WO2013136024A1 - Production d'acide eicosapentaenoique et/ou d'acide docosahexaenoique en mode mixotrophe par cyclotella - Google Patents

Production d'acide eicosapentaenoique et/ou d'acide docosahexaenoique en mode mixotrophe par cyclotella Download PDF

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WO2013136024A1
WO2013136024A1 PCT/FR2013/050541 FR2013050541W WO2013136024A1 WO 2013136024 A1 WO2013136024 A1 WO 2013136024A1 FR 2013050541 W FR2013050541 W FR 2013050541W WO 2013136024 A1 WO2013136024 A1 WO 2013136024A1
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WO
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μιτιοι
culture
dha
microalgae
cyclotella
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Application number
PCT/FR2013/050541
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English (en)
Inventor
Khadidja Romari
François GODART
Pierre Calleja
Original Assignee
Fermentalg
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a method of cultivation in mixotrophic mode, especially in the presence of a discontinuous illumination and / or variable light, of a microalga of the genus Cyclotella, in particular of the species Cyclotella cryptica.
  • the method makes it possible to obtain a high yield of biomass and an enrichment of the microalgae thus cultivated with lipids and more particularly with eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the method thus makes it possible to select Cyclotella cryptica strains of a mixotrophic nature, and having a high yield of lipids, and more particularly of polyunsaturated fatty acids.
  • the invention also relates to a new microalgae strain belonging to the species Cyclotella cryptica, particularly suitable for the production of fatty acids.
  • This new strain of Cyclotella cryptica is useful for producing ⁇ (eicosapentaenoic acid) and docosahexaenoic acid (DHA) in mixotrophic mode.
  • ⁇ eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are usually autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis. For these, the presence in their medium of organic carbon substrates or organic matter is not favorable to them and does not improve their growth.
  • a certain Many species of microalgae, of families and of very diverse origins prove not to be strictly autotrophic. Thus some of them, called heterotrophic, are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • microalgae species for which photosynthesis remains essential for their development, are able to take advantage of both photosynthesis and organic matter present in their environment. These intermediate species, called mixotrophs, can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • AGH I highly unsaturated
  • PUFA-CJU3 eicosapentaenoic acid
  • DHA or C22: 6 ⁇ 3 docosahexaenoic acid
  • PUFA-CJU6 arachidonic acid
  • ARA or AA or eicosatetraenoic acid C20: 4 ⁇ 6 have a recognized nutritional importance and have high potential in terms of therapeutic applications.
  • DHA is necessary for the normal and functional development of cells, and plays a crucial role in various biochemical processes and functions. Its polyunsaturated nature gives it a crucial importance vis-à-vis the properties of the cell membrane, in plants as in animals: fluidity, flexibility and selective permeability allowing, for example, effective adaptation, and even survival, at low temperatures. especially in fish.
  • DHA is a major structural constituent of the human brain and is its main AG. DHA represents 15-20% of the cerebral cortex (the brain of an adult contains at least 20 g of DHA) and 30-60% of the retina. It is essential for the development of the central nervous system and retinal function, by incorporation into cell membranes, and plays a vital role in the satisfactory acquisition and maintenance of the mechanisms of vision and memory.
  • New sources of these fatty acids such as ⁇ , DHA and TARA must therefore be sought in order to meet, in the future, the growing market demand for this type of polyunsaturated fatty acids.
  • microalgae offer several advantages over fish oils: they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a biomass of relatively constant biochemical composition and, d. On the other hand, unlike fish oils, they do not have an unpleasant smell and their lipids contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by microalgae have a simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • the taxonomic classification of eukaryotic algae contains 14 phyla.
  • species of the different classes composing these phyla which produce fatty acids, there are significant variations in the content of polyunsaturated fatty acids in microalgae.
  • the relative proportions of lipids, in particular EPA, DHA and ARA in the lipid profiles vary according to the species and the culture conditions.
  • the main microalgae of interest, producing EPA and DHA, are marine species. However, of the hundreds of thousands of marine microalgae species, only a small number have a high content of both of these fatty acids at the same time and sufficient capacity to be cultured in vitro.
  • the species of interest are mainly Bacillariophytes (or diatoms) derived from marine phytoplankton. They are generally characterized by active production of EPA, but often produce rather low levels of DHA.
  • the cultures can be carried out in autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions depending on the strain, the temperature, the light conditions and the size of the fermenters.
  • crops can also be grown in one-liter containers, in a laboratory, in photobioreactors, and in 100,000-liter containers or in open ponds (several hectares).
  • energy expenditure and other resources such as labor and the ease of continuing cultivation must be taken into account by developing ideal growing conditions.
  • the microalgae be grown under optimal conditions to increase the yield of (s) fatty acid (s) to produce.
  • the highest possible yield for example biomass above 30 g / l of material dry, and more than 50% of fatty acids by weight relative to the total weight of the dry matter.
  • Cyclotella cryptica is a diatom (a bacillariophyte originally isolated from brackish water in Massachusetts, USA) known to produce ⁇ as well as DHA in autotrophy.
  • German Patent Application DE4018820 discloses the cultivation of the Cryptomonas ovata, Chlorella fusca, Scenedesmus accuminatus and Cyclotella cryptica strains under autotrophic conditions to produce ⁇ .
  • Table 1 of this application shows comparative results between strains: the yield of the strain Cyclotella cryptica, is 45.6 g of lipids per 100 grams of dry matter, with 22.0% by weight of PUFA and 17.4 % by weight of EPA on the total weight of dry matter.
  • an alternative to the autotrophic culture would be to practice the cultures in heterotrophic mode, that is to say in the absence of light with a supply of energy in the form of carbon substrates organic, or in mixotrophic mode, that is to say with a light input of less intensity and in the presence of a supply of organic substrate.
  • the cultivation and selection process consisted more particularly in cultivating microalgae under mixotrophic conditions, in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes, with a range of variations in light intensity and a frequency specific.
  • strains of Cyclotella cryptica a high production of biomass, lipids and more. especially polyunsaturated fatty acids.
  • This implementation of the strains according to the invention opens the prospect of an industrial production of polyunsaturated fatty acids, in particular EPA and DHA, in fermentors benefiting from a reduced light input, and therefore should to save energy compared to autotrophic farming methods.
  • the subject of the present invention is therefore a process for cultivating microalgae of the genus Cyclotella, in particular of the Cyclotella cryptica species, in mixotrophic mode.
  • the process according to the invention makes it possible to enrich the microalgae of the Cyclotella genus with polyunsaturated fatty acids and more particularly with EPA and DHA.
  • the illumination has intensity variations whose amplitude is generally between 5 ⁇ . m “2 , s " 1 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 30 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1 . These variations can generally take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour. These cultivation conditions make it possible to provide a defined quantity of light. This luminous contribution may comprise phases of discontinuous and / or variable illumination, with variations in intensity that may have identical or different amplitudes.
  • the illumination can be in particular in the form of flashes.
  • This process has the advantage of increasing the yield of biomass obtained from the culture. It also has the advantage of enriching the microalgae thus cultured in polyunsaturated fatty acids, more particularly in eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • This method can also be used to select strains of the genus Cyclotella, in particular of the Cyclotella cryptica species, of a mixotrophic nature, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids, especially ⁇ (eicosapentaenoic acid) and / or DHA. (docosahexaenoic acid).
  • the mixotrophic culture of this microalga is preferably carried out in the presence of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and even more preferably from 100 mM to 150 mM. an organic carbon substrate.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration.
  • This organic carbon substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture: glucose, cellulose derivatives, lactate, starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates organic carbon adapted to the mixotrophic culture of microalgae according to the invention.
  • This process is more particularly intended for the implementation of new microalgae strains of the genus Cyclotella (Division: Bacillariophyta, Order: Thalassiosirales, Family: Stephanodiscaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic nature, especially for their ability to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ l, in a mineral medium, for example F / 2 + medium if [Guillard, RRL (1975); Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, pg. 26-60. in Smith WL and Chanley M. H (eds.) Culture of Marine Invertebrate Animais. Plenum Press, New York, USA], in which is added an organic carbon substrate.
  • the organic carbon substrate comprises glucose, lactate, in a concentration equivalent to or greater than 5 mM.
  • These new strains of Cyclotella, more particularly Cyclotella cryptica can be isolated and selected according to the method of selection and culture according to the invention described below.
  • a representative strain of the Cyclotella cryptica strains according to the invention is the strain FCC 971 isolated by the applicant and deposited at the CCAP, under the number CCAP 1070/7.
  • Such strains are capable of producing significant amounts of biomass as well as lipids and more particularly of EPA and DHA when they are cultivated in mixotrophic mode with a variable or discontinuous light supply, according to the invention.
  • the CCAP 1070/7 strain belongs to the species Cyclotella cryptica.
  • the invention relates to any strain of the species Cyclotella cryptica, capable of growing in mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as DHA and ⁇ .
  • the invention also relates to any microalgae species of the genus Cyclotella, capable of growing under mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as DHA and ⁇ .
  • the strains of Cyclotella cryptica isolated according to the invention make it possible to produce, under mixotrophic conditions, significant amounts of biomass as well as lipids rich in EPA and / or DHA, said EPA being able to represent more than 40%, or more than 50% , and said DHA may represent more than 10%, or more than 20%, or more than 30% of the total lipids contained in microalgae.
  • FCC 971 isolated by the applicant, from a culture under mixotrophic conditions in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes, is from 10 to 60%, more generally from 20 to 50%, greater than that of a culture with the same strain carried out in heterotrophic mode.
  • Heterotrophic mode means culture conditions with an identical culture medium, but without the addition of light.
  • the subject of the invention is thus a process for the cultivation of microalgae of the genus Cyclotella, in particular of the Cyclotella cryptica species in mixotrophic mode, in the presence of a variable or discontinuous illumination over time, for example in the form of flashes, in particular to produce polyunsaturated fatty acids, such as ⁇ and DHA.
  • the subject of the invention is thus a process for the selection of microalgae of the genus Cyclotella, in particular of the Cyclotella cryptica species with a mixotrophic nature, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids such as ⁇ and DHA, in the presence of an illumination. variable and / or discontinuous over time.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes.
  • a flash within the meaning of the invention, is a short period of illumination, that is to say less than 30 minutes.
  • the duration may be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes or more preferably less than 1 minute.
  • the flash duration may be less than one second.
  • the flash duration can be 1/10 of a second, or 2/10 of a second, or 3/10 one second, or 4/10 of a second or 5/10 of a second, or 6/10 of a second, or 7/10 of a second, or 8/10 of one second, or 9/10 of a second.
  • the illuminance, or flash is usually longer than 15 seconds. It is generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • This time period can be between 1 second and 30 minutes, or between 1 second and 36 seconds, or between 1, 2 seconds and 30 seconds, or between 1.44 seconds and 9 seconds, or between 1.8 seconds and 6 seconds. seconds, or between 2.4 seconds and 4.5 seconds.
  • This frequency can also be between 18 seconds and 30 minutes, preferably between 24 seconds and 6 minutes, more preferably between 36 seconds and 4 minutes, and even more preferably between 72 seconds and 3 minutes.
  • the number of flashes per hour is chosen according to the intensity and duration of the flashes (see below). In general, the intensity of the light provided in the form of flashes is between 5 and 1000 ⁇ . m "2 , s " 1 , preferably between 5 and 500 ⁇ . m "2 , s " 1 , or 50 and 400 ⁇ .
  • 1 ⁇ . m “2 , s “ 1 corresponds to 1 ⁇ m “2 , s “ 1 (Einstein), a unit often used in the literature.
  • the intensity of the light is between 50 and 200 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 , the time period of the frequency flashes are between 10 seconds and 60 minutes for a flash time of between 1 second and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time. This variation in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the invention, it is also possible to carry out a light supply combining continuous and discontinuous illumination phases.
  • the light intensity provided to the algae in culture varies at least one times in one hour.
  • the amplitude of this light intensity variation is generally between 5 and 1000, or between 50 and 800, or between 100 and 600 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light can also vary between 5 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1
  • the amplitude of the light intensity variation is between 70 and 300 ⁇ . m “2 , s " 1 and more preferably between 100 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • Said luminous intensity can successively achieve, under variable lighting conditions, for example, the values 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 100 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 5 and 400 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 50 and 800 ⁇ . m “2 , s “ 1 several times each hour.
  • Said luminous intensity can successively reach, preferably the values 50 and 200 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • said luminous intensity can successively, several times in the hour, for example, the values 0 and 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 , the values 0 and 100 ⁇ .
  • the intensity of the light brought to the culture varies according to the cell density.
  • the cell density is the number of cells per ml and is measured according to the techniques known to those skilled in the art.
  • the light intensity can be between 5 and 15 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the light intensity can be increased to between 15 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 20 and 50 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the luminous intensity can be increased to between 50 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 50 and 150 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the intensity of the light may be greater compared to the values mentioned above.
  • the light intensity can be between 5 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 30 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 50 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the luminous intensity can be increased to between 100 and 1000 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 for example, preferably between 200 and 500 ⁇ .
  • the quantity of light brought to the culture in the hour remains between certain values. It is between about 2000 and 600 000, preferably between 2000 and 300 000 ⁇ . m "2. It can be between about 4000 and 200,000 ⁇ . m" 2 per hour.
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 10 ⁇ . m “2 , s " 1 . The latter gives a total light input per hour of 9000 ⁇ . m “2.
  • culture is illuminated with 20 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 20 ⁇ . m “2 , s " 1 . The latter gives a total light input per hour of 12,000 ⁇ . m “2.
  • the culture is irradiated with 45 flashes per hour, each flash having a duration of 15 seconds and an intensity of 5 ⁇ .
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity of 200 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 240,000 ⁇ . m “2 .
  • the amount of light provided to the culture per hour may vary depending on the cell density.
  • the total light input in the hour is generally between about 1500 and 8000, preferably 1500 and 6000 ⁇ . m “2 , more preferably between 2000 and 5000 ⁇ . m " 2 .
  • the total light supply in the hour can be increased to between 6000 and 67 000 ⁇ . m "2 , preferably between 6000 and 50 000 and more preferably between 12 000 and 45 000 ⁇ . m " 2 , for example.
  • the total light supply in the hour can be increased to between 45,000 and 300,000, for example preferably between 45 to 300,000. 000 and 200 000 ⁇ . m "2 , and for example, more preferably between 50,000 and 150,000 ⁇ . m " 2 .
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and a intensity between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 2250 ⁇ . m “2 to 4500 ⁇ . m “ 2 .
  • the intermediate stage at a cell density between 10 6 and 10 7 cells per ml, the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 15 and 50 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 which gives a total light input per hour of 13,500 to 45,000 ⁇ . 2. Then, at final stage of the culture (at a cell density between 10 7 and 10 8 cells per ml), the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 50 and 150 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 45,000 to 135,000 ⁇ . m "2 .
  • the duration of the flashes is for example less than one minute, or less than one second
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 50 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 15,000 ⁇ . m “2 to 30,000 ⁇ . m “ 2 .
  • the culture is illuminated with 50 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 200 and 300 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 100,000 to 150,000 ⁇ . m "2.
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 350 and 450 ⁇ m "2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 420,000 to 540,000 ⁇ . m "2 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention thus makes it possible to select strains of the genus Cyclotella, in particular of the Cyclotella cryptica species with a mixotrophic nature, similar to that isolated by the applicant and filed at the CCAP under the number CCAP 1070/7, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids, especially DHA and EPA.
  • This process for producing EPA and / or DHA is characterized in that it comprises the following steps:
  • recovery step is meant more particularly the isolation of the strain or strains whose cell number has grown the most during said generations.
  • the cultivation in mixotrophic mode is carried out under discontinuous and / or variable illumination conditions over time, the illumination having intensity variations whose amplitude is between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , these variations taking place between 2 and 200 times per hour
  • various strains of the genus Cyclotella in particular of the species Cyclotella cryptica, can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure, with precise monitoring of the conditions and the evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the different strains to the discontinuous and / or variable illumination and, where appropriate, the addition of one or more organic carbon substrates in the culture medium. Strains that respond favorably to discontinuous and / or variable illumination and to organic carbon substrates generally offer a better yield for lipid production in terms of quality (polyunsaturated fatty acids more abundant in the lipid profile) and quantitative (lipids contain a higher proportion of EPA and / or DHA).
  • the microalgae can be selected in a fermentor from a heterogeneous population and we seek to select variants favored by the selection mode according to the invention combining discontinuous and / or variable light having a range of light intensity and a specific frequency, with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture method according to the invention also makes it possible to produce lipids.
  • the method according to the invention also comprises the following steps:
  • the culture method according to the invention can also be applied to any species of the genus Cyclotella, capable of growing under the mixotrophic conditions according to the invention, and capable of producing ⁇ and / or DHA.
  • the culture method according to the invention makes it possible to optimize the production of the biomass obtained from the culture. It also makes it possible to enrich the microalgae thus cultivated with polyunsaturated fatty acids, more particularly eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • polyunsaturated fatty acids more particularly eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • the invention therefore also aims at optimizing the production of biomass, as well as the production of lipids, in particular fatty acids, via the cultivation of microalgae of the genus Cyclotella of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the methods previously referred to, then the recovery of microalgae cultivated to extract the lipid content, especially ⁇ and / or DHA. Strains of the species Cyclotella cryptica are especially concerned.
  • the invention also relates to microalgae of the genus Cyclotella, which can be obtained according to the process of the invention as previously described. These microalgae are enriched in polyunsaturated fatty acids.
  • the total lipids of such microalgae generally comprise more than 30%, often more than 40% EPA and / or more than 10% DHA relative to the total percentage of lipids.
  • the cultures of Cyclotella cryptica FCC 971 were carried out in fermenters (bioreactors) of 1, 5L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 23 ° C.
  • Stirring is carried out by means of two stirring shakers placed on the shaft according to the following configuration: Rushton propeller and three-bladed pumping propellers.
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture carried out on a stirring table (140 rpm) in thermo-steady enclosure (23 ° C.) and illuminated between 80 and 100 ⁇ .
  • Pre-cultures and bioreactor cultures are performed in modified SK medium (Stephen L. Pahl, David M. Lewis, Feng Chen, Keith D. King, J Appl Phycol 2010 April, 22 (2): 165-171)
  • the organic carbon substrate used for the bioreactor mixotrophic culture is glucose at concentrations between 100 mM and 150 mM. Crop monitoring
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GFB filter, Whatman, then drying in an oven at 100 ° C for a minimum of 24 hours before weighing).
  • the crop is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 80 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • LEDs Electro Luminescent Diodes
  • Computer control triggers the power supply of the LEDs for lighting times or flashes.

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Cyclotella cryptica permettant une production à haut rendement de lipides, notamment de l'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou de l'acide docosahexaénoïque (DHA), en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches, utilisant un apport de lumière variable et/ou discontinu notamment sous forme de flashs.

Description

Production d'acide éicosapentaénoïque et/ou d'acide
docosahexaénoïque en mode mixotrophe par Cyclotella
L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une microalgue du genre Cyclotella, en particulier de l'espèce Cyclotella cryptica. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des microalgues ainsi cultivées en lipides et plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide docosahexaénoïque (DHA). Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches de Cyclotella cryptica à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides, et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés. L'invention se rapporte aussi à une nouvelle souche de microalgue appartenant à l'espèce Cyclotella cryptica, particulièrement adaptée à la production d'acides gras. Cette nouvelle souche de Cyclotella cryptica est utile pour produire de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) et de l'acide docosahexaénoïque (DHA) en mode mixotrophe. Préambule
Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés organiques ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique.
D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés (AGH I) de la série des oméga-3 (PUFA-CJU3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 ω3), et de la série des oméga-6 (PUFA-CJU6), en particulier l'acide arachidonique (ARA ou AA ou encore acide eicosatétraènoïque C20:4 ω6) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques.
Considéré comme nutriment essentiel, le DHA est nécessaire au développement normal et fonctionnel des cellules, et joue un rôle crucial dans divers processus et fonctions biochimiques. Sa nature polyinsaturée lui confère une importance cruciale vis-à-vis des propriétés de la membrane cellulaire, chez les végétaux comme chez les animaux : fluidité, flexibilité et perméabilité sélective permettant par exemple une adaptation effective, et même la survie, aux basses températures en particulier chez les poissons. Le DHA est un constituant structurel majeur du cerveau humain et il en est le principal AG. Le DHA représente 15-20 % du cortex cérébral (le cerveau d'un adulte contient au moins 20 g de DHA) et 30-60 % de la rétine. Il est indispensable au développement du système nerveux central et à la fonction rétinienne, par incorporation dans les membranes cellulaires, et joue un rôle capital dans l'acquisition et le maintien satisfaisant des mécanismes de la vision et de la mémoire.
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.
De nouvelles sources de ces acides gras tels que ΙΈΡΑ, le DHA et TARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés.
Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.
Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153- 171].
La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi des espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment d'EPA, de DHA et d'ARA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.
Les principales microalgues d'intérêt, productrices d'EPA et de DHA, sont des espèces marines. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces de microalgues marines, seul un faible nombre présente une teneur élevée de ces deux acides gras à la fois et une capacité suffisante à être cultivée in vitro. Les espèces d'intérêt sont principalement des Bacillariophytes (ou diatomées) issues du phytoplancton marin. Elles se caractérisent généralement par une production active d'EPA, mais produisent souvent des teneurs assez faibles en DHA.
Pour mettre en œuvre la production des acides gras par des microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.
En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple une biomasse au-delà de 30 g/l de matière sèche, et plus de 50% d'acides gras en poids par rapport au poids total de la matière sèche).
Cyclotella cryptica est une diatomée (un bacillariophyte à l'origine isolé des eaux saumâtres au Massachusetts aux Etats-Unis) connue pour produire de ΙΈΡΑ ainsi que du DHA en autotrophie.
La demande de brevet allemand DE4018820 décrit la culture des souches Cryptomonas ovata, Chlorella fusca, Scenedesmus accuminatus et Cyclotella cryptica sous les conditions autotrophes pour produire de ΙΈΡΑ. Le tableau 1 de cette demande montre des résultats comparatifs entre des souches : le rendement de la souche Cyclotella cryptica, est de 45,6 g de lipides pour 100 grammes de matière sèche, avec 22,0% en poids de PUFA et 17,4% en poids d'EPA sur le poids total de matière sèche.
La demande de brevet internationale WO201 1 1 19677 divulgue des systèmes et des procédés permettant d'obtenir de ΙΈΡΑ et du DHA par culture d'algues, ces algues produisant les huiles contenant de ΙΈΡΑ et/ou du DHA, en conditions autotrophes. La récolte des algues s'effectue par l'intermédiaire de poissons dans un ou plusieurs systèmes clos, puis les poissons sont traités pour séparer et purifier ΙΈΡΑ et/ou le DHA. Ces systèmes ont été conçus pour résoudre ce problème de la récolte de la biomasse algale qui est relativement diluée compte tenu du volume d'eau.
Dans la perspective d'une exploitation industrielle, un tel mode de culture s'avère inadapté. En effet, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photo-bioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est difficile à réaliser en mode autotrophe, car lorsque la densité des cellules augmente dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique.
II serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en EPA et
DHA plus importants que ce qui est décrit dans l'art antérieur pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable. Pour améliorer le rendement en EPA et DHA, une alternative à la culture en mode autotrophe serait de pratiquer les cultures en mode hétérotrophe, c'est-à-dire en l'absence de lumière avec un apport d'énergie sous forme de substrats carbonés organiques, ou bien, en mode mixotrophe, c'est-à-dire avec un apport de lumière de moindre intensité et en présence d'un apport de substrat organique.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue de l'espèce Cyclotella cryptica, cultivables en mode mixotrophe permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et de DHA.
Une souche (FCC 971 ) représentative des nouvelles souches de Cyclotella cryptica ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1070/7.
Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifique.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Cyclotella cryptica une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acides gras polyinsaturés. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA et DHA, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des microalgues du genre Cyclotella, notamment de l'espèce Cyclotella cryptica, en mode mixotrophe. Le procédé selon l'invention permet un enrichissement des microalgues du genre Cyclotella en acides gras polyinsaturés et plus particulièrement en EPA et DHA.
Elle concerne également un procédé de culture en mode mixotrophe dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence entre 30 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.
Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou acide docosahexaènoïque (DHA). Ce procédé peut être également utilisé, pour sélectionner des souches du genre Cyclotella, en particulier de l'espèce Cyclotella cryptica, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) et/ou du DHA (acide docosahexaènoïque). La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 150 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Cyclotella (Division : Bacillariophyta, Ordre : Thalassiosirales, Famille : Stephanodiscaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu F/2+si [Guillard, R.R.L. (1975) ; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, pg. 26-60. dans Smith W.L. et Chanley M. H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animais. Plénum Press, New York, Etats Unis], dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM. Ces nouvelles souches de Cyclotella, plus particulièrement de Cyclotella cryptica peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.
Une souche représentative des souches de Cyclotella cryptica selon l'invention est la souche FCC 971 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1070/7. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides et plus particulièrement d'EPA et de DHA quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon l'invention.
Selon les analyses taxonomiques réalisées, la souche CCAP 1070/7 appartient à l'espèce Cyclotella cryptica. L'invention porte sur toute souche de l'espèce Cyclotella cryptica, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA et ΙΈΡΑ. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Cyclotella, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telle que décrite dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA et ΙΈΡΑ.
Les souches de Cyclotella cryptica isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides riches en EPA et/ou DHA, ledit EPA pouvant représenter plus de 40 %, ou plus de 50 %, et ledit DHA pouvant représenter plus de 10 %, ou plus de 20 %, ou plus de 30 % des lipides totaux contenus dans les microalgues.
Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche
FCC 971 , isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode hétérotrophe. Par mode hétérotrophe, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais sans apport de lumière. L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Cyclotella, notamment de l'espèce Cyclotella cryptica en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que ΙΈΡΑ et le DHA.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Cyclotella, notamment de l'espèce Cyclotella cryptica à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés tels que ΙΈΡΑ et le DHA, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.
Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. Elle est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence entre 5 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ou 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , et plus préférentiellement entre 150 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1. Par définition, 1 μιτιοΙ. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1. L'intensité de la lumière peut également varier, entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 100 μηηοΙ. m"2s"1, ou 5 et 400 μηηοΙ. m"2 s"1, ou 50 et 800 μηηοΙ. m"2, s"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence les valeurs 50 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 , les valeurs 0 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , les valeurs 0 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1, les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellule par ml et est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.
Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , par exemple, de préférence, entre 20 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , par exemple, de préférence, entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 1 05 et 5 x 105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence entre 5 et 100 μιτιοΙ . m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1 , par exemple, de préférence, entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 μιτιοΙ . m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 μηηοΙ. m"2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2, par heure.
Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 μηηοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μιτιοΙ. m"2.
Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est 105 et 5 x105 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μιτιοΙ. m"2, de préférence encore entre 2000 et 5000 μιτιοΙ. m"2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 μηηοΙ. m"2, de préférence entre 6000 et 50 000 et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 μιτιοΙ. m"2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple de préférence entre 45 000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 μιτιοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 μιτιοΙ. m"2 à 4500 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 μιτιοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μιτιοΙ. m"2 à 30 000 μιτιοΙ. m"2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 μιτιοΙ. m"2.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et du DHA.
Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Cyclotella, en particulier de l'espèce Cyclotella cryptica à caractère mixotrophe, similaire à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1070/7, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA et EPA. Ce procédé de production d'EPA et/ou de DHA est caractérisé en ce qu'il comprend des étapes suivantes :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Cyclotella,
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.
Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
Avantageusement, la culture en mode mixotrophe s'effectue dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure
Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Cyclotella, en particulier de l'espèce Cyclotella cryptica, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés organiques dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés organiques offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA et/ou DHA).
Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :
d) une étape de récupération des lipides des microalgues et éventuellement
e) l'extraction de ΙΈΡΑ et/ou du DHA des lipides récupérés.
Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Cyclotella, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire ΙΈΡΑ et/ou le DHA.
Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide docosahexaénoïque (DHA).
L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Cyclotella à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier ΙΈΡΑ et/ou le DHA. Les souches de l'espèce Cyclotella cryptica sont spécialement concernées.
Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont ΙΈΡΑ et le DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:91 1 -917].
L'invention porte également sur les microalgues du genre Cyclotella, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acides gras polyinsaturés. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 30 %, souvent plus de 40 % d'EPA et/ou plus de 10 % de DHA par rapport au pourcentage total de lipides. Exemple 1
Les cultures de Cyclotella cryptica FCC 971 ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 ,5L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 23°C. L'agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration suivante : hélice de Rushton et hélices tripales à pompage descendant. La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table agitante (140 rpm) en enceinte thermo statée (23°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu SK modifié (Stephen L. Pahl, David M. Lewis, Feng Chen, Keith D. King, J Appl Phycol. 2010 April; 22(2): 165-171 )
Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 100 mM et 150 mM. Suivi des cultures
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFB, Whatman, puis séchage à l'étuve à 100°C pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 7.108 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier. Eclairement :
La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 80 μιτιοΙ. m"2, s"1.
L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu des LED (Diodes Electro Luminescentes) réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Un pilotage informatique déclenche l'alimentation des LED pour des temps d'éclairement ou des flashs.
Résultats (n=3) :
Masse Sèche Lipides DHA (% des EPA (% des (9 L) totaux (% de lipides totaux) lipides
la MS) totaux)
Mixotrophie 13,8 +/- 1 21 ,2 +/- 0,5 10,2 +/- 1 ,1 45 +/- 1 ,5 Flash
Hétérotrophie 7,5 +/- 0,8 16,7 +/- 0,6 13,1 +/- 1 ,3 34,8 +/- 1 ,6

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de production d'EPA et/ou DHA comprenant l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Cyclotella, caractérisé en ce que la culture s'effectue dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 et 1000 μιτιοΙ m"2, s"1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 400 μιτιοΙ. m"2, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la microalgue est de l'espèce Cyclotella cryptica.
4. Procédé selon la revendication 1 , 2 ou 3, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 150 mM, le substrat carboné organique étant choisi parmi l'amidon, le lactate, le lactose, le saccharose, l'acétate, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glucose.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 5 et 1000, de préférence entre 30 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence encore entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1, et plus préférentiellement encore entre 100 et 200 μηηοΙ. m"2, s"1.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement encore entre 20 secondes et 1 minute.
9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'apport total de lumière par heure en micromoles des photons est entre 2000 à 600 000, de préférence 2000 à 200 000 μηηοΙ. m"2.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées, et éventuellement d) une étape de récupération des lipides des microalgues et éventuellement
e) l'extraction de ΙΈΡΑ et/ou du DHA des lipides récupérés.
12. Microalgue du genre Cyclotella susceptible d'être obtenue par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 .
13. Microalgue du genre Cyclotella selon la revendication 12, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent plus de 30 %, ou plus de 40 % d'EPA et/ou plus de 10 %, de DHA.
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