WO2012175866A1 - Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe - Google Patents

Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe Download PDF

Info

Publication number
WO2012175866A1
WO2012175866A1 PCT/FR2012/051386 FR2012051386W WO2012175866A1 WO 2012175866 A1 WO2012175866 A1 WO 2012175866A1 FR 2012051386 W FR2012051386 W FR 2012051386W WO 2012175866 A1 WO2012175866 A1 WO 2012175866A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
isochrysis
microalgae
culture
genus
mixotrophic
Prior art date
Application number
PCT/FR2012/051386
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Calleja
Khadidja Romari
Original Assignee
Fermentalg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fermentalg filed Critical Fermentalg
Priority to US14/127,389 priority Critical patent/US20140199739A1/en
Priority to EP12738510.2A priority patent/EP2723876A1/fr
Publication of WO2012175866A1 publication Critical patent/WO2012175866A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a process for the cultivation and selection of microalgae strains belonging to the Isochrysis genus involving a discontinuous light supply in the form of flashes, as well as to selected Isochrysis strains, particularly suitable for the production of polyunsaturated fatty acids, especially EPA (eicosapentaenoic acid) in mixotrophic culture mode.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are strictly autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis. For these, the presence in their medium of carbon substrates or organic material is not favorable to them and even tends to inhibit their growth.
  • heterotrophic are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • microalgae species for which photosynthesis remains essential for their development, are able to take advantage of photosynthesis and the organic matter present. in their midst. These intermediate species, called mixotrophs, can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • microalgae offer several advantages over fish oils: they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a biomass of relatively constant biochemical composition, and, on the other hand, unlike fish oils, they do not have an unpleasant smell and their lipids contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by microalgae have a simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • the taxonomic classification of eukaryotic algae contains 14 phyla. There are important variations among the different species of the different classes composing these phylums with regard to the content of microalgae in polyunsaturated fatty acids. In addition, the relative proportions of EPA and DHA in lipid profiles vary with species and culture conditions [Yongmanitchai, W. and Ward, O.P. (1989) Omega-3 fatty acids: alternative sources of production. Process. Biochem. 24: 1 17-125].
  • microalgae In the perspective of industrial exploitation of microalgae, it is the heterotrophic or mixotrophic species that are currently attracting the most interest from industrialists. Indeed, the reduced dependence of this type of microalgae vis-à-vis the light, can consider their culture in closed containers of large size, as is practiced in fermenters for bacteria or yeasts.
  • microalgae of the genus Isochrysis which are flagellated marine microalgae of brown color belonging to the class of Prymnesiophyceae.
  • Microalgae of the genus Isochrysis are widely used in fish hatcheries for fish, shrimp, molluscs and crustaceans as a dietary supplement rich in DHA. These microalgae are generally marketed in the form of concentrated long-life microalgae preparations (Instant Algae® , 871 East Hamilton Ave, Campbell, CA 95008, USA). The peculiarity of these microalgae is to store their fatty acids intracellularly in the form of lipid inclusions. As their walls are relatively thin, several studies place Isochrysis among the microalgae best suited to extract their lipids on an industrial scale.
  • This process which is the subject of the present invention, consisted more particularly in cultivating microalgae under the conditions of mixotrophy, in the presence of discontinuous illumination, especially in the form of flashes.
  • This process has, for the first time, enabled the production of EPA by Isochrysis strains under mixotrophic conditions.
  • CCAP Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban , Argyll PA371 QA, Scotland, United Kingdom
  • strains and the culture method according to the invention thus opens the prospect of an industrial production of polyunsaturated fatty acids, in particular EPA and DHA, using strains of the genus Isochrysis, in fermenters benefiting from reduced light input and energy saving.
  • the present invention firstly relates to new microalgae strains of the genus Isochrysis (Isochrysis sp.) Characterized in that they are capable of producing ⁇ under mixotrophic conditions.
  • the isolated Isochrysis strains according to the invention are the first ones described as being capable of producing, in a mixotrophic condition, significant amounts of EPA that may represent more than 5% or even more than 10% of lipids. totals contained in microalgae.
  • a representative strain of the Isochrysis strains according to the invention is the strain FCC 11 11, deposited at the CCAP on May 27, 2011, under the number CCAP 927/16. This strain is characterized in that it is capable of producing ⁇ in mixotrophic culture mode.
  • this strain belongs to the genus Isochrysis [Parke, M. 1949 (1949). Studies on marine flagellates. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 28: 255- 288]. Nevertheless, considering that the main species Isochrysis galbana, Isochrysis litoralis or Isochrysis maritima are phylogenetically close, the precise species to which belongs the strain FCC 11 1 1 has not yet been definitively established. Therefore, the invention relates to any species of Isochrysis capable of producing ⁇ in mixotrophic culture mode, as described in the present application.
  • the mixotrophic culture of Isochrysis according to the invention is preferentially carried out in a f / 2 type culture medium [Guillard, R.R. and Ryther, J.H. (1962) Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8: 229-239], in the presence of at least 5 mM, preferably at least 10 mM, more preferably at least 20 mM, and even more preferably more than 50 mM of a carbon substrate.
  • This carbon substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture, glucose, cellulose (or cellulose derivatives), starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • the cultivation in the mixotrophic mode of this microalga is preferably carried out in the presence of 10-200 mM and more preferably between 20 and 50 mM of carbon substrate.
  • the carbon substrate present in the culture medium comprises at least 5 mM glycerol or lactose.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration.
  • the culture is thus carried out in the presence of cumulative concentrations of carbon substrate of 5 mM to 1 M, preferably 50 mM to 800 mM, more preferably 70 mM to 600 mM, and still more preferably 100 mM to 500 mM.
  • This carbon substrate can consist of mixtures of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates carbonates adapted to the mixotrophic culture of microalgae according to the invention.
  • the subject of the invention is also a process for cultivating microalgae of the genus Isochrysis in mixotrophic mode in order to produce polyunsaturated fatty acids, in particular ⁇ .
  • This process has the effect of enriching microalgae of the genus Isochrysis polyunsaturated fatty acids, which generally results in an increase in the proportion of EPA or DHA present in the total lipids produced by said microalgae.
  • the efficiency of microalgae in EPA is higher when microalgae are cultivated in the presence of a variable or discontinuous light input, that is to say when the light flux brought to the microalgae in culture is variable or discontinuous over time. .
  • microalgae tend to accumulate lipid reserves to withstand the stresses of their environment.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes, that is to say over periods of short duration.
  • the successive phases of illumination are then generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, and that the light intensity varies over time.
  • This light variation can be periodic, cyclic or even random.
  • the illumination can vary continuously, that is to say that the light intensity is not constant and varies continuously over time (dpmol (photons) / dt ⁇ 0).
  • the invention aims, in particular, a microalgae culture process of the Isochrysis genus, characterized in that said algae are cultivated in the dark with a discontinuous or variable light input during of time, whose intensity in micromoles of photons varies by an amplitude equal to or greater than 10 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 at several times per hour, preferably equal to or greater than 50 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 more preferably equal to or greater than 100 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the common point of these different modes of illumination lies in the fact that, according to the invention, the light intensity provided to the algae in culture, expressed in micromoles of photons per second per square meter ( ⁇ .m “2 , s " 1 ), varies at least once in the same hour.
  • the amplitude of this variation of light intensity is generally greater than 10 pmol. m “2 , s “ 1 , preferably greater than or equal to 20 ⁇ . m “2 , s " 1 , more preferably greater than or equal to ⁇ ⁇ . ⁇ 2 . s "1.
  • the light intensity reaches every hour, preferably several times in an hour, a high and low value, whose difference is equal to or greater than that indicated above.
  • said intensity The luminous value successively reaches the values 50 pmol.m.sup.- 2 , s.sup.- 1 and 100 pmol.m.sup.- 2 , s.sup.- 1 every hour, more preferably values 0 and 50 pmol.m.sup.- 2 . s more preferably still values 0 and 100 ⁇ . m "2 , s 1 .
  • the intensity of the light provided to the culture can be increased depending on the cell density.
  • the duration of the flashes can be increased to 20 seconds with an intensity of 50-100 ⁇ . m "2 , s " 1 .
  • the flashes can have a duration of 30 seconds and an intensity of 100-200 ⁇ . m "2 , s 1 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention therefore makes it possible to select Isochrysis strains of a mixotrophic nature, having a high yield of polyunsaturated fatty acids and capable of producing ⁇ in mixotrophic mode, such as the FCC strain 1 1 11, deposited at the CCAP under the number CCAP 927/16.
  • Such a method generally comprises one or more of the following steps:
  • strains of Isochrysis can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure with precise monitoring of the conditions and evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the various strains to the discontinuous illumination and, where appropriate, the addition of one or more carbon substrates in the culture medium. Strains that respond favorably to discontinuous illumination and carbon substrates, generally offer a better yield for lipid production in terms of quality (polyunsaturated fatty acids more abundant in the lipid profile) and quantitative (lipids contain a higher proportion EPA).
  • the microalgae can be selected in a fermenter from a pool of diversified microalgae, the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention, combining discontinuous or variable light with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in culture over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture process according to the invention is characterized more particularly in that the culture of the strains is carried out over several generations, preferably in the mixotrophic mode, and in that the cells loaded with lipids are harvested.
  • the object of the invention is therefore also the production of lipids, in particular of fatty acids, via the cultivation of microalgae of the genus Isochrysis of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the processes referred to above, then the recovery of the microalgae thus cultivated for to extract the lipid content, in particular ⁇ .
  • the invention also relates to microalgae of the Isochrysis genus enriched in polyunsaturated fatty acids, which can be obtained according to the process of the invention as previously described.
  • the total lipids of such microalgae generally comprise more than 20%, often more than 40% and sometimes even more than 50% EPA.
  • Such microalgae can be used as a dietary supplement, especially in fish farming.
  • the cultures are made in fermentors (bioreactors) of 2L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 22 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank. The intensity as well as the light cycles are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the reactors are inoculated with a pretreatment performed on a stirring table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (22 ° C.) and lit continuously at 100 ⁇ m- 2 sec -1 .
  • Pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in f / 2 medium supplemented with 10 ⁇ g / L of Biotin as well as vitamin B12.
  • the organic carbon used for the bioreactor mixotrophic culture is glycerol at final concentrations between 20 and 30 g / L.
  • the organic carbon substrate is added to the culture medium in "fed-batch" mode.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GFC filter, Whatman, then drying in a vacuum oven at 65 ° C and -0.8 bar, for 24 hours minimum before weighing).
  • lipid extraction methods are known to those skilled in the art and are, for example, described by Bligh, EG and Dyer, WJ [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol 37: 911-917].
  • the contribution of light in bioreactor cultures was obtained by LED lamps distributed around the outer wall of the fermenters.
  • a clock triggers these LEDs for illumination times or flashes between 20 and 200 ⁇ m "2 , s " 1 .
  • the duration of the illumination times is between 15 and 30 seconds.
  • the intensity and duration of illumination time vary depending on the cell density.
  • the culture has a total duration of about 10 days.
  • the flashes For the first three days of culture, the flashes have a duration of 15 seconds and an intensity of 30 ⁇ m "2 , s " 1 . From the fourth day, the duration of the flashes is 20 seconds with an intensity of 75 ⁇ m "2 , s " 1 .
  • the flashes have a duration of 30 seconds and an intensity of 150 ⁇ m "2 , s " 1 .
  • the luminous intensity of the flash system used in mixotrophy is equal to that used in autotrophy (control).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Isochrysis permettant une production optimale d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA, en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches faisant appel, notamment, à un apport de lumière discontinu sous forme de flashs.

Description

NOUVELLES SOUCHES DE MICROALGUES DU GENRE ISOCHRYSIS POUR LA PRODUCTION D'EPA ET DE DHA EN MODE MIXOTROPHE
L'invention se rapporte à un procédé de culture et de sélection de souches de microalgues appartenant au genre Isochrysis impliquant un apport discontinu de lumière sous forme de flashs, ainsi qu'à des souches d'Isochrysis sélectionnées, particulièrement adaptées à la production d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA (acide éicosapentaénoïque) en mode de culture mixotrophe.
Préambule
Il est rappelé que les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins, qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance.
Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique.
D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102].
A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des omégas 3 (AGHI ou PUFA-u)3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA, C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 ω3) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225].
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.
De nouvelles sources d'EPA et de DHA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poissons : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante, et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.
Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Il existe des variations importantes parmi les différentes espèces des différentes classes composant ces phylums en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives d'EPA et de DHA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture [Yongmanitchai, W. et Ward, O.P. (1989) Omega-3 fatty acids : alternative sources of production. Process. Biochem. 24 :1 17-125].
Dans la perspective d'une exploitation industrielle des microalgues, ce sont les espèces à caractère hétérotrophe ou mixotrophe, qui suscitent actuellement le plus d'intérêt de la part des industriels. En effet, la dépendance réduite de ce type de microalgues vis-à-vis de la lumière, permet d'envisager leur culture dans des récipients fermés de grande dimension, comme cela se pratique en fermenteurs pour des bactéries ou des levures.
Par rapport aux cultures classiques en mode autotrophe, ces nouveaux modes de culture permettent de gagner de l'espace et de réaliser des économies d'énergie liées à un apport de lumière d'intensité plus faible et à un brassage moins intensif des cultures.
Néanmoins, de nombreuses espèces de microalgues cultivées traditionnellement en mode autotrophe ne se montrent pas cultivables en mode de culture hétérotrophe. C'est le cas, en particulier, des microalgues du genre Isochrysis, qui sont des microalgues marines flagellées de couleur brune appartenant à la classe des Prymnesiophyceae.
Les microalgues du genre Isochrysis sont très utilisées en pisciculture dans les écloseries de poissons, crevettes, mollusques et crustacés comme complément alimentaire riche en DHA. Ces microalgues sont commercialisées généralement sous forme de préparations de microalgues concentrées à longue conservation (Algues instantanées®, 871 East Hamilton Ave, Campbell, CA 95008, USA). La particularité de ces microalgues est de stocker leurs acides gras intra cellulairement sous la forme d'inclusions lipidiques. Comme leurs parois sont relativement fines, plusieurs études placent Isochrysis parmi les microalgues se prêtant le mieux à une extraction de leurs lipides à l'échelle industrielle.
Les souches d'Isochrysis actuellement décrites sont dépendantes de la lumière, ce qui explique qu'elles ne peuvent pas être cultivées en mode hétérotrophe. Cependant, des études (Liu, C-P. and Lin, L-P. (2001 ) Ultrastructural study and lipid formation of Isochrysis sp. (2001 ) Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214] ont déterminé que certaines souches, notamment la souche commerciale CCMP1324, pouvaient être cultivées en mode mixotrophe dans de l'eau de mer artificielle (3,2 % NaCI) à 25°C, pH=8, avec un apport continu de lumière de 10 klux (plus de 160 pmol. m"2, s"1 exprimés en photons) en présence d'une concentration de 10 à 50 mM d'acétate de sodium (substrat carboné). Dans de telles conditions, une biomasse totale de 4 g/l en poids sec de microalgues a été obtenue, avec une production optimale de DHA correspondant à 16 mg par litre de culture.
Ce faisant, à la connaissance du demandeur, aucune souche d'Isochrysis sp. ne s'est montrée capable de produire de ΙΈΡΑ dans ces conditions.
C'est donc de façon surprenante, au terme de nombreuses expérimentations réalisées avec des souches variées dans différentes conditions de mixotrophie, que le demandeur est parvenu à sélectionner et cultiver des souches d'Isochrysis capables de produire de ΙΈΡΑ en mode mixotrophe.
Ce procédé, objet de la présente invention, a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous forme de flashs.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour les microalgues, a permis, de façon surprenante, de sélectionner des souches d'Isochrysis capables de produire à la fois de ΙΈΡΑ et du DHA en mode mixotrophe.
Ce procédé a ainsi permis, pour la première fois, la production d'EPA par des souches d'Isochrysis en conditions de mixotrophie.
Une souche (FCC 1 11 1 ) représentative des nouvelles souches d'Isochrysis, sélectionnées et cultivées selon l'invention, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, le 27 mai 2011 sous le numéro d'accession CCAP 927/16.
La mise en oeuvre des souches et du procédé de culture selon l'invention ouvre ainsi la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA et de DHA, à l'aide de souches du genre Isochrysis, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit et économes en énergie.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Description détaillée
La présente invention a pour premier objet de nouvelles souches de microalgues du genre Isochrysis (Isochrysis sp.) caractérisées en ce qu'elles sont capables de produire de ΙΈΡΑ en conditions de culture mixotrophe. A la connaissance du demandeur, les souches d'Isochrysis isolées selon l'invention sont les premières décrites comme pouvant produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives d'EPA pouvant représenter plus de 5 %, voire plus de 10 %, des lipides totaux contenus dans les microalgues.
Ces nouvelles souches à'Isochrysis ont été isolées et sélectionnées selon les procédés de sélection et de culture détaillés plus loin.
Une souche représentative des souches d'Isochrysis selon l'invention est la souche FCC 11 11 , déposée à la CCAP le 27 mai 2011 , sous le numéro CCAP 927/16. Cette souche est caractérisée en ce qu'elle est capable de produire de ΙΈΡΑ en mode de culture mixotrophe.
Selon les analyses taxonomiques en cours, cette souche appartient au genre Isochrysis [Parke, M. 1949 (1949). Studies on marine flagellâtes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 28: 255- 288]. Néanmoins, compte tenu du fait que les principales espèces Isochrysis galbana, Isochrysis litoralis ou Isochrysis maritima sont phylogénétiquement proches, l'espèce précise à laquelle appartient la souche FCC 11 1 1 n'a pas encore pu être définitivement établie. De ce fait, l'invention porte sur toute espèce d'Isochrysis capable de produire de ΙΈΡΑ en mode de culture mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande.
La culture en mode mixotrophe d'Isochrysis selon l'invention s'effectue préférentiellement dans un milieu de culture de type f/2 [Guillard, R. R. and Ryther, J. H. (1962) Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8: 229-239], en présence d'au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, plus préférentiellement au moins 20 mM, et encore plus préférentiellement plus de 50 mM d'un substrat carboné. Ce substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange, du glucose, de la cellulose (ou dérivés de cellulose), de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.
Plus précisément, la culture en mode mixotrophie de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence de 10-200mM et plus préférentiellement entre 20 et 50mM de substrat carboné. De préférence, le substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glycérol ou de lactose.
L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. La culture s'effectue ainsi en présence des concentrations cumulatives de substrat carboné de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM.
Ce substrat carboné peut consister en des mélanges de molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.
L'invention a également pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Isochrysis en mode mixotrophe en vue de produire des acides gras polyinsaturés, notamment de ΙΈΡΑ. Ce procédé a pour effet d'enrichir les microalgues du genre Isochrysis en acides gras polyinsaturés, ce qui se traduit généralement par une augmentation de la proportion d'EPA ou de DHA présents dans les lipides totaux produits par lesdites microalgues.
De façon surprenante, le rendement des microalgues en EPA est plus élevé lorsqu'on cultive les microalgues en présence d'un apport lumineux variable ou discontinu, autrement dit lorsque le flux de lumière apporté aux microalgues en culture est variable ou discontinu au cours du temps.
Ainsi, contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides.
Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer en partie, par le fait que, dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, et que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire.
Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt≠ 0).
Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
L'invention vise, en particulier, un procédé de culture de microalgues du genre Isochrysis, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 μητιοΙ. m"2, s"1 à raison de plusieurs fois par heure, de préférence égale ou supérieure à 50 μιτιοΙ. m"2, s"1, plus préférentiellement égale ou supérieure à 100 μιηοΙ. m"2, s"1. Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιηοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m"2, s"1, préférentiellement supérieure ou égale à 20 μηηοΙ. m"2, s"1 , plus préférentiellement supérieure ou égale à δθ μηηοΐ. ιτί2. s"1. Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 pmol. m"2, s"1 et IOO pmol. m"2, s"1 à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m"2. s plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 μηηοΙ. m"2, s 1.
Il est rappelé que 1 μηιοΙ. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
De préférence, et selon les connaissances de l'homme de métier, l'intensité de la lumière apportée à la culture peut être augmentée en fonction de la densité cellulaire. Par exemple, au début de la culture, lorsque les flashs ont, par exemple, une durée de 15 secondes et une intensité de 20-50 μιτιοΙ. m"2, s"1, ensuite, quand la culture devient plus dense, la durée des flashs peut être augmentée à 20 secondes avec une intensité de 50-100 μητιοΙ. m"2, s"1. Dans la phase finale de la culture, les flashs peuvent avoir une durée de 30 secondes et une intensité de 100- 200 μητιοΙ. m"2, s 1.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA.
Le procédé de culture selon l'invention permet donc de sélectionner des souches d'Isochrysis à caractère mixotrophe, ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés et capables de produire de ΙΈΡΑ en mode mixotrophe, comme la souche FCC 1 1 11 , déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 927/16.
Un tel procédé comprend généralement une ou plusieurs des étapes suivantes :
- la culture de différentes souches du genre Isochrysis dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie préférentiellement d'une amplitude égale ou supérieure à 50 pmol. m"2, s"1 à raison d'au moins une fois par heure;
- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations;
- l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
Pour réaliser le criblage des souches, différentes souches d'Isochrysis peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA). Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en culture sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention se caractérise plus particulièrement en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides.
L'invention a donc également pour but la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Isochrysis à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier ΙΈΡΑ.
Les méthodes d'extraction sélective de ΙΈΡΑ et du DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:91 1-917].
L'invention porte également sur les microalgues du genre Isochrysis enrichies en acides gras polyinsaturés, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 20 %, souvent plus de 40 % et parfois même plus de 50 % d'EPA. De telles microalgues peuvent servir en tant que complément alimentaire, notamment en pisciculture. Exemple
Culture des souches d'Isochrysis en bioréacteur :
Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au minimum = 100 rpm et au maximum = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 wm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée en continu à 100 μΕ m"2, s"1. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu f/2 supplémenté avec 10 pg/L de Biotine ainsi que de la vitamine B12. Le carbone organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glycérol à des concentrations finales entre 20 et 30 g/L. Le substrat organique carboné est rajouté au milieu de culture en mode « fed-batch ».
Suivi des cultures
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage en étuve sous vide, à 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 107 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].
Lumière en flash
L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des flashs entre 20 et 200 μΕ m"2, s"1. Pendant la culture, la durée des temps d'éclairement est entre 15 et 30 secondes. L'intensité et la durée de temps d'éclairement varient en fonction de la densité cellulaire. La culture a une durée totale d'environ 10 jours. Pour les trois premiers jours de la culture, les flashs ont une durée de 15 secondes et une intensité de 30 μΕ m"2, s"1. A partir du quatrième jour, la durée des flashs est de 20 secondes avec une intensité de 75 μΕ m"2, s"1. Pour les derniers trois jours de la culture, les flashs ont une durée de 30 secondes et une intensité de 150 μΕ m"2, s"1.
L'intensité lumineuse du système flash utilisé en mixotrophie est égale à celle utilisée en autotrophie (témoin).
Souche Isochrysis sp. Mixotrophie en flash
Biomasse (% par rapport à + 30%
l'autotrophie)
Lipides totaux (% par rapport à +20%
l'autotrophie)
EPA (% par rapport à l'autotrophie) +20%
DHA (% par rapport à l'autotrophie) +5%

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de production d'EPA (acide éicosapentaénoïque) caractérisé en ce qu'il comprend la culture en mode mixotrophe d'une microalgue du genre Isochrysis, et la récupération de la biomasse ainsi formée.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la culture en mode mixotrophe de ladite microalgue du genre Isochrysis s'effectue en présence d'un substrat carboné comprenant au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, et plus préférentiellement au moins 20 mM de glucose, de cellulose, d'amidon, de lactose, de saccharose, d'acétate et/ou de glycérol.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glycérol.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de lactose.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction des acides gras polyinsaturés accumulés dans les microalgues au cours de leur culture.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la culture d'une ou plusieurs souches du genre Isochrysis dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 50 pmol. m"2, s"1 , à raison d'au moins une fois par heure;
- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné dans le milieu de culture;
- la récolte des cellules d'Isochrysis ainsi obtenues.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le flashage consiste en des phases successives d'éclairement d'une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite microalgue du genre Isochrysis, est capable de produire de ΙΈΡΑ en mode mixotrophe, comme la souche FC 1 1 11 , déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa) sous le numéro CCAP 927/16.
10. Procédé de sélection de souches isolées du genre Isochrysis capables de produire de ΙΈΡΑ en mode mixotrophe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de production d'EPA par lesdites souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
1 1. Microalgue du genre Isochrysis enrichie en EPA, susceptible d'être obtenue en mode de culture mixotrophe selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Microalgue du genre Isochrysis cultivée en mode mixotrophe, caractérisée en ce que ses lipides totaux contiennent plus de 5 %, de préférence plus de 10 %, plus préférentiellement plus de 20 % d'EPA.
13. Microalgue du genre Isochrysis selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent également au moins 5 % de DHA.
14. Microalgue caractérisée en ce qu'elle consiste en une souche isolée du genre Isochrysis correspondant à la souche FC 1111 , déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 927/16.
15. Utilisation d'une microalgue du genre Isochrysis selon l'une des revendications 11 à 14, en tant que complément alimentaire, notamment en pisciculture.
PCT/FR2012/051386 2011-06-21 2012-06-20 Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe WO2012175866A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/127,389 US20140199739A1 (en) 2011-06-21 2012-06-20 Novel strains of microalgae of the isochrysis genus for producing epa and dha in a mixotrophic mode
EP12738510.2A EP2723876A1 (fr) 2011-06-21 2012-06-20 Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1155443 2011-06-21
FR1155443A FR2976951A1 (fr) 2011-06-21 2011-06-21 Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012175866A1 true WO2012175866A1 (fr) 2012-12-27

Family

ID=46579171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2012/051386 WO2012175866A1 (fr) 2011-06-21 2012-06-20 Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20140199739A1 (fr)
EP (1) EP2723876A1 (fr)
FR (1) FR2976951A1 (fr)
WO (1) WO2012175866A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9758756B2 (en) 2012-11-09 2017-09-12 Heliae Development Llc Method of culturing microorganisms using phototrophic and mixotrophic culture conditions
US10240120B2 (en) 2012-11-09 2019-03-26 Heliae Development Llc Balanced mixotrophy method
US11162126B2 (en) 2015-09-25 2021-11-02 Fermentalg Method for the culture of unicellular red algae
US11365387B2 (en) 2015-12-04 2022-06-21 Fermentalg Method for culturing unicellular red algae (URA) with milk permeate

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019208803A1 (fr) * 2018-04-26 2019-10-31 日本水産株式会社 Huile microbienne et procédé de production d'huile microbienne

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0459744A2 (fr) * 1990-05-26 1991-12-04 The Scottish Agricultural College Méthode de production d'un acide gras
ES2088366A1 (es) * 1995-01-13 1996-08-01 Univ Almeria Microalga marina y su empleo en acuicultura y en la obtencion de acidos grasos poliinsaturados.

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101478138B1 (ko) * 2008-10-24 2015-01-02 바이오-프로세스에이치20 엘엘씨 미생물을 배양하고 가스를 진정시키는 시스템, 장치 및 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0459744A2 (fr) * 1990-05-26 1991-12-04 The Scottish Agricultural College Méthode de production d'un acide gras
ES2088366A1 (es) * 1995-01-13 1996-08-01 Univ Almeria Microalga marina y su empleo en acuicultura y en la obtencion de acidos grasos poliinsaturados.

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALONSO LOPEZ ET AL: "Fatty acid variation among different isolates of a single strain of Isochrysis galbana", PHYTOCHEMISTRY (OXFORD), vol. 31, no. 11, 1992, pages 3901 - 3904, XP002667822, ISSN: 0031-9422 *
BLIGH, E.G.; DYER, W.J.: "A rapid method of total lipid extraction and purification", CAN. J. BIOCHEM. PHYSIOL, vol. 37, 1959, pages 911 - 917, XP000998224
BLIGH, E.G.; DYER, W.J.: "A rapid method of total lipid extraction and purification", CAN. J.BIOCHEM. PHYSIOL, vol. 37, 1959, pages 911 - 917, XP000998224
CHEN CHUN-YEN ET AL: "Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microalgae for biodiesel production: A critical review", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 102, no. 1, Sp. Iss. SI, January 2011 (2011-01-01), pages 71 - 81, XP002667823 *
DUBINSKY ET AL., HYDROBIOLOGIA, vol. 639, 2010, pages 153 - 171
GUILLARD, R. R.; YTHER, J. H.: "Studies on marine planktonic diatoms. 1. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran", CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 8, 1962, pages 229 - 239
HORROCKS L.A. ET AL.: "Health Benefits of DHA.", PHARMACOL. RES., vol. 40, 2000, pages 211 - 225, XP001153885, DOI: doi:10.1006/phrs.1999.0495
LIU CHING-PIAO ET AL: "Ultrastructural study and lipid formation of Isochrysis sp. CCMP1324", BOTANICAL BULLETIN OF ACADEMIA SINICA (TAIPEI), vol. 42, no. 3, July 2001 (2001-07-01), pages 207 - 214, XP002667820, ISSN: 0006-8063 *
LIU, C-P.; LIN, L-P.: "Ultrastructural study and lipid formation of Isochrysis sp.", BOT. BULL. ACAD. SIN., vol. 42, 2001, pages 207 - 214, XP002667820
OTERO A ET AL: "Manipulation of the biochemical composition of the eicosapentaenoic acid-rich microalga Isochrysis galbana in semicontinuous cultures", BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY 1997 GB, vol. 26, no. 3, 1997, pages 171 - 177, XP008147746, ISSN: 0885-4513 *
PARK DOO WON ET AL: "Sterol composition of dark-grown Isochrysis galbana and its implication in the seed production of Pacific oyster, Crassostrea gigas.", JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY, vol. 14, no. 5, October 2002 (2002-10-01), pages 351 - 355, XP002667821, ISSN: 0921-8971 *
PARKE, M.: "Studies on marine flagellates", JOURNAL OF THE MARINE BIOLOGICAL ASSOCIATION OF THE UNITED KINGDOM, vol. 28, 1949, pages 255 - 288
UKELES R ET AL: "OBSERVATIONS ON ORGANIC CARBON UTILIZATION BY PHOTOSYNTHETIC MARINE MICRO ALGAE", MARINE BIOLOGY (BERLIN), vol. 37, no. 1, 1976, pages 11 - 28, XP008147741, ISSN: 0025-3162 *
YANG C. ET AL., BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 6, 2000, pages 87 - 102
YONGMANITCHAI, W.; WARD, O.P.: "Omega-3 fatty acids : alternative sources of production", PROCESS. BIOCHEM., vol. 24, 1989, pages 117 - 125, XP003004328

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9758756B2 (en) 2012-11-09 2017-09-12 Heliae Development Llc Method of culturing microorganisms using phototrophic and mixotrophic culture conditions
US10240120B2 (en) 2012-11-09 2019-03-26 Heliae Development Llc Balanced mixotrophy method
US11162126B2 (en) 2015-09-25 2021-11-02 Fermentalg Method for the culture of unicellular red algae
US11365387B2 (en) 2015-12-04 2022-06-21 Fermentalg Method for culturing unicellular red algae (URA) with milk permeate

Also Published As

Publication number Publication date
FR2976951A1 (fr) 2012-12-28
US20140199739A1 (en) 2014-07-17
EP2723876A1 (fr) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2616536B1 (fr) Procédé de culture d'algues unicellulaires mixotrophes en présence d'un apport lumineux discontinu sous forme de flashs
EP2825631B1 (fr) Production d'acide docosahexaénoïque et d'astaxanthine en mode mixotrophe par schizochytrium.
EP2825629B1 (fr) Production d'acide docosahexaenoique et/ou d'acide eicosapentaenoique et/ou de carotenoides en mode mixotrophe par nitzschia
EP3019592B1 (fr) Nouvelle souche de aurantiochytrium et procédé utilisant celle-ci
EP2718419A1 (fr) Nouvelle souche de microalgue du genre odontella pour la production d'epa et de dha en mode de culture mixotrophe
CA2944546A1 (fr) Procede de culture des microalgues du genre aurantiochytrium dans un milieu de culture sans chlorure et sans sodium pour la production de dha
EP2723876A1 (fr) Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe
EP2825628A1 (fr) Production d'acide eicosapentaenoïque et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par euglena.
EP2844734B1 (fr) Production de lutéine en mode mixotrophe par scenedesmus
WO2012168662A1 (fr) Procede d'enrichissement en epa de microalgues du genre monodus, cultivees en mode mixotrophe
CA2812579A1 (fr) Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues
EP2836586A1 (fr) Production d'acide eicosapentaenoique et/ou d'acide docosahexaenoique en mode mixotrophe par cyclotella
WO2013136026A1 (fr) Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus
CA3007749A1 (fr) Procede d'enrichissement de protistes en lipides riches en acides gras polyinsatures, en particulier de classe omega 3, et sa mise en oeuvre pour la production de ces protistes enrichis ou de ces lipides

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12738510

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012738510

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14127389

Country of ref document: US