KR102157596B1 - 두나리엘라 배양용 조성물 및 이의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우수한 색소 생산능을 갖는 두나리엘라 변이종 배양용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두나리엘라 변이종을 대량배양하기 위한 배양용 조성물 및 이를 이용한 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명의 배양용 조성물을 이용하는 경우 두나리엘라 미세조류의 황반색소 생산량을 늘릴 수 있고, 배양 조성물에 무기염류를 첨가하지 않아도 되므로, 배양배지의 생산 단계를 현저히 낮출 수 있어, 두나리엘라의 배양, 특히 대량 배양에 매우 효과적이다.

Description

두나리엘라 배양용 조성물 및 이의 배양방법{COPOSITION FOR CULTURING DUNALIELLA AND CULTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 우수한 색소 생산능을 갖는 두나리엘라 변이종 배양용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두나리엘라 변이종을 대량배양하기 위한 배양용 조성물 및 이를 이용한 대량 배양 방법에 관한 것이다.

1990년대부터 2000년대 서구화된 식습관과 각종 IT 기기의 사용이 보편화되기 시작하면서, 황반변성 환자가 증가하고 있고, 최근에는 스마트폰 등 강한 빛이 나오는 전자기기를 장시간 사용하거나 동물성 지방을 주로 섭취 등 식습관과 생활습관의 변화에 의해서 40~50대의 젊은 황반변성 환자도 늘어나는 추세이다. 황반변성은 당뇨망막병증, 녹내장과 함께 3대 실명질환 중 하나로, 최근 세 질환 중 실명 위험이 높은 질환으로 황반변성이 지목되고 있다.

황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 노화(연령관련 황반변성), 가족력, 인종, 흡연, 강한 빛에 과도하게 노출되는 경우 등이 관련이 있다고 알려져 있다. 황반변성의 경우 치료 방법이 없고, 조기에 증상이 거의 없는 편이기 때문에 실명을 막기 어렵다. 따라서, 황반변성을 예방하기 위해서는 정기적인 검사를 통해 황반부의 이상을 초기에 발견하고, 비만, 흡연, 고혈압 등의 조절 가능한 인자를 줄이도록 애쓰는 것이 중요하다. 흡연은 맥락막 순환에 손상을 주어 혈중 항산화 인자를 떨어뜨리고, 맥락막 혈관수축을 야기하여 저산화 손상을 야기하므로, 황반변성의 위험성이 있는 환자는 반드시 금연이 필요하다. 또한, 황반색소(lutein, zeaxanthin)는 노화에 의한 손상을 감소시켜 망막을 건강하게 유지하는 역할을 하므로, 야채와 과일을 통해 충분히 섭취하거나, 상용화된 비타민제를 복용함으로써 황반변성의 예방에 도움을 줄 수 있다.

황반색소는 망막의 중앙부분에서 기인한 노인성 시력감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필(크산토필, xanthophyll)가 있다. 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인(lutein) 또는 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있다. 루테인은 몸속에서 자연적으로 생성되는 산소 자유라디칼(free radical)에 의해서 손상되는 눈의 내부를 보호하는 항산화제로서 활동하며, 암종양에 영양분을 공급하는 혈관의 성장을 줄여 암세포를 죽이고, 유방, 결장, 폐, 난소암, 피부암 예방에 약간의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있는데, 이러한 잔토필은 식물의 잎사귀, 꽃, 과실 등의 녹색부에 엽록소, 카로틴과 함께 존재한다. 최근 잔토필류를 포함하는 눈 건강을 위한 건강기능식품 등이 각광받고 있다.

지아잔틴과 루테인은 마리골드, 박테리아, 미세조류 등에서 얻을 수 있는데, 대부분 마리골드 꽃에서 추출되고 있다. 그러나 마리골드와 같은 고등식물로부터 지아자닌 등의 색소를 얻기 위해서는 육종 기간이 매우 길고, 생산을 위한 토지 면적에 비해서 생산량이 많지 않아 생산 단가가 문제가 있다. 이러한 고등식물 시스템을 대체하기 위한 박테리아 시스템을 이용해 색소 합성 기작을 삽입한 지아잔틴과 루테인 생산 조류 개발이 이루어졌지만, 박테리아에서 얻어지는 색소는 궁극적으로 식품첨가물로 이용되기에는 부적합하다는 문제점이 있다. 또한, 유전자 삽입 기술 등을 이용한 유전자 재조합 식품(GMO; genetically modified organism)은 국내에서 선호되고 있지 않기 때문에 소비자들의 인식이 중요한 식품첨가물 시장에는 치명적 단점으로 작용하며, 고등식물 시스템과 마찬가지로 박테리아 배양액이나 바이오 리액터 등을 유지하는 비용이 많이 요구되어, 여전히 지아잔틴이나 루테인의 생산단가를 낮출 수 없었다.

이를 해결하기 위해서, 지아잔틴/루테인을 고함량으로 생산하는 두나리엘라 미세조류를 이용하는 황반색소 생산방법이 제안되었으나, 종래의 두나리엘라 배양배지는 다양한 무기염류를 대량으로 포함하기 때문에, 대량 생산 시 생산 단가를 상승시키는 문제가 있었다. 구체적으로 두나리엘라의 배양 조성물로 알려진 D 배지(media) 조성에 따른 배양액의 제조 단가는 1000L 당 400만원 이상이 소요되며, 톤(ton) 단위의 배양을 실시하는 미세조류의 산업 측면에서 본다면, 매우 고가로 여겨진다.

따라서, 지아잔틴 및 루테인을 포함하는 황반색소를 경제적이고 효율적으로 생산하기 위해서, 종래보다 높은 효율 및 저가격으로 두나리엘라 미세조류를 배양할 수 있는 기술의 개발이 여전히 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 지아잔틴/루테인 고함량 생산능을 갖는 두나리엘라 미세조류를 배양하기 위한 배양조성물을 제공하는 것으로, 본 발명의 발명자는 황반색소의 생산효율을 증가시키기 위해서 루테인/지아잔틴 등 잔토필 색소를 고함량으로 생산할 수 있는 두나리엘라 변이종을 개발하였고, 이의 대량 배양에 효과적인 배양 배지를 지속적으로 연구하여, 용암해수를 포함하는 배양배지를 이용하는 경우 종래의 배지보다 효율적이면서도 종래의 배지 가격의 1/100배로 미생물을 배양할 수 있는 배양액 조성물을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하고자 하는 측면에서, 본 발명은 용암해수, NaNO₃, NaHPO₄ 수화물 및 Na₂SiO₃ 수화물을 포함하는, 두나리엘라 배양용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 두나리엘라 속 미세조류를 용암해수, NaNO₃, NaHPO₄ 수화물 및 Na₂SiO₃ 수화물을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 두나리엘라 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 용암해수를 포함하는 두나리엘라 배양용 조성물은 다량의 무기염류를 첨가하지 않아도 되므로, 배양배지의 제조 단계와 단가를 현저히 낮출 수 있다. 또한, 본 발명의 배양액 조성물의 경우, 지아잔틴 고함량 두나리엘라 미세조류의 생산에 더욱 적합하여, 두나리엘라 미세조류를 이용한 황반색소 생산량을 현저히 증가시킬 수 있고, 낮은 단가의 배양을 이용해서 두나리엘라 미세조류를 효과적으로 대량 배양할 수 있어, 두나리엘라룰 이용한 황반색소의 생산 등에 적합하다.

도1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 배양액의 종류에 따른 두나리엘라 세포의 형태학적 특성을 확인한 광학현미경 사진이다. 좌측의 세포 사진은 아무런 처리를 하지 않은 상태이며, 우측의 세포 사진은 루골용액(Lugol's solution)으로 세포를 고정 및 전분염색을 한 후, 확인한 사진이며, 바는 10 ㎛를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 20mL 부피 배양액(100mL 규모 플라스크)에서 두나리엘라를 배양한 후 18일째의 사진(A) 및 플라스크에서 배양한 세포 밀도의 변화 패턴을 나타낸 성장 곡선(B)이다. D 배지(세모), F1 배지(원형), F1.5 배지(사각형)의 그래프는 배양 18일까지 측정되었으며, 해당 시점의 바이오매스는 g/L의 단위로 계산하여 표기되었다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 20mL 부피 배양액(100mL 규모 플라스크)에서 배양한 후 18일째에 수확한 두나리엘라의 색소 분석 그래프이다. 노란색 막대는 루테인(lutein), 주황색 막대는 지아잔틴(zeaxanthin), 적갈색 막대는 베타-카로틴(beta-carotene), 붉은색 막대는 세 가지 색소의 총량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 실시한 두나리엘라의 대량 배양 과정의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 두나리엘라를 본 발명의 배양 조성물에서 5L 배양을 수행하였을 때 바이오매스의 변화 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명의 배양 조성물을 사용한 4,000L 규모의 개방형 수로(open raceway pond, ORP) 배양 중의 두나리엘라의 바이오매스 변화 그래프이고, 도 6b는 ORP 배양을 통해 얻어진 두나리엘라 개량종의 분말의 무기물 영양성분 분석 결과, 도 6c는 ORP 배양 중의 두나리엘라의 루테인(노란색 막대)과 지아잔틴(주황색 막대)의 함량 분석 그래프, 그리고 도 6d는 ORP 배양을 통해 얻어진 두나리엘라 개량종의 분말의 유기물 영양성분 분석 결과(붉은색 부분은 단백질, 연두색 부분은 지질, 보라색 부분은 탄수화물, 파란색 부분은 회분을 의미함)를 나타낸다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 두나리엘라 배양용 조성물에 관한 것이다.

두나리엘라 속 미세조류는 등장의 2편모가 있는 단세포 녹조로, 세포는 방추형이며, 크기는 종류에 따라 길이 7 내지 25㎛이고, 배상엽록체를 갖는다. 염분 농도가 높은 환경에서 생육할 수 있는 특성을 갖는다. 두나리엘라 속 미세조류는 지아잔틴 및/또는 루테인을 포함하는 잔토필 색소 생산능을 가질 수 있으며, 본 발명에서는 잔토필 색소 생산능을 갖는 두나리엘라 속 미세조류 개량종(변이종)이 바람직하다.

본 발명에서는 가장 바람직하게 기탁번호 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular pigment 3(Dunaliella sp. MP3) 조류(algae)일 수 있다. 상기 두나리엘라 MP3 변이종은 색소 생산능, 구체적으로 잔토필 생산능을 가지며, 보다 구체적으로는 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin) 생산능이 야생형 두나리엘라 미세조류보다 현저히 우수하며, 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 생산할 수 있다. 상기한 두나리엘라 MP3 미세조류의 경우 잔토필 색소의 함량이 매우 높은 균학적 특성을 갖는데, 종래의 배양배지 보다 본 발명의 용암해수를 포함한 배양용 조성물에 배양되는 경우 잔토필 색소의 생산능이 더욱 향상되는 특성이 있다. 따라서, 본 발명의 배양용 조성물은 기탁번호 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 배양용 조성물 일 수 있다.

상기 두나리엘라 속 MP3 조류는 약광(dim light)에서 생존 가능하고, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m²s 범위의 광도 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 두나리엘라 속 MP3 조류는 약광 조건 이하인 완전한 어둠에서는 광합성을 할 수 없고, 너무 높은 광 조건에서는 광 스트레스에 의해 세포가 피해를 입을 수 있으므로, 상기 조건을 만족하는 광 조건에서 두나리엘라 속 MP3 조류를 배양하는 경우, 변이종 내 잔토필 함량을 높이면서도, 우수한 생장률을 갖는 장점이 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 두나리엘라를 배양하기 위한 배지를 구성하는 조성물을 의미하는 것으로, 배양기, 배양액, 배양배지 등에 포함되어 사용할 수 있고, 바람직하게는 배양용 조성물 자체가 두나리엘라 미세조류의 배양액 또는 배양배지로 사용될 수 있다. 본 발명의 배양용 조성물을에서 상기 배지는 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 배양용 조성물은 두나리엘라의 배양을 위해서 용암해수, NaNO₃, NaHPO₄ 수화물 및 Na₂SiO₃ 수화물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 수화물은 물이 다른 화합물에 결합되어 있는 형태의 화합물을 의미하는 것으로, 함수화물이라고도 지칭된다. 물 분자수에 따라 1 수화물, 2수화물 등일 수 있고, 수화의 정도는 동일 화합물에서도 온도나 물의 증기압 등의 조건에 따라 다를 수 있고, 동일 화합물 이라고 하더라도, 물 분자수가 상이한 수화물을 모두 포함한다.

상기 용암해수는 제주도의 화산암반층 아래의 지하에서 취수한 해수를 의미하는 것으로, 100m 이하에서 취수된 해수일 수 있다. 상기 용암해수를 배양용 조성물에 포함하는 경우, 일반 해수 또는 인공 해수를 이용하는 경우와 비교해서 두나리엘라 배양에 매우 효과적이고, 고비용의 무기염료를 별도로 첨가하지 않아도 된다는 장점이 있다. 특히, 미세조류의 광합성에 사용되는 Zn, Fe, Mn 등의 금속이온 함량이 일반 해수와 비교해서 현저히 높고, 미생물과 대장균이 전혀 검출되지 않아, 박테리아 감염에 취약할 수 있는 두나리엘라 미세조류의 배양에 더욱 유리하다.

한편, 종래 두나리엘라 배양배지의 경우 다량의 무기염류를 첨가해야 하므로, 배양액 제조 시 매우 높은 단가가 요구되었으나, 용암해수를 포함하는 경우 상기한 미량원소를 포함하지 않아도 되므로, 종래 배양액의 제조단가와 비교해 1/100 수준으로 배양액의 제공이 가능하다. 실제, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 F 1.5 배지의 실제 제조단가를 계산하면, 1000L 당 약 4만원 수준으로, 종래 D 배지와 비고해서 1/100 수준 임을 확인하였다. 이는 종래 생산 단가가 매우 높아 대량 공급의 어려움이 있었던 지아잔틴 및 루테인의 문제점을 해결할 수 있다는 측면에서 매우 중요하다. 이러한 측면에서, 본 발명의 조성물은 대량 배양용 조성물 일 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 용암해수를 이용하여 기존 배양액의 인공 염수를 100% 대체할 수 있도록 새롭게 조성된 것이다. 본 발명의 배양용 조성물의 경우 기존 배양액에서 0.5M 내지 1.0M의 인공 염수를 만들기 위해 증류수와 NaCl을 섞어주는 단계를 진행할 필요가 없고, 두나리엘라 배양 시 종래의 배양배지와 비교해서 두나리엘라 조류 내에 더욱 높은 함량의 잔토필 색소를 생산하도록 할 수 있다. 본 발명의 배양용 조성물은 전체 조성물에 대하여 용암해수를 80%(v/v) 내지 90%(v/v)로 포함할 수 있다.

상기 NaHPO₄ 수화물은 바람직하게는 1수화물 일 수 있고, Na₂SiO₃ 수화물은 9 수화물 일 수 있으며, MnCl₂ 수화물은 4수화물 일 수 있고, ZnSO₄ 수화물 5수화물 또는 7수화물 일 수 있으며, CuSO₄ 수화물은 5수화물 일 수 있고, NaMoO₄ 또는 Na₂MoO₄ 수화물은 2 수화물 일 수 있으며, 또는 CoCl₂ 수화물은 6수화물 일 수 있다. 그러나, 상기 수화물에서 물 분자수가 다른 형태의 수화물이 본 발명의 배양용 조성물에 포함될 수 도 있다.

또한, 본 발명의 배양용 조성물은 100 내지 250 mg/L의 NaNO₃, 5 내지 20 mg/L의 NaHPO₄ 수화물 또는 40 내지 110 미만 mg/L의 Na₂SiO₃를 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 배양용 조성물은 FeCl₃, MnCl₂ 수화물, ZnSO₄ 수화물, CuSO₄ 수화물, NaMoO₄ 수화물, Na₂MoO₄ 수화물 및 CoCl₂ 수화물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 배양용 조성물은 바람직하게는 FeCl₃는 3 내지 10 mg/L로, MnCl₂ 수화물은 0.2 내지 0.7 mg/L로, 그리고 CoCl₂ 수화물은 0.01 내지 0.04 미만 mg/L으로 포함할 수 있다.

보다 바람직하게, 본 발명의 배양용 조성물은 200 내지 250 mg/L의 NaNO₃, 10 초과 내지 20 mg/L의 NaHPO₄ 수화물, 70 내지 110 미만 mg/L의 Na₂SiO_{3 ,} 7 내지 10 mg/L의 FeCl₃, 0.4 내지 0.6 mg/L의 MnCl₂ 수화물, 0.025 내지 0.04 mg/L의 CoCl₂ 수화물을 포함하는 것 일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 성분을 포함하는 배양용 조성물에서 두나리엘라 미세조류의 세포 밀도가 높은 생장효과를 가질 뿐 아니라, 미세조류 세포 내 잔토필 색소의 함량도 높아, 색소 생산을 위한 대량 배양에 더욱 적합하게 이용될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 200 내지 250 mg/L의 NaNO₃; 10 초과 내지 20 mg/L의 NaH₂PO₄·H₂O; 70 내지 110 미만 mg/L의 Na₂SiO₃·9H₂O; 7 내지 10 mg/L의 EDTA 중 FeCl₃(FeCl₃·6H₂O, Na₂EDTA·2H₂O); 0.4 내지 0.6 mg/L의 MnCl₂·4H₂O; 0.025 내지 0.04 mg/L의 CoCl₂·6H₂O; ZnSO₄·5H₂O 또는 ZnSO4·7H₂O; CuSO₄·5H₂O; 및 NaMoO₄·2H₂O 또는 Na₂MoO₄·2H₂O;및 H₃BO₃를 포함하는 두나리엘라 배양용 조성물 일 수 있다. 본 조성물의 경우 두나리엘라 생장 시 세포 밀도를 높일 수 있고, 두나리엘라 세포 내 잔토필 색소 함량을 높일 수 있어 매우 효과적이다.

본 발명의 배양용 조성물은 0.5M 내지 1.0M의 염도 조건 일 수 있다. 또한, 본 발명의 배양용 조성물은 pH 7 이상, 구체적으로 pH 7 내지 pH 10, 더욱 구체적으로 pH 8.0 이상 내지 pH 10.0 미만의 조건일 수 있다. 상기 염도 조건 및 pH 조건을 만족하는 배양용 조성물에서, 보다 우수한 두나리엘라 성장 및 색소 생산 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 다른 목적을 위해, 배양액 조성물에 통상적으로 포함될 수 있는 물질을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 두나리엘라 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 두나리엘라 배양 방법은 두나리엘라 속 미세조류를 용암해수, NaNO₃, NaHPO₄ 수화물 및 Na₂SiO₃ 수화물을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기 두나리엘라 속 미세조류는 바람직하게는 기탁번호 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)일 수 있다. 상기한 두나리엘라 MP3 미세조류의 경우 잔토필 색소 생산능을 갖는 것으로 종래의 배양배지 보다 본 발명의 용암해수를 포함한 배양용 조성물을 이용하는 경우, 두나리엘라 MP3 미세조류의 잔토필 색소의 생산능이 더욱 향상되는 특성이 있다.

상기 배지는 1L 내지 5000L의 대량생산용 배양배지를 포함하며, 특히, 본 발명의 용암해수를 포함하는 배양 조성물을 이용하는 경우, 배양배지의 생산 단가를 1/100 수준으로 현저히 낮출 수 있기 때문에, 두나리엘라 대량 생산에 매우 적합하다. 따라서, 본 발명의 배양 방법은 두나리엘라의 생산 또는 두나리엘라로부터 잔토필 색소의 대량생산을 위한 것 일 수 있다.

상기 배양용 조성물에 관한 내용은 배양 방법에 적용될 수 있고, 중복된 기재를 피하기 위해 자세한 기재는 생략한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

[ 시험예 1] 일반 해수와 제주도 용암 해수의 성분 비교

제주도 인근 바다에서 채취할 수 있는 일반 해수(이하, '일반 해수'로 지칭한다), 제주도 지하 100 내지 200m에서 취수한 용암해수(이하, '제주도 용암 해수'로 지칭한다)의 성분을 비교하였다(표 1).

두 해수의 성분은 크게 12가지의 무기염류에 대해서 비교 분석 되었으며, 그 종류는 다음과 같다. 나트륨(Na), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 칼륨(K), 브롬(Br), 스트론튬(Sr), 아연(Zn), 철(Fe), 망간(Mn), 바나듐(V), 세슘(Se), 그리고 게르마늄(Ge). 제주도 용암 해수와 일반 해수의 무기염류 성분은 대부분 비슷한 수준을 나타내었으나, 광합성 미세조류의 광합성에 사용되는 중요한 금속이온들인 Zn, Fe, Mn의 함량이 일반 해수에 비해서 용암 해수가 각각 54배, 500배, 400배 높은 것을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 2] 황반색소 고함량 두나리엘라 배양을 위한 배양액 설계

황반색소 고함량 두나리엘라 개량종인 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. Macular pigment 3(MP3), KCTC 12990BP; 이하, '두나리엘라 개량종'으로 지칭한다)의 배양 방법으로 제시된 배양액은 다양한 무기염류가 요구된다. 그런데, 무기염류를 포함하는 배양액은 실험실 수준의 소량 배양에는 큰 문제가 되지 않지만, 대량 배양의 경우에는 첨가해야 하는 무기염류가 다양해지고, 그 함량이 높아지면서, 단가가 현저하게 상승하는 문제가 발생한다.

따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해, 용암해수를 이용하는 경우 배지의 조성을 표 2와 F1 배지, F1.5 배지와 같이 설정하였다. D 배지(media)는 종래 두나리엘라 배양 배지로 알려진 조성이다. 종래의 배양 방법에서는 인공 염수에 D 배지를 첨가하였지만, 본 발명의 F1 및 F1.5 배지는 제주도 용암 해수에 배양액을 첨가하는 것이기 때문에, 기본적으로 인공 염수에 비해서 표 1에 언급된 12가지 무기염류는 충분한 양이 들어있다고 볼 수 있다. 따라서 F1 및 F1.5 배지에는 KNO₃, MgCl₂6H₂O, MgSO₄7H₂O, CaCl₂, K₂HPO₄ 및 NaVO₃를 첨가하지 않는 조성으로 배지 조성을 설계하였다.

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, D 배지(대조군)의 경우에는 F1 배지(실시예 1), F1.5 배지(실시예 2)와는 달리 Tris-HCl, KNO₃, MgCl₂6H₂O, MgSO₄7H₂O, CaCl₂, K₂HPO₄, H₃BO₃, NaVO₃이 추가로 첨가되나, NaNO₃, NaH₂PO4H₂O, Na₂SiO₃9H₂O, 비타민 용액(vitamine solution)은 첨가되지 않는다.

[ 시험예 3] 배양 배지에 따른 두나리엘라 개량종 세포의 광학적 비교

두나리엘라 개량종을 하기 표 1에 표기한 조성의 제주도 용암 해수에 하기 표 2에 표기한 조성의 D 배지, F1 배지, F1.5 배지의 각 성분을 섞어 액체배지(이하, 'D 배지', 'F1 배지', 'F1.5 배지'라 지칭한다)에 접종한 후 플라스크 배양하였다. 탄소원의 공급을 위해서 NaHCO₃을 25mM이 되도록 첨가하였다. 배양 조건은 광도 약 75±10 μmol photons/m²s, 온도는 25±1 ℃로 하였고, 진탕 배양하였다.

두나리엘라 개량종을 각각 20mL의 D 배지, F1 배지, F1.5 배지에 25x10⁴ 세포/mL의 밀도가 되도록 100mL 플라스크에 접종한 다음, 세포에 가해진 삼투 스트레스 및 그 외의 스트레스 영향을 확인하기 위해서 광학 현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다(도 1).

도 1에 나타낸 바와 같이, 세포의 외형에 대해서 D 배지, F1 배지, F1.5 배지 사이의 유의미한 크기의 차이는 없었으며 모두 10 ㎛보다 크기가 작았다. 모두 엽록체 영역(연녹색) 과 세포질 영역(흰색) 이 또렷하게 색으로 구분되었으며, 도 1의 오른쪽에 보이는 것처럼 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하고, 육안으로 관찰하였을 때 F1 배지의 색상이 좀 더 짙은 것을 확인할 수 있다. 보통 두나리엘라와 같은 미세조류는 영양분 결핍과 같은 스트레스 상태에서 녹말을 많이 축적하는 경향을 보이므로, 이 결과는 F1 배지에서는 두나리엘라 개량종이 스트레스를 받을 가능성을 제시한다.

[ 시험예 4] 배양 배지에 따른 두나리엘라 개량종 세포의 성장 비교

시험예 3에 따른 각각의 배양액에서의 두나리엘라 개량종의 성장 곡선 및 바이오매스 생산량을 확인하였다(도 2).

도 2의 (A)에 나타낸 바와 같이, 배양한지 18일째에 플라스크의 탁도의 차이를 비교하였을 때, D 배지와 F1.5 배지의 탁도는 진한 녹황색을 띠고 있으나, F1 배지에서는 상대적으로 연한 탁도를 보이는 것을 확인할 수 있다. 도 2의 (B)에서의 성장 곡선 및 바이오매스는 (A)의 결과와 일치하는 경향을 나타냈다. D 배지와 F1.5 배지의 최대 세포밀도는 배양 12일째에 최대치인 약 1,000x10⁴ 세포/mL에 이르는 것을 확인할 수 있으며, 이는 F1 배지가 가지는 약 700 x 10⁴ 세포/mL보다 약 42% 증가된 결과이다.

또한, 18일째 배양액을 모두 수확하여 바이오매스를 측정하였을 때, D 배지와 F1.5 배지는 g/L로 환산 시에 약 0.6 g/L의 바이오매스를 가지는 것으로 확인되었지만 F1 배지는 g/L로 환산 시에 약 0.4 g/L의 바이오매스를 가지는 것으로 확인되었다. 이는 도 1에서 확인된 것처럼 F1 배지에서는 두나리엘라가 영양분 결핍과 같은 스트레스에 의해서 성장률이 저해된 것으로 예상된다. 따라서, 용암해수를 포함하는 배양용 조성물의 조성은 F1.5 배지의 구성이 두나리엘라 개량종의 배양에 더욱 적합한 것으로 확인하였다.

[ 시험예 5] 배양 배지에 따른 두나리엘라 개량종 세포의 색소함량 비교

배양액에 따라서 색소함량이 달라졌는지 여부를 확인하기 위해서 한양대학교 식물생명공학연구실의 HPLC를 이용하여 색소분석을 수행하였다.

상기 시험예 2의 배양조건에서 18일째까지 배양된 두나리엘라 개량종을 수확하여 80% 아세톤을 사용하여 색소를 추출하고 원심분리한 상층액을 다시 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다. 색소를 분리하기 위해 용매의 총 유속은 분당 1.2mL로 하였고, 제 0분 내지 제 15분까지 pH8.0의 Tris는 14%, 아세토니트릴은 84%로부터 0%까지 각각 균일하게 감소시키고, 메탄올과 에틸아세테이트는 2%로 시작하여 제 15분까지 각각 68%, 32%까지 증가시킨다. 이후 3분간(제 15분 내지 18분) 이 용매 비율을 그대로 유지시킨 다음, 1분 동안(제 18분 내지 제 19분) 각 용매의 비율을 시작할 때의 비율로 되돌린 다음 나머지 6분간 그대로 유지하며 포스트-런(post-run)을 하였다. 펌프는 Shimadzu사의 LC-20A Prominence를, 컬럼은 Watera Spherisorb^TM S5 DS1(4.6x250 mm, 5μm Cartridge Column, Maple St. Milford, Massachusetts, USA)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기는 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector: SPD-M20A, Shimadzu)를 사용하여 데이터를 분석하였고 제아잔틴을 비롯한 카로티노이드 색소들은 445nm에서, 엽록소 a는 670nm에서 검출된 결과를 DHL(Agern Alle, Horsholm, Denmark)에서 구입한 제아잔틴과 엽록소 a를 정량한 표준곡선을 스탠다드로 사용하여 농도를 구하였다.

도 3에 제시된 노란색 막대는 루테인(lutein)을, 주황색 막대는 지아잔틴(zeaxanthin)을, 적갈색 막대는 베타-카로틴(beta-carotene)을, 붉은색 막대는 세 가지 유용색소의 총 합을 나타내며, D 배지(28.5 ug/10⁸ 세포) 에 비해서 F1 배지(31.1 ug/10⁸ 세포), F1.5 배지(31.6 ug/10⁸ 세포) 에서 루테인의 함량이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 또 지아잔틴의 함량은 D 배지(24.6 ug/10⁸ 세포), F1.5 배지(23.8 ug/10⁸ 세포)가 F1 배지(21.5 ug/10⁸ 세포) 보다 많았으며, 미소하게 D 배지에서 가장 높은 함량이 확인되었다. 그리고 베타-카로틴은 각각 D 배지(18.5 ug/10⁸ 세포), F1 배지(19.1 ug/10⁸ 세포), F1.5 배지(18.1 ug/10⁸ 세포)로서 배양액에 따라서 큰 함량 차이를 보이지는 않았다. 단, 세 가지 유용색소의 총 합에서는 F1.5 배지가 가장 높은 함량을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

도 2의 바이오 매스 생산량, 도 3의 내용을 고려할 때, F1.5 배지와 유사한 수준의 바이오매스를 생산하면서, 총 잔토필 색소의 생산량이 더 높아, 종래의 D 배지를 효과적으로 대체할 수 있으면서, 더 효율적으로 색소를 생산할 수 있는 배지 조성이라고 판단되며, 이는 약 1/100 가격 수준으로 더 높은 색소 생산을 가능하게 한다는 점에서, 본 발명의 F1.5 배지는 유용한 배양 배지로 활용 될 수 있음을 알 수 있다.

[ 시험예 6] F1.5 배지를 대량 배양에 적용하였을 때, 두나리엘라 개량종의 바이오매스, 무기염류, 황반 색소, 유기 및 무기물의 함량 분석

앞서, 실험실에서의 플라스크 수준의 배양 결과를 통해서 배양 결과를 확인하였으나, 실제 산업에 적용되기 위해서는 대량생산을 통한 두나리엘라 개량종 바이오매스를 얻을 수 있어야 하므로, 본 발명의 F1.5 배지를 이용한 대량 배양을 수행하였다.

5L 플라스크 배양은 도 4에 나타낸 바와 같이 수행되었다. 약 2L의 제주도 용암해수를 기반으로 하고 F1.5 배지를 영양원으로 하는 배양액을 넣고 기포기를 통해 공기를 공급하여 수행되었다. 두나리엘라 개량종 세포가 침전되어 성장이 저해되는 것을 막고, 배양액 내의 영양성분이 골고루 섞이게 하기 위해서 기포기의 공기방울을 이용하였다. 배양 조건은 광도 20 μmol photons/m²s를 명암 조건(명조건 12시간, 암조건 12시간), 온도는 26 ℃로 하였다. 이는 최종 4,000L 배양을 위한 씨드(seed)로 사용되며 이와 같은 방법으로 깨끗한 원 종주를 유지하게 된다. 배양 초기에는 0.19±0.01 g/L의 비율로 접종하였으며, 배양 후 10일에는 0.43±0.03 g/L로 바이오매스가 점차 증가하는 양상을 나타냈다. 배양 종료 시점인 20일 째에는 0.57±0.02 g/L의 바이오매스를 나타냈다(도 5). 이는 하기 도 2의 (B)에 표기된 0.6 g/L의 바이오매스와 동일한 수치를 보이는 것으로, 본 발명의 배양용 조성물을 이용한 대량 배양 환경에서도 두나리엘라 개량종이 충분히 잘 자라고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 F1.5 배지를 이용한 두나리엘라 미세조류의 스케일업(scale-up)의 배양 가능성을 확인하였다고 해석할 수 있다.

따라서, 효과적인 스케일업의 가능성을 확인하기 위해, 300L 규모의 중간 배양은 두나리엘라 개량종을 한국해양과학기술원(제주국제해양과학연구 지원센터) 미세조류 배양 온실 내부에서 앞서 확립한 제주도 용암해수를 기반으로 하고 F1.5 배지를 영양원으로 하는 배양액에서 수행되었다. 300L 규모의 중간 배양은 4,000L 규모의 대량 배양시설에 접종하기 충분한 밀도의 두나리엘라 개량종을 확보하기 위해서 20일간 진행되었다.

개방형 수로지(Open raceway pond, ORP)를 이용한 두나리엘라 개량종의 실증 대량배양(4,000L)은 한국해양과학기술원(제주국제해양과학연구 지원센터) 미세조류 대량배양 실증시설에서 앞서 확립한 제주도 용암해수를 기반으로 하고 F1.5 배지를 영양원으로 하는 배양액에서 수행되었다. 초기 접종은 300L 규모의 중간 배양의 시료를 0.32±0.08 g/L의 비율로 접종하였으며, 8일째에 회분 배양하는 방식으로 배양을 수행하였다. 배양 조건은 자연광을 통한 명암조건에 따라서 광에너지를 조사하였고, 배양수를 유동 혼합시키는 수차의 회전 속도는 15 rpm을 유지하였다.

바이오매스의 변화 패턴은 도 6a에 나타낸 바와 같이, 접종 후 2, 4, 6, 8일 째에 바이오매스의 변화를 측정하였고, 4일째에 최대 0.61±0.06 g/L의 바이오매스를 나타냈다. 이후 바이오매스가 감소하는 패턴을 보이며 배양 8일째에는 0.45±0.01 g/L의 수치를 나타냈다.

ORP를 이용하여 실증 대량배양으로 얻어낸 두나리엘라 개량종의 바이오매스의 수확은 펌프를 이용하여 진행되며 원심분리를 이용하여 탈수과정을 거쳐서 진행된다. 그 후, 동결 건조 과정을 통해서 두나리엘라 개량종 분말을 확보하였다. 대량 배양 바이오매스의 수확은 Cleanpia사의 분리기(Tubular separator. GQLY 125N)를 사용해서 15,000 rpm에서 12시간 동안 이루어졌으며, 펠렛(pellet) 형태의 수확된 바이오매스는 -50 ℃에서 냉동 보관되었다. 일정량이 모아지면 -45℃의 조건의 OPERON사의 동결건조기(FDTA-4508)를 사용하여 48시간 동안 동결건조 시켰다. 대량의 경우에는 Zonesun사의 분쇄기(RH-600A)를, 소량의 경우에는 막자사발을 이용하여 빛에 대한 노출을 최소화하여 분쇄하였다.

ORP를 이용하여 실증 대량배양을 통한 두나리엘라 개량종의 루테인, 지아잔틴 함량을 한양대학교 식물생명공학연구실의 HPLC를 이용하여 확인하였다. 분석 방법은 상기 시험예 5에 나타낸 방법에 따랐다. 접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 째까지 매일 그 함량을 측정하였을 때, 3~5일까지가 최대 루테인, 지아잔틴 함량을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 6c). 약 0.14±0.01 g/L의 루테인과 0.12±0.01 g/L의 지아잔틴의 함량을 확인할 수 있었다. 이를 바이오매스와 연관지어 계산하면, 1g의 건중량 당 약 0.25g의 루테인과 약 0.2g의 지아잔틴을 얻을 수 있을 것으로 예상된다.

ORP를 이용하여 실증 대량배양으로 얻어낸 두나리엘라 개량종 분말의 유기물과 무기물의 성분 분석을 한국분석기술연구원에 의뢰하였다. 도 6b는 두나리엘라 개량종 분말의 무기물 함량을 나타내고 있다. 열량 205.4 kcal/100g, 칼슘 16.72 mg/g, 철분 17.72 mg/g, 마그네슘 63.12 mg/g, 칼륨 7.03 mg/g, 망간 1.04 mg/g, 구리 0.03 mg/g, 인 26.24 mg/g, 아연 0.2 mg/g의 함량을 나타내었다. 이어 도 6d는 두나리엘라 개량종 분말의 유기물 함량을 나타내고 있다. 단백질은 22.2%, 탄수화물 26%, 지질 1.4%, 회분 49.2%의 함량 비율을 나타내고 있다. 이 결과는 실증 대량배양에서 수확한 두나리엘라 개량종 분말의 성분의 지표가 될 수 있다.

Claims (10)

1. 용암해수, 80%(v/v) 내지 90%(v/v), 200 내지 250 mg/L의 NaNO₃, 10 초과 내지 20 mg/L의 NaH₂PO₄·H₂O, 70 내지 110 미만 mg/L의 Na₂SiO₃·9H₂O, 7 내지 10 mg/L의 EDTA 중 FeCl₃, 0.4 내지 0.6 mg/L의 MnCl₂·4H₂O, 0.025 내지 0.04 mg/L의 CoCl₂·6H₂O, ZnSO₄·5H₂O 또는 ZnSO4·7H₂O; CuSO₄·5H₂O; 및 NaMoO₄·2H₂O 또는 Na₂MoO₄·2H₂O;및 H₃BO₃를 포함하는 기탁번호 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주 배양용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 0.044 초과 내지 0.066 mg/L의 ZnSO₄·5H₂O 또는 ZnSO₄·7H₂O,
   0.0196 초과 내지 0.0294mg/L의 CuSO₄·5H₂O 및 0.0126 초과 내지 0.0189 mg/L의 NaMoO₄·2H₂O 또는 Na₂MoO₄·2H₂O를 포함하는 것인, 기탁번호 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주 배양용 조성물.
3. 제1항에 따른 조성물을 포함하는 배지에서 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주를 배양하는 것을 포함하는, KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주 배양 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 배양은 1L 내지 5000L의 배지에서 수행하는 KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주의 대량생산을 위한 것인, KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주 배양방법.
5. 제3항에 있어서,
   상기 배양은 3 내지 5일 동안 수행하는 것인, KCTC 12990BP의 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3) 균주 배양방법.
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