JP6480187B2 - ニツシア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）による混合栄養モードでのドコサヘキサエン酸および／またはエイコサペンタエン酸および／またはカロテノイドの産生 - Google Patents

Description

本発明は、ニツシア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、特にニツシア・ブレビロストリス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｂｒｅｖｉｒｏｓｔｒｉｓ）種の微細藻類を混合栄養モードで特に不連続な照明および／または変化する照明の存在下にて培養する方法に関する。この方法により、バイオマスを高収率にすることと、このようにして培養された微細藻類の脂質、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を豊富にすることが可能になる。また、この方法は、培養された微細藻類中のカロテノイド、特にフコキサンチンを豊富に取得することを可能とする。例えばこの方法により、混合栄養性であって、脂質、より具体的には多不飽和脂肪酸、及びカロテノイド、より具体的にはフコキサンチンの収率が高い、ニツシア、特にニツシア・ブレビロストリスの株を選択することができる。また、本発明は、ニツシア・ブレビロストリス種に属する微細藻類の株のうちで特にカロテノイドの産生に適した新規な株にも関する。ニツシア・ブレビロストリスのこの新規な株は、混合栄養モードでのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はフコキサンチンの産生に有用である。

微細藻類は、独立栄養性の光合成微生物、すなわち光合成によって自律的に増殖する傾向を有する光合成微生物である。

微細藻類は、海水環境や、淡水または塩水のほか、さまざまな地上環境でも増殖する。

淡水または海洋で見つかる微細藻類の大半の種は、一般に、独立栄養性である、すなわち光合成によってしか増殖することができない。それらの種にとって、環境中に有機性の炭素含有基質または有機材料が存在することは有利ではなく、増殖を向上させることはない。

しかし科と起源が非常に多彩な微細藻類のいくつかの種は、厳密には独立栄養性ではないことがわかっている。例えばそのうちの従属栄養性と呼ばれるいくつかは、光がまったくない状態で、発酵によって、すなわち有機材料を利用して増殖することができる。

増殖する上で光合成が不可欠な微細藻類の他の種は、光合成と、環境中に存在する有機材料の両方を利用することができる。混合栄養性と呼ばれるこれらの中間種は、光と有機材料の両方が存在する状態で培養することができる。

“混合栄養性”と呼ばれる藻類のこの特徴は代謝と結び付いていて、その代謝によってこの藻類が光合成と発酵を同時に実行することが可能になっているように思われる。これら２種類の代謝は、藻類の増殖に対するプラスの全体的効果と共存している［Ｙａｎｇ， Ｃ．他（２０００年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻：８７〜１０２ページ］。

現在、微細藻類は多くの工業的プロジェクトの対象となっている。なぜならいくつかの種は、大量の脂質、特に多不飽和脂肪酸を蓄積または分泌することができるからである。

これら多不飽和脂肪酸のうちで、オメガ−３シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）のいくつかの非常に不飽和な脂肪酸（ＨＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡまたはＣ２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはＣ２２：６ ω３）と、オメガ−６シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）からのいくつかの非常に不飽和な脂肪酸、特にアラキドン酸（ＡＲＡまたはＡＡ、またはエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４ ω６）が、栄養学的に重要であると認識されていて、治療の用途で大きな可能性がある。

必須栄養素の一つとして、ＤＨＡは、細胞の通常の機能的発達に必須であり、様々な生化学的プロセス及び機能において、重大な役割を果たす。斯かる高度不飽和の特性は、植物及び動物の両方の細胞膜の特性に関して重要な役割を果たし、低温下での、特に魚の、例えば効率的な適応、あるいは生存を可能とする、流動性、柔軟性、及び選択的透過性をもたらし得る。

ＤＨＡは、ヒトの脳の主要な構成要素である。ＤＨＡは、大脳皮質の１５〜２０％を占め（成人の脳は２０ｇ以上のＤＨＡを含有する）、網膜の３０〜６０％を占める。ＤＨＡは、細胞膜に組み込まれることにより、神経系の発達及び網膜の機能にとって必須であり、映像及び記憶の機構を十分に維持し、適応において主要な役割を果たす。

現在のところ、水産業からの魚油が、市場においてこのようなタイプの脂肪酸の主な供給源になっている。しかしこれらの油には新たな用途（養殖における食品サプリメント、マーガリンへの組み込み）があるにもかかわらず、活発な漁獲活動が理由で海の漁獲資源が少なくなりつつある。

したがって、これらのタイプの多不飽和脂肪酸に対する将来における要求の増大に対処するため、ＥＰＡ、ＤＨＡやＡＲＡといった脂肪酸の新たな供給源を探す必要がある。

微細藻類は、脂肪酸を新たに合成できることに加え、魚油と比べていくつかの利点を有する。微細藻類は、インビトロで制御された条件下において培養できるため、バイオマスを比較的一定の生化学的組成で産生することが可能であることに加え、魚油とは違って不快な臭いがなく、脂質にコレステロールがほとんど含まれないか、まったく含まれていない。

最後に、微細藻類によって産生される脂質は、魚油よりも脂肪酸のプロファイルが簡単であるため、興味の対象である脂肪酸を分離する工程の数が限られる。

現在のところ、藻類の分類は、主に、形態的基準と、細胞に含まれる光合成色素の性質とに相変わらず基づいている。そのため、藻類は種と形態が非常に多彩であるにもかかわらず、この分類では、藻類の種が、独立栄養性、従属栄養性、混合栄養性のどれであるかがほとんどわからない［Ｄｕｂｉｎｓｋｙ他（２０１０年）；Ｈｉｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、第６３９巻：１５３〜１７１ページ］。真核性藻類の分類には１４の門が含まれる。脂肪酸を産生するこれらの門を構成するさまざまな綱の種の間で、微細藻類に含まれる多不飽和脂肪酸の含量が大きく異なっている。さらに、脂質プロファイル中の脂質、特にＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＲＡの相対的な比率は、種と培養条件によって異なる。

一方、カロテノイドも興味の対象となる分子である。これらは一般に色素として使用されるが、抗酸化剤としてヒトの健康に重要な役割も有している。最後に、それらは免疫系を刺激する能力を有する。フコキサンチンはカロテノイドの例であり、これは、日本料理の食材の海藻であるワカメ中に特に含まれる。

微細藻類による脂肪酸及び／又はカロテノイドの産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。

いずれにせよ、微細藻類は、産生する脂肪酸及び／又はカロテノイドの収率増大にとって最適な条件で培養することが望ましい。したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば乾燥材料が３０ｇ／ｌを超えるバイオマスと、乾燥材料に対して２０重量％超の脂肪酸）。

カロテノイドにおいて、微小藻類の乾燥体の０．２％を超える収量が望ましい。

ニツシア属の微小藻類は、北極や南極等の冷たい海に見られる海洋性の珪藻である。これらの微小藻類は、従属栄養モードで、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生産するものとして主に知られている。

しかしながら、ニツシア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｌａｅｖｉｓ）種において、混合栄養モードが研究されており、ＥＰＡの合成に対するその影響が評価されていることに留意されたい。

そこで出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、混合栄養モードで培養できるニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類の株を単離することで、本発明の条件下における多不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ及び／又はＥＰＡ及び／又はフコキサンチンの高収率での産生を可能にした。

このようにして単離されて選択されたニツシア・ブレビロストリスの新規な株である１つの株（ＦＣＣ８１０）が、ブダペスト条約の規定に従ってＣＣＡＰ（藻類と原生生物の培養コレクション、スコットランド海洋科学協会、ダンスタッフネージ海洋研究所、オーバン、アルギル ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、イギリス国）に登録番号ＣＣＡＰ １０５２／２１として寄託された。

培養と選択の方法は、より具体的には、光の強度と周波数がある範囲で特定の変化をする、変化する照明および／または不連続な照明（特にフラッシュの形態の照明）の存在下で微細藻類を有機炭素含有基質とともに混合栄養条件下で培養するというものであった。

微細藻類にとってストレスとなると一般に考えられる明相と暗相（または光の強度がより小さい相）の頻繁な交代により、驚くべきことに、ニツシア・ビレビロストリスの株で、バイオマスと脂質と多不飽和脂肪酸、その中でも特に多不飽和脂肪酸、及び／又はカロテノイド、特にフコキサンチンの産生を増大させることができた。本発明による株を用いることで、光の照射を少なくして多不飽和脂肪酸（特にＤＨＡ、ＥＰＡ、フコキサンチン）を発酵装置の中で工業的に産生させる展望が開け、したがって独立栄養モードでの培養と比べてエネルギーを節約することができるはずである。

本発明のさまざまな側面と利点を以下に詳細に記載する。

したがって本発明は、ニツシア属、特にニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類を、不連続な照明および／または時間変化する照明の条件にて、混合栄養モードで培養する方法に関する。照明は強度が変化し、その振幅は一般に５マイクロモル／ｍ^２秒〜１，０００マイクロモル／ｍ^２秒だが、３０〜４００マイクロモル／ｍ^２秒であることが好ましい。この変化は、一般に１時間につき２〜３，６００回にできるが、１時間につき２〜２００回であることが好ましい。

本発明の方法は、ニツシア属における多不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ及び／又はＥＰＡ、及び／又はカロテノイド、特にフコキサンチンの豊富化を可能とする。

これらの培養条件により、規定量の光を照射することができる。光のこの照射は、不連続な照明の段階および／または変化する照明の段階を含むことができ、強度の変化は、振幅が同じでも異なっていてもよい。照射は、特にフラッシュの形態で行なうことができる。

この方法の利点は、培養で得られるバイオマスの収率が増大することである。別の利点は、このようにして培養した微細藻類の多不飽和脂肪酸、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはカロテノイド、特にフコキサンチンが豊富になることである。この方法は、混合栄養性で多不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはカロテノイドの収率が高いニツシア属の株、特にニツシア・ブレビロストリス種の株を選択するのにも利用できる。

この微細藻類の混合栄養モードでの培養は、照明条件がどのようであれ、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質を蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはラクトース、および／または蔗糖、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。

培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って微細藻類を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。

この方法は、より具体的には、ニツシア属の微細藻類（門：Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ、目：Ｂａｃｉｌｌａｒｉａｃｅａｅ、科：Ｂａｃｉｌｌａｒｉａｃｅａｅ）［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、有機炭素含有基質を添加した無機培地、例えばｆ培地プラス窒素強化シリカ［Ｇｕｉｌｌａｒｄ， Ｒ．Ｒ．Ｌ． （１９７５）． Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ， ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ， ｐｐ ２６−６０． Ｓｍｉｔｈ Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｃｈａｎｌｅｙ Ｍ．Ｈ （Ｅｄｓ．） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］の中で特に１０μＥを超える光を照射して培養できる株を選択するためのものである。有機炭素含有基質は、グルコースまたは乳酸塩を５ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。

ニツシア、より具体的にはニツシア・ブレビロストリスのこの新規な株は、以下に記載する本発明の方法による選択と培養の方法によって単離し、選択することができる。

本発明によるニツシア・ブレビロストリス株の代表的な１つの株は、出願人が単離したＦＣＣ８１０株であり、ＣＣＡＰに登録番号ＣＣＡＰ １０５２／２１として寄託された。このような株は、本発明によれば、変化する光または不連続な光を照射して混合栄養モードで培養するとき、大量のバイオマスと脂質（より具体的にはＥＰＡとＡＲＡ）を産生することができる。また、それらは顕著な量のカロテノイド、特にフコキサンチンを生産することも出来る。

完了した分類分析によれば、ＣＣＡＰ １０５２／２１株は、ニツシア・ブレビロストリス種に属する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸（例えばＥＰＡとＡＲＡ）の産生が可能なニツシア・ブレビロストリス種のあらゆる株に関する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸（例えばＤＨＡ）の産生が可能なニツシア属の微細藻類のあらゆる種にも関する。

本発明は、本願に記載されるような混合栄養培養条件下で増殖し、脂肪酸、例えばＤＨＡ及び／又はＥＰＡ及び／又はカロテノイド、特にフコキサンチンを生産できるニツシア属の微細藻類にも関する。

本発明によって単離されたニツシア・ブレビロストリス株により、混合栄養条件下で、大量のバイオマスと、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡが豊富な脂質を産生させることができる。なおそのＤＨＡおよび／またはＥＰＡは、微細藻類に含まれる全脂質の２０％超、または２５％超、または３０％超を占めることができる。

また、本発明のニツシア・ブレビロストリスの単離された株は、混合栄養条件下で、顕著な量のカロテノイド、特にフコキサンチンを生産でき、その量は、微細藻類の全乾燥重量（微小藻類中のカロテノイド成分を含む）に対して０．２％超、より好ましくは０．２５％超である。

本発明では、出願人が単離したＦＣＣ８１０株を用い、変化する照明および／または不連続な照明（特にフラッシュの形態の照明）の存在下にて混合栄養条件で培養することによって得られたバイオマスは、従属栄養モードで同じ株を培養した場合よりも１０〜６０％、より一般には２０〜５０％多い。従属栄養モードとは、照明がないものの、同一の培養培地を用いた培養条件を意味する。

したがって本発明は、ニツシア属、特にニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類を、時間変化する照明および／または不連続な照明（例えばフラッシュの形態の照明）の存在下にて混合栄養モードで培養し、多不飽和脂肪酸（例えばＤＨＡおよび／またはＥＰＡ、及び／又は１つ以上のカロテノイド、例えばフコキサンチン）を産生させる方法に関する。

したがって本発明は、混合栄養性であって多不飽和脂肪酸（例えばＤＨＡおよび／またはＥＰＡ、及び／又は１つ以上のカロテノイド、例えばフコキサンチン）の収率が大きいニツシア属、特にニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類を、時間とともに変化する照明および／または不連続な照明の存在下で選択する方法に関する。

特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、藻類の増殖に好ましい影響があり、特に脂質及び／又はカロテノイドの産生に関して藻類の生産性を増大させうることがわかった。

発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を微細藻類に照射すると、増殖と脂質及び／又はカロテノイド合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において微細藻類は環境の制約に対抗するため予備の脂質及び／又はカロテノイドを蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。

不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。

本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。

一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。フラッシュは、定期的な時間間隔で発生させること、または不定期な時間間隔で発生させることができる。定期的な時間間隔での発生の場合、１時間あたりのフラッシュの数は、時間間隔（Ｔ）を持つ頻度（Ｆ）に対応し、Ｆ＝１／Ｔになると考えられる。この時間間隔は１秒〜３０分、または１秒〜３６秒、または１．２秒〜３０秒、または１．４４秒〜９秒、または１．８秒〜６秒、または２．４秒〜４．５秒にすることができる。この時間間隔は１８秒〜３０分にすることもできるが、２４秒〜６分が好ましく、３６秒〜４分がより好ましく、７２秒〜３分がさらに好ましい。１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ^２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ^２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ^２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ^２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ^２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ^２秒に対応する（アインシュタイン）。

本発明の特別な一実施態様によれば、光の強度は５０〜２００マイクロモル／ｍ^２秒であり、フラッシュの時間間隔は、フラッシュの持続時間が１秒間〜１分間だと１０秒〜６０分である。

本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。

本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ^２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１，０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ^２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ^２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ^２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ^２秒がより好ましい。

光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ^２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ^２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ^２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ^２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ^２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ^２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ^２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ^２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ^２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ^２秒に、または０と１，０００マイクロモル／ｍ^２秒にすることもできる。

本発明の一実施態様によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。

培養の初期段階において細胞密度が約１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ^２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ^２秒にすることができる。培養物が１０^６〜１０^７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０^７〜１０^８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜４００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくすることが好ましい。

本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ^２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ^２秒にすることができる。培養物が１０^６〜１０^７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０^７〜１０^８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１，０００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ^２秒まで大きくすることが好ましい。

本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ^２である。この量は、１時間あたり約４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ^２にすることができる。

本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。

光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ^２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ^２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ^２であることがさらに好ましい。培養物が１０^６〜１０^７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０^７〜１０^８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ^２まで増大させることがさらに好ましい。

本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ^２〜４５００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０^６〜１０^７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０^７〜１０^８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。

本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ^２〜３０，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０^６〜１０^７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０^７〜１０^８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ^２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ^２であることを意味する。

培養物への光の照射は、発酵装置の外壁の周囲に配置した複数のランプによって実現できる。クロックが、これらのランプを決められた照射時間だけ稼働させる。発酵装置は、日光があたらない容器の中に位置している。その容器の周囲温度は制御できることが好ましい。

出願人が確認できたように、このようにして選択した株が混合栄養モードで不連続な光および／または変化する光の存在下においてうまく増殖できるという事実があるため、上記の株は多不飽和脂肪酸、特にＤＨＡとＥＰＡ、及び１つ以上のカロテノイド、特にフコキサンチンをより多く産生することができる。

したがって本発明の培養方法により、出願人が単離してＣＣＡＰにＣＣＡＰ １０５２／２１という番号で寄託した株と同様、混合栄養性であって多不飽和脂肪酸及び／又はカロテノイドの収率が高いニツシア属の特にニツシア・ブレビロストリス種の株を選択することができる。この培養方法は、
ａ）強度が変化し、その変化の振幅は５〜１，０００マイクロモル／ｍ^２秒、好ましくは５〜４００マイクロモル／ｍ^２秒であり、その変化は１時間に２〜３，６００回、好ましくは５〜４００回である、不連続な照明および／または時間変化する照明という条件下でニツシア属の１種類以上の株を混合栄養モードで培養するステップと、
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にてこの培養物を数世代にわたって維持するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップ
を含むことを特徴とする。

“回収ステップ”とは、より具体的には、上記の継代の間に細胞の数が最も増加した株の単離を意味する。

有利な場合、混合栄養モードでの培養は、時間中不連続及び／又は可変的な照明条件下で実施され、当該照明は強度を変動でき、その振幅は、５ μｍｏｌ．ｍ^−２．ｓ^−１〜 ４００ μｍｏｌ．ｍ^−２．ｓ^−１に含まれ、これらの変化は、１時間に２〜２００回行われる。

株を選択するため、ニツシア属の特にニツシア・ブレビロストリス種のさまざまな株を同一の容器内の複数のマイクロプレート上で並列に培養し、そのさまざまな培養物の条件と変化をしっかりとモニタすることができる。したがってさまざまな株が、不連続な照明および／または変化する照明に対してと、場合によっては培地に添加した１種類または複数種類の炭素含有基質に対してどのように応答するかが容易にわかる。

不連続な照明および／または変化する照明と炭素含有基質の添加に対して好ましい応答をする株が、品質（脂質プロファイル中に多不飽和脂肪酸がより豊富に存在し、カロテノイドの中でフコキサンチンがより豊富になる）と量（脂質が、ＤＨＡ及び／又はＥＰＡをより多い割合で含む）の面で脂質及びカロテノイドの産生に関して一般に最高の収率を提供する。

微細藻類は、発酵装置の中で不均一な集団から選択することができる。その集団から、本発明の選択法により、特定の範囲の光強度と特定の周波数を持つ不連続な光および／または変化する光を混合栄養という培養条件と組み合わせて有利な変異体を選択する。この場合、培養は、培養物の中で微細藻類を多くの世代にわたって維持しながら実施し、次いで培養が終わったとき、培地の中で過半を占めるようになった成分を単離する。

本発明の培養方法により、脂質も産生させることができる。

その場合、本発明の方法は、
ｄ）微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した脂質からＤＨＡ及び／又はＥＰＡを抽出するステップ
をさらに含んでいる。

本発明の培養方法は、カロテノイドを生産することも可能とする。この場合、本発明の方法は、更に次の工程：
ｄ）微細藻類から疎水性物質を回収する工程；及び任意で
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ及び／又はＥＰＡ及び／又はフコキサンチンを抽出する工程
を含む。

本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件において増殖できてＤＨＡ及び／又はＥＰＡ及び／又はフコキサンチンの産生が可能なニツシア属のあらゆる種にも適用できる。

本発明の培養方法により、培養で得られるバイオマスの産生を最適化することができる。この方法により、このようにして培養された微細藻類の脂肪酸（特にＤＨＡ及び／又はＥＰＡ）、及びカロテノイド、特にフコキサンチンを豊富にすることもできる。

したがって本発明は、上記の方法に従って培養または選択することが好ましい混合栄養性のニツシア属の微細藻類の培養を通じてバイオマスの産生と脂質（特に脂肪酸）の産生を最適化し、次いでこのようにして培養した微細藻類を回収してそこから脂質（特にＥＰＡおよび／またはＡＲＡ）を抽出することも目的とする。また、本発明は、カロテノイド、特にフコキサンチンの生産を最適にすることにも関する。ニツシア・ブレビロストリス種の株が特に関係する。

脂質（その中にＥＰＡとＡＲＡが含まれる）を選択的に抽出する方法は当業者に知られており、例えば［Ｂｌｉｇｈ， Ｅ．Ｇ． ａｎｄ Ｄｙｅｒ， Ｏ．Ｋ． （１９５９）； Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３７：９１１−９１７］及び［ＭｃＣｒｅａｒｙ ＤＫ， Ｋｏｓｓａ ＷＣ， Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｓ， Ｋｕｒｔｚ ＲＲ． （１９７８）， “Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｆｏｒ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｅｄｉｂｌｅ ｆａｔｓ ａｎｄ ｏｉｌｓ”， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ． １６（８）：３２９−３１．］に記載されている。

フコキサンチンを含むカロテノイドの抽出及び解析方法は、当業者に知られており、例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） （Ｓ．Ｗ． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｓ．Ｗ． Ｊｅｆｆｒｅｙ， Ｒ．Ｆ．Ｃ． Ｍａｎｔｏｕｒａ， Ｃ．Ａ． Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ， Ｔ． Ｂｊｏｒｎｌａｎｄ， Ｄ． Ｒｅｐｅｔａ， Ｎ． Ｗｅｌｓｃｈｍｅｙｅｒ ： Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ ａｎｄ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ． Ｍａｒｉｎｅ ｅｃｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｓｅｒｉｅｓ ： Ｖｏｌ． ７７： １８３−１９６， １９９１）に記載されている。

本発明は、上記の本発明の方法に従って得ることのできるニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類にも関する。これら微細藻類は多不飽和脂肪酸が豊富である。このような微細藻類の全脂質には、一般に、その微細藻類に含まれる全脂質の２０％超または２５％超、しばしば３０％超のＤＨＡ及び／又はＥＰＡが含まれている。また、当該微細藻類は、当該微細藻類の乾燥重量の０．２％超、好ましくは０．２５％超のフコキサンチンをも含有し得る。

コンピュータで監視する専用の自動制御装置を備えた有効体積が２リットルの発酵装置（バイオリアクター）の中でニツシア・ブレビロストリスＦＣＣ８１０を培養する。このシステムのｐＨは、塩基（１Ｎの水酸化ナトリウム溶液）および／または酸（１Ｎの硫酸溶液）を添加して調節する。培養温度は２５℃に設定する。ラッシュトンの配置（下方にポンピングする３枚刃のインペラ）に従ってシャフトに取り付けた２つの撹拌用ロータを利用して撹拌する。撹拌速度と換気量は、最小＝１００ｒｐｍ、最大＝２５０ｒｐｍ、Ｑ最小＝０．５ｖｖｍ、Ｑ最大＝２ｖｖｍにそれぞれ調節する。バイオリアクターには、透明な容器を取り囲む外部照射システムが取り付けられている。

温度制御した容器（２５℃）内の撹拌台（１４０ｒｐｍ）の上で事前培養物を反応装置に接種し、８０〜１００μＥの光を照射した。事前培養とバイオリアクター内での培養は、ｆ培地プラス窒素強化シリカの中で実施する。バイオリアクター内で混合栄養培養に用いる有機炭素含有基質は、濃度が１００ｍＭ〜１５０ｍＭのグルコースである。

培養物のモニタリング

乾燥重量を測定して全バイオマスの濃度をモニタリングする（ＧＦＢフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社）で濾過し、次いで１００℃にて少なくとも２４時間にわたって乾燥させた後、計量する）。

全脂質を定量するため、７．１０^８細胞／ｍｌを抽出した。脂質の抽出法は当業者に知られている。

照明

培養物に１時間につき１８０回のフラッシュを照射する。各フラッシュは持続時間が５秒間であり、強度は３００マイクロモル／ｍ^２秒である。

バイオリアクターの中での培養物に対する光の照射は、発光ダイオードの外壁の周囲に配置した複数のＬＥＤ（発光ダイオード）ランプによってなされた。ＬＥＤに対する電力供給は、照明時間又はフラッシュにおける自動化されたコントロールにより管理される。

Claims (8)

1. ニツシア・ブレビロストリスの微細藻類を取得する方法であって、以下のステップ：
   ａ）振幅が５０〜４００μｍｏｌ．ｍ^−２．ｓ^−１であり、変化が１時間につき２〜２００回起こる、５秒間〜１０分間の持続時間で明相と暗相が切り替わるフラッシュの形態で供給される不連続な照明の条件下にて混合栄養モードでニツシア属の１つ以上の株を培養するステップ、
   ｂ）培地内の有機炭素含有基質の存在下で数世代にわたって前記培養物を維持するステップ、及び
   ｃ）このように培養した微細藻類を回収するステップ、
   を含む方法。
2. 前記培養を５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度の炭素含有基質の存在下で実施し、その有機炭素含有基質の選択を、乳酸塩、ラクトース、蔗糖、酢酸塩、グリセロール、グルコース、セルロース誘導体、これら分子の混合物の中から行なうことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 培地の中に存在する前記有機炭素含有基質が少なくとも５ｍＭのグルコースを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. フラッシュの数が、１時間につき１０〜１５０回であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. １時間あたりの全光照射量が、フォトンのマイクロモル数を単位として２，０００〜６００，０００マイクロモル／ｍ^２、好ましくは２，０００〜２００，０００μｍｏｌ．ｍ^−２であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 更に、以下のステップ：
   ｄ）その微細藻類から疎水性物質を回収するステップ、必要に応じて
   ｅ）回収したその疎水性脂質からＤＨＡ及び／又はＥＰＡ及び／又はフコキサンチンを抽出するステップ、
   を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ニツシア・ブレビロストリス種の微細藻類が、受入番号ＣＣＡＰ １０５２／２１でＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に供託されたＦＣＣ ８１０株に対応することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により取得できる、微細藻類の全乾燥重量の０．２％超のフコキサンチンを含有することを特徴とする、ニツシア属の微細藻類。