EP2718419A1 - Nouvelle souche de microalgue du genre odontella pour la production d'epa et de dha en mode de culture mixotrophe - Google Patents

Nouvelle souche de microalgue du genre odontella pour la production d'epa et de dha en mode de culture mixotrophe

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EP2718419A1
EP2718419A1 EP12745890.9A EP12745890A EP2718419A1 EP 2718419 A1 EP2718419 A1 EP 2718419A1 EP 12745890 A EP12745890 A EP 12745890A EP 2718419 A1 EP2718419 A1 EP 2718419A1
Authority
EP
European Patent Office
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microalgae
culture
odontella
dha
genus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12745890.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Calleja
Khadidja Romari
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Fermentalg SA
Original Assignee
Fermentalg SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Fermentalg SA filed Critical Fermentalg SA
Publication of EP2718419A1 publication Critical patent/EP2718419A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a new strain of microalgae of the genus Odontella, capable of growing in heterotrophy and mixotrophy, as well as to a method for selecting and culturing said microalgae, allowing production of polyunsaturated fatty acids, in particular EPA and DHA, in heterotrophic or mixotrophic mode.
  • This new strain is found to be particularly useful for producing ⁇ and DHA, especially in a culture process carried out in mixotrophic mode, in which the light input takes the form of flashes.
  • microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are strictly autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis.
  • microalgae species from families and from very different origins, do not appear to be strictly autotrophic. Thus some of them, called heterotrophic, are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • mixotrophs can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • microalgae is still based largely on morphological criteria and on the nature of the photosynthetic pigments contained in their cells. As a result, it is not very indicative of the autotrophic, heterotrophic or mixotrophic nature of the different species of algae, whereas these cover a very large diversity of species and forms [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639: 153-171].
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • microalgae offer several advantages over fish oils.
  • they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a relatively constant biochemical composition biomass.
  • lipids from microalgae do not have an unpleasant smell and contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by microalgae have a generally simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • the main microalgae producing EPA and DHA are marine species belonging to different phyla. However, of the hundreds of thousands of species covered by these phyla, only a small number of species taxonomically distant from each other have high levels of EPA and DHA.
  • the species capable of producing significant amounts of EPA and / or DHA most often mentioned are those belonging to the genera Schizotrium sp., Crypthecodinium sp. (Dinophyceae), Phaeodactylum sp. (Bacillariophyceae, Naviculales) and Odontella sp. (Bacillariophyceae, Coscinodiscophyceae).
  • Microalgae of the genus Odontella are unicellular algae of large size, whose length can wait 35 to 50 microns. They have a silica frustule composed of two symmetrical valves. These are ubiquitous and cosmopolitan microalgae of the neritic zone, not forming dense planktonic populations, and which are often associated with various species of benthic macroalgae in coastal zones. In the natural state, the species Odontella aurita accumulates between 1.6% to 3.4% by total dry weight of EPA, which represents on average 21% of the total fatty acids produced by this microalgae.
  • Odontella aurita is usually grown in autotrophic mode in outdoor ponds for use in animal feed, particularly for feeding fish larvae and crustaceans [Pulz and Gross (2004). Applied to biotechnology of microalgae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 (6): 635-648].
  • microalgae in autotrophic mode in open basins is not very suitable for industrial exploitation of these. Indeed, in view of the intensive exploitation of microalgae, the production of biomass must be able to be carried out in large quantities, in closed and large photo-bioreactors. However, it is difficult under such conditions to provide satisfactory illumination to all cells in the culture medium, particularly when the density of microalgae becomes important.
  • Odontella would be to practice cultures in heterotrophic mode, that is to say in the absence of light, with a supply of energy in the form of carbon substrates, or in mixotrophic mode, that is to say, in the presence of a light input of less intensity, with also a contribution of organic substrate.
  • This new strain of Odontella was isolated from the environment and cultured by the inventor, and more particularly, according to a process developed by it, consisting of cultivating microalgae under conditions of mixotrophy, in the presence of discontinuous illumination, especially in the form of flashes.
  • the close alternation of lighted phases and dark phases, generally perceived as stressful for microalgae, has allowed, surprisingly, to obtain from this strain a high production of polyunsaturated fatty acids.
  • the implementation of such a strain, according to the invention makes it possible to envisage an industrial production of polyunsaturated fatty acids in fermentors benefiting from a reduced light input, and thus, to save energy and energy. surface compared to existing autotrophic culture methods.
  • Odontella strain, FCC 675 which is the first of these strains to be selected according to the present invention, was deposited according to the provisions of the Budapest Treaty to the CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Scotland, United Kingdom), May 27, 2011, and was granted accession number CCAP 1054/5.
  • the subject of the present invention is therefore an isolated microalga, of the genus Odontella (Phylum: Bacillariophyta, Class: Coscinodiscophyceae, Family: Eupodicaceae) [ITIS, Catalog of Life, 2010], characterized in that it is cultivable in heterotrophic or mixotrophic mode. .
  • this microalga is cultivable in the heterotrophic mode by its capacity to multiply in the dark in a conventional culture medium, usually used for the cultivation of Odontella in autotrophic mode, preferably a mineral medium, in which a carbon substrate is added.
  • mineral medium is meant a culture medium consisting of an aqueous solution, often based on seawater, in which inorganic compounds are dissolved, as well as possibly vitamins and some amino acids.
  • An environment Suitable mineral for the cultivation of Odontella is, for example, the medium f / 2 [Guillard, RRL (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60.
  • this microalga is cultivable in mixotrophic mode is appreciated by the capacity of the microalga to multiply in the presence of a light supply, in a culture medium similar to that described above, that is to say a medium usually used for the cultivation of Odontella in autotrophic mode, but in which a carbon substrate is added.
  • the intensity of the light input is greater than or equal to 5 ⁇ , preferably between 5 and 300 ⁇ , more preferably between 10 and 200 ⁇ , and even more preferably between 20 and 150 ⁇ .
  • a carbon substrate is brought to the culture.
  • the carbon substrate comprises or consists of, in pure form or as a mixture, generally one or more of the following compounds: starch, glucose, xylose, arabinose, lactose, lactate, cellulose and its derivatives, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • Products derived from the biotransformation of starch for example from maize, wheat or potato, especially starch hydrolysates, which consist of small molecules, can form exploitable carbon substrates for cultivation of microalgae in heterotrophic or mixotrophic mode.
  • the mixotrophic or heterotrophic culture of this microalga is preferably carried out in the presence of at least 5 mM, preferably at least 10 mM, more preferably at least 20 mM, and even more preferably more than 50 mM of a carbon substrate. .
  • Those skilled in the art know how to determine the maximum concentrations of the carbon substrate to be used.
  • the cultivation in mixotrophic or heterotrophic mode of this microalgae can be carried out in the presence of 10-200 mM, preferably between 20 and 50 mM of carbon substrate.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration. Those skilled in the art can determine the amounts of the carbon substrate to be added to the culture to maintain a constant concentration of the carbon substrate in the culture medium.
  • the culture can be carried out with cumulative concentrations of carbon substrate of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and still more preferably from 100 mM to 500 mM. mM.
  • arabinose and xylose are preferred carbon substrates for the odontella culture in the heterotrophic mode according to the invention.
  • Acetate and sucrose constitute preferred carbon substrates for the cultivation of Odontella in the mixotrophic mode according to the invention.
  • the subject of the invention is thus a process for cultivating or selecting a microalgae of the Odontella genus of heterotrophic or mixotrophic nature according to the invention, characterized in that it comprises the following stages:
  • the cultivation method according to the invention is intended in particular to produce polyunsaturated fatty acids, more particularly ⁇ and DHA, which accumulate in the microalgae thus selected or produced.
  • Such a culture method is particularly advantageous when a variable or discontinuous light input is implemented, in other words, when the light flux brought to the algae in culture is variable or discontinuous over time.
  • microalgae tend to accumulate lipid reserves to withstand the stresses of their environment.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes, that is to say over periods of short duration.
  • the successive phases of illumination are then generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, and that the light intensity varies over time.
  • This light variation can be periodic, cyclic or even random.
  • the illumination can vary continuously, that is to say that the light intensity is not constant and varies continuously over time (d mol (photons) / dt ⁇ 0) .
  • the invention relates to a method for cultivating microalgae of the genus Odontella, characterized in that said algae are cultivated in the dark with a discontinuous or variable light input over time, the intensity of which in micromoles of photons vary by an amplitude equal to or greater than 10 pmol. m “2 , s " 1 , preferably equal to or greater than 50 pmol. m “2 , s " 1 , more preferably equal to or greater than 100 pmol. m “2 , s " 1 , one or more times per hour, advantageously more than once per hour.
  • the common point of these different modes of illumination lies in the fact that, according to the invention, the light intensity provided to the algae in culture, expressed in micromoles of photons per second per square meter (pmol.m “2. s “ 1 ), varies at least once in the same hour.
  • the amplitude of this variation of light intensity is generally greater than 10 pmol. m “2 , s “ 1 , preferably greater than or equal to 20 pmol. m “2 , s " 1 , more preferably greater than or equal to 50 pmol. nor "2 , s " 1 .
  • the light intensity reaches, each hour, preferably several times in the hour, a high and low value, whose difference is equal to or greater than that indicated above.
  • said luminous intensity successively reaches 50 pmol. m “2 , s “ 1 and 100 pmol. m “2 , s " 1 every hour, more preferably the values 0 and 50 pmol. m “2 , s 1 , more preferably still values 0 and 100 ⁇ . m “ 2 , s "1 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the cultures can be carried out in a fermenter in which the culture medium circulates regularly to reach an illuminated part of this fermenter.
  • a fermenter can take, for example, the shape of a device equipped with a circular pipe, part of which is transparent and illuminated from the outside. The culture medium and the algae in suspension, actively circulating through the illuminated part of such a device, are thus periodically in contact with the light.
  • Odontella FCC 675 A particular strain of Odontella FCC 675, isolated, selected and grown by the applicant, was filed at CCAP on May 27, 2011, under the number CCAP 1054/5. According to current taxonomic analyzes, it belongs to the species Odontella aurita. Nevertheless, given its affiliation with other species of Odontella, the invention relates to any species of microalgae of the genus Odontella having a mixotrophic character, as described in the present application.
  • strains selected according to the process of the invention have good aptitude to grow in heterotrophic or mixotrophic mode, predisposes these strains to a higher production of polyunsaturated fatty acids, in particular EPA and DHA.
  • the cultivation method according to the invention therefore makes it possible to select Odontella strains of a mixotrophic nature, similar to that isolated by the applicant and deposited with CCAP, having a high yield of polyunsaturated fatty acids.
  • strains of Odontella can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure with precise monitoring of the conditions and the evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the various strains to the discontinuous illumination and, where appropriate, the addition of one or more carbon substrates in the culture medium. Strains that respond favorably to discontinuous illumination and carbon substrates, generally offer a better yield for lipid production in terms of quality (polyunsaturated fatty acids more abundant in the lipid profile) and quantitative (lipids contain a higher proportion EPA and DHA).
  • the microalgae can be selected in a fermenter from a pool of diversified microalgae, the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention, combining discontinuous or variable light with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture process according to the invention is characterized more particularly in that the culture of the strains is carried out over several generations, preferably in the mixotrophic mode, and in that the cells loaded with lipids are harvested.
  • the invention also relates to a process for enriching microalgae of the genus Odontella in polyunsaturated fatty acids, characterized in that it comprises the selection and cultivation of microalgae of the genus Odontella, in mixotrophic or heterotrophic mode, more particularly according to culture methods described above.
  • the invention also aims to produce lipids, in particular polyunsaturated fatty acids, via the cultivation of microalgae of the Odontella genus with a heterotrophic or mixotrophic nature, then the recovery of the microalgae thus cultivated to extract the lipid content, in particular ⁇ and / or DHA.
  • microalgae are preferably cultivated or selected according to the methods referred to above.
  • the cultivation of Odontella strains according to the invention in mixotrophic or heterotrophic mode generally makes it possible to increase the total biomass by more than 20%, more often by more than 30%, and sometimes even by more than 40% with respect to the cultivation of the same strain of Odontella in autotrophic mode.
  • the content of total lipids in EPA and DHA in the total lipids extracted from the strains of Odontella thus cultivated represents more than 10%, generally more than 30%, very often more than 40%, or even more than 50% of the total cellular lipids, in dry weight.
  • ⁇ and DHA are known to those skilled in the art and are, for example, described by Bligh, E.G. and Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37: 91 1-917].
  • the EPA and DHA thus extracted can be used as additives in nutritional compositions, such as infant formula, or in cosmetic or therapeutic compositions.
  • microalgae selected, cultured or enriched in polyunsaturated fatty acids according to the method of the invention, can be used directly, in hydrated or dehydrated form, or after processing, as a food supplement, particularly in fish farming, or as a an ingredient in the composition of cosmetic or therapeutic products.
  • the cultures are made in 2L fermenters (bioreactors) which are useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 23 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank.
  • the intensity as well as the light cycles are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture carried out on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (22 ° C.) and continuously lit at 100 ⁇ m- 2 s- 1 .
  • Pre-cultures and cultures in bioreactors are performed in f / 2 medium.
  • the organic carbon used for the bioreactor mixotrophic culture is sodium acetate at concentrations between 20 mM and 50 mM.
  • the organic carbon substrate is added to the culture medium in "fed-batch" mode.
  • the culture conditions in heterotrophy are identical to those of the mixotrophy in the absence of light.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (GFC filter filtration, Whatman, then drying in a vacuum oven, 65 ° C and -0.8 bar, for 24 hours minimum before weighing).
  • the quantification of total lipids 10 7 cells / ml were extracted.
  • the lipid extraction methods are known to those skilled in the art and are, for example, described by Bligh, EG and Dyer, WJ A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol 37: 911-917].

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Abstract

L'invention se rapporte à une nouvelle souche de microalgue du genre Odontella, capable de croître en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture d'une telle souche permettant une production d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et de DHA, en mode hétérotrophe ou mixotrophe.

Description

NOUVELLE SOUCHE DE MICROALGUE DU GENRE ODONTELLA POUR LA PRODUCTION D'EPA ET DE DHA EN MODE
DE CULTURE MIXOTROPHE
L'invention se rapporte à une nouvelle souche de microalgue du genre Odontella, capable de croître en hétérotrophie et en mixotrophie, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture desdites microalgues, permettant une production d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et de DHA, en mode hétérotrophe ou mixotrophe.
Cette nouvelle souche se trouve être particulièrement utile pour produire de ΙΈΡΑ et du DHA, notamment dans un procédé de culture réalisé en mode mixotrophe, dans lequel l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
Préambule
Il est rappelé que les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins, qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse.
Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique. D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des microalgues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance desdites microalgues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102].
A l'heure actuelle, la classification des microalgues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des différentes espèces d'algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des omégas 3 (AGHI ou PUFA-u)3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA, C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 ω3) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225].
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive. De nouvelles sources d'EPA et de DHA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés.
Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson. En particulier, elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante. D'autre part, contrairement aux huiles de poissons, les lipides provenant des microalgues ne présentent pas d'odeur désagréable et contiennent peu ou pas de cholestérol. Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras généralement plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
Les principales microalgues productrices d'EPA et de DHA sont des espèces marines appartenant à différents phylums. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces que recouvrent ces phylums, seul un petit nombre d'espèces éloignées les unes des autres sur le plan taxonomique, présente une teneur élevée en EPA et DHA. Les espèces capables de produire des quantités significatives d'EPA et/ou de DHA les plus souvent mentionnées sont celles appartenant aux genres Schizotrium sp., Crypthecodinium sp. (Dinophyceae), Phaeodactylum sp. (Bacillariophyceae, Naviculales) et Odontella sp. (Bacillariophyceae, Coscinodiscophyceae).
Les microalgues du genre Odontella sont des algues unicellulaires de taille importante, dont la longueur peut attendre 35 à 50 microns. Elles possèdent un frustule en silice composé de deux valves symétriques. Il s'agit de microalgues ubiquistes et cosmopolites de la zone néritique, ne formant pas de populations planctoniques denses, et que l'on trouve souvent associées à diverses espèces de macroalgues benthiques en zones côtières. A l'état naturel, l'espèce Odontella aurita accumule entre 1.6 % à 3.4 % en poids sec total d'EPA, ce qui représente en moyenne 21 % des acides gras totaux produit par cette microalgue. Odontella aurita est généralement cultivée en mode autotrophe dans des bassins extérieurs pour son utilisation en alimentation animale, notamment pour l'alimentation des larves de poissons et des crustacés [Pulz et Gross (2004) Valuable products from biotechnology of microalgae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65(6):635-648].
Néanmoins, la culture des microalgues en mode autotrophe dans des bassins ouverts n'est pas très adaptée à une exploitation industrielle de celles-ci. En effet, dans la perspective d'une exploitation intensive des microalgues, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée en grande quantité, dans des photo-bioréacteurs fermés et de grande dimension. Cependant, il est difficile dans de telles conditions de fournir un éclairement satisfaisant à l'ensemble des cellules contenues dans le milieu de culture, en particulier lorsque la densité des microalgues devient importante.
Une alternative à la culture en autotrophie des microalgues du genre
Odontella serait de pratiquer les cultures en mode hétérotrophe, c'est-à-dire en l'absence de lumière, avec un apport d'énergie sous forme de substrats carbonés, ou bien en mode mixotrophe, c'est-à-dire, en présence d'un apport de lumière de moindre intensité, avec également un apport de substrat organique.
Toutefois, jusqu'à présent, les microalgues du genre Odontella ne se sont pas avérées cultivables dans de telles conditions.
C'est donc de manière inattendue que le demandeur est parvenu à isoler une souche de microalgue du genre Odontella, cultivable en mode hétérotrophe et mixotrophe, capable de produire du DHA et de ΙΈΡΑ en quantité satisfaisante.
Cette nouvelle souche d'Odontella a été isolée de l'environnement et mise en culture par l'inventeur, et plus particulièrement, selon un procédé mis au point par celui-ci, consistant à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous forme de flashs. L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir de cette souche une production élevée d'acides gras polyinsaturés. La mise en œuvre d'une telle souche, selon l'invention, permet d'envisager une production industrielle d'acides gras polyinsaturés dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et donc, de réaliser des économies d'énergie et de surface par rapport aux modes de culture autotrophes existants.
La souche d'Odontella, FCC 675, qui est la première de ces souches à avoir été sélectionnée selon la présente invention, a été déposée suivant les dispositions du traité de Budapest auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume- Uni), le 27 mai 2011 , et s'est vue attribuer le numéro d'accession CCAP 1054/5.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet une microalgue isolée, du genre Odontella (Phylum: Bacillariophyta, Classe: Coscinodiscophyceae, Famille: Eupodicaceae) [ITIS, Catalogue of Life, 2010], caractérisée en ce qu'elle est cultivable en mode hétérotrophe ou mixotrophe.
Le fait que cette microalgue soit cultivable en mode hétérotrophe s'apprécie par sa capacité à se multiplier dans l'obscurité dans un milieu de culture classique, habituellement utilisé pour la culture d'Odontella en mode autotrophe, de préférence un milieu minéral, dans lequel est ajouté un substrat carboné. Par milieu minéral, on entend un milieu de culture consistant en une solution aqueuse, souvent à base d'eau de mer, dans laquelle sont dissous des composés inorganiques, ainsi qu'éventuellement des vitamines et certains acides aminés. Un milieu minéral approprié pour la culture d'Odontella est, par exemple, le milieu f/2 [Guillard, R.R.L. (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M. H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animais. Plénum Press, New York, USA; Guillard, R.R.L. and Ryther, J.H. (1962) Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229- 239].
Le fait que cette microalgue soit cultivable en mode mixotrophe s'apprécie par la capacité de la microalgue à se multiplier en présence d'un apport lumineux, dans un milieu de culture similaire à celui décrit ci- dessus, c'est-à-dire un milieu habituellement utilisé pour la culture d'Odontella en mode autotrophe, mais dans lequel est ajouté un substrat carboné.
En général, l'intensité de l'apport lumineux est supérieure ou égale à 5 μΕ, préférentiellement comprise entre 5 et 300 μΕ, plus préférentiellement entre 10 et 200 μΕ, et encore plus préférentiellement entre 20 et 150 μΕ.
En hétérotrophie ou en mixotrophie, un substrat carboné est apporté à la culture. Le substrat carboné comprend ou consiste en, sous forme pure ou en mélange, généralement, un ou plusieurs des composés suivants : amidon, glucose, xylose, arabinose, lactose, lactate, cellulose et ses dérivés, saccharose, acétate et/ou glycérol.
Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, peuvent former des substrats carbonés exploitables pour la culture des microalgues en mode hétérotrophe ou mixotrophe.
La culture en mode mixotrophe ou hétérotrophie de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence d'au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, plus préférentiellement au moins 20 mM, et encore plus préférentiellement plus de 50 mM d'un substrat carboné. L'homme du métier sait déterminer les concentrations maximales du substrat carboné à utiliser. Généralement, la culture en mode mixotrophie ou hétérotrophie de cette microalgue peut s'effectuer en présence de 10-200mM, de préférence entre 20 et 50mM de substrat carboné.
L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. L'homme du métier sait déterminer les quantités du substrat carboné à ajouter à la culture pour maintenir une concentration constante du substrat carboné dans le milieu de culture. Généralement, la culture peut s'effectuer ainsi avec des concentrations cumulatives de substrat carboné de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM.
Aux fins de la présente invention, l'arabinose et la xylose constituent des substrats carbonés préférés pour la culture Odontella en mode hétérotrophe selon l'invention.
L'acétate et le saccharose constituent des substrats carbonés préférés pour la culture d'Odontella en mode mixotrophe selon l'invention.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture ou de sélection d'une microalgue du genre Odontella à caractère hétérotrophe ou mixotrophe selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la culture d'une ou plusieurs souches du genre Odontella dans l'obscurité ou en présence d'un apport de lumière;
- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné, tel que décrit précédemment, dans ledit milieu de culture;
- la récolte des cellules d'Odontella ainsi obtenues.
Le procédé de culture selon l'invention a notamment pour finalité de produire des acides gras polyinsaturés, plus particulièrement de ΙΈΡΑ et du DHA, qui s'accumulent dans les microalgues ainsi sélectionnées ou produites.
Un tel procédé de culture s'avère particulièrement avantageux lorsqu'un apport lumineux variable ou discontinu est mis en œuvre, autrement dit lorsque le flux de lumière apporté aux algues en culture est variable ou discontinu au cours du temps.
Contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides.
Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer en partie, par le fait que, dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, et que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire.
Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (d mol(photons)/dt≠ 0).
Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. L'invention vise, en particulier, un procédé de culture de microalgues du genre Odontella, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 pmol. m"2, s"1, de préférence égale ou supérieure à 50 pmol. m"2, s"1, plus préférentiellement égale ou supérieure à 100 pmol. m "2, s"1, à raison d'une ou plusieurs fois par heure, avantageusement plus d'une fois par heure. Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m"2. s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m"2, s"1, préférentiellement supérieure ou égale à 20 pmol. m"2, s"1, plus préférentiellement supérieure ou égale à 50 pmol. ni"2, s"1. Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 pmol. m"2, s"1 et 100 pmol. m"2, s"1 à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m"2, s1, plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 μηιοΙ. m"2, s"1.
Il est rappelé que 1 pmol. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les cultures peuvent être réalisées dans un fermenteur dans lequel le milieu de culture circule de manière régulière pour atteindre une partie éclairée de ce fermenteur. Un tel fermenteur peut prendre, par exemple, la forme d'un dispositif muni d'un tuyau circulaire dont une partie est transparente et éclairée depuis l'extérieur. Le milieu de culture et les algues en suspension, en circulant activement à travers la partie éclairée d'un tel dispositif, se trouvent ainsi périodiquement au contact de la lumière.
Une souche particulière d'Odontella FCC 675, isolée, sélectionnée et cultivée par le demandeur, a été déposée à la CCAP, le 27 mai 2011 , sous le numéro CCAP 1054/5. Selon les analyses taxonomiques en cours, celle-ci appartiendrait à l'espèce Odontella aurita. Néanmoins, compte tenu de sa filiation avec d'autres espèces d'Odontella, l'invention porte sur toute espèce de microalgue du genre Odontella ayant un caractère mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches sélectionnées selon le procédé de l'invention présentent de bonnes aptitudes à croître en mode hétérotrophe ou mixotrophe, prédispose ces souches à une production d'acides gras polyinsaturés plus élevée, notamment d'EPA et de DHA.
Le procédé de culture selon l'invention permet donc de sélectionner des souches d'Odontella à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés.
Pour réaliser le criblage des souches, différentes souches d'Odontella peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA et de DHA). Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention se caractérise plus particulièrement en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides.
L'invention a également pour objet un procédé d'enrichissement de microalgues du genre Odontella en acides gras polyinsaturés, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection et la culture de microalgues du genre Odontella, en mode mixotrophe ou hétérotrophe, plus particulièrement selon les procédés de culture décrits précédemment.
L'invention a également pour finalité la production de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés, via la culture de microalgues du genre Odontella à caractère hétérotrophe ou mixotrophe, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier ΙΈΡΑ et/ou le DHA. Ces microalgues sont de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment.
La culture des souches d'Odontella selon l'invention en mode mixotrophe ou hétérotrophe permet généralement d'augmenter la biomasse totale de plus de 20 %, plus souvent de plus de 30 %, et parfois même, de plus de 40 % par rapport à la culture d'une même souche d'Odontella en mode autotrophe.
Par ailleurs, le contenu des lipides totaux en EPA et DHA dans les lipides totaux extraits des souches d'Odontella ainsi cultivées, représente plus de 10 %, généralement plus de 30 %, bien souvent plus de 40 %, voire même plus de 50 % des lipides totaux cellulaires, en poids sec.
Les méthodes d'extraction sélective de ΙΈΡΑ et du DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. and Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37: 91 1-917]. L'EPA et le DHA ainsi extraits peuvent être utilisés en tant qu'additifs dans des compositions nutritionnelles, telles que du lait maternisé, ou bien dans des compositions cosmétiques ou thérapeutiques.
Les microalgues, sélectionnées, cultivées ou enrichies en acides gras polyinsaturés selon le procédé de l'invention, peuvent être utilisées directement, sous forme hydratée ou déshydratée, ou après transformation, en tant qu'aliment complément alimentaire, notamment en pisciculture, ou en tant qu'ingrédient entrant dans la composition de produits cosmétiques ou thérapeutiques.
Exemple
Culture des souches ô'Odontella aurita en bioréacteur Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 23°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmjni =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée en continue à 100 μΕ m"2 s"1. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu f/2. Le carbone organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est l'acétate de sodium à des concentrations entre 20 mM et 50 mM. Le substrat organique carboné est rajouté dans le milieu de culture en mode « fed-batch ». Les conditions de culture en hétérotrophie sont identiques à celles de la mixotrophie en absence de lumière.
Suivi des cultures
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée). Concernant la quantification des lipides totaux, 107 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].
Lumière en flash
L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des puises entre 10 et 100 uE. L'intensité lumineuse du système flash utilisé en mixotrophie est égale à celle utilisée en autotrophie (témoin).
Souche Odontella Hétérotrophie Mixotrophie en
flash
Biomasse (% par rapport > 150% > 200%
à l'autotrophie)
Lipides totaux > 20% >35%
(% par rapport
à l'autotrophie)
EPA et DHA (% par rapport >25% >30%
à l'autotrophie)

Claims

REVENDICATIONS
1. Microalgue correspondant à la souche à'Odontella déposée auprès de la CCAP, le 27 mai 2011 , sous le numéro CCAP 1054/5.
2. Procédé de culture ou de sélection d'une microalgue du genre Odontella, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la culture d'une ou plusieurs souches du genre Odontella dans l'obscurité ou en présence d'un apport de lumière;
- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné comprenant au moins 20 mM d'acétate, glucose, xylose, arabinose, lactose, saccharose, acétate ou glycérol dans le milieu de culture;
- la récolte des cellules d'Odontella ainsi obtenues.
3. Procédé de culture selon la revendication 2, dans lequel le substrat carboné comprend de l'acétate ou du saccharose.
4. Procédé de culture selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la souche de microalgue du genre Odontella est telle que définie dans la revendication 1.
5. Procédé de culture selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la culture des souches est effectuée en mode mixotrophe avec un apport de lumière dont l'intensité est compris entre 5 et 300 μΕ, de préférence entre 10 et 200 μΕ, plus préférentiellement entre 20 et 150 μΕ.
6. Procédé de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit substrat carboné comprend de l'arabinose ou du xylose.
7. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la culture des souches est effectuée en mode mixotrophe avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 50 μηηοΙ. m"2, s"1, à raison d'au moins une fois par heure.
8. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
9. Procédé de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce que le flashage consiste en des phases successives d'éclairement d'une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
10. Procédé d'enrichissement en EPA (acide éicosapentaénoïque) et/ou DHA (acide docosahexaénoïque) de microalgues du genre Odontella, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'au moins une souche de microalgue du genre Odontella en mode hétérotrophe ou mixotrophe, suivant le procédé de culture de l'une quelconque des revendications 2 à 9.
11. Microalgue du genre Odontella susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que son contenu en EPA et DHA représente plus de 40 %, et plus préférentiellement plus de 50 % des lipides totaux cellulaires.
12. Procédé de production d'EPA ou de DHA, caractérisé en ce qu'on extrait ΙΈΡΑ et/ou le DHA du contenu lipidique des microalgues obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 2 à 10.
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