한 저조한 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 베타-카로틴을 화학적으로 합성하는 방법이 시도된 바 있으나, 이 합성 베타-카로틴의 안전성이 아직 인정되지 못한 단점이 있다.
기존에 베타-카로틴을 생산하는 것으로 알려진 두날리엘라 바르다빌(Dunaliella bardawil) 균주는 생장이 느리고 고농도 배양이 어려워 효율적이고 경제적으로 천연의 베타-카로틴을 생산하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은 신규한 미세조류를 선별하여 천연 베타-카로틴을 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 하였다.
이에 본 발명은 베타-카로틴을 생성하고 생장력이 우수한 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아) 및 이를 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea)) 균주를 제공한다.
본 발명자들은 천연으로부터 베타-카로틴을 생산하기 위하여 서해안 태안반도 인근의 염전지역의 해수를 채취하여 신규한 미세조류를 분리하였다. 분리된 균 주 중에서 생장속도가 빠르면서 고밀도로 배양되고 세포 내 베타-카로틴 함량이 높은 균주를 신규 균주로 선별하여 테오도레스코(Teodoresco)가 1905년에 문헌(Beih. Bot. Cetralbl. Bd. 18 Abt.1)에 개시한 바에 따라 균주의 형태적, 생리적 성질 및 핵 rDNA의 ITS1(internal transcribed spacer 1) 및 ITS2 염기서열의 PCR 산물 분석(Gonzalez et al., 1999, J. Appl. Phycol. 10, p573-580) 등 분자적 측면의 방법을 통해 규명하고 그 균주를 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea))로 명명하였다. 상기 균주는 대전시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원 내 생물자원센터(KCTC)에 2004년 6월 10일자로 기탁하고 KCTC10654BP의 기탁번호를 부여받았다.
본 발명에 따른 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)는 약 10 내지 15mm의 폭과 16 내지 24mm의 길이의 계란형 또는 타원형 형태를 가지며, 비셀룰로스의 세포벽을 가진 운동성을 가진 단세포이다(도 1). 본 발명의 균주는 두개의 편모가 세포의 장축의 끝에 붙어 있고, 엽록체가 핵 주위에 위치하면서 세포 부피의 약 절반을 차지하며 세포 내에 안점(eye-spot)은 가지지 않는다. 또한 피레노이드(pyrenoid)가 엽록체에 파묻혀 있고 주위에 전분 과립체가 위치한다. 본 발명의 균주는 기존에 베타-카로틴을 생성한다고 알려진 두날리엘라 바르다빌(Dunaliella bardawil)에 비해 세포의 크기가 작고, 중기 대수기 단계의 세포와 비교할 때 초기 대수기의 세포는 더 연한 색을 보이며, 환상의 피레노이드를 가진다(도 2).
본 발명의 균주는 한천배지에서 생존이 가능하여 약 1.5%의 한천이 첨가된 배지에서 장기간 저장 및 보존할 수 있다. 예를 들면, 1.0M NaCl이 함유된 한천 배지에 접종하여 10mmol photon/m2s의 광도로 5 내지 20℃에서 저장할 수 있다.
본 발명에 따른 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아) 균주의 특성을 하기 표 1에 요약하였다.
Figure 112004028285968-PAT00001
또 다른 양태로서, 본 발명은 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 균주는 다른 두날리엘라 살리나 예를 들어, 두날리엘라 바르다빌에 비하여 생장속도가 빠르면서 고농도 배양이 가능하여 베타-카로틴을 생산하는 데에 높은 장점이 있다(도 4). 또한, 해수의 염농도 또는 그 이상의 고농도 염에서 자라는 특징이 있어 곰팡이, 동물성 플랑크톤, 갑각류 등으로부터 배양액이 오염되지 않으며, 배지 내 염의 농도가 높을수록 생성되는 베타-카로틴 함량이 증가한다.
본 발명은 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아) 균주를 하기의 인공 배지나 해수에서 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 방법을 제공한다.
두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)의 생장 및 베타-카로틴 생산을 위한 인공 배지는 NaCl을 0.1 내지 5.0M, 바람직하게는 0.5 내지 4.5M, Mg2+을 0.05 내지 500mM, 바람직하게는 0.1 내지 10mM, K+을 0.1 내지 10mM, 바람직하게는 0.3mM 내지 5mM, Ca2+을 0.1 내지 20mM, 바람직하게는 0.2 내지 5mM를 포함하는 pH 7.0 내지 9.0의 완충용액이다. 상기의 인공배지에 또한 FeCl3와 같은 철 공급원을 0.5 내지 50mM, 바람직하게는 4 내지 10mM, SO4 2- 이온은 0.1 내지 10mM, 바람직하게는 0.3 내지 7mM, 질소원으로서 NO3 - 이온은 1 내지 20mM, 바람직하게는 3 내지 7mM 또는 NH4 + 이온을 0.5 내지 2.5mM, 바람직하게는 1 내지 2mM, 인산을 0.1 내지 50mM, 바람직하게는 0.2 내지 10mM을 추가로 첨가할 수 있다. 탄소원으로서는 25mM의 NaHCO3을 첨가하거나 CO2, CaCO3 등을 공급할 수 있다. 또한, H3BO3 , MnCl2, ZnCl2, CuCl2, Na2MoO4, NaVO3, CoCl2 등의 미량원소를 첨가하여 균주의 생육을 촉진시킬 수 있다. 배지 조성의 구체적 한 예는 다음과 같다; 40mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1.0M NaCl, 4mM KNO3, 5mM MgSO4, 0.3mM CaCl2, 0.4mM KH2PO4, 8μM FeCl3, 80μM EDTA(pH 7.5) 용액에 150μM H3BO3, 10μM MnCl2, 0.8μM ZnCl2, 0.3μM CuCl 2, 2μM Na2MoO4, 2μM NaVO3, 0.2μM CoCl2, 25mM NaHCO3. 본 발명 균주의 배양 및 베타-카로틴 생산을 위하여 해수를 부분증발하여 농축시키거나 해수에 상기 인공배지와 같은 농도범위가 되도록 성분들을 첨가한 것을 배지로 사용할 수 있다.
상기의 배지에 균주를 접종하여 20 내지 35℃ 바람직하게는, 22 내지 30℃에서 4 내지 8일간 약 150rpm의 속도로 진탕 배양할 수 있으며 배양 기간 중 계속하여 50 내지 200umol photon/m2s 바람직하게는, 약 100 umol photon/m2s의 빛을 조사하고 배양액에 CO2, 염산, 질산을 첨가하여 pH를 7.0 내지 9.0로 조절하는 바람직하다.
베타-카로틴의 생산을 최대화하기 위하여 배양 초기에는 균주의 생장을 최대화 한 후 배양 후기에 배지의 조성 및 배양 조건 예를 들어, 염농도, 질소원의 농 도 또는 조도를 변화시켜 베타-카로틴을 생산을 촉진시킬 수 있다.
한 가지 방법으로서 배양시 질산칼륨, 질산나트륨, 질산암모늄 또는 암모니아 같은 형태로 제공되는 질소원을 제한 공급하여 베타-카로틴의 생산량을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아) 균주를 2 내지 20mM의 질소원(예를 들어, KNO3)를 포함하는 배지에서 균주의 농도가 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후 배양액을 질소원이 0 내지 1mM으로 포함된 배지로 옮겨 2주간 배양하면, 20mM의 질소원을 가진 배지에서 계속 배양하는 경우에 비하여 약 5배 정도의 베타-카로틴을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아) 균주를 2 내지 20mM의 질소원, 바람직하게는 KNO3를 포함하는 배지에서 고농도로 배양한 후 배양액을 질소원이 0 내지 1mM으로 포함된 배지로 옮겨 2주간 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따라 질소원의 공급을 제한하는 경우에 기타 배지의 조성이 상기 인공배지 또는 해수배지의 조건을 갖추도록 하여야 한다. 예를 들어, 40mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1.0M NaCl, 4mM KNO3, 5mM MgSO4, 0.3mM CaCl2, 0.4mM KH2PO4 , 8μM FeCl3, 80μM EDTA(pH 7.5) 용액에 150μM H3BO3, 10μM MnCl2, 0.8μM ZnCl2, 0.3μM CuCl2, 2μM Na2MoO4, 2μM NaVO3, 0.2μM CoCl2, 25mM NaHCO3 배지에서 본 발명 균주를 농도가 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후, 4mM KNO3가 포함되어 있지 않은 저 질소원 함유 배 지로 옮겨 배양하는 경우, 저 질소원 함유 배지에 4mM의 KCl을 가하는 것이 바람직하다.
베타-카로틴의 생산을 최대화하기 위해서는 배양시 균주 생장에 최적인 조도 이상의 빛을 공급하는 것이 바람직하다. 두날리엘라는 천연의 베타-카로틴을 함유하고 있는데, 강한 빛의 조사와 같이 배양 환경이 악화되면 광합성에 중요한 엽록소인 클로로필 a(chlorophyll a)를 보호하기 위하여 베타-카로틴을 대량 합성하여 세포벽 아래에 베타-카로틴 막을 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 본 발명의 균주를 50 내지 200umol photon/m2s과 같은 낮은 광도에서 배양한 후에 베타-카로틴의 합성을 유도하기 위하여 인공적으로 빛의 조도를 높이거나 실외로 옮겨 햇빛에서 1주간 배양할 수 있다. 인공적인 빛을 사용하는 경우에는 400 내지 2000mmol photon/m2s 바람직하게는, 800 내지 2000umol photon/m2s에서 배양할 수 있으며, 이때 빛은 백색광 영역인 400nm 내지 800nm을 사용할 수 있고 이 중 610nm 내지 750nm가 바람직하다. 상기와 같이 조도를 변화시켜 배양하면 낮은 광도에서 계속 배양하는 경우에 비해 10배 이상의 베타-카로틴을 생산할 수 있다. 실외에서 배양하는 경우에는 물의 깊이는 15cm이하, 바람직하게는 약 5cm일 수 있다.
본 발명의 균주는 배지 내의 염농도가 높은 경우에는 생장이 느리지만 베타-카로틴을 더 많이 생산하는 특징이 있으므로 배양의 초기 단계에서는 0.5 내지 2.5M NaCl과 같은 저농도의 염을 포함하는 배지에서 균주를 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후, 배양액을 3 내지 5M의 NaCl과 같은 고농도 염을 포함하는 배지 로 옮겨 3 내지 10일간 배양하면 염농도를 변화시키지 않은 경우에 비하여 10배 정도의 베타-카로틴을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 0.5 내지 2.5M NaCl을 함유하는 배양배지에서 균주 농도가 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후, 배양액을 3 내지 5M의 NaCl과 같은 고농도 염을 포함하는 배지로 옮겨 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 배양시 염농도, 질소원의 농도 또는 조도의 한가지 요소만을 변화시켜 베타-카로틴의 생성을 유도할 수 있으나, 두 가지 요소 예를 들어, 염농도 및 질소원의 농도, 염농도 및 조도, 및 염농도 및 조도를 조합하여 변화시키는 경우에는 상승적으로 베타-카로틴의 생성량을 증가시킬 수 있으며 배양시간도 단축시킬 수 있다.
배양 종료 후, 미세조류는 배양액을 자연 침전시키거나 원심분리를 통하여 세포를 회수할 수 있다.
세포내 생산된 베타-카로틴은 본 발명의 방법에 따라, 회수된 세포에서 90% 아세톤을 혼합하여 추출한 후 원심분리하여 상층액을 HPLC를 이용하여 445 nm에서 베타-카로틴을 검출하여 베타-카로틴의 함량을 측정할 수 있다. 또는 세포를 DMSO 및 비드(bead)로 처리한 후 메탄올로 추출하여 추출액을 얻고, 상기 추출액을 사포닌화 시킨 후 헵탄 용매로 베타-카로틴을 추출하여 436nm에서 그 흡수도를 측정할 수도 있다. 이 경우 베타-카로틴의 양은 다음과 같이 계산할 수 있다.
베타-카로틴(%)= Abs436/{196×(질량(g)×건조 질량(g))}×25ml×1.25×100
×0.84
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
두날리엘라를 분리하기 위하여 한국 서해안에 위치한 태안반도 인근의 염전지역의 웅덩이에서 해수를 무균적으로 멸균 광구병에 채취하였다. 채수기로 실험용 해수 시료를 채수하여 0.45mm 여과 필터로 여과시킨 후 121℃에서 15분간 습열멸균한 멸균 해수를 이용하여 십진법으로 희석하였다.
희석한 시료액 1ml을 40mM 트리스(Tris-HCl(pH 7.5)), 4mM KNO3, 5 mM MgSO4, 0.3 mM, CaCl2, 0.4 mM KH2PO4, 8 μM FeCl3, 80 μM EDTA, 1M NaCl, 1.5% 한천이 첨가된 인공 해수 배지(pH 7.5, artificial seawater medium, Pick (1986), Plant Physiol. 85: 195-198)에 도말(streaking)하여 50mmol photon/m2s의 형광등 조명하에서 약 25℃에서 1주일간 배양하였다. 상기 배지에는 150 μM H3BO3, 10 μM MnCl2, 0.8 μM ZnCl2, 0.3 μM, CuCl2, 2 μM Na2MoO4 , 2 μM NaVO3, 0.2 μM CoCl2의 미량원소(D7) 및 여과하여 살균한 NaHCO3(sodium bicarbonate) 용액(pH 7.5)을 최종 농도가 25mM이 되도록 배지에 첨가하였고 세균의 오염을 배제하기 위하여 5ug/ml의 클로로암페니콜을 첨가하였다.
배양 후 형성된 콜로니를 클로로암페니콜이 첨가되지 않은 동일한 배지에 다시 도말하여 1주일간 배양하였다. 현미경으로 관찰하여 오염이 되지 않은 단일한 녹색을 띠는 원형의 콜로니만을 골라 동일한 배지에 계대 배양하면서 순수하게 분리하였다. 콜로니별로 ITS1 및 ITS2 서열에 대해 PCR을 실시하여 오염여부를 확인하였다. 즉, 평판배지의 각 콜로니를 QIAGEN DNeasy Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA 91355, USA)로 게놈 DNA을 추출하고 그 중 200ng(100ul)를 프로메가 마스터 믹스(PROMEGA Master Mix #M7502,,Promega Corp., Madison, WI 53711-5399, USA)를 이용하여 PCR(PTC-100 Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc.)을 수행하였다. ITS1 서열을 증폭하기 위해서 10pmol의 하기 서열의 프라이머 1 및 2(Bruns laboratory, UC Berkeley, CA, USA)를 사용하여 95˚C에서 1분, 57˚C에서 1분, 72˚C에서 1분씩 36회 반복하였다.
프라이머 1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
프라이머 2: 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’
또한 ITS2 서열의 증폭은 하기 서열의 프라이머 3 및 4(Bruns laboratory, UC Berkeley, CA, USA) 10pmol씩을 사용하여 95˚C에서 1분, 55˚C에서 1분, 72˚C에서 1분씩 36회 반복하였다.
프라이머 3: 5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’
프라이머 4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR결과, ITS1 210bp 및 ITS2 230bp의 단일한 PCR 산물을 가지는 콜로니를 하나 선택하였다.
실시예 2. 분리한 균주의 동정 및 배양 특성
실시예 1의 균주를 테오도레스코(Teodoresco) 등이 1905년에 문헌(Beih. Bot. Cetralbl. Bd. 18 Abt.1)에 개시한 형태적 및 생리적 성질과 Gonzales 등이 1999년에 J. Appl. Phycol 에서 개시한 분자적 방법에 따라 동정하였다.
분리된 균주를 실시예 1의 한천을 첨가하지 않은 액체 배지에 접종하여 7일간 약 80mmol photon/m2s하에서 배양하여 지수성장 단계까지 생장하게 한 후 LWD PH40x/0/60 오브젝티브(objective)가 있는 역상 현미경(Motic AE31)과 디지털 커플러 옵템(Coupler Optem) 29-90-56, 25-70-15 및 25-70-14이 연결된 디지털 카메라(Nikon Coolpix 4500, Nikon Corp., Tokyo, Japan)로 4배 줌하여 400배 확대된 사진을 촬영하였다(도 1). 두날리엘라 세포는 테오도레스코가 기술한 형태적 특징에 따라 현미경하에서 동정하였다. 분리된 균주는 단세포의 반수체(haploid)이고 10 내지 15mm의 폭과 16 내지 24mm의 길이의 원통형이며 회전 뿐만 아니라 전진운동도 관찰되었다. 세포는 비셀룰로스 성분의 세포벽을 가져 파쇄가 용이하며, 두개의 편모를 가지는데 세포가 휴식상태에 있을 때에도 계속 진동하였다. 세포 내 피레노이드(pyronoid)와 세포질 과립체(cytoplasmic granule)는 있으나 안점(eyespot)을 가지지 않으며, 1M의 NaCl 농도에서 완전히 녹색을 띠며 두터운 층의 뮤실리지(mucilage)가 있는 컵 모양의 엽록체를 가짐을 확인하였다.
기존에 베타-카로틴을 생산하는 것으로 알려진 두날리엘라 바르다빌(D. bardawil)의 세포의 모양 및 색깔을 새로이 분리된 균주와 비교하였다(도 2). 본 발명의 균주는 두날라엘라 바르다빌에 비해 더 짙은 녹색을 띠며 세포의 크기도 약간 작았으며 중간 대수기와 비교할 때 초기 대수기에서는 더 연한색을 나타내며, 환상의 피레노이드를 가짐을 확인하였다.
순수 분리된 두날리엘라 균주를 NaCl를 각각 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 3.0 및 4.5M로 포함하는 실시예 1와 동일한 조성의 액체 배지에 초기 농도가 30×104cells/mL가 되도록 접종한 후 80umol photon/m2s의 24시간 연속 형광등 조명하에서 150rpm으로 7일간 약 25℃에서 진탕 배양하면서 최대 세포 밀도 및 세포의 색깔을 측정하여 표 2에 나타내었다. 표 2에서 분광광도계(Shimadzu UV-160U. Shimadzu)를 이용하여 670nm에서 흡광도를 측정함으로써 생장 정도를 측정하였고, 세포 밀도는 혈구계산기(hemocytometer, Neubauer ultraplane, Reichert Co., Buffalo, NY)를 이용하여 계산하였으며, 실시예 1와 같은 현미경 측정방법으로 세 포의 색을 관찰하였다(도 3).
Figure 112004028285968-PAT00002
새로이 분리된 두날리엘라 균주는 상기와 같이 106cells/mL 이상의 높은 밀도로 세포 배양이 가능하며 염의 농도가 높을수록 세포 내 베타-카로틴을 많이 축적하여 오렌지 색을 띰을 알 수 있다.
또한, 신규한 두날리엘라 균주를 두날리엘라 바르다빌 균주와 생장 속도의 차이를 비교하였다(도 4). 양 균주 모두 저농도의 염에서 생장이 빠르며, 본 발명의 균주는 두날리엘라 바르다빌과 비교할 때 생장 속도가 더 빨라 동일한 배양시기에도 고농도로 배양이 가능함을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 생장속도가 빠르고 고밀도 배양이 가능한 분리된 신규 균주를 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea))로 명명한 후 대전시 유성구 어은동 52번지에 위치하는 생명공학연구원 내 생물자원센 터에 2004년 6월 10일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC10654BP를 부여받았다.
실시예 3. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)의 염농도에 따른 베타-카로틴의 생산
두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 NaCl 농도를 달리한 배지에서 실시예 2와 같은 방법으로 배양하면서 생성된 베타-카로틴의 함량을 워터스 스페리소브(Waters Spherisorb) S5 ODS2 카트리지 칼럼(4.6x250 mm)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard Series model 1100)를 사용하여 측정하였다.
7일간 배양 후 배양액 2ml을 14,000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 이 펠렛에 여과된 90% 아세톤을 200ul 첨가하고 1분간 혼합하여 색소를 추출한 후, 추출물을 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기에서 14,000rpm으로 원심분리하였다. 상층액 15ul을 다시 여과하여(0.2um 나일론 필터) HPLC 분석을 하였다.
색소를 분리하기 위해 용매를 1.0ml/분의 속도로 흘려주면서 0 내지 1분 사이에는 아세토니트릴 90%, 증류수 9.99% 및 트리에틸아민이 0.01%, 2 내지 14분에는 아세토니트릴 86%, 증류수 8.99%, 트리에틸아민 0.01 % 및 에틸아세테이트 5%로 하였으며 15 내지 21분 동안은 100% 에틸아세테이트를 사용하였다. 포스트 런(post-run)은 처음 시작한 용매로 9분간 하였다. 레퍼런스(Jin et al., 2001 Biochim Biophys Acta 1506:244-2597)를 550nm로 한 경우 베타-카로틴 색소는 445nm에서 검출되었으며, 베타-카로틴(DHI water and environment사, Denmark)을 정량한 표준곡선을 기초로 베타-카로틴의 양을 측정하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112004028285968-PAT00003
배지 내 염농도가 증가함에 따라 베타-카로틴의 함량이 증가하고, 4.5M NaCl에서는 그 함량이 현저히 높음을 알 수 있다.
실시예 4. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)의 질소원 결여 배지에서의 베타-카로틴의 생산
질소원이 결여된 배지에서 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 배양하면서 베타-카로틴의 세포 내 축적을 측정하였다.
실시예 1의 4mM KNO3 질소원이 포함된 배지 및 4mM KNO3 대신 4mM의 KCl을 포함된, 질소원이 결핍된 배지에서 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 실시예 1과 동일한 조건으로 배양하면서 세포의 변화 및 세포 내 베타-카로틴의 축적을 현미경을 통해 관찰하였다(도 5).
도 5a에서 보는 바와 같이 질소원이 함유된 배지에서 생장한 균주에서는 두개의 편모를 가진 세포가 활발하게 운동하지만 정체기에 들어서는 세포 모양이 원형으로 변하면서 운동량이 감소하며(도 5b), 질소원이 결여된 배지에서 자란 균주는 배양 2주 후에 세포가 색을 띠며 편모가 사라지고 세포의 형태가 원형으로 변하였고(도 5c), 3주 후에는 세포 전체가 주황색으로 변하여 세포 내 베타-카로틴이 대량 축적됨을 알 수 있다(도 5d).
본 발명은 베타-카로틴을 생산하는 신규한 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)를 제공하며, 본 발명의 방법에 따라 상기 균주를 고농도로 배양한 후 베타-카로틴의 생성을 유도함으로써 베타-카로틴을 대량 생산할 수 있다.

Claims (6)

  1. 베타-카로틴을 생산하는 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea) (KCTC 10654BP)
  2. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(Dunaliella salina (chlorophycea) (KCTC 10654BP)를 배양하여 베타-카로틴을 생산하는 것을 특징으로 하는 베타-카로틴의 생산방법.
  3. 제2항에서, 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(KCTC 10654BP)를 NaCl 0.1 내지 5.0M, MgSO4 0.05 내지 500mM, KH2PO4 0.1 내지 10mM, CaCl2 0.1 내지 20mM, FeCl3 0.5 내지 50uM, KNO3 1 내지 20mM, NaHCO3 25mM을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(KCTC 10654BP)를 0.5 내지 2.5M의 NaCl를 포함하는 배지에서 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후 배양액을 3 내지 5M의 NaCl를 포함하는 배지로 옮겨 배양하는 것을 특징으로 하는 베타-카로틴의 생산방법.
  5. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(KCTC 10654BP)를 2 내지 20mM의 KNO3를 포함하는 배지에서 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후 배양액을 질소원이 0 내지 1mM으로 포함된 배지로 옮겨 배양하는 것을 특징으로 하는 베타-카로틴의 생산방법.
  6. 두날리엘라 살리나 (클로로파이세아)(KCTC 10654BP)를 50 내지 200umol photon/m2s의 조도에서 105 내지 106cell/ml로 되도록 배양한 후 배양액을 800 내지 2000umol photon/m2s의 조도로 옮겨 배양하는 것을 특징으로 하는 베타-카로틴의 생산방법.
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