WO2013136023A1 - Production d'acide eicosapentaenoïque et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par euglena. - Google Patents

Production d'acide eicosapentaenoïque et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par euglena. Download PDF

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WO2013136023A1
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WO
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pmol
culture
microalgae
lipids
euglena
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PCT/FR2013/050540
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Khadidja Romari
Pierre Calleja
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Fermentalg
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Publication date
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a method of cultivation in mixotrophic mode, especially in the presence of a discontinuous illumination and / or variable light, of a microalga of the genus Euglena, in particular of the species of Euglena gracilis.
  • the method makes it possible to obtain a high yield of biomass and an enrichment of the microalgae thus cultivated with lipids and more particularly with eicosapentaenoic acid (EPA) and / or arachidonic acid (ARA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • the method thus makes it possible to select Euglena gracilis strains of a mixotrophic nature, and having a high yield of lipids and more particularly of polyunsaturated fatty acids.
  • the invention also relates to a new microalgae strain belonging to the species Euglena gracilis, particularly suitable for the production of fatty acids.
  • This new strain of Euglena gracilis is useful for producing ⁇ (eicosapentaenoic acid) and arachidonic acid (ARA) in mixotrophic mode.
  • ⁇ eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • Microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are usually autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis. For these, the presence in their environment of carbon substrates or organic material is not favorable to them and does not improve their growth.
  • a number microalgae species, families and very diverse origins prove to be not strictly autotrophic. Thus some of them, called heterotrophic, are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • microalgae species for which photosynthesis remains essential for their development, are able to take advantage of both photosynthesis and organic matter present in their environment. These intermediate species, called mixotrophs, can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • PUFA-3 highly unsaturated omega-3
  • EPA or C20: 5 ⁇ 3 eicosapentaenoic acid
  • DHA or C22: 6 ⁇ 3 docosahexaenoic acid
  • PUFA- ⁇ arachidonic acid
  • AA or ARA or eicosatetraenoic acid C20: 4 ⁇ 6 arachidonic acid
  • microalgae offer several advantages over fish oils: they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a biomass of relatively constant biochemical composition and, d. On the other hand, unlike fish oils, they do not have an unpleasant smell and their lipids contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by microalgae have a simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • the taxonomic classification of eukaryotic algae contains 14 phyla.
  • the species of the different classes composing these phyla which produce fatty acids, there are significant variations in the content of polyunsaturated fatty acids in microalgae.
  • the relative proportions of lipids, in particular EPA and ARA in the lipid profiles vary according to the species and the culture conditions.
  • the main microalgae of interest producing EPA and ARA, are marine species. However, among the hundreds of thousands of marine microalgae species, only a small number have a high content of both of these fatty acids at the same time and sufficient capacity to be cultured in vitro.
  • the species of interest are mainly Bacillariophytes (or diatoms) from marine phytoplankton. They are generally characterized by an active production of EPA.
  • freshwater microalgae Although rich in ⁇ -linolenic acid (C18: 3 u) 3), freshwater microalgae generally do not contain EPA [Pencreac'h et al. (2004) Marine microalgae: alternative source of EPA and DHA, Lipids, 11 (2): 118-222].
  • ARA is quite rare for marine algae.
  • microalgae include, but are not limited to Euglenophytes (eg, Euglena), Rhodophytes (eg, Porphyridium) and Chlorophytes (eg, Parietochloris).
  • the cultures can be carried out in autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions depending on the strain, the temperature, the light conditions and the size of the fermenters.
  • crops can also be grown in one-liter containers, in a laboratory, in photobioreactors, and in 100,000-liter containers or in open ponds (several hectares).
  • energy expenditure and other resources such as labor and the ease of continuing cultivation must be taken into account by developing ideal growing conditions.
  • microalgae be grown under optimal conditions to increase the yield of (s) fatty acid (s) to produce. So, it's best to have the most return high potential (eg biomass above 30 g / 1 dry matter, and more than 15% fatty acids relative to dry matter).
  • JP9252764 and JP60087798 thus describe strains of Monodus subterraneus grown in autotrophic mode that can accumulate an amount of EPA of up to 3.8% of their dry weight. These strains were cultured under laboratory conditions, ie in inorganic culture media, in flasks or bioreactors of low volumetric capacity with a continuous light supply.
  • Euglena is a common genus of Flagellate Protista and belongs to the Euglenoids family, which does not have a rigid wall, which gives them a characteristic shape mobility during their displacement, which is called the euglenoid movement. Euglenes can lose their chloroplasts and produce depigmented heterotrophic individuals that are slightly different from flagellated protozoa. The Euglenes have a stigma, orange spot that fulfills the role of photoreceptor and allows the microorganism to move. The flagella are permanently present in the Euglenes. The metabolism of Euglenes is versatile.
  • the cultivation and selection process consisted more particularly in cultivating microalgae under mixotrophic conditions, in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes, with a range of variations in light intensity and a frequency specific.
  • strains of Euglena gracilis a high production of biomass, lipids and more. especially polyunsaturated fatty acids.
  • This implementation of the strains according to the invention opens the prospect of an industrial production of polyunsaturated fatty acids, in particular EPA and ARA, in fermenters benefiting from a reduced light input, and should therefore make it possible to carry out energy savings compared to autotrophic farming methods.
  • the subject of the present invention is therefore a process for culturing microalgae of the genus Euglena, in particular of the Euglena gracilis species, in mixotrophic mode, under discontinuous and / or variable illumination conditions over time.
  • the illumination has intensity variations whose amplitude is generally between 5 pmol. m “2 , s " 1 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 30 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1 . These variations can generally take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour.
  • These cultivation conditions make it possible to provide a defined quantity of light.
  • This luminous contribution may comprise phases of discontinuous and / or variable illumination, with variations in intensity that may have identical or different amplitudes.
  • the illumination can be in particular in the form of flashes.
  • This process has the advantage of increasing the yield of biomass obtained from the culture. It also has the advantage of enriching the microalgae thus cultured in polyunsaturated fatty acids, more particularly in eicosapentaenoic acid (EPA) and / or arachidonic acid (ARA).
  • This method can also be used to select strains of the genus Euglena, in particular Euglena gracilis, of a mixotrophic nature, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids, in particular ⁇ (eicosapentaenoic acid) and / or TARA ( arachidonic acid).
  • the mixotrophic culture of this microalga is preferably carried out in the presence of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and still more preferably from 100 mM to 500 mM. an organic carbon substrate.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration.
  • This organic carbon substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture: glucose, cellulose derivatives, lactate, starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, carbon substrates adapted to the mixotrophic culture of microalgae according to the invention.
  • This process is more particularly intended for the implementation of new microalgae strains of the genus Euglena (Phylum: Euglenoza, Order: Euglenales, Family: Euglenaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic nature, particularly for their ability to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ l, in a mineral medium, for example Euglena medium [Andersen, RA; Jacobson, D.M. & Sexton, J.P. (1991) - Provasoli-Guillard Center for Culture of Marine Phytoplankton, Catalog of Strains. 98pp. West Boothbay Harbor, Maine, USA] in which an organic carbon substrate is added.
  • the organic carbon substrate comprises glucose and / or lactate, in a concentration equivalent to or greater than 5 mM.
  • These new Euglena strains can be isolated and selected according to the method of selection and culture according to the invention described below.
  • a representative strain of the Euglena gracilis strains according to the invention is the strain FCC 540 isolated by the applicant and deposited at the CCAP, under the number CCAP 1224/49.
  • Such strains are capable of producing significant quantities of biomass as well as lipids, and more particularly of ⁇ and ARRA when they are cultivated in mixotrophic mode with a variable and / or discontinuous light supply, according to the invention.
  • strain CCAP 1224/49 belongs to the species Euglena gracilis.
  • the invention relates to any strain of the species Euglena gracilis, capable of growing under mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as TARA and ⁇ .
  • the invention also relates to any species of microalgae of the genus Euglena, capable of growing under mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as TARA and ⁇ .
  • the euglena gracilis strains isolated according to the invention make it possible to produce, under mixotrophic conditions, significant amounts of biomass as well as lipids rich in EPA and / or ARA, said EPA and / or ARA being able to represent more than 10%, more than 25%, or more than 40% of the total lipids contained in microalgae.
  • the biomass obtained with the FCC 540 strain, isolated by the applicant, from a culture in mixotrophic conditions in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes is from 10 to 60% , more generally from 20 to 50%, greater than that of a culture with the same strain carried out in heterotrophic mode.
  • Heterotrophic mode means identical culture conditions, except for the absence of illumination.
  • the subject of the invention is thus a process for culturing microalgae of the genus Euglena, in particular of Euglena gracilis species in mixotrophic mode, in the presence of a variable and / or discontinuous illumination with the passage of time, for example in the form of flashes, especially for producing polyunsaturated fatty acids, such as ⁇ and TARA.
  • the subject of the invention is therefore a process for the selection of microalgae of the genus Euglena, in particular of Euglena gracilis species with a mixotrophic nature, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids such as ⁇ and TARA, in the presence of variable illumination. and / or discontinuous over time.
  • a discontinuous and / or variable light supply to microalgae has the effect of causing a "stress" favorable to the growth and synthesis of lipids. This may be explained, in part, by the fact that in nature, microalgae tend to accumulate lipid reserves to withstand the stresses of their environment.
  • discontinuous illumination it is necessary to hear an illumination punctuated by periods of darkness. The periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes.
  • a flash within the meaning of the invention, is a short period of illumination, that is to say less than 30 minutes.
  • the duration of the flash may be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes or more preferably less than 1 minute.
  • the flash duration may be less than one second.
  • the flash duration can be 1/10 of a second, or 2/10 of a second, or 3/10 of a second, or 4/10 of a second or 5 / 10 of a second, or 6/10 of a second, or 7/10 of a second, or 8/10 of a second, or 9/10 of a second.
  • the illuminance, or flash is usually longer than 15 seconds.
  • the duration of the flash is generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • This time period can be between 1 second and 30 minutes, or between 1 second and 36 seconds, or between 1, 2 seconds and 30 seconds, or between 1.44 seconds and 9 seconds, or between 1.8 seconds and 6 seconds. seconds, or between 2.4 seconds and 4.5 seconds.
  • This frequency can also be between 18 seconds and 30 minutes, preferably between 24 seconds and 6 minutes, more preferably between 36 seconds and 4 minutes, and even more preferably between 72 seconds and 3 minutes.
  • the number of flashes per hour is chosen according to the intensity and duration of the flashes (see below). In general, the intensity of the light provided in the form of flashes is between 5 and 1000 pmol. m "2 , s " 1 , preferably between 5 and 500 pmol.
  • n pmol. m “2 , s “ 1 corresponds to 1 ⁇ m “2 , s “ 1 (Einstein), a unit often used in the literature.
  • the intensity of the light is between 50 and 200 pmol.
  • m “2 , s " 1 , the flash frequency is between 10 seconds and 60 minutes for a flash duration of between 1 second and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time. This variation in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the invention, it is also possible to carry out a light supply combining continuous and discontinuous illumination phases.
  • the light intensity provided to the algae in culture varies at least one times in one hour.
  • the amplitude of this variation in light intensity is generally between 5 and 1000, or between 50 and 800, or between 100 and 600 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light can also vary between 5 and 400 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the magnitude of the light intensity variation is between 70 and 300 pmol. m “2 , s “ 1 and more preferably between 100 and 200 pmol. m “2 , s “ 1 .
  • Said luminous intensity can successively reach, under conditions of variable illumination, for example, the values 50 pmol. m “2 , s “ 1 and 100 pmol. m “2 s “ 1 , or 5 and 400 pmol. m “2 , s “ 1 , or 50 and 800 pmol. m “2 , s “ 1 several times each hour.
  • Said luminous intensity can successively reach, preferably, the values 50 and 200 pmol. m "2 s -1.
  • said light intensity can reach successively several times within one hour, for example, the values 0 and 50 pmol.
  • m" 2 s "1 the values 0 and 100 pmol.m.sup.- 2 , s.sup.- 1 or, more preferably, the values 0 and 200 pmol.m.sup.- 2 , s.sup.- 1, It may also successively, several times in the hour, for example, the values 0 and 300 pmol m -2 , s -1 , the values 0 and 600 pmol m -2 , s -1 , the values 0 and 800 pmol m -2 , s -1, or the values 0 and 1000 pmol. m "2 , s " 1 .
  • the intensity of the light brought to the culture varies according to the cell density.
  • the denser the culture the more intense the light.
  • the cell density is the number of cells per ml and is measured according to the techniques known to those skilled in the art.
  • the light intensity may be between 5 and 15 pmol. m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 10 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 15 and 200 pmol. m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 20 and 50 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the culture, at the final stage reaches a density between 10 7 and 10 8 cells per ml
  • the light intensity can be increased to between 50 and 400 pmol. m “2 , s “ 1 for example, preferably between 50 and 150 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light may be greater compared to the values mentioned above.
  • the light intensity may be between 5 and 200 pmol. m “2 , s " 1 , preferably between 5 and 100 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 30 and 500 pmol. m “2 , s " 1 , by for example, preferably between 50 and 400 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 When the culture, at the final stage, reaches a density between 10 7 and 10 8 cells per ml, the light intensity can be increased to between 100 and 1000 pmol. m “2 , s “ 1 for example, preferably between 200 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the quantity of light brought to the culture in the hour remains between certain values. It is between about 2000 and 600 000, preferably between 2000 and 300 000 mol. m "2. It can be between about 4000 and 200 000 pmol. m" 2 per hour.
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 10 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the latter gives a total light input per hour of 9000 ⁇ . m "2.
  • the culture is irradiated with 20 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 20 pmol. m" 2 s "1. This gives total light output per hour of 12,000 pmol.m -2 .
  • the culture is illuminated with 45 flashes per hour, each flash having a duration of 15 seconds and an intensity of 5 pmol.
  • culture is illuminated with 120 flashes per hour, each having a flash duration of 10 seconds and an intensity of 200 ⁇ . m" 2 s "1, to give a total light output per hour of 240,000 ⁇ m- 2 .
  • the amount of light provided to the culture per hour may vary depending on the cell density.
  • the total light supply in the hour is generally between about 1500 and 8000, preferably 1500 and 6000 pmol. m "2 , more preferably between 2000 and 5000 pmol. m " 2 .
  • the total light supply in the hour can be increased to between 6000 and 67000 pmol.
  • the total light supply in the hour can be increased to between 45 000 and 300 000, for example preferably between 45 000 and 200,000 pmol. m "2 , and for example, more preferably between 50,000 and 150,000 ⁇ . m " 2 .
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 5 and 10 pmol. m "2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 2250 ⁇ . m 2 to 4500 pmol m -2 .
  • the intermediate stage at a cell density between 10 6 and 10 7 cells per ml, the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 15 and 50 ⁇ .
  • the culture is irradiated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 50 and 150 ⁇ m "2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 45,000 to 135,000 ⁇ .rr ⁇ 2 .
  • the duration of the flashes is for example less than one minute, or less than one second
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 50 and 100 pmol. m "2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 15,000 ⁇ . m 2 to 30,000 pmol m -2 .
  • the culture is illuminated with 50 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 200 and 300 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 which gives a total light input per hour of 100,000 to 150,000 pmol. m "2.
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each having a flash duration of 10 seconds and intensity between 350 and 450 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 which gives a total light output per hour of 420,000 to 540,000 pmol. m "2 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention thus makes it possible to select strains of the genus Euglena, in particular of the species Euglena gracilis of a mixotrophic nature, similar to that isolated by the applicant and deposited with the CCAP under the number CCAP 1224/49. and having a high yield of polyunsaturated fatty acids.
  • This culture method is characterized in that it comprises the following steps:
  • recovery step is meant more particularly the isolation of the strain or strains whose cell number has grown the most during said generations.
  • various strains of the genus Euglena in particular of the Euglena species gracilis, can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure, with precise monitoring of the conditions and evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the various strains to the discontinuous and / or variable illumination and, where appropriate, the addition of one or more carbon substrates in the culture medium.
  • Strains that respond favorably to discontinuous and / or variable illumination and to carbon substrates generally offer a better yield for lipid production in terms of quality (polyunsaturated fatty acids more abundant in the lipid profile) and quantitative (lipids contain higher proportion of EPA and / or ARA).
  • the microalgae can be selected in a fermentor from a heterogeneous population and the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention combining discontinuous and / or variable light having a range of light intensity and a frequency specific, with mixotrophic growing conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture method according to the invention also makes it possible to produce lipids.
  • the method according to the invention also comprises the following steps:
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • the culture method according to the invention can also be applied to any species of the genus Euglena, capable of growing under the mixotrophic conditions according to the invention, and capable of producing ⁇ and / or TARA.
  • the culture method according to the invention makes it possible to optimize the production of the biomass obtained from the culture. It also allows to enrich the microalgae thus cultured in polyunsaturated fatty acids, more particularly in eicosapentaenoic acid (EPA) and / or arachidonic acid (ARA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • the invention therefore also aims at optimizing the production of biomass, as well as the production of lipids, in particular of fatty acids, via the cultivation of microalgae of the Euglena genus of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the methods referred to above, then the recovery of microalgae cultivated to extract the lipids, especially ⁇ and / or TARA. Strains of the species Euglena gracilis are especially concerned.
  • the invention also relates to microalgae of the genus Euglena gracilis, which can be obtained according to the process of the invention as previously described. These microalgae are enriched in polyunsaturated fatty acids.
  • the total lipids of such microalgae generally comprise more than 15% or 20%, often more than 30% and sometimes even more than 40% EPA and / or ARA based on the total percentage of lipids.
  • Example 1 Euglena gracilis FCC 540 cultures are carried out in 2L fermentors (bioreactors) useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 22 ° C.
  • Stirring is carried out by means of two stirring shakers placed on the shaft according to the following configuration: Rushton propeller and three-bladed pumping propellers.
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank. The intensity as well as the light cycles are controlled by a dedicated automaton and supervised by a computer station.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture performed on a stirring table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (22 ° C.) and illuminated between 80 and 100 ⁇ E.
  • Pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in medium Euglena medium [Starr, R.C. & Zeikus, J.A. (1993) - UTEX - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. J. Phycol. Suppl. 29].
  • the organic carbon substrate used for the bioreactor mixotrophic culture is glucose at concentrations between 100 mM and 150 mM.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GFC filter, Whatman, then drying in a vacuum oven at 65 ° C and -0.8 bar, for 24 hours minimum before weighing).
  • the crop is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 80 pmol. m “2 , s " 1 .

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Euglena permettant une production de lipides, notamment d'EPA et/ou d'ARA, en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches, utilisant un apport de lumière variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs.

Description

Production d'acide éicosapentaénoïque et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par Eualena
L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une microalgue du genre Euglena, en particulier de l'espèce d'Euglena gracilis. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des microalgues ainsi cultivées en lipides et plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide arachidonique (ARA). Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches d'Euglena gracilis à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés. L'invention se rapporte aussi à une nouvelle souche de microalgue appartenant à l'espèce Euglena gracilis, particulièrement adaptée à la production d'acides gras. Cette nouvelle souche d'Euglena gracilis est utile pour produire de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) et de l'acide arachidonique (ARA) en mode mixotrophe. Préambule
Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique.
D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des oméga-3 (PUFA- 3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 ω3), et de la série des oméga-6 (PUFA-ωθ), en particulier l'acide arachidonique (AA ou ARA ou encore acide eicosatétraènoïque C20:4 ω6), ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques.
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, incorporation dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive. De nouvelles sources de ces acides gras tels que ΙΈΡΑ et TARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés.
Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.
Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153- 171].
La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi les espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment d'EPA et d'ARA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.
Les principales microalgues d'intérêt, productrices d'EPA et d'ARA, sont des espèces marines. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces de microalgues marines, seul un faible nombre présentent une teneur élevée de ces deux acides gras à la fois et une capacité suffisante à être cultivée in vitro. Les espèces d'intérêt sont principalement des Bacillariophytes (ou diatomées) issues du phytoplancton marin. Elles se caractérisent généralement par une production active d'EPA.
Bien que riches en acide α-linolénique (C18:3 u)3), les microalgues d'eau douce ne contiennent généralement pas d'EPA [Pencreac'h et al. (2004) Les microalgues marines : source alternative d'EPA et de DHA, Lipides, 11(2) :118-222].
En revanche, la production d'ARA est assez rare pour des algues marines. De telles microalgues incluent, mais ne sont pas limitées à Euglenophytes (par exemple, Euglena), Rhodophytes (par exemple, Porphyridium) et Chlorophytes (par exemple, Parietochloris).
Plusieurs souches de microalgues d'eau douce sont capables de synthétiser et d'accumuler de l'acide arachidonique. Entre autres, les triglycérides de la Chlorophyte Parietochloris incisa, une algue isolée du Mont Tateyama au Japon, sont naturellement riches en acide arachidonique. L'ARA est majoritairement présent sous forme de triglycérides qui constituent la classe de lipides dominante [Bigogno C. et al. (2002) ; Lipid and fatty acid composition of the green oleaginous alga Parietochloris incisa, the richest plant source of arachidonic acid, Phytochemistry, 60(5): 497-503].
Pour mettre en œuvre la production des acides gras par des microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.
En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple une biomasse au-delà de 30 g/1 de matière sèche, et plus de 15% d'acides gras par rapport à la matière sèche).
La demande de brevet internationale WO 03/079810 divulgue des cultures de Parietoch loris incisa pour la production d'ARA destiné à des produits alimentaires pour animaux. Ces cultures ont été réalisées dans des conditions autotrophes avec un rendement d'ARA d'au moins 10% d'ARA en poids par rapport au poids de ces cellules.
Les demandes de brevet japonais JP9252764 et JP60087798 décrivent ainsi des souches de Monodus subterraneus cultivées en mode autotrophe pouvant accumuler une quantité d'EPA allant jusqu'à 3,8 % de leurs poids sec. Ces souches ont été cultivées en conditions de laboratoire, c'est-à-dire dans des milieux de culture inorganiques, en flacons ou en bioréacteurs de faible capacité volumétrique avec un apport lumineux continu.
Dans la perspective d'une exploitation industrielle, un tel mode de culture s'avère inadapté. En effet, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photo-bioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est difficile à réaliser en mode autotrophe, car lorsque la densité des cellules augmente dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique.
Il serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en EPA et ARA plus importants pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable.
Euglena est un genre commun de Protistes flagellés et fait partie de la famille des Euglénoïdes qui ne possèdent pas de paroi rigide, ce qui leur donne une mobilité de forme caractéristique au cours de leur déplacement, qui s'appelle le mouvement euglénoïde. Les Euglènes peuvent perdre leurs chloroplastes et donner des individus dépigmentés hétérotrophes peu différents des protozoaires flagellés. Les Euglènes possèdent un stigma, tache orangée qui remplit le rôle de photorécepteur et permet au micro-organisme de se diriger. Les flagelles sont présents en permanence chez les Euglènes. Le métabolisme des Euglènes est polyvalent. En présence de lumière, elles sont autotrophes, et en l'absence de lumière ou après la perte de leur chloroplaste, elles deviennent hétérotrophes et sont en particulier capables de métaboliser le lactate [Lechevalier, Hubert A. (1977) ; Fungi, Algae, Protozoa, and Viruses, CRC Handbook of Microbiology, 2ème édition, Vol. Il, p. 874, Floride, Laskin, Allen I.].
Dans l'article scientifique "Biomass production in mixotrophic culture of
Euglena gracilis under acidic condition and its growth energetics", Biotechnology Letters Vol. 23, No. 15, 1223-1228, il a été démontré que le rendement de biomasse obtenu avec Euglena gracilis cultivée en conditions mixotrophes (avec lumière continue) est de 15 à 19 % supérieur au rendement obtenu avec une culture en conditions hétérotrophes. Des niveaux élevés de chlorophylle de 39,4 mg par litre et de caroténoïdes de 13,8 mg par litre ont en outre été obtenus dans les cultures mixotrophes.
Dans l'article scientifique par Hayashi M et al : « Enriching Euglena with unsaturated fatty acids", BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY BIOCHEMISTRY, vol. 57, no. 2, 1er janvier 1993, p 352-353, l'enrichissement des microalgues du genre Euglena gracilis en EPA est décrit. Les microalgues sont cultivées en conditions hétérotrophiques avec un ajout d'EPA ou de DHA de 0 à 1 % au milieu de culture. Afin d'obtenir des microalgues avec un taux de 75,6 % d'EPA par rapport à leurs lipides totaux, il fallait ajouter 0,5 % d'EPA au milieu de culture, ce qui représente une étape coûteuse et non rentable pour une exploitation industrielle.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue de l'espèce Euglena gracilis, cultivables en mode mixotrophe, permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et ARA.
Une souche (FCC 540) représentative des nouvelles souches d'Euglena gracilis ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1224/49.
Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Euglena gracilis une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acides gras polyinsaturés. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA et ARA, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis, en mode mixotrophe, dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 pmol. m"2, s"1 et 1000 μιηοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 30 et 400 μητιοΙ. m"2, s"1. Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.
Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou acide arachidonique (ARA). Ce procédé peut également être utilisé pour sélectionner des souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) et/ou de TARA (acide arachidonique).
La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Euglena (Phylum: Euglenoza, Ordre: Euglenales, Famille: Euglenaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu Euglena [Andersen, R.A.; Jacobson, D.M. & Sexton, J.P. (1991) - Provasoli-Guillard Center for Culture of Marine Phytoplankton, Catalogue of Strains. 98pp. West Boothbay Harbor, Maine, USA] dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose et/ou du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.
Ces nouvelles souches d'Euglena, plus particulièrement d'Euglena gracilis, peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.
Une souche représentative des souches d'Euglena gracilis selon l'invention est la souche FCC 540 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1224/49. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides, et plus particulièrement de ΙΈΡΑ et de TARA quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable et/ou discontinu, selon l'invention.
Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 1224/49 appartient à l'espèce Euglena gracilis. L'invention porte sur toute souche de l'espèce Euglena gracilis, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, telles que TARA et ΙΈΡΑ. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Euglena, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que TARA et ΙΈΡΑ. Les souches û'Euglena gracilis isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides riches en EPA et/ou ARA, ledit EPA et/ou ARA pouvant représenter plus de 10 %, plus de 25%, ou plus de 40% des lipides totaux contenus dans les microalgues.
Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche FCC 540, isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode hétérotrophe. Par mode hétérotrophe, on entend des conditions de culture identiques, hormis l'absence d'illumination.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps, par exemple, sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que ΙΈΡΑ et TARA.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés tels que ΙΈΡΑ et TARA, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.
Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée du flash peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. La durée du flash est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 500 pmol. m"2, s"1, ou 50 et 400 pmol. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m"2, s"1. Par définition, 1 pmol. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 pmol. m"2, s"1, la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 pmol. m"2, s"1. L'intensité de la lumière peut également varier entre 5 et 400 pmol. m"2, s"1. De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 pmol. m"2, s"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m"2, s"1.
Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 pmol. m"2, s"1 et 100 pmol. m"2 s"1, ou 5 et 400 pmol. m"2, s"1, ou 50 et 800 pmol. m"2, s"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 pmol. m"2, s*1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 pmol. m"2, s"1, les valeurs 0 et 100 pmol. m"2, s"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 pmol. m"2, s"1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 pmol. m"2, s"1, les valeurs 0 et 600 pmol. m"2, s"1, les valeurs 0 et 800 pmol. m"2, s"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 pmol. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.
Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être comprise entre 5 et 15 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 10 pmol. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 pmol. m"2, s"1 par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m"2, s"1.
Selon certains modes de réalisation, par exemple quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 100 pmol. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 pmol. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 pmol. m"2, s"1 par exemple, de préférence entre 200 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 mol. m"2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 pmol. m"2, par heure.
Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 μητιοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 pmol. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μιηοΙ. m"2.
Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 pmol. m"2, de préférence encore entre 2000 et 5000 pmol. m"2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 pmol. m"2, de préférence entre 6000 et 50 000, et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 pmol. m"2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple de préférence entre 45 000 et 200 000 pmol. m"2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 μιτιοΙ. m" 2.
Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 μητιοΙ. m"2 à 4500 pmol. m"2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μιηοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 μηποΙ. rrï2.
Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μητιοΙ. m"2 à 30 000 pmol. m"2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 pmol. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 pmol. m"2.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et d'ARA.
Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1224/49, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend des étapes suivantes :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Euglena dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιηοΙ. m"2, s"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 pmol. m"2, s"1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure,
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.
Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations. Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA et/ou ARA).
Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :
d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement
e) l'extraction d'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou acide arachidonique (ARA) des lipides récupérés.
Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Euglena, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire ΙΈΡΑ et/ou TARA.
Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide arachidonique (ARA).
L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Euglena à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire les lipides, en particulier ΙΈΡΑ et/ou TARA. Les souches de l'espèce Euglena gracilis sont spécialement concernées.
Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont ΙΈΡΑ et TARA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917].
L'invention porte également sur les microalgues du genre Euglena gracilis, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acides gras polyinsaturés. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 15 % ou 20%, souvent plus de 30 % et parfois même plus de 40 % d'EPA et/ou d'ARA par rapport au pourcentage total de lipides.
Exemple 1 Les cultures à'Euglena gracilis FCC 540 sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration suivante : hélice de Rushton et hélices tripales à pompage descendant. La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 wm / Qmaxi = 2 wm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisés par station informatique.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu Euglena médium [Starr, R.C. & Zeikus, J.A. (1993) - UTEX - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. J. Phycol. Suppl. 29]. Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 100 mM et 150 mM.
Suivi des cultures :
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage en étuve sous vide, à 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 108 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier.
Eclairement :
La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 80 pmol. m"2, s"1.
L'apport de lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED (Diodes Electro Luminescentes) réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des puises. Résultats (n=3) :
Masse Sèche Lipides ARA (% des EPA(% des
(g/L) totaux (% de lipides totaux) lipides la MS) totaux)
Mixotrophie 25,6 +/- 1 ,2 17,1 +/-0.7 15,6+/- 0,3 14+/- 0,9 Flash
Hétérotrophie 17,5 +/-1 18,7+/- 0,2 16,1 +/-0.4 14,3+/- 1,1

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé comprenant l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Euglena dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 et 1000, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m"2, s"1 et 400 pmol. m"2, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la microalgue est de l'espèce Euglena gracilis.
4. Procédé selon la revendication 1 , 2 ou 3, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM, le substrat carboné organique étant choisi parmi l'amidon, le lactate, le lactose, le saccharose, l'acétate, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glucose.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 30 et 400 μιηοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 70 et 300 pmol. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιηοΙ. m"2, s"1.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement encore entre 20 secondes et 1 minute.
9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 fois par heure.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'apport total de lumière par heure en micromoles des photons est entre 2000 à 600 000 pmol. m"2 de préférence, 2000 à 200 000 pmol. m"2.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées, et éventuellement
d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement
e) l'extraction d'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou d'acide arachidonique (ARA) des lipides récupérés.
12. Microalgue du genre Euglena susceptible d'être obtenue par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Microalgue du genre Euglena, selon la revendication 12, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent plus de 10 %, de préférence plus de 25 %, et plus préférentiellement plus de 40 % d'EPA et/ou d'ARA par rapport au pourcentage total de lipides.
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