KR101856055B1 - 조절되는 조명을 사용하는 미세조류 발효 - Google Patents

조절되는 조명을 사용하는 미세조류 발효 Download PDF

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Abstract

미세조류(microalgae)를 재배하기 위한 바이오리액터 및 방법이 본원에 제공된다. 바이오리액터 및 방법은 광 신호를 제공함으로써 종속 영양 성장 효율을 향상시키기 위한 특징 및 변형을 포함한다.

Description

조절되는 조명을 사용하는 미세조류 발효{MICROALGAE FERMENTATION USING CONTROLLED ILLUMINATION}
본원은 2009년 9월 18일에 출원된 미국 가출원번호 제61/243,593호 및 2010년 6월 29일에 출원된 미국 가출원번호 제61/359,726호에 대하여 우선권을 주장하며, 모든 목적을 위해서 이들 문헌의 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 마이크로유기체, 예를 들어 미세조류의 발효 방법, 발효 방식 및 발효 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 약학, 미용 및 음식 산업에서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미세조류로부터 오일 및 바이오 연료를 얻기 위해서 사용될 수 있다.
최근에는 지질, 탄화수소, 오일, 다당류, 안료 및 바이오 연료를 포함하는 다양한 물질의 생산에 미세조류의 응용에 대해 관심이 쏠리고 있다.
미세조류를 성장시키기 위한 종래의 방법 중 하나는 폐쇄된, 광이 없는 시스템에서 미세조류를 종속 영양 배양하는 것이다. 기술은 에너지원으로 광 대신에 유기 탄소를 활용함으로써 종속 영양 성장 조건 하에서 수생 미세조류의 대규모 생산을 위해 발전해왔다. 예를 들어, 미국특허 제3,142,135호 및 제3,882,635호는 클로렐라, 스폰지오코큠(spongiococcum) 및 프로토테카(prototheca)와 같은 조류로부터 단백질 및 안료의 종속 영양 생산에 대한 공정을 설명한다. 추가로, 종속 영양 조류 배양은 광합성 무기 영양 배양에 비해 더 높은 밀도를 이룰 수 있다.
반면에, 상기 응용은 모든 미세조류에 적용될 수 없는데, 그 이유는 제한된 수의 미세조류 균주만이 종속 영양 조건에서 성장할 수 있기 때문이다. 종속 영양 조건에서 미세조류가 성장시키려는 시도는 종속 영양 조건에서 성장할 수 있거나 이러한 조건 하에서 성장을 할 수 있도록 미생물을 유전 변형할 수 있는 균주인지를 검사하는 단계를 종종 수반한다.
당(sugar)에 대한 적절한 수송 시스템 및 종속 영양 조건에서 자연적으로 성장할 수 있는 것을 모두 함유하는 미세 조류는 종종 낮은 성장 속도를 보이거나 상업적으로 유용한 물질의 낮은 생산률을 보이는데, 이는 대사과정의 양태 뿐만 아니라 광합성을 통해 생성된 에너지를 제어하기 위해 환경 신호로서 태양광을 활용하는 것이 수년 동안 진화해왔기 때문이다.
대부분의 광합성 유기체(미세조류 포함)는 환경 신호로서 광을 사용하여 그들 자신이 성장하고 생존하기 위해 최적화된다. 광 신호는 적색/적외 광수용체(포토크롬(photochromes)) 및 청색광 광수용체(크립토크롬(cryptochromes) 및 NPHs)를 포함하여 다양한 광수용체들에 의해 감지된다. 광은 생리학적 및 발육 과정을 조절하고 무기 탄소의 감소를 부채질하는 에너지를 제공하는 환경 신호로서 역할한다. 그러나, 특정 조건 하에서, 광은 유독할 수 있는 가능성을 가질 수도 있다. 광저해는, (매우 밝은 조건 하에서) 엽록체에 의해 흡수된 광자 흐름이 매우 높은 경우 또는 (세포가 에너지원으로 환원된 탄소를 사용하는 혼합 영양 조건 하에서) 광 에너지 유입이 소비 능력을 초과하는 경우에 발생한다. 혼합 영양 조건에서, 광합성 유기체는 독립 영양 조건에 비해 더 적은 광 강도에서 광 억제를 보이는데, 그 이유는 광합성 장치를 통해 흡수된 전자가 캘빈 순환(Calvin cycle)에서 피드백 메커니즘에 의해 효율적으로 사용되지 않을 수 있기 때문이다.
흡수된 광 에너지는 안료층 내에서 들뜬 엽록소 분자의 축적 및 광계의 손상을 가져올 수 있다. 또한, 과잉 들뜸의 결과로 안료층에 축적된 들뜬 엽록소 분자는 초과산화물(superoxide), 히드록실 라디칼 및 싱글렛(singlet) 산소와 같은 활성 산소 종의 생성을 촉진할 수 있다.
본 발명의 목적은 조절되는 조명을 사용하여 미세조류의 발효를 제공하는 것이다.
본원은 종속 영양 성장을 가능하게 하는 미세조류를 재배하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 미세조류가 성장하기에 충분한 기간 동안 종속 영양 조건 하에서 미세 조류를 배양하는 단계를 포함하며, 이때 종속 영양 조건은 탄소원을 포함하는 배지를 포함하고, 낮은 광 조도를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 미세조류는 보트리오코커스(Botryococcus) 균주이며, 탄소원은 글루코오스이고, 낮은 광 조도는 1μmol/m2s 내지 10μmol/m2s이다.
일부 실시예에서, 미세조류는 보트리오코커스 수데티커스(Botryococcus sudeticus)이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 보트리오코커스 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 UTEX 2629 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 UTEX 2441 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 네오클로리스 올레아분단스(Neochloris oleabundans) 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 네오클로리스 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 UTEX 1185 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 클라미도모나스 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 UTEX 2243 균주이다. 일부 실시예에서, 미세조류는 광수용체를 포함한다.
일부 실시예에서, 탄소원은 글루코오스이다. 일부 실시예에서, 탄소원은 고정된 탄소원, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스, 람노오스, N-아세틸글루코사민, 글리세롤, 플로리도시드, 글루쿠론산, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로오스계 물질, 사탕수수, 사탕무, 락토오스, 유장(milk whey) 및 당밀로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 광은 자연 광원에 의해 생성된다. 일부 실시예에서, 광은 자연 태양광이다. 일부 실시예에서, 광은 전 영역의 스펙트럼 광 또는 특정 파장의 광을 포함한다. 일부 실시예에서, 광은 인공 광원에 의해 생성된다. 일부 실시예에서, 광은 인공 광이다. 일부 실시예에서, 광의 낮은 조도 강도는 0.01μmol광자/m2s 내지 1μmol광자/m2s이다. 일부 실시예에서, 광의 낮은 조도 강도는 1μmol광자/m2s 내지 10μmol광자/m2s1이다. 일부 실시예에서, 광의 낮은 조도 강도는 10μmol광자/m2s 내지 100μmol광자/m2s이다. 일부 실시예에서, 광의 낮은 조도 강도는 100μmol광자/m2s 내지 300μmol광자/m2s이다. 일부 실시예에서, 광의 낮은 조도 강도는 3μmol광자/m2s 내지 4μmol광자/m2s이다, 2μmol광자/m2s 내지 3μmol광자/m2s, 1μmol광자/m2s 내지 2μmol광자/m2s, 또는 3μmol광자/m2s 내지 5μmol광자/m2s이다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 미세조류로부터 물질을 생산하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 물질은 다당류, 안료, 지질 또는 탄화수소이다. 일부 실시예에서, 상기 물질은 탄화수소이다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 물질을 회수하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 물질을 추출하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 물질을 가공하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 물질을 가공하는 단계는 가공된 물질을 생성한다. 일부 실시예에서, 상기 가공된 물질은 연료, 바이오디젤, 제트 연료, 화장료, 약제, 계면활성제 및 재생 디젤로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 방법에서 미세 조류의 성장 속도는 미세조류를 성장시키기에 적합한 기간 동안 제 2 종속영양 성장 조건 하에서 배양된 제 2 미세조류에 비해 높으며, 이때 제 2 종속 영양 성장 조건은 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하고, 상기 제 2 종속 영양 성장 조건은 낮은 광 조도를 포함하지 않는다.
본원은 미세조류를 배양하는 방법을 또한 개시하는데, 상기 방법은 탄소원 및 낮은 광 조도의 존재 하에 복수의 미세조류 세포를 놓아두는 단계를 포함한다.
본원은 물질을 제조하는 방법을 또한 개시하며, 상기 방법은: 물질을 생성할 수 있는 미세조류를 제공하는 단계; 탄소원을 포함하는 배지에 미세조류를 배양하는 단계; 미세조류에 낮은 광 조도를 가하는 단계; 및 물질로서 미세조류가 이의 건조 세포 중량의 적어도 10%로 축적되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 물질을 회수하는 단계를 더 포함한다.
본원은 바이오리액터 시스템을 또한 개시하며, 상기 시스템은 바이오리액터; 탄소원을 포함하는 배양 배지로, 상기 배양 배지는 바이오리액터 내부에 위치되며; 종속 영양 성장에 적합한 미세조류로, 상기 미세조류는 배양 배지 내에 위치되며; 및 낮은 광 조도를 생성하는 광원을 포함하되, 상기 광원은 바이오리액터에 작동하도록 결합된다.
일부 실시예에서, 광원으로부터의 광은 전범위 스펙트럼 광 또는 특정 파장의 광을 포함한다. 일부 실시예에서, 광원으로부터의 광은 바이오리액터에 작동하도록 결합된 태양 에너지 수집기에 의해 수집된 자연 태양 광을 포함하고, 이때 상기 광은 태양광 수집기 및 바이오리액터에 작동하도록 결합된 광학 섬유를 통해 바이오리액터의 내부로 전달된다. 일부 실시예에서, 광원으로부터의 광은 인조 광을 포함하며, 이때 상기 인조 광은 발광 소자(LED) 또는 형광등에 의해 생성된다. 일부 실시예에서, 상기 시스템은 LED 또는 형광등을 구동시키기에 적합한 전력 공급기를 더 포함하며, 이때 상기 전력 공급기는 바이오리액터에 작동하도록 결합되며; 그리고 광 제어기는 전력 공급기에 작동하도록 결합되며, 이때 상기 광 제어기는 LED 또는 형광등에 의해 방출되는 광의 강도 및 파장을 제어하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 광학 섬유는 투명하고 보호하는 광 구조체 내에 실장된다. 일부 실시예에서, 상기 LED는 투명하고 보호하는 광 구조체 내에 실장된다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 특징, 양태 및 효과는 이어지는 설명 및 첨부된 도면과 관려하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 바이오리액터의 일 실시예이다.
도 2는 이소프레노이드/카로티노이드 경로를 도시한다.
도 3a 내지 3c는 백색, 청색 및 적색 광 조건 하에서 UTEX 1185의 성장을 보여준다. X-축은 날짜를 나타낸다. Glu는 글루코오스를 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 백색, 청색 및 적색 광 조건 하에서 UTEX 2629의 성장을 보여준다. X-축은 날짜를 나타낸다. Glu는 글루코오스를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 백색, 청색 및 적색 광 조건 하에서 UTEX 2441의 성장을 보여준다. Glu는 글루코오스를 나타낸다.
도 6은 적색 광 조건하에서 UTEX 2441에 의한 지질의 생성을 보여준다. LG는 광 + 글루코오스를 나타내고; DG는 어둠 + 글루코오스를 나타낸다.
도 7은 백색 광 조건 하에서 UTEX 2243의 성장을 보여준다.
청구항 및 본원에서 사용된 용어는 다른 방식으로 정의되지 않는 한 하기와 같이 정의된다.
"무균(Axenic)"은 다른 살아있는 유기체에 의한 오염이 없는 유기체의 배양을 의미한다.
"바이오디젤(Biodiesel)"은 디젤 엔진의 연료로 사용하기에 적합한 생물학적으로 생성된 지방산 알킬 에스테르이다.
용어 "바이오매스(biomass)"는 세포의 성장 및/또는 분열에 의해 생성된 물질을 지칭한다. 바이오매스는 세포 및/또는 세포 내 물질 뿐만 아니라 세포 외 물질을 함유할 수 있다. 세포 외 물질은 세포에 의해 분비된 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"바이오리액터"는 세포가 배양되고, 선택적으로는 현탁액에서 배양되는 밀봉체(enclosure) 또는 부분 밀봉체를 의미한다. 도 1은 바이오리액터의 예이다. "광 바이오리액터"는 용기(container)의 적어도 일부가 적어도 부분적으로 투명하거나 부분적으로 개방되어서, 광이 통과할 수 있으며, 그 안에서 하나 이상의 미세조류 세포가 배양되는 용기를 지칭한다. 광 바이오리액터는 예를 들어 폴리에틸렌 백 또는 엘렌메이어 플라스크 내에 차폐될 수 있으며, 또는 예를 들어 외부 못(outdoor pond)에서 주변 환경에 개방될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "촉매"는 생성물의 일부가 되지 않으면서 반응물에서 생성물로 화학 반응을 가능하게 하거나 촉진할 수 있는 분자 또는 고분자 착물과 같은 시제(agent)를 지칭한다. 따라서, 촉매는 반응의 속도를 증가시킨 뒤, 촉매는 또 다른 반응물이 생성물을 형성하도록 작용할 수 있다. 촉매는 일반적으로 반응에 요구되는 전체 활성화 에너지를 낮추어서 반응을 더 빠르게 또는 더 낮은 온도에서 진행하도록 한다. 따라서 반응 평형은 더 빠르게 도달될 수 있다. 촉매의 예로는 생물학적 촉매인 효소, 비-생물학적 촉매인 열, 및 화 석유(fossil oil) 정유 공정에서 사용된 금속 촉매를 포함한다.
"셀룰로오스계 물질"은 셀룰로오스의 소화의 산물을 의미하며, 여기에는 글루코오스 및 자일로오스가 포함되고, 선택적으로 이당류, 올리고당, 리그닌, 퍼퓨랄 및 다른 화합물과 같은 추가적인 화합물이 포함된다. 셀룰로오스계 물질의 제한되지 않는 예는 사탕수수 버개스(bagasses), 사탕무 펄프(sugar beet pulp), 옥수수대(corn stover), 목편(wood chip), 톱밥(sawdust) 및 지팽이풀(switchgrass)을 포함한다.
용어 "공동-배양", 및 "공동-재배(co-cultivate)"와 같은 이의 유사형은 동일한 바이오리액터에서 두 개 이상의 세포형의 존재를 지칭한다. 상기 두 개 이상의 세포형은 둘 다 미세조류와 같은 마이크로유기체일 수 있거나, 상이한 세포형과 배양된 미세조류 세포일 수 있다. 배양 조건은 두 개 이상의 세포형의 성장 및/또는 분열을 돕거나, 나머지 세포의 세포 성장을 유지하면서 두 개 이상의 세포 중 하나 또는 서브세트(subset)의 성장 및/또는 증식을 가능하게 하는 조건일 수 있다.
용어 "공동 인자(cofactor)"는 효소가 이의 효소 활성을 수행하기에 요구되는, 기질 이외의 임의의 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "재배된(cultivated)" 및 이의 유사형은 의도된 배양 조건의 사용에 의해 하나 이상의 세포의 성장(세포 크기의 증가, 세포 내용물의 증가 및/또는 세포 활성의 증가) 및/또는 분열(체세포 분열을 통한 세포 수의 증가)을 고의로 조성하는 것을 지칭한다. 성장 및 분열 둘 모두의 조합은 증식(proliferation)으로 지칭될 수 있다. 하나 이상의 세포는 미세조류와 같은 마이크로유기체의 것일 수 있다. 의도된 조건의 예는 정의된 배지의 사용(pH, 이온 강도, 및 탄소원과 같은 공지된 특징을가짐), 특정 온도, 특정 산소 분압, 특정 이산화탄소 농도 및 바이오리액터 내에서의 성장을 포함한다. 상기 용어는 마이크로유기체의 자연적인 또는 그렇지 않으면 지질학적 원유를 생산하기 위해 근본적으로 화석화되는 유기체의 자연적인 성장과 같은 인간의 개입이 없는 성장 또는 분열을 지칭하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 용해"는 저장성 환경에서 세포의 용해를 지칭한다. 세포 용해는 세포 내부로의 물의 이동(과수화작용) 또는 과잉 삼투에 의해 유발된다. 세포는 내부 물의 삼투압에 견디질 못하고 폭발한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정 핵산 요소로 재조합되거나 합성되어 생성된 핵산 구조체를 지칭한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부분일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 프로모터에 전사를 작동하도록 연관되는 핵산을 포함한다.
"외생 유전자"는 세포 안으로 형질전환된 핵산을 지칭한다. 형질전환된 세포는 추가적인 외생 유전자(들)이 도입될 수 있는 재조합 세포로 지칭될 수도 있다. 외생 유전자는 형질 전환되는 세포에 관하여 상이한 종(및 비상동)으로부터 또는 동일한 종(및 상동)으로부터의 것일 수 있다. 상동 유전자의 경우에서, 이것은 유전자의 내생 복제에 관한 세포의 게놈에서 상이한 위치를 차지한다. 외생 유전자는 세포의 하나 이상의 복제에서 존재할 수 있다. 외생 유전자는 게놈 안으로 삽입되거나 에피솜 분자(episomal molecule)로서 세포에서 유지될 수 있다.
"외생적으로 제공된"은 세포 배양의 배양 배지에 분자가 제공되는 것을 설명한다.
"고정된 탄소원"은 주변 온도 및 압력 하에서 고체 또는 액체형으로 존재하는 탄소, 예를 들어 유기물을 의미한다.
"호모제네이트(homogenate)"은 물리적으로 파괴되는 바이오매스를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탄화수소"는 (a) 수소 및 탄소 원자 만을 함유하는 분자로, 상기 탄소 원자는 공유 결합되어 수소 원자가 결합되는 곳에 선형, 분지형, 환형 또는 부분적으로 환형 백본을 형성하며; 또는 (b) 1차 만이 수소 및 탄소 원자를 함유하고 한번 내지 네 번의 화학 반응에 의해 수소 및 탄소 원자 만을 함유하도록 전환될 수 있는 분자를 지칭한다. 후자의 제한되지 않는 예는 하나의 탄소 및 하나의 수소 원자 사이에 산소 원자를 함유하여 알콜 분자를 형성할 뿐만 아니라 단일 산소 원자를 함유하는 알데히드를 형성하는 탄화수소를 포함한다. 탄소 및 수소 원자만을 함유하는 탄화수소로 알콜을 환원하는 방법은 잘 알려져 있다. 탄화수소의 또 다른 예는 수소 원자(또는 하나 이상의 수소 원자)가 산소 산(oxygen acid)으로 치환된 유기 군 중의 에스테르이다. 탄화수소 화합물의 분자 구조는 천연 가스의 구성성분인 메탄(CH4)의 형태인 가장 간단한 것으로부터 일부 분자 예를 들어, 원유, 석유 및 역청에서 발견된 아스팔텐과 같은 매우 무겁고 매우 복잡한 것으로 다양하다. 탄화수소는 가스형, 액체형 또는 고체형일 수 있고, 또는 이들 형태의 임의의 조합된 형태일 수 있고, 상기 탄화수소는 백본(backbone) 내의 인접한 탄소 원자 사이에 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 가질 수 있다. 따라서, 탄화수소라는 용어는 선형, 분지형, 환형, 또는 부분적 환형 알칸, 알켄, 지질 및 파라핀을 포함한다. 예들로는 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 옥탄, 트리올레인 및 스쿠알렌을 포함한다.
용어 "수소:탄소 비"는 원자 대 원자에 기초한 분자의 탄소 원자에 대한 수소 원자의 비를 지칭한다. 상기 비는 탄화수소 분자 내의 탄소 및 수소 원자의 수를 지칭하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 가장 높은 비를 갖는 탄화수소는 메탄 CH4(4:1)이다.
"소수성 분율"은 수성상에 비하여 소수성상에 더 가용인 물질의 부분, 또는 분율을 지칭한다. 소수성 분율은 물에 실질적으로 불용성이고 보통 비-극성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "지질 수율을 증가시키는"은 예를 들어 배양의 리터 당 세포의 건조 중량을 증가시키거나, 지질을 이루는 세포의 퍼센트를 증가시키거나, 단위 시간 당 배양 부피의 리터 당 지질의 전체 양을 증가시킴으로써 미생물의 배양의 생산성을 증가시키는 것을 지칭한다.
"유도성 프로모터"는 특정 자극에 반응하여 작동하도록 연관된 유전자의 전사를 매개하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "작동가능하도록 연관"은 제어 서열(보통 프로모터) 및 연관 서열과 같은 두 개의 서열 간에 관능성 연관을 지칭한다. 프로모터는 만일 외생 유전자가 유전자의 전사를 매개할 수 있다면 이와 작동가능하도록 연관된다.
용어 "당소(in situ)"는 "제자리" 또는 "이의 원래 위치"를 의미한다. 예를 들어, 배양은 촉매를 분비하는 제 1 미세조류 및 기질을 분비하는 제 2 마이크로유기체를 함유할 수 있으며, 이때 제 1 및 제 2 세포형은 특정 화학 반응에 필요한 성분을 생성하여 물질의 추가적인 분리 또는 가공의 필요 없이 당소에서 공동-배양을 발생시킨다.
"영양물질의 제한 농도"는 배양된 유기체의 분열을 제한하는 배양의 농도이다. "영양물질의 비-제한 농도"는 주어진 배양 기간 동안 최대 분열을 지원하는 농도이다. 따라서, 주어진 배양기간 동안 생성된 세포의 수는, 영양물질이 제한되지 않는 경우에서보다 영양물질의 농도가 제한되는 경우에 더 적다. 영양물질이 최대 분열을 지원하는 농도에 비해 더 높은 농도로 존재하는 경우에, 영양물질은 배양 내에 "과잉"이라고 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "리파아제"는 수-불용성 지질 기질에서 에스테르 결합의 가수분해를 촉진하는 수용성 효소이다. 리파아제는 글리세롤 및 지방산으로 지질의 가수분해를 촉진한다.
"지질"은 비극성 용매(예, 에테르 및 클로로포름)에서 가용성이고 물에 상대적으로 또는 완전히 불용성인 탄화수소류이다. 지질 분자는 이러한 성질을 가지며, 그 이유는 지질이 소수성 성질인 긴 탄화수소 꼬리로 구성되기 때문이다. 지질의 예는 지방산(포화 및 불포화); 글리세리드 또는 글리세로지질(예, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리셀드 또는 중성 지방, 및 포스포글리세리드 또는 글리세로포스포지질); 비-글리세리드(스핀고지질, 콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬을 포함하는 스테롤 지질, 터페노이드, 지방 알콜, 왁스 및 폴리케티드를 포함하는 프레놀 지질); 및 복합 지질 유도체(당-연관된 지질, 또는 글리코지질, 및 단백질-연관된 지질)를 포함한다. "지방"은 "트리아실글리세리드"로 불리는 지질의 서브군(subgroup)이다.
용어 "낮은 광 조도"는 종속 영양 조건 하에서 현저한 광 억제를 피하면서 마이크로유기체에 가해질 수 있는 광의 조도 및 마이크로유기체에서 광-활성화된 대사를 개시하는데 필요한 광의 조도를 지칭한다. 광-활성화된 대사는 수명 주기, 생체 리듬, 세포 분열, 생합성 경로 및 수송 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "파쇄액"은 용해된 세포의 내용물을 함유하는 용액을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용해"는 적어도 일부 세포 내 함유물을 방출하기에 충분하도록 원형질막 및 선택적으로는 생물학적 유기체의 세포 벽이 붕괴되는 것을 지칭하며, 상기 원형질막 및 세포벽은 종종 기계에 의해, 바이러스에 의해, 삼투 기작에 의해 이의 온전성이 위태로워진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용해되는"은 적어도 일부 세포 내 함유물을 방출하기에 충분하도록 세포막을 파괴하고 선택적으로는 생물학적 유기체 또는 세포의 세포 벽을 파괴하는 것을 지칭한다.
"미세조류"는 엽록체를 함유하고, 및 선택적으로는 광합성을 수행할 수 있는 진핵 미생물 유기체, 또는 광합성을 수행할 수 있는 원핵 미생물 유기체를 의미한다. 미세조류는 에너지로서 고정된 탄소원을 대사할 수 없는 완전 광독립영양생물을 포함할 뿐만 아니라, 고정된 탄소원 만으로 살아갈 수 있는 종속영양 생물을 포함한다. 미세조류는 세포 분할 직후에 자매 세포(sister cell)로부터 분리되는 단일 세포 유기체, 예를 들어 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 지칭할 수 있고, 또한 두 개의 구분되는 세포형의 단순한 다세포의 광합성 미생물인 예를 들어, 볼복스(Volvox)와 같은 미생물을 지칭할 수 있다. 또한, "미세조류"는 클로렐라(Chlorella) 및 두나리엘라(Dunaliella)와 같은 세포를 지칭할 수 있다. 또한, "미세조류"는 세포-세포 접합을 보이는 다른 미생물 광합성 유기체, 예를 들어 아그메넬룸(Agmenellum), 아나베나(Anabaena) 및 피로보트리스(Pyrobotrys)를 포함한다. 또한, "미세조류"는 광합성 수행 능력을 잃어버린 완전 종속 영양 마이크로유기체, 예를 들어 특정 편조류(dinoflagellate algae) 종을 포함한다. 미세조류의 다른 예는 하기에서 설명된다.
용어 "마이크로유기체" 및 "미생물"은 본원에서 교환하여 사용될 수 있으며, 이들은 미세한 단세포 유기체, 예를 들어 미세조류를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "삼투압 충격"은 삼투압에 갑작스런 감소를 가져오는 용액 내에서 세포의 파열을 지칭한다. 삼투압 충격은 어떤 세포의 세포 성분을 용액 안으로 방출하기 위해 가끔 유도된다.
"다당류" ("글리칸"으로도 불림)는 글리코시드 결합에 의해 단당류가 함께 연결되어 구성된 탄수화물이다. 셀룰로오스는 특정 식물 세포 벽을 구성하는 다당류의 예이다. 셀룰로오스는 자일로오스 및 글루코오스와 같은 단당류 뿐만 아니라 더 큰 이당류 및 올리고당을 수득하기 위해 효소에 의해 탈중합될 수 있다
바이오리액터에서, "포트"는 가스, 액체 및 세포와 같은 물질의 유입 또는 유출을 가능하게 하는 바이오리액터의 개구부를 지칭한다. 포트는 바이오리액터로부터 이어지는 튜브에 보통 연결된다.
"프로모터"는 핵산의 전사로 이어지는 핵산 제어 서열의 배열을 정의한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 프로모터는 폴리머라아제 II 형 프로모터의 경우에, TATA 요소와 같은 전사의 시작부 근방에 필수 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 원위 증폭자 또는 억제자 요소를 선택적으로 포함하며, 이들은 전사의 시작부로부터 몇천 염기 쌍만큼 떨어져서 위치될 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 용어 "재조합"은, 예를 들어 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 대한 기준과 함께 사용된 경우에, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 외생 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 자생 핵산 또는 단백질의 개조에 의해 변형된 것을 나타내거나, 세포가 변형된 세포로부터 유래된 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는, 발현되거나 전혀 발현되지 않는 조건 하에서, 세포의 자생형(재조합 안됨) 안에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되는 자생 유전자를 발현한다. 본원에서 용어 "재조합 핵산"은 일반적으로 예를 들어, 폴리머라아제 및 엔도뉴클리아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 형태로 시험관 내에서 본래 형성된 핵산을 의미한다. 이런 방식에서, 상이한 서열의 작동가능한 연관이 달성된다. 따라서, 선형의 단리된 핵산, 또는 일반적으로 연결되지 않는 DNA 분자를 결찰(ligating)함으로써 시험관 내에서 형성된 발현 벡터는 모두 본 발명의 목적을 위해 재조합된 것으로 고려된다. 일단 재조합 핵산이 만들어지고 숙주 세포 또는 유기체에 재도입되면, 이는 비-재조합적으로(non-recombinantly) 복제할 것이며, 즉, 시험과 내 조작에 비해 숙주 세포의 생체 내 세포기관(cellular machinery)을 사용하여 복제될 것이지만; 이러한 핵산이 일단 재조합적으로 생산되지만, 차후의 비-재조합적 복제는 본 발명의 목적을 위해 재조합으로 여전히 고려된다. 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 즉 상술된 방과 같이 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재생 디젤"은 지질의 수소화 및 탈산소화를 통해 생성된 알칸(예, C:10:0, C:12:0, C:14:0, C:16:0 및 C:18:0)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초음파 분해"는 세포와 같은 생물학적 물질을 음파 에너지를 사용하여 파괴하는 과정을 지칭한다.
"퍼퓨랄 종"은 동일한 기본 구조적 특징을 보유하는 2-퓨란카복살데히드 또는 이의 유도체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "마초(stover)"는 곡물이 수확된 이후에 남아있는 작물의 건줄기(dried stalk) 및 잎을 지칭한다.
"폐수"는 세척 수, 세탁 수, 배설물, 소변 및 다른 액체 또는 반-액체 폐기물을 일반적으로 함유하는 물의 폐기물을 지칭한다. 이것은 지자체 폐기물뿐만 아니라 2차 처리된 하수의 일부 형태를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "a", "an" 및 "the"는 다르게 명백히 지시하지 않는 한 복수형을 포함하는 것으로 인식되어야만 한다.
마이크로유기체
고 농도의 적합한 지질 또는 탄화수소를 자연적으로 생산하는 마이크로유기체가 선호됨에도 불구하고, 적합한 지질 또는 탄화수소를 생산하는 임의의 유기체 종이 사용될 수 있다. 마이크로유기체에 의한 탄화수소의 생산은 문헌[Metzger 등, Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496] 및 문헌[A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)]에 의해 확인된다.
본 발명에서 사용하기 위한 마이크로유기체의 선택에 영향을 미치는 것에 대한 고려, 그 밖에도 오일, 연료 및 함유(含油)화학제품의 생산을 위한 적합한 지질 또는 탄화수소의 생산에 대한 고려는 (1) 세포 중량 퍼센트로 높은 지질 함량; (2) 성장의 용이성; (3) 유전자 조작의 용이성; 및 (4) 바이오매스 처리의 용이성을 포함한다. 특정 실시예에서, 야생형 또는 유전자 조작된 마이크로유기체는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 이상의 지질을 함유하는 세포를 수득한다. 바람직한 유기체는 종속 영양에서 성장하거나, 또는 예를 들어, 본원에서 개시된 방법에 사용되도록 조작될 수 있다. 형질전환의 용이성, 및 구성요소인 및/또는 유도성인 마이크로유기체에서 관능성인, 선택 표지 및 프로모터의 유효성은 유전자 조작의 용이성에 영향을 미친다. 처리시에서 고려할 것은 예를 들어, 세포를 용해하기 위한 효과적인 수단의 유효성을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 마이크로유기체는 종속 영양 조건 하에서 성장할 수 있고 세포 처리를 제어하기 위한 신호로서 광을 사용할 수 있는 천연 또는 조작된 마이크로유기체를 포함한다. 이러한 것들로는 남조식물, 녹조식물, 홍조식물, 은편모조식물문, 클로라라크니오조식물문(Chlorarachniophyta), 착편모조류, 유클레나식물문, 부등편모조식물문, 및 규조류와 같은 조류(藻類)를 포함할 수 있다.
조류
본 발명의 일 실시예에서, 마이크로유기체는 미세조류이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 미세조류의 제한되지 않는 예는 하기에서 설명된다.
더 구체적으로, 남조류를 포함하는 남조식물에 해당하는 조류 분류군은 원핵 생물인 것들이며, 이들은 산소 방출 형(oxygen evolution type) 광합성의 능력을 가지고 이어지는 목(order) 및 과(family)로 분류된다. 소구체목(Chroococcales)은 미크로시스타과(Microcystaceae), 소구체과(Chroococcaceae), 엔토피살리드과(Entophysalidaceae), 카메시포니과(Chamaesiphoniaceae), 데모카펠르과(Dermocarpellaceae), 제노코크과(Xenococcaceae) 및 히드로코크과(Hydrococcaceae)를 포함하며, 흔들말목(Oscillatoriales)은 보르지과(Borziaceae), 슈다나바엔과(Pseudanabaenaceae), 쉬조트리크과(Schizotrichaceae), 포르미디과(Phormidiaceae), 흔들말과(Oscillatoriaceae) 및 호모에오트리크과(Homoeotrichaceae)를 포함하며, 연쇄체목(Nostocales)은 채찍실과(Scytonemataceae), 미크로케트과(Microchaetaceae), 리불라리과(Rivulariaceae) 및 노스토크과(Nostocaceae)를 포함하며, 그리고 스티고네마목(Stigonematales)은 클로로글로에오프스과(Chlorogloeopsaceae), 카프소시르과(Capsosiraceae), 스티고네마트과(Stigonemataceae), 피셔렐과(Fischerellaceae), 보르지네마트과(Borzinemataceae), 노스토콥스과(Nostochopsaceae) 및 마스티고클라드과(Mastigocladaceae)를 포함한다.
녹조류는 녹조식물강, 담녹조강, 페디노모나스강(Pedinophyceae), 트레복시조강(Trebouxiophyceae) 및 갈파래강(Ulvophyceae)을 포함한다. 더 구체적으로, 녹조식물강은 아세타불라리아(Acetabularia), 아시쿨라리아(Acicularia), 액티노클로리스(Actinochloris), 암피크리코스(Amphikrikos), 아나디오멘(Anadyomene), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키라(Ankyra), 아파노케테(Aphanochaete), 아스코클로리스(Ascochloris), 아스테로코쿠스(Asterococcus), 아스테로모나스(Asteromonas), 아스트레포멘(Astrephomene), 아트랙토모르파(Atractomorpha), 악실로코쿠스(Axilococcus), 악실로스페라(Axilosphaera), 바시클라미스(Basichlamys), 바시클라디아(Basicladia), 비누클리어리아(Binuclearia), 비페디노모나스(Bipedinomonas), 블라스토피사(Blastophysa), 보에르게세니아(Boergesenia), 부들리아(Boodlea), 보로디넬라(Borodinella), 보로디넬롭시스(Borodinellopsis), 보트리오코쿠스(Botryococcus), 브라키오모나스(Brachiomonas), 브락테아코쿠스(Bracteacoccus), 불보케트(Bulbochaete), 케스피텔라(Caespitella), 캡소시폰(Capsosiphon), 카르테리아(Carteria), 센트로스페라(Centrosphaera), 케토포르파(Chaetomorpha), 케토네마(Chaetonema), 케토펠티스(Chaetopeltis), 케토포라(Chaetophora), 칼마시아(Chalmasia), 카메트리콘(Chamaetrichon), 카라키오클로리스(Characiochloris), 카라키오시폰(Characiosiphon), 카라키움(Characium), 클라미델라(Chlamydella), 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스피로테니아(Spirotaenia), 스폰지오클로리스(Spongiochloris), 스폰지오코쿰(Spongiococcum), 스테파놉테라(Stephanoptera), 스테파노스페라(Stephanosphaera), 스티게오클로니움(Stigeoclonium), 스트루베아(Struvea), 테트메모루스(Tetmemorus), 테트라베나(Tetrabaena), 테트라시스티스(Tetracystis), 테트라데스무스(Tetradesmus), 테트라에드론(Tetraedron), 테트랄란토스(Tetrallantos), 테트라셀미스(Tetraselmis), 테트라스포라(Tetraspora), 테트라스트룸(Tetrastrum), 트레우바리아(Treubaria), 트리플로세로스(Triploceros), 트로키스시아(Trochiscia), 트로키시옵시스(Trochisciopsis), 파래(Ulva), 우로네마(Uronema), 발로니아(Valonia), 발로니옵시스(Valoniopsis), 벤트리카리아(Ventricaria), 비리디엘라(Viridiella), 비트레오클라미스(Vitreochlamys), 볼복스(Volvox), 볼불리나(Volvulina), 웨스텔라(Westella), 윌레아(Willea), 위슬로우키엘라(Wislouchiella), 주클로렐라(Zoochlorella), 지그네몹시스(Zygnemopsis), 히알로테카(Hyalotheca), 클로렐라(Chlorella), 슈도플레우로코쿰(Pseudopleurococcum) 및 로팔로시스티스(Rhopalocystis)를 포함한다. 담녹조강(Prasinophyceae)은 헤테로마스틱스(Heteromastix), 맘멜라(Mammella), 만토니엘라(Mantoniella), 미크로모나스(Micromonas), 네프로셀미스(Nephroselmis), 오스트레오코쿠스(Ostreococcus), 프라시노클라두스(Prasinocladus), 프라시노코쿠스(Prasinococcus), 슈도스코우르피엘다(Pseudoscourfielda), 피크토코쿠스(Pycnococcus), 피라미모나스(Pyramimonas), 셰르펠리아(Scherffelia)를 포함한다. 페디노모나스강(Pedinophyceae)은 마르수피오모나스(Marsupiomonas), 페디노모나스(Pedinomonas), 레술토르(Resultor)를 포함한다. 트레복시조강(Trebouxiophyceae)은 아파토코쿠스(Apatococcus), 아스테로클로리스(Asterochloris), 옥세노클로렐라(Auxenochlorella), 클로렐라(Chlorella), 코코믹사(Coccomyxa), 데스모코쿠스(Desmococcus), 딕티클로롭시스(Dictyochloropsis), 엘립토클로리스(Elliptochloris), 자기엘라(Jaagiella), 렙토시라(Leptosira), 로보코쿠스(Lobococcus), 마키노엘라(Makinoella), 미크로탐니온(Microthamnion), 미그메시아(Myrmecia), 나노클로리스(Nannochloris), 오시스티스(Oocystis), 프라시올라(Prasiola), 프라시올롭시스(Prasiolopsis), 프로토테카(Prototheca), 스티코코쿠스(Stichococcus), 테트라클로렐라(Tetrachlorella), 트레복시아(Trebouxia), 트리코필루스(Trichophilus), 와타나베아(Watanabea) 및 미르메시아(Myrmecia)를 포함한다. 갈파래강(Ulvophyceae)은 아크로케트(Acrochaete), 브리옵시스(Bryopsis), 세팔레우로스(Cephaleuros), 클로로시스티스(Chlorocystis), 엔테로모르파(Enteromorpha), 글레오오틸롭시스(Gloeotilopsis), 할로클로로코쿰(Halochlorococcum), 오스트레오비움(Ostreobium), 피룰라(Pirula), 피토포라(Pithophora), 플라노필라(Planophila), 슈덴도클로니움(Pseudendoclonium), 트렌테폴리아(Trentepohlia), 트리코사르시나(Trichosarcina), 울로트릭스(Ulothrix), 볼보콜레온(Bolbocoleon), 케토시폰(Chaetosiphon), 유고몬티아(Eugomontia), 올트만시엘롭시스(Oltmannsiellopsis), 프링쉐이미엘라(Pringsheimiella), 슈도덴드로클로니움(Pseudodendroclonium), 슈둘벨라(Pseudulvella), 스포로클라돕시스(Sporocladopsis), 우로스포라(Urospora) 및 위트록키엘라(Wittrockiella)를 포함한다.
홍조식물은 아크로케티움(Acrochaetium), 아가르드히엘라(Agardhiella), 안티탐니온(Antithamnion), 안티탐니오넬라(Antithamnionella), 아스테로시티스(Asterocytis), 아우도위넬라(Audouinella), 발비아니아(Balbiania), 반기아(Bangia), 바트라코스페르뭄(Batrachospermum), 보네마이소니아(Bonnemaisonia), 보스트리키아(Bostrychia), 칼리탐니온(Callithamnion), 칼로글로사(Caloglossa), 세라미움(Ceramium), 캄피아(Champia), 크로닥틸론(Chroodactylon), 크로테세(Chroothece), 콤프소포곤(Compsopogon), 콤프소포고놉시스(Compsopogonopsis), 쿠마글로이아(Cumagloia), 시아니디움(Cyanidium), 시스토클로니움(Cystoclonium), 다시아(Dasya), 디게니아(Digenia), 딕소니엘라(Dixoniella), 에리트로클라디아(Erythrocladia), 에리트롤로바스(Erythrolobas), 에리트로트리키아(Erythrotrichia), 플린티엘라(Flintiella), 갈디에리아(Galdieria), 겔리디움(Gelidium), 글라우코스페라(Glaucosphaera), 고니오트리쿰(Goniotrichum), 그라실라리아(Gracilaria), 그라텔로피아(Grateloupia), 그리피트시아(Griffithsia), 힐덴브란디아(Hildenbrandia), 히메노클라디옵시스(Hymenocladiopsis), 힙네아(Hypnea), 라인기아(Laingia), 펨브라놉테라(Membranoptera), 미리오그람(Myriogramme), 나말리온(Nemalion), 넴날리오놉시스(Nemnalionopsis), 네오아가르드히엘라(Neoagardhiella), 팔마리아(Palmaria), 필로포라(Phyllophora), 폴리뉴라(Polyneura), 폴리시포니아(Polysiphonia), 포르피라(Porphyra), 포르피리디움(Porphyridium), 슈도칸트란시아(Pseudochantransia), 프테로클라디아(Pterocladia), 푸게티아(Pugetia), 로델라(Rhodella), 로도케트(Rhodochaete), 로도코르톤(Rhodochorton), 로도소루스(Rhodosorus), 로도스포라(Rhodospora), 로디메니아(Rhodymenia), 세이로스포라(Seirospora), 셀레나스트룸(Selenastrum), 시로도티아(Sirodotia), 솔리에리아(Solieria), 스페르모탐니온(Spermothamnion), 스피리디아(Spyridia), 스틸로네마(Stylonema), 토레아(Thorea), 트레일리에라(Trailiella) 및 투오메이아(Tuomeya)를 포함한다.
은편모조식물문은 크립토모나스강(Cryptophycease)을 포함하며, 더 구체적으로, 캠필로모나스(Campylomonas), 킬로모나스(Chilomonas), 크로모나스(Chroomonas), 크립토크리시스(Cryptochrysis), 크립토모나스(Cryptomonas), 고니오모나스(Goniomonas), 귈라르디아(Guillardia), 하누시아(Hanusia), 헤미셀미스(Hemiselmis), 플라기오셀미스(Plagioselmis), 프로테오모나스(Proteomonas), 피레노모나스(Pyrenomonas), 로도모나스(Rhodomonas) 및 스트로레아툴라(Stroreatula)를 포함한다.
클로라라크니오조식물문은 클로라라크니온(Chlorarachnion), 로타렐라(Lotharella) 및 카토넬라(Chattonella)를 포함한다.
착편모조류는 아피스토네마(Apistonema), 크리소크로물리나(Chrysochromulina), 코콜리토포라(Coccolithophora), 코르콘토크리시스(Corcontochrysis), 크리코스페라(Cricosphaera), 디아크로네마(Diacronema), 에밀리아나(Emiliana), 파블로바(Pavlova), 루트네라(Ruttnera), 크루시플라콜리투스(Cruciplacolithus), 프림네시움(Prymnesium), 이소크리시스(Isochrysis), 칼립트로스페라(Calyptrosphaera), 크리소틸라(Chrysotila), 코콜리투스(Coccolithus), 디크라테리아(Dicrateria), 헤테로시그마(Heterosigma), 히메노모나스(Hymenomonas), 이만토니아(Imantonia), 게피로캅사(Gephyrocapsa), 오크로스페라(Ochrosphaera), 페오시스티스(Phaeocystis), 플라티크리시스(Platychrysis), 슈도이소크리시스(Pseudoisochrysis), 시라코스페라(Syracosphaera) 및 플레우로크리시스(Pleurochrysis)를 포함한다.
유클레나식물문은 스타시아(stasia), 콜라시움(Colacium), 시클리디옵시스(Cyclidiopsis), 디스티그마(Distigma), 유글레나(Euglena), 유트렙티아(Eutreptia), 유트렙티엘라(Eutreptiella), 기로파인(Gyropaigne), 히알로파쿠스(Hyalophacus), 콰키니아 아스타시아(Khawkinea Astasia), 레포신클리스(Lepocinclis), 메노이디움(Menoidium), 파르미디움(Parmidium), 파쿠스(Phacus), 랍도모나스(Rhabdomonas), 랍도스피라(Rhabdospira), 테트루에트렙티아(Tetruetreptia) 및 트라켈로모나스(Trachelomonas)를 포함한다.
부등편모조식물문은 규조류(Bacillariophyceae), 갈색조류(Phaeophyceae), 펠라고파이시(Pelagophyceae), 황록조강(Xanthophyceae), 진안점조강(Eustigmatophyceae), 시아누로파이시(Syanurophyceae), 페오탐니오파이시(Phaeothamniophyceae) 및 침편모조강(Raphidophyceae)을 포함한다. 더 구체적으로, 규조류(Bacillariophyceae)는 아카나테스(Achnanthes), 암포라(Amphora), 케토세로스(Chaetoceros), 바실라리아(Bacillaria), 니츠시아(Nitzschia), 나비쿨라(Navicula) 및 피눌라리아(Pinnularia)를 포함한다. 갈색조류(Phaeophyceae)는 아스코세이라(Ascoseira), 아스테로클라돈(Asterocladon), 보다넬라(Bodanella), 데스마레스티아(Desmarestia), 딕티오카(Dictyocha), 딕티오타(Dictyota), 엑토카르푸스(Ectocarpus), 할롭테리스(Halopteris), 헤리바우디엘라(Heribaudiella), 플레우로클라디아(Pleurocladia), 포르테리네마(Porterinema), 필라이엘라(Pylaiella), 소로카르푸스(Sorocarpus), 스페르마토크누수(Spermatochnus), 스파셀라리아(Sphacelaria) 및 와에르니엘라(Waerniella)를 포함한다. 펠라고파이시(Pelagophyceae)는 오레오코쿠스(Aureococcus), 오레움브라(Aureoumbra), 펠라고코쿠스(Pelagococcus), 펠라고모나스(Pelagomonas), 풀비나리아(Pulvinaria) 및 사르시노크리시스(Sarcinochrysis)를 포함한다. 황록조강(Xanthophyceae)은 클로라모에발레스(Chloramoebales), 리조클로리달레스(Rhizochloridales), 미스코코칼레스(Mischococcales), 트리보네마탈레스(Tribonematales) 및 바우케리알레스(Vaucheriales)를 포함한다. 진안점조강(Eustigmatophyceae)은 클로리델라(Chloridella), 엘립소이디온(Ellipsoidion), 유스티그마토스(Eustigmatos), 모노돕시스(Monodopsis), 모노두스(Monodus), 나노클롭시스(Nannochloropsis), 폴리에드리엘라(Polyedriella), 슈도카라시옵시스(Pseudocharaciopsis), 슈도스타우라스트룸(Pseudostaurastrum)을 포함하고 비스케리아 시아누로파이시(Vischeria Syanurophyceae)는 알로모나스(allomonas), 시누라(Synura) 및 테셀라리아(Tessellaria)를 포함한다. 페오탐니오파이시(Phaeothamniophyceae)는 헤오보트리스(haeobotrys) 및 페오탐니온(Phaeothamnion)을 포함한다. 침편모조강(Raphidophyceae)은 올리스토디스쿠스(Olisthodiscus), 바쿠올라리아(Vacuolaria) 및 피브로캅사(Fibrocapsa)를 포함한다.
규조류는 볼리도모나스강(Bolidophyceae), 코스시노디스코파이시(Coscinodiscophyceae), 외편모조류(Dinophyceae) 및 알베올라테스(Alveolates)를 포함한다. 볼리도모나스강(Bolidophyceae)은 볼리도모나스(Bolidomonas), 크리소파이시(Chrysophyceae), 기라우디옵시스(Giraudyopsis), 글로소마스틱스(Glossomastix), 크로모파이톤(Chromophyton), 크리사모에바(Chrysamoeba), 크리소케트(Chrysochaete), 크리소디디무스(Chrysodidymus), 크리솔레피도모나스(Chrysolepidomonas), 크리소사쿠스(Chrysosaccus), 크리소스페라(Chrysosphaera), 크리속시스(Chrysoxys), 시클로넥시스(Cyclonexis), 디노브리온(Dinobryon), 에피크리시스(Epichrysis), 에피픽시스(Epipyxis), 히베르디아(Hibberdia), 라기니온(Lagynion), 레포크로물리나(Lepochromulina), 모나스(Monas), 모노크리시스(Monochrysis), 파라피소모나스(Paraphysomonas), 페오플라카(Phaeoplaca), 페오스키조클라미스(Phaeoschizochlamys), 피코파구스(Picophagus), 플레우로크리시스(Pleurochrysis), 스티코글로에아(Stichogloea) 및 우로글레나(Uroglena)를 포함한다. 코스시노디스코파이시(Coscinodiscophyceae)는 박테리아스트룸(Bacteriastrum), 벨레로키아(Bellerochea), 비둘피아(Biddulphia), 브록크마니엘라(Brockmanniella), 코레트론(Corethron), 코스시노디스쿠스(Coscinodiscus), 유캄피아(Eucampia), 엑스투보셀룰루스(Extubocellulus), 귀나르디아(Guinardia), 헬리코테카(Helicotheca), 렙토실린드루스(Leptocylindrus), 레야넬라(Leyanella), 리토데스미움(Lithodesmium), 멜로시라(Melosira), 미니디스쿠스(Minidiscus), 오돈텔라(Odontella), 플란크토니엘라(Planktoniella), 포로시라(Porosira), 프로보시아(Proboscia), 리조솔레니아(Rhizosolenia), 스텔라리마(Stellarima), 탈라시오네마(Thalassionema), 비코소에시드(Bicosoecid), 심비오모나스(Symbiomonas), 악티노시클루스(Actinocyclus), 암포라(Amphora), 아르코셀룰루스(Arcocellulus), 데토눌라(Detonula), 디아토마(Diatoma), 디틸룸(Ditylum), 프라길라리오파이시(Fragilariophyceae), 아스테리오넬롭시스(Asterionellopsis), 델피네이스(Delphineis), 그람마토포라(Grammatophora), 나노프루스툴룸(Nanofrustulum), 시네드라(Synedra) 및 타불라리아(Tabularia)를 포함한다. 외편모조류(Dinophyceae)는 아데노이데스(Adenoides), 알렉산드리움(Alexandrium), 암피디니움(Amphidinium), 세라티움(Ceratium), 세라토코리스(Ceratocorys), 쿨리아(Coolia), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 엑수비엘라(Exuviaella), 감비에르디스쿠스(Gambierdiscus), 고니아울락스(Gonyaulax), 김노디니움(Gymnodinium), 기로디니움(Gyrodinium), 헤테로캅사(Heterocapsa), 카토다니움(Katodinium), 린굴로디니움(Lingulodinium), 피에스테리아(Pfiesteria), 폴라렐라(Polarella), 프로토 세라티움(Proto ceratium), 피로시스티스(Pyrocystis), 스크립시엘라(Scrippsiella), 심비오디움(Symbiodinium), 테카디니움(Thecadinium), 토라코스페라(Thoracosphaera) 및 죽산텔라(Zooxanthella)를 포함한다. 알베올라테스(Alveolates)는 시스토디니움(Cystodinium), 글레노디니움(Glenodinium), 옥시리스(Oxyrrhis), 페리디니움(Peridinium), 프로로센트룸(Prorocentrum) 및 월로스진스키아(Woloszynskia)를 포함한다.
마이크로유기체 및 바이오리액터를 배양하는 방법
마이크로유기체는 유전자 조작하기 위한 목적 및 이후에 탄화수소(예, 지질, 지방산, 알데히드, 알콜 및 알칸)의 생산을 위한 목적 모두를 위해 일반적으로 배양된다. 유전자 조작을 하기 위한 배양은 소규모로 수행되고 최초에 시작 마이크로유기체가 성장할 수 있는 조건하에서 적어도 수행된다. 탄화수소 생산의 목적을 위한 배양은 대규모로 보통 수행된다. 바람직하게는, 고정된 탄소원(예, 공급원료)이 존재한다. 또한, 배양은 일부 또는 전체 시간 동안 광에 노출될 수 있다.
바이오리액터
미세조류는 액체 배지에서 배양될 수 있다. 배양은 바이오리액터 내에 함유될 수 있다. 또한, 미세조류는 고정 탄소원을 함유하고 광이 세포에 가해지도록 하는 광 바이오리액터에서 배양될 수 있다. 세포가 운반되고 활용되는 고정 탄소원의 존재 하에서도, 미세조류 세포를 광에 노출시키는 것은 어둠 속에서 세포를 배양하는 것에 비해 성장을 가속화할 수 있다. 배양 조건 파라미터는 최종 탄화수소 생산, 탄화수소 종의 조합을 생산하는 것, 및/또는 탄화수소 종의 생산을 최적화하도록 조작될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오리액터의 일 실시예이다. 일 양태에서, 바이오리액터 시스템은 미세조류를 배양하는데에 사용될 수 있다. 바이오리액터 시스템은 용기 및 상기 용기에 작동하도록 결합된 조사 조립체를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 바이오리액터는 공업 발효 공정에서 사용되는 발효 탱크이다.
일 실시예에서, 바이오리액터는 예를 들어, 통기, 교반 속도, 온도, pH 및 다른 관심있는 파라미터를 제어하기 위한 세팅 및 거즈를 구비한 유리, 금속 또는 플라스틱 탱크를 포함한다. 일반적으로 거지 및 세팅은 바이오리액터에 작동하도록 결합된다.
일 양태에서, 바이오리액터는 벤치-탑(bench-top) 응용을 위해 충분히 작을 수 있거나(5-10L 이하) 또는 최대 120,000L, 또는 대규모 공업적 응용을 위해 그 이상의 용량일 수 있다.
일부 실시예에서, 바이오리액터 시스템은 광-확산 구조체 또는 복수의 광-확산 구조체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 복수의 광-확산 구조체로부터 하나 이상의 광-확산 구조체는 바이오리액터의 내부 표면을 따라 위치된다. 일부 실시예에서, 광-확산 구조체는 바이오리액터에 작동하도록 결합된다.
바이오리액터 시스템은 하나 이상의 광학 섬유 및/또는 복수의 광원 및/또는 광원을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 광학 섬유는 보호되고 광학적으로 투명한 조명 구조체에 실장된다. 일부 실시예에서, 상기 광학 섬유는 바이오리액터에 작동하도록 결합된다. 일부 실시예에서, 광원은 바이오리액터에 작동하도록 결합된다.
일부 실시예에서, 바이오리액터 시스템은 바이오리액터에 작동하도록 결합된 조명 구조체를 포함할 수 있다. 본원에서 특정 실시예에 따르면, 조명 구조체는 바이오리액터의 내부로 광 신호를 보내는 동안 임의의 형성 또는 형태를 가질 수 있다. 또한, 바이오리액터 시스템은 하나 이상의 광학 섬유 중 적어도 하나의 제 1 단부로부터 태양광 에너지 수집기의 일부로 연장되는 적어도 하나의 광학 섬유를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 태양광 에너지 수집기는 바이오리액터에 작동하도록 결합된다. 광학 섬유는 바이오리액터에 태양광 에너지 수집기를 작동하도록 결합하도록 구성될 수 있다. 광학 섬유는 태양광 에너지 수집기에 (직접 또는 간접적으로) 광학적으로 결합될 수 있다.
일부 실시예에서, 바이오리액터 시스템은 바이오리액터에 작동하도록 결합된 복수의 광원을 포함한다. 복수의 광원은 다중 LED를 포함할 수 있다. 다중 LED를 포함하는 복수의 광원은 인조 광의 전체 범위의 스펙트럼 또는 인조 광의 특정 파장을 바이오리액터에 공급하도록 구성될 수 있다.
일 실시예에서, LED는 보호되고 광학적으로 투명한 조명 구조체에 실장된다. 일 실시예에서, LED는 LED들의 배열이다.
일부 실시예에서, 미세조류는 상이한 유형의 투명 또는 반투명 물질로 구성된 폐쇄 바이오리액터에서 성장되고 유지될 수 있다. 이러한 물질은 플렉시글라스™(Plexiglass™) 밀봉체, 유리 밀봉체, 폴리에틸렌과 같은 성분으로 구성된 백, 투명하거나 반투명한 파이프, 그리고 다른 물질들을 포함할 수 있다. 미세조류는 레이스웨이 못(raceway ponds), 세틀링 못(settling ponds) 및 다른 비-차폐된 용기와 같은 개방 바이오리액터에서 성장되고 유지될 수 있다.
미세조류와 같은 마이크로유기체를 성장시키기 위한 바이오리액터의 가스 함량은 조작될 수 있다. 바이오리액터의 용적의 일부는 액체가 아닌 가스를 함유할 수 있다. 가스 주입구는 바이오리액터 안으로 가스를 펌핑하는데에 사용될 수 있다. 임의의 가스는 바이오리액터 안으로 펌핑될 수 있으며, 이러한 가스는 공기, 공기/O2 혼합물, 아르곤과 같은 비활성 가스 및 다른 가스들을 포함한다. 또한, 바이오리액터 안으로 가스의 유입 속도는 조작될 수 있다. 바이오리액터 안으로의 가스 흐름이 증가되는 것은 미세조류의 배양의 탁도를 증가시킨다. 또한, 바이오리액터 안으로 가스를 이송하는 포트의 설치는 주어진 가스 흐름 속도에서 배양의 탁도에 영향을 미칠 수 있다. 공기/O2 혼합물은 조절되어서 특정 유기체에 의한 최대 성장을 위한 O2의 최적량을 발생시킬 수 있다. 미세조류는 예를 들어, 100% 공기에 비해 3% O2/97% 공기, 광 존재하에서 현저히 빠르게 성장한다. 3% O2/97% 공기에는 공기에서 발견되는 것에 비해 약 100배 이상의 O2가 있다. 예를 들어, 약 99.72% 공기:0.25% O2, 약 99.5% 공기:0.5% 02, 약 99.0% 공기:1.00% 02, 약 98.0% 공기:2.0% 02, 약 97.0% 공기:3.0% 02, 약 96.0% 공기:4.0% 02, 및 약 95.00% 공기:5.0% 02의 공기:O2 혼합물은 바이오리액터 또는 바이오리액터 안으로 주입될 수 있다.
또한, 미세조류 배양은 스피닝 블레이드(spinning blades) 및 임펠러(impellers)와 같은 장치를 사용하여 혼합하고, 배양을 록킹(rocking of a culture)하고, 스터 바(stir bar)로 혼합하고, 압축 가스를 주입하는 것을 겪을 수 있다.
바이오리액터는 미세조류를 함유하는 챔버 안으로 가스, 고체, 반고체 및 액체가 유입되도록 하는 포트를 가질 수 있다. 포트는 배관 또는 다른 수단의 이송 성분에 보통 결착된다. 가스 포트는, 예를 들어 배양 안으로 가스를 이송한다. 바이오리액터 안으로 가스를 펌핑하는 것은 O2 및 다른 가스 모두를 공급 세포에 제공할 수 있어서 배양을 공기가 통하게 하고, 따라서 탁도를 발생시킨다. 배양의 탁도의 양은, 가스 포트의 수 및 위치가 변화함에 따라 달라진다. 예를 들어, 가스 포트는 원통형의 폴리에틸렌 백의 하부를 따라 위치될 수 있다. 미세조류는 O2가 공기에 첨가되고 바이오리액터 안으로 버블링(bubbled)되는 경우에 더 빠르게 성장한다.
바이오리액터는 배지의 유입을 가능하게 하는 하나 이상의 포트를 가지는 것이 바람직하다. 하나의 성분만이 포트에 유입되거나 유출될 필요가 없다. 예를 들어, 포트는 바이오리액터 안으로 배양 배지가 흐르도록 사용될 수 있고, 이후에 샘플링, 가스 유입구, 가스 배출구, 또는 다른 목적으로 사용될 수 있다. 일부 예에서, 바이오리액터는 배양의 초기에 배양 배지로 채워지고 배양이 접종된 이후에 더 이상의 성장 배지는 주입되지 않는다. 다시 말하면, 미세조류 바이오매스는 미세조류가 재생되고 그 수가 증가되는 기간 동안 수성 배지에서 배양되지만; 수성 배양 배지의 양은 그 기간 동안 바이오리액터를 통해 흐르지 않는다. 따라서, 일부 실시예에서, 수성 배양 배지는 접종 후에 바이오리액터를 통해 흐르지 않는다.
다른 예에서, 배양 배지는 미세조류가 재생되고 그 수가 증가되는 기간 동안에 바이오리액터를 통해 흐를 수 있다. 일부 실시예에서, 배지는 접종 후, 세포가 소정의 밀도를 달성하기 이전에 바이오리액터 안으로 주입된다. 다시 말하면, 가스 유입구 및 배지 유입구의 난류 체제(turbulent flow regime)는 상기 미세조류의 수에 소정의 증가가 달성될 때까지 미세조류의 재생산을 위해 유지되지 않는다.
바이오리액터는 가스 유입을 허용하는 하나 이상의 포트를 가지는 것이 바람직하다. 가스는 O2와 같은 영양 성분을 제공할 뿐만 아니라 배양 배지에 난류를 제공하는 역할을 할 수 있다. 난류는 수성 배양 배지의 높이 바닥에 가스 유입 포트를 설치되어서 바이오리액터로 유입되는 가스가 배양의 표면에서 버블링을 달성할 수 있다. 하나 이상의 가스 배출 포트는 가스가 빠져나오게 하여서 바이오리액터 내에 압력의 축적을 방지한다. 바람직하게는, 가스 배출 포트는 바이오리액터로 유입에서 마이크로유기체가 오염되는 것을 방지하는 "일-방식(one-way)" 밸브로 이어진다. 일부 예에서, 세포는 미세조류가 재생되고 그 수가 증가되는 기간 동안 바이오리액터에 배양되지만, 가스 유입구에 의해 유발되는 배양 배지 전반에 두드러지는 난류 소용돌이를 갖는 난류 체제가 상기 기간의 전체 시간 동안 유지되지 않는다. 다른 예에서, 가스 유입구에 의해 유발되는 배양 배지 전반에 두드러지는 난류 소용돌이를 갖는 난류 체제는, 미세조류가 재생되고 그 수가 증가되는 기간 전체 동안 유지될 수 있다. 일부 예에서, 바이오리액터의 규모 및 소용돌이의 규모 사이의 기결정된 비율 범위는 미세조류가 재생되고 그 수가 증가되는 기간 동안에 유지되지 않는다. 다른 예에서, 상기 비율 범위는 유지될 수 있다.
바이오리액터는 배양을 샘플링(sampling)하는데 사용될 수 있는 적어도 하나의 포트를 가지는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 샘플링 포트는 배양의 무균 본질을 손상시키는 것을 변화시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있다. 샘플링 포트는 샘플의 흐름을 정지시키고 시작시키는 밸브 또는 다른 장치를 갖도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 샘플링 포트는 연속적인 샘플링을 가능하게 할 수 있다. 바이오리액터는 배양의 접종을 허용하는 적어도 하나의 포트를 가진다. 또한, 이러한 포트는 배지 또는 가스 유입구와 같은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 조사 시스템을 갖는 바이오리액터는 보트리오코커스(Botryococcus)로부터 탄화수소를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 보트리오코커스는 화학식 CnH2n -10을 갖는 분지되지 않은 이소프레노이드 트리터펜이다. A 레이스(race)는 알카디엔 및 알카트리엔(지반산의 유도체)을 생산하며, 이때 n은 23 내지 31 중 홀수이다. B 레이스는 보트리오코커스를 생산하며, n은 30 내지 40의 수이다. 이러한 것은 가솔린형 탄화수소로 수소화 분해하기 위해 선택된 바이오연료일 수 있다.
배지
미세조류 배양 배지는 고정 질소원, 미량 영양소, 선택적으로는 pH 유지를 위한 완충액, 및 인산염과 같은 구성 성분을 일반적으로 함유한다. 다른 구성 성분은 아세트산염 또는 글루코오스와 같은 고정 탄소원, 및 염화나트륨과 같은 염, 특히 해수 미세조류에 대한 염을 포함할 수 있다. 미량 영양소의 예로는 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브데늄을 예를 들어, ZnCl2, H3B03, CoCl2·6H20, CuCl2·2H20, MnCl2·4H20 및 (NH4)6Mo7O2·4Η20의 형태로 각각 포함한다.
고정 탄소원에서 성장할 수 있는 유기체에 대하여, 고정 탄소원은 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스, 람노오스, N-아세틸글루코사민, 글리세롤, 플로리도시드, 및/또는 글루쿠론산일 수 있다. 하나 이상의 탄소원(들)은 하나 이상의 외생으로 제공된 고정 탄소원(들)의 50 μM 미만, 약 50 μM 이상, 약 100 μM 이상, 약 500 μM 이상, 약 5 mM 이상, 약 50 mM 이상, 약 500 mM 이상 및 500 mM을 초과하는 농도로 공급될 수 있다. 하나 이상의 탄소원(들)은 배지의 1% 미만, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%으로 공급될 수 있다. 또한, 하나 이상의 탄소원(들)은 상기 언급된 퍼센트 사이의 배지의 퍼센트, 예를 들어 배지의 2.5% 또는 3.7%로 공급될 수 있다.
일부 마이크로유기체는 지자체의 폐기물, 2차 처리된 하수, 폐수, 및 다른 고정 탄소의 공급원과 같은 화합물의 이종 공급원 및 황산염, 인산염 및 질산염과 같은 다른 영양 성분인 고정 탄소원 상에서 자연적으로 성장하거나 성장하도록 조작될 수 있다. 하수 구성 성분은 탄화 수소의 생산에서 영양 성분 공급원으로서 역할하고, 배양은 탄화수소의 저가의 공급원을 제공한다.
또한, 배양 배지의 pH, 미량 영양소의 정체 및 농도, 그리고 다른 배지 성분과 같은 다른 배양 파라미터는 조작될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 마이크로유기체는 전 세계의 다양한 위치 및 환경에서 발견된다. 다른 종으로부터 이들의 단리의 결과 및 이들의 진화적 분기(evolutionary divergence)의 결과로서, 최적 성장 및 발생을 위한 지질 및/또는 탄화수소 성분의 특정 성장 배지는 달라질 수 있다. 일부 경우에서, 마이크로유기체의 특정 균주는 특정 성장 배지 상에서 성장할 수 없을 수 있는데, 그 이유는 일부 억제 성분이 존재하거나 또는 특정 마이크로유기체의 균주에 의해 요구되는 일부 필수 영양 성분 요건이 없기 때문이다.
고체 및 액체 성장 배지는 광범위한 공급원으로부터 일반적으로 사용가능하고, 마이크로유기체의 광범위한 균주에 적합한 특정 배지의 제조를 위한 설명서가 조류(UTEX)의 배양 수집에 대해서, 예를 들어 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 온라인 웹사이트에서 찾을 수 있다.
처리 조건은 특정 용도에 적합한 지질의 수율을 증가시키도록, 및/또는 생산 비용을 감소시키기에 적합하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 미생물(예, 미세조류)은 예를 들어, 탄소 및/또는 질소, 인 또는 황과 같은 하나 이상의 영양 성분이 제한된 농도로 존재하지만, 글루코오스와 같은 고정된 탄소 에너지를 과잉으로 첨가하면서 배양된다. 질소 제한은 질소가 과잉으로 제공되는 배양 중의 미생물 지질 수율에 대하여 미생물 지질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 구체적인 실시예에서, 지질 수율의 증가는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상이다. 미생물은 총 배양기간의 일부 동안 또는 전체 기간 동안 제한된 양의 영양 성분의 존재 하에서 배양될 수 있다. 구체적인 실시예에서, 영양 성분 농도는 총 배양기간 동안에 제한된 농도 및 비-제한된 농도 사이에서 적어도 2회 순환된다.
종속 영양 성장 및 광
마이크로유기체는 고정 탄소원이 성장 및 지질 축적을 위한 에너지를 제공하는 종속 영양 성장 조건 하에서 배양될 수 있다.
종속 영양 성장 및 미세조류의 분열에 대한 표준 방법은 공지되어 있다(예, 문헌[Miao 및 Wu, J Biotechnology, 2004, 11 :85-93] 및 문헌[Miao 및 Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846] 참조)
탄화수소 생산에 있어서, 본원에서 설명되는 본 발명의 재조합 세포를 포함하는 세포는 대량으로 배양되거나 발효될 수 있다. 배양은 예에서와 같이 서스펜션 배양과 같은 큰 액체 용적에서 이루어질 수 있다. 다른 예는 세포 성장 및 분열 뿐만 아니라 탄화수소 생산과 함께 큰 바이오매스로 확장하는 세포의 작은 배양으로 시작하는 것을 포함한다. 바이오리액터 또는 강철 발효기는 큰 배양 용적을 수용하기 위해 사용될 수 있다. 바이오리액터는 발효기를 포함할 수 있다. 맥주 및/또는 와인의 생산에 사용되는 것과 유사한 발효기는 적합할 수 있으며, 에탄올의 생산에 사용되는 매우 큰 발효기도 적합하다.
발효기에서 배양을 위해 적합한 영양성분 공급원이 제공된다. 이것들은 하기 중 하나 이상을 원료로 포함한다: 글루코오스, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로오스계 물질, 수크로오스, 사탕수수, 사탕무, 락토오스, 유장 또는 당밀과 같은 고정 탄소원; 지방 또는 식물성 오일과 같은 지방원; 단백질, 대두박(soybean meal), 옥수수 침지액(cornsteep liquor), 암모니아(순수형 또는 염의 형태), 니트레이트 또는 질산염, 또는 분자 질소와 같은 질소원; 및 인산염과 같은 인원(phosphorus source). 게다가, 발효기는 온도, pH, 산소 분압, 및 이산화 탄소 농도와 같은 배양 조건의 제어가 가능하다. 선택적으로, 산소 또는 질소와 같은 가스계 성분은 액체 배양을 통과해 버블링될 수 있다. 밀, 감자, 쌀 및 수수와 같은 다른 전분(글루코오스)원. 다른 탄소원은 공업용 글리세롤, 흑액(black liquor), 아세테이트와 같은 유기산, 및 당밀과 같은 공정 스트림을 포함한다. 또한, 탄소원은 수크로오스 및 탈중합된 사탕무 펄프(sugar beet pulp)의 혼합물과 같은 혼합물로서 제공될 수 있다.
발효기는 세포가 이들의 성장 주기 중 다양한 단계를 겪도록 사용될 수 있다. 예로서, 탄화수소-생산 세포의 접종원은 배지 안에 도입된 이후에, 세포의 성장이 시작되기 이전에 증식기(lag period)(증식단계)가 이어질 수 있다. 증식기 이후에, 성장 속도는 꾸준히 증가하고 로그기(log phase) 또는 지수기(exponential phase)로 진입한다. 지수기 이후에 영양 성분의 감소 및/또는 독소 성분의 증가에 의한 성장의 느려짐이 각각 이어진다. 이런 느려짐 이후에, 성장은 멈추고, 세포는 세포에 제공된 특정 환경에 따라 정지상 또는 정상 상태(steady state)에 진입한다.
본원에 개시된 세포에 의한 탄화수소 생산은, 세포 분열의 부재시에도 탄화수소 생산의 지속이 지속 되도록 영양 성분이 공급되거나, 영양성분이 여전히 사용될 수 있는 정지상을 포함하는, 로그기 중에 또는 그 이후에 발생할 수 있다.
바람직하게는, 본원에서 설명되고 당해 분야에 알려진 조건 하에서 성장된 마이크로유기체는 적어도 약 20 중량%, 바람직하게는 적어도 약 40 중량%, 더 바람직하게는 적어도 약 50 중량%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 60 중량%의 지질을 포함한다.
본원 발명에 따른 종속 영양 성장 방법의 대안으로, 마이크로유기체는 공급원료로서 탈중합된 셀룰로오스계 바이오매스를 사용하여 배양될 수 있다. 셀룰로오스계 바이오매스(예, 옥수수 대와 같은 마초)는 저가이고 용이하게 구할 수 있지만; 효모에 대한 공급 원료로서 이 물질을 사용하려는 시도는 실패하였다. 구체적으로, 이러한 공급 원료는 효모 성장에 대해 억제성이라고 밝혀졌고, 효모는 셀룰로오스계 물질로부터 생성된 5-탄소 당(예, 헤미셀룰로오스로부터의 자일로오스)을 사용하지 못한다. 이와 대조적으로, 미세조류는 처리된 셀룰로오스계 물질 상에서 성장할 수 있다. 따라서, 본 발명은 셀룰로오스계 물질 및/또는 5-탄소 당의 존재하에서 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다.
적합한 셀룰로오스계 물질은 초본(herbaceous) 및 목질계 에너지 작물(woody energy crop)로부터의 잔기, 뿐만 아니라 농작물, 즉 일차 식물 또는 섬유 생산물을 갖는 들판으로부터 제거되지 않은 식물부, 주로 줄기 및 잎으로부터의 잔기를 포함한다. 예로는 사탕수수 버개스, 왕겨(rice hulls), 옥수수 섬유(줄기, 잎, 껍질, 및 속대를 포함), 밀짚, 볏짚, 사탕무 펄프, 감귤류 펄프(citrus pulp), 감귤류 껍질(citrus peels)과 같은 농업 폐기물; 견목 및 연목 간벌(thinnings), 및 목재 절단으로부터의 견목 및 연목 잔류물과 같은 임업 폐기물; 제재소(製材所) 폐기물(목재칩, 톱밥) 및 펄프 공장 폐기물과 같은 목재 폐기물; 지자체의 고형 폐기물 중 종이 분획과 같은 도시 폐기물, 도시 목재 폐기물, 및 지자체 제초물과 같은 도시 친환경 폐기물(green waste); 및 목재 건축 폐기물을 포함한다. 추가적인 셀룰로오스계는 지팽이풀(switchgrass), 잡종 포플라 목(hybrid poplar wood), 및 억새와 같은 전용 셀룰로오스계 작물, 섬유 줄기(fiber cane), 및 섬유 수수(fiber sorghum)을 포함한다. 이러한 물질로부터 생성되는 5-탄소 당은 자일로오스를 포함한다.
상술한 방법과 함께 선택적으로 사용될 수 있는, 본 발명에 따른 또 다른 대안적인 종속 영양 성장 방법에서, 사탕 수수 또는 사탕무로부터의 예에 의해 생성된 수크로오스는 공급원료로 사용된다.
종속 영양 성장은 세포가 성장하여 탄화수소를 생성하도록 광 및 고정 탄소원(들) 모두의 사용을 포함할 수 있다. 종속 영양 성장은 광바이오리액터에서 수행될 수 있다.
바이오리액터는 하나 이상의 광원에 노출되어 광 신호를 미세조류에 제공할 수 있다. 광 신호는 광원에 의해 바이오리액터의 표면으로 향하는 광을 통해 제공될 수 있다. 바람직하게, 광원은 세포가 성장하기에 충분하지만 산화 손상 또는 광억제 반응을 유발할 정도로 강력하지 않은 강도를 제공한다. 일부 예에서, 광원은 태양의 파장 범위를 모방하거나 대략적으로 모방하는 파장 범위를 가진다. 다른 예에서, 상이한 파장 범위가 사용된다. 바이오리액터는 외부에 배치될 수 있거나 그린하우스(greenhouse)에 배치될 수 있거나, 태양광이 표면을 강타할 수 있는 다른 시설에 배치될 수 있다. 일부 실시예에서, 보트리오코쿠스 속의 종들에 대한 광자 강도는 25 내지 500 μmE/m2s이다(예, 문헌[Photosynth Res. 2005 June; 84(l-3):21-7] 참조).
미세조류 세포의 배양을 강타하는 광자의 수는 조작될 수 있을 뿐만 아니라, 파장 스펙트럼 및 하루에 어둠:광 시간의 비율과 같은 다른 파라미터도 조작될 수 있다. 또한, 미세조류는 자연 광에서 배양될 뿐만 아니라 자연 광 및 인조 광의 동시 및/또는 교대로 조합하여 배양될 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 광 시간 동안 자연 광 하에서, 그리고 어둠 시간 동안 인조 광 하에서 배양될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 마이크로유기체는 광합성에 요구되는 약 0.1% 내지 약 1%의 광 조도에 노출되며, 바람직하게는 유기체에 의한 광합성에 요구되는 약 0.3% 내지 약 0.8%의 광 조도에 노출된다. 전형적인 광 조도는 0.1 미만, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 내지 99, 100, 101 내지 149, 150, 151 내지 199, 200, 201 내지 249, 250 또는 250 μmol 광자/m2s 이상을 포함하는 0.1 내지 300 μmol 광자/m2s일 수 있다. 광 조도는 0.1 내지 1 μmol 광자/m2s, 바람직하게는 1 내지 10 μmol 광자/m2s, 또는 10 내지 100 μmol 광자/m2s, 또는 100 내지 300 μmol 광자/m2s, 또는 100 내지 300 μmol 광자/m2s일 수 있다. 또한, 상기 언급된 조도들 사이의 범위도 광 조도로 포함되며, 이러한 예로는 1.1, 2.1, 2.5 또는 3.5 μmol 광자/m2s가 있다.
일 양태에서, 상이한 광 스펙트럼(예, 360 내지 700 nm)은 사용될 수 있다. 광 스펙트럼은 300 미만, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 또는 750 nm 또는 그 이상일 수 있다. 상기 언급된 광 스펙트럼 사이의 범위도 광 스펙트럼으로 포함되며, 이러한 예로는 360 nm 또는 440 nm가 있다.
일 실시예에서, 조도는 연속 방식으로 가해질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 조도는 12시간 광:12시간 어둠 또는 16시간 광:8시간 어둠에 제한되지 않고 포함하는 적절한 조명 기간으로 순환 패턴으로 가해질 수 있다. 광 패턴은 1 미만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간의 광 및/또는 1 미만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간의 어둠을 포함할 수 있다. 상기 언급한 광 패턴 사이의 광 패턴도 포함되며, 이러한 예로는 7.5시간의 광 또는 7.5시간의 어둠이 있다.
일 실시예에서, 조도는 태양광 수집기에 의해 수집되고 광학 섬유를 통해 바이오리액터의 내부로 전송되는 자연 태양광일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 발광 다이오드(LEDs) 또는 형광등과 같은 인조 광은 광원으로 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 자연 태양광 및 인조광은 함께 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 조도는 전체 스펙트럼의 광이다.
또 다른 실시예에서, 조도는 특정 필터를 통해 전송된 특정 파장의 광 또는 스펙트럼 광의 범위이다.
지질 및 탄화수소를 회수하는 방법
본 발명의 세포에 의해 생성된 탄화수소(예, 지질, 지방산, 알데히드, 알콜 및 알칸)는 채취될 수 있거나 그렇지 않으면 임의의 편리한 방식으로 수집될 수 있다. 예를 들어, 세포로부터 분비된 탄화수소는 원심분리되어 수성층 내의 오염 물질로부터 소수성 층 내에 탄화수소를 분리해 내고, 선택적으로는 원심분리후에 침전물로서 임의의 고체 물질로부터 분리해 낼 수 있다. 세포 또는 세포 분획을 함유하는 물질은 프로티아제로 처리하여 원심분리 이전 또는 이후에 오염물질 단백질을 분해할 수 있다. 일부 예에서, 상기 오염물질 단백질은 탄화수소 또는 단백질의 제거에 의해 탄화수소를 형성하는 탄화수소 전구체와 공유결합으로 연관될 수 있다. 다른 예에서, 탄화수소 분자는 단백질도 함유하는 제제 내에 있다. 프로티아제는 단백질을 함유하는 탄화수소 제제에 첨가되어 단백질을 분해할 수 있다(예, 스트렙토마이스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터의 프로티아제가 사용될 수 있음(SigmaAldrich catalog number P5147)). 소화 후에, 탄화수소는 잔류 단백질, 펩티드 단편, 및 아미노산으로부터 정제되는 것이 바람직하다. 정제는 예를 들어, 원심분리 및 여과와 같은 상기 나열된 방법에 의해 성취될 수 있다.
또한, 세포 밖의 탄화수소는 이후에 세포의 노출에 의해 바이오리액터로 되돌아가거나, 그렇지 않으면 멸균 환경에서 비-독성 추출 용매로 되돌아가는 살아있는 미세조류 세포로부터 생체 내에서 추출된 후, 살아있는 세포 및 추출된 용매의 소수성 분획 및 탄화수소를 분리할 수 있으며, 이때 분리된 살아있는 세포는 이후에 다시 스테인레스 강철 발효기 또는 광바이오리액터와 같은 배양 용기로 되돌아간다(문헌[Biotechnol Bioeng. 2004 Dec. 5; 88(5):593-600] 및 문헌[Biotechnol Bioeng. 2004 Mar. 5; 85(5):475-81] 참조).
또한, 탄화수소는 전세포 추출에 의해 단리될 수 있다. 세포는 최초 붕괴된 후에 세포 내 및 세포막/세포벽-연관 탄화수소 뿐만 아니라 세포 밖 탄화수소는 전세포 덩어리로부터 예를 들어, 상술한 원심분리의 사용에 의해 수집될 수 있다.
다양한 방법은 상기 방법에 의해 생성된 세포 용해물로부터 탄화수소 및 지질을 분리하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 탄화수소는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출될 수 있다(문헌[Frenz 등, 1989, Enzyme Microb. TechnoL, 11 :717] 참조). 또한, 탄화수소는 액화법(예, 문헌[Sawayama 등, 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39] 및 문헌[Inoue 등, 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274] 참조); 오일 액화법(예, 문헌[Minowa 등, 1995, Fuel 74(12): 1735-1738] 참조); 및 초임계 CO2 추출법(예, 문헌[Mendes 등, 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334] 참조)을 사용하여 추출될 수 있다.
Miao 및 Wu는 세포를 원심분리에 의해 채취하고, 증류수로 세척한 뒤 냉각 건조로 건조하여, 배양으로부터 미세조류 지질을 회수하는 프로토콜을 설명한다. 결과로 얻은 세포 분말은 모토르(mortor)에서 분쇠된 후 n-헥산으로 추출했다(문헌[Mia 및 Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846]).
용해 세포
세포 내 지질 및 마이크로유기체에서 생성된 탄화수소는, 일부 실시예에서, 마이크로유기체의 세포를 용해한 후 추출된다. 일단 추출되면, 지질 및/또는 탄화수소는 예를 들어, 오일, 연료 또는 함유(含油)화학 제품을 생성하도록 추가적으로 정제될 수 있다.
배양의 종료 후에, 마이크로유기체는 발효 배양액(fermentation broth)으로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 분리는 원심분리에 의한 결과로 농축된 페이스트(paste)를 발생시킨다. 원심분리는 마이크로유기체로부터 세포 내 물의 현저한 양을 제거하지 않고, 이는 건조 단계가 아니다. 이후에, 바이오매스는 발효 배양액 및 잔해를 없애기 위해 세척 용액(예, 탈이온수)으로 세척될 수 있다. 선택적으로, 세척된 미생물 바이오매스는 세포 파괴 이전에 건조(오븐 건조, 감압 동결 건조)될 수도 있다. 대안적으로, 세포는 발효가 완료되는 경우에 발효 배양액의 일부 또는 전부로부터 분리되지 않고 용해될 수 있다. 예를 들어, 세포는, 세포가 용해되는 경우에 세포 대 세포 밖 액체의 비가 1:1(v:v) 미만일 수 있다.
지질 및/또는 탄화수소를 함유하는 마이크로유기체는 용해물을 생성하도록 용해될 수 있다. 여기서 설명된 바와 같이, 마이크로유기체를 용해하는 단계는(세포 용해로도 지칭됨) 임의의 간편한 방식에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 방식은 열-유도 용해, 염의 첨가, 산의 첨가, 프로티아제와 같은 효소 및 아밀라아제와 같은 다당류 분해 효소의 사용, 초음파의 사용, 기계적 용해, 삼투압 충격의 사용, 용균성 바이러스로 감염, 및/또는 하나 이상의 용균성 유전자의 발현을 포함한다. 용해는 마이크로유기체에 의해 생성되는 세포 내 분자를 방출하도록 수행된다. 마이크로유기체를 용해하는 이러한 방법 각각은 단일 방법으로, 또는 동시에 또는 순차적으로 함께 사용될 수 있다.
세포 파괴의 정도는 현미경 분석에 의해 관찰될 수 있다. 본원에서 설명된 하나 이상의 방법을 사용하여, 일반적으로 70%를 초과하는 세포 파손이 관찰된다. 바람직하게는, 세포 파손은 80%를 초과하고, 더 바람직하게는 90%를 초과하고, 가장 바람직하게는 약 100%이다.
특정 실시예에서, 마이크로유기체는 성장 후에 용해되어, 예를 들어 추출 또는 추가적인 처리를 위한 세포 지질 및/또는 탄화수소의 노출을 증가시킨다. 리파아제 발현(예, 유도 프로모터를 통해) 또는 세포 용해의 시기는 조정되어서 리파아제 및/또는 탄화수소의 수율을 최적화할 수 있다. 하기에서는 많은 용해 기술이 설명된다. 이러한 기술은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
열-유도 용해
본 발명의 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 마이크로유기체를 함유하는 세포 서스펜션을 가열하는 단계를 포함한다. 이 실시예에서, 마이크로유기체(또는 발효 배양액으로부터 단리된 마이크로유기체의 서스펜션)를 함유하는 발효 배양액은 마이크로유기체, 즉 마이크로유기체의 세포벽 및 세포막이 분해되거나 파괴될 때까지 가열된다. 일반적으로, 가해진 온도는 적어도 50℃이다. 고온, 예를 들어 적어도 30℃, 적어도 60℃, 적어도 70℃, 적어도 80℃, 적어도 90℃, 적어도 100℃, 적어도 110℃, 적어도 120℃, 적어도 130℃ 또는 그 이상이 더 효과적인 세포 용해를 위해 사용된다.
열 처리에 의해 세포를 용해하는 것은 마이크로유기체를 가열함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 열 처리(가열 없이)는 오토클레이브(autoclave)에서 수행될 수 있다. 열 처리된 용해물은 추가적인 처리를 위해 냉각될 수 있다.
또한, 세포 파괴는 증기 처리에 의해, 즉 압축된 증기의 첨가를 통해 수행될 수 있다. 세포 파괴를 위한 미세조류의 증기 처리는 예를 들어 미국특허 제6,750,048호에서 설명된다.
염기를 사용하는 용해
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 마이크로유기체를 함유하는 세포 서스펜션에 염기를 첨가하는 단계를 포함한다.
염기는 사용된 마이크로유기체의 단백질 화합물의 적어도 일부분을 가수분해하기에 충분히 강해야만 한다. 단백질을 가용화하는데에 유용한 염기는 화학 분야에 알려져 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슝의 히드록시드, 카보네이트 및 디카보네이트, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 세포 파괴를 위한 미세조류의 염기 처리는 예를 들어 미국특허 제6,750,048호에 설명된다.
산성 용해
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 마이크로유기체를 함유하는 세포 서스펜션에 산을 첨가하는 단계를 포함한다. 산 용해는 10 내지 500 mN의 농도로 또는 바람직하게는 40 내지 160 nM의 농도로 산을 사용하여 영향을 미칠 수 있다. 산 용해는 실온보다 높은 온도인 40 내지 160℃ 및 바람직하게는 50 내지 130℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 보통 정도의 온도(예, 실온) 내지 100℃ 및 특정 실온 내지 65℃에 있어서, 산 처리는 음파처리(sonication) 또는 다른 세포 파괴 방법과 함께 혼합되어 유용할 수 있다.
효소를 사용하는 세포의 용해
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 효를 사용하여 마이크로유기체를 용해하는 단계를 포함한다. 마이크로유기체를 용해하기 위한 바람직한 효소는 프로테아제, 및 헤미셀룰라아제(예, St. Louis, Mo.의 Sigma Aldrich 제조사의 검은곰팡이(Aspergillus niger)로부터의 헤미셀룰라아제; #H2125), 펙티나아제(예, St. Louis, Mo.의 Sigma Aldrich제조사의 라이조프스속(Rhizopus sp.)으로부터의 펙티나아제; #P2401), 만나웨이(Mannaway) 4.0L(노보자임(Novozymes)), 셀룰라아제(예, St. Louis, Mo.의 Sigma Aldrich제조사의 트리코더마 비리디(Trichoderma viride)로부터의 셀룰로오즈; #C9422), 및 드리셀라아제(예, St. Louis, Mo.의 Sigma Aldrich제조사의 담자균류(Basidiomycetes sp.)로부터의 드리셀라아제; #D9515)와 같은 다당류-분해 효소이다.
셀룰라아제
본 발명의 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하기 위한 셀룰라아제는 다당류-분해 효소, 선태적으로는 클로렐라 또는 클로렐라 바이러스로부터의 다당류-분해 효소이다.
프로테아제
스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제, 키모트립신, 프로테인아제 K(proteinase K), 문헌[Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Y et al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000, pp. 29-32(4)]에 나열된 프로테아제와 같은 프로테아제, 및 다른 프로테아제가 마이크로유기체를 용해하기 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 프로테아제는 알칼라아제 2.4 FG(Alcalase 2.4 FG)(노보자임) 및 플라보자임 100 L(Flavourzyme 100 L)(노보자임)을 포함한다.
조합
프로테아제 이후에 다당류-분해 효소의 임의의 조합을 포함하여, 프로테아제 및 다당류-분해 효소의 임의의 조합이 사용될 수도 있다.
초음파를 사용하는 세포의 용해
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 초음파, 즉, 음파 처리에 의해 수행된다. 따라서, 세포는 고주파음을 사용하여 용해될 수 있다. 음(sound)은 금속 팁(metalㅣic tip)을 통해 전기적으로 생성되어 적절하게 농축된 세포 서스펜션으로 전달될 수 있다. 이런 음파 처리(또는 초음파 처리)는 세포 서스펜션에 구멍을 만드는 것에 기초하여 세포 보전을 파괴한다.
기계적 용해
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는단계는 기계적 용해에 의해 수행된다. 세포는 기계적으로 용해될 수 있고, 선택적으로는 탄화수소(예, 지질) 수집을 가능하게 하도록 균질화 될 수 있다. 예를 들어, 압력 분열기(pressure disruptor)는 제한된 오리피스 밸브(orifice valve)를 통해 슬러리를 함유하는 세포를 펌핑하는데 사용될 수 있다. 고압(최대 1500 bar)이 가해진 뒤, 배출 노즐을 통해 즉각적인 확장이 이루어진다. 세포 붕괴는 세 개의 상이한 기작에 의해 성취된다: 밸브에 닿음, 오리피스에서 높은 액체 전단, 및 방출에 따른 급격한 압력 강하, 이에 의한 세포의 파괴. 상기 방법은 세포 내 분자를 방출시킨다.
대안적으로, 볼 밀(ball mill)이 사용될 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 작은 연마제 입자를 갖는 서스펜션에서 교반된다. 세포는 전단력, 비드들 간의 분쇄, 및 비드와의 충돌 때문에 부서진다. 비드는 세포 함유물을 방출하도록 세포를 파괴한다. 또한, 세포는 세포를 파괴하기 위해서 예를 들어, 블렌딩(blending)의 사용(예, 고속 또는 웨어링 블렌더(waring blender)), 프렌치 프레스(french press)의 사용하여 전단력에 의해 파괴되거나 약한 세포 벽의 경우에는 원심분리만으로도 파괴될 수 있다.
삼투압 충격에 의한 세포의 용해(세포용해)
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 삼투압 충격을 가함으로써 수행된다.
용균 바이로스로 감염
본 발명의 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 용균 바이러스로 마이크로유기체를 감염시키는 단계를 포함한다. 광범위한 바이러스는 본 발명에서 사용하기에 적합한 마이크로유기체를 용해하는 것으로 알려져 있고, 특정 마이크로유기체에 대하여 특정 용균 바이러스를 선택하고 사용하는 것은 당해 분야의 통사의 기술자의 수준 내에 있다.
예를 들어, 파라메시움 부르가리아 클로렐라 바이러스(paramecium bursaria chlorella virus)(PBCV-1)은 특정 단세포 진핵 클로렐라-유사 녹조류에서 복제하고 용해하는 20면체 플라크-형성 이중 나선형 DNA 바이러스의 커다란 군의 원형이다. 따라서, 모든 영향받기 쉬운 미세조류는 배양을 적합한 클로렐라 바이러스로 감염시킴으로써 용해될 수 있다(예, 문헌[Adv. Virus Res. 2006; 66:293-336]; 문헌[Virology, 1999 Apr. 25; 257(1): 15-23]; 문헌[Virology, 2004 Jan. 5; 318(l):214-23]; 문헌[Nucleic Acids Symp. Ser. 2000; (44): 161-2]; 문헌[J. Virol. 2006 March; 80(5):2437-44]; 및 문헌[Annu. Rev. Microbiol. 1999; 53:447-94] 참조).
자가용해(autolysis)(용해 유전자의 발현)
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 마이크로유기체를 용해하는 단계는 자가용해를 포함한다. 이 실시예에서, 본 발명에 따른 마이크로유기체는 마이크로유기체를 용해할 용해 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다. 이 용해 유전자는 유도 프로모터를 사용하여 발현되어서 세포는 발효기 내에서 소정의 밀도로 우선 성장된 후, 세포를 용해하도록 용해 유전자를 발현시키기 위해 프로모터의 유도가 이루어질 수 있다. 일 실시예에서, 용해 유전자는 다당류-분해 효소를 인코딩한다.
특정 다른 실시예에서, 용해 유전자는 용균 바이러스로부터 유래된 유전자이다. 따라서, 예를 들어, 클로렐라 바이러스로부터 유래된 용해 유전자는 C. 프로토테코이드(C. protothecoides)와 같은 클로렐라 속의 조류 세포에서 발현될 수 있다.
적합한 발현 방법은 리파아제 유전자의 발현과 관련하여 본원에서 설명된다. 용해 유전자의 발현은 소분자, 광, 열 및 다른 자극요소와 같은 자극에 의해 유도되는 미세조류에서 활성인 프로모터와 같은 유도 프로모터를 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다(예, 문헌[Virology 260, 308-315 (1999)]; 문헌[FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53]; 문헌[Virology 263, 376-387 (1999)]; 및 문헌[Virology 230, 361-368 (1997)] 참조).
지질 및 탄화수소의 추출
본 발명의 마이크로유기체에 의해 발생된 지질 및 탄화수소는 유기 용매로 추출함으로써 회수될 수 있다. 일부 경우에서, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 일반적으로, 유기 용매는 용해물 성분의 분리 이전에 용해물에 직접적으로 첨가된다. 일 실시예에서, 상술된 하나 이상의 방법에 의해 발생된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분을 허용하기에 충분한 기간 동안 유기 용매와 접촉되어 유기 용매를 포함하는 용액을 형성한다. 일부 경우에서, 용액은 특정 소정의 지질 또는 탄화수소 성분을 회수하도록 추가로 정제된다. 헥산 추출 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
지질 및 탄화수소를 처리하는 방법
효소에 의한 변형
본원에서 설명되는 바와 같이 세포에 의해 생성된 탄화수소(예, 지질, 지방산, 알데히드, 알콜 및 알칸)는 리파아제를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 변형될 수 있다. 탄화수소가 세포의 세포 밖 환경에 있는 경우에, 하나 이상의 효소는 효소가 탄화수소를 변형하거나 탄화수소 전구체로부터 이의 합성을 완료하는 조건 하의 환경에서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 탄화수소는 효소와 같은 하나 이상의 촉매의 첨가 이전에 세포 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 단리될 수 있다. 이러한 촉매는 외생적으로 첨가되고 , 이들의 활성은 세포 외부 또는 시험관 내에서 발생한다.
열 및 다른 촉매에 의한 변형
본원에서 설명된 바와 같이, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 효소에 의해 변형된 세포에 의해 생성된 탄화수소는 종래의 방식에 의해 선택적으로 추가 처리될 수 있다. 처리는 크기를 줄이기 위한 "크래킹(cracking)"을 포함할 수 있고, 이에 의하여 탄화수소 분자 중의 수소:탄소 비율이 증가된다. 촉매에 의한 그리고 열에 의한 크래킹 방법은 탄화수소 및 트리글리세리드 오일 처리에 일상적으로 사용된다. 촉매에 의한 방법은 고체 산 촉매와 같은 촉매의 사용을 수반한다. 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있으며, 이는 탄소-탄소 결합의 불균질, 또는 비대칭, 절단을 야기하여 탄소 양이온 및 수산화 음이온을 야기한다. 이러한 반응성 중간체는 이후에 재배열 또는 또 다른 탄화수소와 수산화 음이온의 전이를 겪는다. 따라서, 반응은 중간체를 재발생시켜서 자가-전파 연쇄반응을 야기한다. 또한, 탄화수소는 그 안에 탄소-탄소 이중, 또는 삼중 결합의 수를 감소시키기 위해, 선택적으로는 0개가 되도록 처리될 수 있다. 또한, 탄화수소는 그 안에 링 또는 환형 구조가 제거되거나 소멸되도록 처리될 수 있다. 또한, 탄화수소는 수소:탄소 비가 증가하도록 처리될 수 있다. 이는 수소의 첨가("수소화") 및/또는 탄화수소를 더 작은 탄화수소로 "크래킹"하는 것을 포함할 수 있다.
열적 방법은 온도 및 압력을 증가시켜서 탄화수소의 크기를 감소시키는 것을 수반한다. 약 800℃의 상승된 온도 및 약 700 kPa의 압력이 사용될 수 있다. 이러한 조건은 "광"을 발생시키고, 상기 광은 수소가 풍부한 탄화수소 분자를 가끔 지칭하는데에 사용되고(광자 유입으로부터 식별됨), 수소가 상대적으로 감소된 중(heavier) 탄화수소 분자를 축합함으로써 발생할 수도 있다. 방법론은 균형, 또는 대칭, 절단을 제공하고, 상술된 바와 같이 선택적으로 효소에 의해 포화될 수 있는 알켄을 생성한다.
촉매를 사용하는 방법 및 열적 방법은 탄화수소 처리 및 오일 정제를 위한 공장에서 흔하다. 따라서, 본원에서 설명된 바와 같이 세포에 의해 생성된 탄화수소는 수집되고 처리되거나, 종래의 방법을 통해 정제될 수 있다(탄화수소를 생성하는 미세조류의 수소화 분해에 대한 문헌[See Hillen 등, Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)] 참조). 대안적인 실시예에서, 분획은 유기 화합물과 같은 다른 촉매, 열, 및/또는 무기 화합물로 처리된다. 바이오 디젤로 지질을 처리함에 있어서, 에스테르 교환반응 처리는 본원의 섹션 IV에서 설명되는 바와 같이 사용된다.
본 발명의 방법을 통해 생성된 탄화수소는 다양한 공업적 응용에 유용하다. 예를 들어, 세제 및 세척 제제의 거의 모든 유형에 사용되는 음이온성 계면 활성제인 선형 알킬벤젠 설포네이트(LAS)의 생산은 10 내지 14개의 탄소 원자로 구성된 쇄를 일반적으로 포함하는 탄화수소를 활용한다(미국특허 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호 참조). LAS와 같은 계면활성제는 미국 특허 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에서 설명되는 것과 같은 개인 생활 조성물 및 세재의 제조에 사용될 수 있다.
디젤 이동수단 및 제트 엔진에 사용하기에 적합한 연료를 생산하는 방법
화석 연료로부터 유래된 시작 물질을 대체할 수 있는 재생 가능한 생물학적 시작 물질이 사용가능하기 때문에, 바이오디젤, 재생 가능한 디젤 및 제트 연료와 같은 연료에서 생물학적 유래의 탄화수소 성분의 사용에 대한 관심이 증가하고 이들의 사용이 요구된다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생산하는 방법에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 본원에서 설명된 방법에 의해 발생된 지질을 사용하여 생물학적 물질로부터 바이오디젤, 재생 가능한 디젤 및 제트 연료를 생산하는, 바이오디젤, 재생 가능한 디젤 및 제트 연료의 생산 방법을 제공함으로써 이런 필요를 충족시킨다.
종래의 디젤 연료는 파라핀계 탄화수소가 풍부한 석유 증류액이다. 이들은 압축 점화 엔진, 예를 들어, 디젤 엔진 이동수단에서 연소에 적합한 370 내지 780℉의 끓는점을 가진다. 미국 재료 시험 협회(ASTM)는 다른 연료 특성의 허용 가능한 범위, 예를 들어, 세탄가, 클라우드 포인트, 점화 시점, 점도, 아닐린 시점, 황 함량, 물 함량, 회분, 구리 스트립 부식, 및 잔류 탄소와 함께 끓는점에 따른 디젤의 등급을 규명한다. 기술적으로, 바이오매스로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 물질 또는 적절한 ASTM 설명서에 맞는 것은 디젤 연료(ASTM D975), 제트 연료(ASTM D1655), 또는 바이오 디젤(ASTM D6751)로 정의될 수 있다.
추출 후에, 본원에서 설명된 미생물 바이오매스로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 이동수단 및 제트 엔진에 사용하기 위한 연료를 제조하기 위해서 화학적 처리를 겪을 수 있다.
바이오디젤
바이오디젤은 생산 공급원료에 따라 황금색 내지 검은 밤색으로 변화하는 액체이다. 이것은 사실상 물과 혼합되지 않고, 높은 끓는점 및 낮은 증기압을 가진다. 바이오디젤은 디젤-엔진 이동수단에 사용하기 위한 디젤-등가 처리된 연료(diesel-equivalent processed fuel)로 지칭된다. 바이오디젤은 생분해성이고 비독성이다. 종래의 디젤 연료에 비해 바이오디젤의 추가적인 이점은 낮은 엔진 마모성이다.
일반적으로, 바이오디젤은 C14-C18 알킬 에스테르를 포함한다. 다양한 처리는 바이오매스 또는 본원에 설명된 바와 같이 생산되고 단리된 지질을 디젤 연료로 전환한다. 바이오디젤을 생산하기 위한 바람직한 방법은 본원에서 설명된 바와 같이 지질을 에스테르교환반응 하는 것이다. 바이오디젤로 사용하기 위한 바람직한 알킬 에스테르는 메틸에스테르 또는 에틸에스테르이다.
본원에서 설명된 방법에 의해 생산된 바이오디젤은 홀로 사용되거나 대부분의 현대의 디젤-엔진 이동수단에서 임의의 농도의 종래의 디젤 연료와 함께 혼합되어 사용될 수 있다. 종래의 디젤 연료(석유 디젤)와 혼합되는 경우에, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 전 세계는 임의의 연료 혼합물 중의 바이오디젤의 양을 나타내기 위해 "B" 인자를 사용한다. 예를 들어, 20%의 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 라벨링된다. 순수한 바이오디젤은 B100으로 지칭된다.
또한, 바이오디젤은 국내에서 판매하는 보일러의 가열 연료로서 사용될 수 있다. 현존하는 기름 보일러는 고무 파트를 함유할 수 있고, 바이오디젤 상에서 구동하기 위해 전환이 요구될 수 있다. 전환 과정은 보통 상대적으로 간단하며, 이는 바이오디젤이 강용매(strong solvent)이기 때문에 고무 파트를 합성 파트로 교환하는 것을 수반한다. 이것의 강 용매 동력(power)에 의하여, 바이오디젤을 연소하는 것은 보일러의 효율을 증가시킬 것이다.
바이오디젤은 사실상 황 함유량이 없기 때문에 이로운 순수한 초저유황 디젤(ULSD) 연료의 윤활성을 증가시키기 위해 디젤의 제제에 첨가제로서 사용될 수 있다.
바이오디젤은 석유디젤에 비해 더 좋은 용매이고, 이전에 석유디젤에서 가진 이동수단의 연료관에서 잔유물의 축적을 타파하기 위해 사용될 수 있다.
바이오디젤의 생산
바이오디젤은 오일이 풍부한 바이오매스에 함유된 트리글리세리드의 에스테르 교환 반응에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 바이오디젤을 생산하는 방법이 제공된다. 바람직한 실시예에서, 바이오디젤을 생산하는 방법은 (a) 본원에서 개시된 방법을 사용하여 지질-함유 마이크로 유기체를 재배하는 단계, (b) 용해물을 생산하기 위해 지질-함유 마이크로유기체를 용해하는 단계, (c) 용해된 마이크로유기체로부터 지질을 단리하는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 에스테르 교환 반응하는 단계를 포함하며, 이에 의하여 바이오디젤이 생산된다.
마이크로 유기체를 성장시키는 방법에 있어서, 용해물을 생산하기 위해 마이크로유기체를 용해하는 단계, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 균질한 혼합물을 형성하는 단계 및 지질 조성물 안으로 처리된 용해물을 분리하는 단계는 상술되었고, 상기 방법은 바이오디젤을 생산하는 방법에 사용될 수도 있다.
지질 조성물은 에스테르 교환 반응을 겪어서 바이오디젤로 유용한 장쇄 지방산 에스테르를 수득할 수 있다. 바람직한 에스테르 교환 반응은 하기에서 개요되고 염기 촉매화 에스테르 교환 반응 및 재조합 리파아제를 사용하는 에스테르 교환 반응을 포함한다.
염기-촉매화 에스테르 교환 반응 공정에서, 트리아실글리세리드는 알칼린 촉매, 일반적으로 수산화칼륨의 존재하에서 메탄올 또는 에탄올과 같을 알콜과 반응된다. 이 반응은 메틸 또는 에틸 에스테르를 형성하고 부산물로 글리세린(글리세롤)을 형성한다.
일반적인 화학 공정
동물성 및 식물성 오일은 일반적으로 3가 알콜인 글리세롤을 갖는 유리 지방산의 에스테르인 트리글리세리드로 구성된다. 에스테르 교환 반응에서, 트리아실글리세리드(TAG) 내의 글리세롤은 메탄올 또는 에탄올과 같은 단쇄 알콜로 교체된다.
재조합 리파아제의 사용
에스테르 교환 반응은 염기 이외에 리파아제와 같은 효소를 사용하는 실험이 또한 수행되었다. 리파아제-촉매화 에스테르 교환 반응은 예를 들어, 실온 내지 80℃의 온도에서, TAG 대 저가 알콜의 몰비가 1:1, 바람직하게는 약 3:1인 조건에서 수행될 수 있다.
에스테르 교환 반응에 사용하기에 적합한 리파아제는 예를 들어, 미국특허 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO89/01032에서 찾아볼 수 있다.
바이오디젤에 적합한 지방산 에스테르의 생산에 리파아제를 사용하기 위한 한가지 장애는 강 염기 공정에서 사용되는 수산화나트륨(NaOH)의 가격에 비해 리파아제의 가격이 훨씬 비싸다는 것이다. 이런 장애는 재사용될 수 있는 고정화된 리파아제를 사용하는 것이 고려된다. 반면에, 고정화된 리파아제의 활성은, 리파아제-기반 공정이 강 염기 공정에 대해 생산 비용 측면에서 경쟁력이 있도록 최소 순환 횟수 동안 재사용된 후 유지되어야만 한다. 고정화된 리파아제는 에스테르 교환 반응에 일반적으로 사용된 저가 알콜에 의한 피독 현상(poisoning)을 겪는다. 미국특허 제6,398,707호(Wu 등에 의해 2002년 6월 4일에 등록 공고됨)는 고정화된 리파아제의 활성을 향상시키는 방법 및 감소된 활성을 갖는 고정화된 리파아제를 재생하는 방법을 설명한다.
특정 실시예에서, 재조합 리파아제는 라파아제가 작용하여 지질을 생산하는 동일한 마이크로유기체에서 발현된다. 리파아제를 인코딩하는 DNA 및 선택 가능한 표지는 코돈-최적화된 cDNA인 것이 바람직하다. 미세조류에서 발현을 위한 유전자를 리코딩(recoding)하는 방법은 미국특허 제7,135,290호에서 설명된다.
표준
바이오디젤에 대한 일반적인 국제 규격은 EN 14214이다. ASTM D6751은 미국 및 캐나다에서 기준이된 가장 흔한 바이오디젤 규격이다. 독일은 DIN EN 14214를사용하고 영국은 BS EN 14214를 따르기를 요구한다.
생성물이 이러한 규격에 합당한지 여부를 결정하기 위한 기본적인 공업적 시험은 일반적으로 가스 크로마토그래피, HPLC, 및 다른 것들을 포함한다. 품질 규격에 맞는 바이오디젤은 50 mL/kg을 초과하는 독성 평가(LD50)를 갖는 매우 비-독성이다.
재생 가능한 디젤
재생 가능한 디젤은 C16:0 및 C18:0과 같은 알칸을 포함하고, 따라서 바이오디젤로부터 구별 가능하다. 고 품질의 재생 가능한 디젤은 ASTM D975 규격에 합당한다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 지질은 공급원료로서 역할하여 재생 가능한 디젤을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 재생 가능한 디젤을 생산하는 방법이 제공된다. 재생 가능한 디젤은 적어도 세 개의 공정에 의해 생산될 수 있다: 열수 공정(수소화 처리); 수소화공정; 및 간접적인 액화. 이러한 공정은 비-에스테르 증류액을 생산한다. 이러한 공정 도중에, 본원에서 설명된 바와 같이 생산되고 단리된 트리아실글리세리드는 알칸으로 전환된다.
바람직한 실시예에서, 재생 가능한 디젤을 생산하는 방법은 (a) 본원에서 개시된 방법을 사용하여 지질-함유 마이크로유기체를 재배하는 단계, (b) 용해물을 생산하기 위해 마이크로유기체를 용해하는 단계, (c) 용해된 마이크로유기체로부터 지질을 단리하는 단계, 및 (d) 알칸을 생산하기 위해 지질을 탈산소화 및 수소화처리하는 단계를 포함하며, 이에 의하여 재생 가능한 디젤이 생산된다. 재생 가능한 디젤을 제조하기에 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하여 미생물 바이오매스로부터의 추출을 통해 얻어질 수 있거나, 또는 미국특허 제5,928,696호에서 설명되는 바와 같은 다른 방법을 통해 얻어질 수 있다.
일부 방법에서, 미생물 지질은 탄소 쇄 길이 및 포화 이중 결합 각각을 감소시키기 위한 수소화 처리와 함께 최초 크래킹된다. 이후에 물질은 수소화 처리와 함께 이성질화된다. 이후에, 나프타 분획은 증류를 통해 제거될 수 있고, 그 다음에 디젤 연료가 D975 규격에 맞도록 요구되는 성분을 기화시키고 증류하기 위해 추가 증류가 이어지며, 이때 이탈하는 성분은 D975 규격에 맞기 위해 요구되는 성분에 비해 더 무거운 성분이다. 트리글리세리드 오일을 포함하는 화학적으로 변형되는 오일의 수소화처리, 수소화크래킹, 탈산소화 및 이성질화 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예, EP 1741768 (A1); EP 1741767 (A1); EP 1682466 (A1); EP 1640437 (A1); EP 1681337 (A1); EP 1795576 (A1); 및 미국특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호 참조).
수소화처리
재생 가능한 디젤을 생산하는 방법의 바람직한 실시예에서, 알칸을 생산하기 위해 지질을 처리하는 단계는 지질 조성물의 수소화처리에 의해 수행된다. 수소화열적 공정에서, 일반적으로 바이오매스는 상승된 온도 및 압력에서 물에서 반응하여 오일 및 잔류 고체를 형성한다. 전환 온도는 일반적으로 300에서 660℉이고, 액체로서 주로 물을 유지하기에 충분한 압력은 100에서 170 표준 압력(atm)이다. 반응 시간은 15 내지 30분 정도이다. 반응이 종료된 후에, 유기물은 물로부터 분리된다. 이에 의하여 디젤에 적합한 증류물이 생산된다.
수소화공정
"친환경 디젤"로 지칭되는 재생 가능한 디젤은 종래의 수소화공정 기술에 의해 지방산으로부터 생산될 수 있다. 트리글리세리드-함유 오일은 석유와 함께 공급되거나 전용 공급으로 수소화공정에 의해 처리될 수 있다. 생성물은 ASTM D975 사양에 합당한 디젤 연료이다. 따라서, 재생 디젤을 생산하는 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서, 알칸을 생산하기 위한 지질 조성물을 처리하는 단계는 지질 조성물의 수소화공정에 의해 수행될 수 있다.
재생 가능한 디젤을 제조하는 일부 방법에서, 트리글리세리드를 처리하는 최초 단계는 이중 결합을 포화하기 위한 수소화공정 처리단계 이후에 수소 및 촉매의 존재 하에서 상승된 온도에서 탈산소화하는 단계가 이어진다. 일부 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 이전에 발생한다. 다음으로 이성질화는 수소 및 촉매의 존재하에서 선택적으로 수행된다. 나프타 성분은 증류를 통해 제거되는 것이 바람직하다(예, 미국특허 제5,475,160호 (hydrogenation of triglycerides); 제5,091,116호 (deoxygenation, hydrogenation and gas removal); 제6,391,815호 (hydrogenation); 및 제5,888,947호 (isomerization)).
석유 정제 공장은 수소를 공급하는 처리에 의해 불순물을 제거하기 위해 수소화공정을 사용한다. 수소화공정 전환 온도는 일반적으로 300 내지 700℉이다. 압력은 일반적으로 40 내지 100 atm이다. 반응 시간은 일반적으로 10 내지 60분 정도이다.
고체 촉매는 특정 반응 속도를 증가시키도록, 특정 생성물에 대한 선택성을 향상시키도록, 그리고 수소 소비를 최적화하도록 채용된다.
수소화처리 및 수소화공정은 공급물의 분자량에 감소를 궁극적으로 가져온다. 트리글리세리드-함유 오일의 경우에, 트리글리세리드 분자는 수소화공정 조건 하에서 4개의 탄화수소 분자로 환원된다: 프로판 분자 및 일반적으로 C8 내지 C18의 세 개의 무거운 탄화수소 분자.
간접 액화
종래의 초저유황 디젤은 두 개의 단계 공정에 의해 임의의 바이오매스 형태로부터 생산될 수 있다. 첫 번째로, 바이오매스는 합성 가스로 전환되며, 이때 가스 혼합물은 수소 및 일산화탄소가 풍부하다. 이후에, 상기 합성 가스는 액체로 촉매에 의해 전환된다. 일반적으로, 액체의 생산은 피셔-트롭스(Fischer-Tropsch, FT) 합성법을 사용하여 성취된다. 이 기술은 석탄, 천연 가스 및 중유에 적용된다. 따라서, 재생 디젤을 생산하는 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서, 알칸을 생산하기 위해서 지질 조성물을 처리하는 것은 지질 조성물의 간접 액화에 의해 수행된다.
제트 연료
비행기 연료는 담황색으로 투명하다. 가장 흔한 연료는 비행기 A-1으로 분류된 무연/파라핀 오일-기반 연료이며, 이는 국제 표준화된 사양으로 생산된다. 비행기 연료는 아마 수천 또는 그 이상의 상당수의 상이한 탄화수소의 혼합물이다. 이들의 크기(분자량 또는 탄소수)의 범위는 예를 들어, 어는점 또는 발연점과 같은 생성물에 대한 요구 사항에 의해 제한된다. 케로손형(kerosone-type) 비행기 연료(Jet A 및 Jet A-1을 포함)는 약 8 내지 16개의 탄소 수 분포를 가진다. 와이드-커트(wide-cut) 또는 나프타형 비행기 연료(Jet B 포함)는 일반적으로 약 5 내지 15개의 탄소 수 분포를 가진다.
비행기 연료(Jet A 및 Jet B) 둘 모두는 다수의 첨가제를 함유할 수 있다. 유용한 첨가제는 항산화제, 정전기 방지제, 부식 억제제 및 연료 시스템 착빙 억제제(FSII)(fuel system icing inhibitor agent)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 거밍(gumming)을 방지하고, 보통 알킬화된 페놀, 예를 들어 AO-30, AO-31 또는 AO-37에 기반한다. 정전기 방지제는 정전기를 소멸시키고 불꽃을 방지한다. 활성 성분으로서 디노닐나프틸설폰산(DINNSA)을 함유하는 Stadis 450이 예이다. 부식 억제제, 예를 들어 DCI-4A는 민간용 및 군용 연료에 사용되고, DCI-6A는 군용 연료에 사용된다. FSII는 예를 들어 Di-EGME를 포함한다.
용액은 배출되는 제트 연료와 블렌딩된 조류 연료이다. 본 발명은 이러한 용액을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 지질은 제트 연료를 생산하기 위한 공급원료로서 역할할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 제트 연료를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 이와 함께 본 발명의 방법에 의해 생산된 지질로부터 제트 연료를 생산하기 위한 두 개의 방법이 제공된다: 유동 접촉 분해(流動接觸分解)(FCC); 및 수소화탈산소화(hydrodeoxygenation)(HDO).
유동 접촉 분해
유동 접촉 분해(FCC)는 올레핀을 생산하는데에, 특히 중질 분획(heavy crude fractions)로부터 프로필렌을 생산하는데에 사용된 하나의 방법이다. 카놀라유와 같은 식물성 오일이 FCC를 사용하여 처리되어 가솔린 연료로서 유용한 탄화수소 스트림을 제공할 수 있다는 문헌에 대한 보고가 존재한다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 지질은 올레핀으로 전환될 수 있다. 공정은 FCC 영역을 통해 생산된 지질을 흘러보내는 단계 및 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 생성물 스트림을 수집하는 단계를 수반한다. 생산된 지질은 분해 조건에서 분해 촉매와 접촉하여 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 생성물 스트림을 제공한다.
바람직한 실시예에서, 제트 연료를 생산하기 위한 방법은 (a) 본원에서 개시된 방법을 사용하여 지질-함유 마이크로유기체를 재배하는 단계, (b) 용해물을 생산하기 위해 지질-함유 마이크로유기체를 용해하는 단계, (c) 용해물로부터 지질을 단리하는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 처리하는 단계를 포함하며, 이에 의하여 제트 연료가 생산된다.
제트 연료를 생산하기 위한 방법의 바람직한 실시예에서, 지질 조성물은 유동 접촉 분해 영역을 통해 흘러갈 수 있으며, 이때, 일 실시예에서, 분해 조건에서 분해 촉매와 액체 조성물이 접촉하여서 C2-C5 올레핀을 포함하는 생성물 스트림을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
이 방법의 특정 실시예에서, 지질 조성물 내에 존재할 수 있는 임의의 오염 물질을 제거하는 것이 요구될 수 있다. 따라서, 유동 접촉 분해 영역을 통해 지질 조성물을 흘려보내기 이전에, 지질 조성물은 기처리된다. 기처리는 이온-교환 수지와 지질 조성물이 접촉하는 단계를 수반할 수 있다. 이온 교환 수지는 AmberlystTM-15와 같은 산성 이온 교환 수지이고, 액체 조성물이 통과해 상류 또는 하류로 흘러가는 반응기의 층으로서 사용될 수 있다. 다른 기처리는 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과 같은 산과 지질 조성물을 접촉시킴으로써 온화한 산 세척하는 것을 포함할 수 있다. 접촉은 보통 주변 온도 및 대기압 하에서 희석한 산 용액으로 이루어진다.
선택적으로 기처리된 지질 조성물은 FCC 영역으로 흘러가며, 여기서 탄화수소의 성분은 올레핀으로 분해된다. 촉매성 분해는 곱게 나누어진 미립자 물질로 구성된 촉매와 지질 조성물을 반응 영역에서 접촉시킴으로써 성취된다. 반응은 수소화분해와 대조적으로 촉매성 분해이고, 수소의 첨가 또는 수소의 소비가 없이 수행된다. 분해 반응이 진행됨에 따라서, 코크스의 상당량이 촉매 상에 축적된다. 촉매는 재생 영역 내의 촉매로부터의 코크스를 고온에서 태움으로써 재생된다. 본원에서 "코크스 촉매"로 지칭된 코크스-함유 촉매는 재생되기 위하여 반응 영역으로부터 재생 영역으로 계속해서 이동되고, 재생 영역으로부터의 본질적으로 코크스가 없는 재생된 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 영역 및 재생 영역 사이에서 촉매의 이동을 가능하게 한다. 본원에서 설명된 지질 조성물의 탄화수소와 같은 탄화수소를 촉매의 유동 스트림 내에서 분해하는 방법에 있어서, 반응 영역 및 재생 영역 사이에서 촉매를 이동시키는 단계, 및 재생장치에서 코크스를 연소시키는 단계는 FCC 공정의 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 FCC 적용 및 C2-C5 올레핀을 생산하기 위해 지질 조성물을 분해하는데에 유용한 촉매는 미국특허 제6.538.169호, 제7,288,685호에 설명되며, 상기 문헌의 전부는 본원에 참조로 포함된다.
일 실시예에서, 본 발명의 지질 조성물을 분해하는 단계는 FCC 영역의 상승부(riser section) 또는 대안적으로 리프트부(lift section)에서 이루어진다. 지질 조성물은 지질 조성물의 급속한 기화에 의한 노즐에 의해 상승부 안으로 도입된다. 촉매에 저촉하기 이전에, 지질 조성물은 약 149℃ 내지 약 316℃(300℉ 내지 600℉)의 온도를 대개는 가질 것이다. 촉매는 혼합 그릇으로부터 상승부로 흘러가고, 여기서 촉매는 지질 조성물과 약 2초 이하의 시간 동안 접촉한다.
다음으로, 혼합된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는 상승부의 상부로 배출구를 통해 배출되고, 올레핀 및 일반적으로 "코크스 촉매"로 불리는 코크스의 상당량으로 덮힌 촉매 입자의 무리를 포함하는 분해된 생성물 증기 스트림으로 분리된다. 원하는 생성물에서 원치 않는 다른 생성물로의 추가적인 전환을 촉진할 수 있는 지질 조성물과 촉매의 접촉 시간을 최소화하기 위한 노력에서, 선회 팔(swirl arm) 배열과 같은 분리 장치의 임의의 배열이 사용되어 생성물 스트림으로부터 코크스 촉매를 빠르게 제거할 수 있다. 분리기, 예를 들어 선회 팔 분리기는 챔버의 하부에 스트립핑 영역(stripping zone)을 갖는 챔버의 상부에 위치된다. 선회 팔 배열에 의해 분리된 촉매는 스트립핑 영역으로 떨어진다. 경(light) 올레핀 및 일부 촉매를 포함하는 분해된 탄화수소를 포함하는 분해된 생성물 증기 스트림은, 원심집진기(cyclone)과 상호 연결되는 도관을 통과해 챔버를 빠져나간다. 원심집진기는 생성물 증기 스트림으로부터 잔류 촉매 입자를 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준에까지 낮춘다. 생성물 증기 스트림은 이후에 분리 그릇의 상부로 빠져나간다. 원심집진기에 의해 분리된 촉매는 분리 그릇으로 다시 돌아오고 이후에 스트립핑 영역으로 돌아간다. 스트립핑 영역은 증기와 향류 접촉(counter-current contact)함으로써 촉매의 표면으로부터 흡수된 탄화수소를 제거한다.
낮은 탄화수소 부분 압력은 경 올레핀의 생산이 용이하도록 작동한다. 따라서, 상승 압력은 약 172 내지 약 241 kPa(25 내지 35 psia)로 세팅되고, 탄화수소 부분압은 약 35 내지 약 172 kPa(5 내지 24 psia)로 세팅되고, 바람직하게는 탄화수소 부분압은 약 69 내지 약 138 kPa(10 내지 20 psia)로 세팅된다. 탄화수소에 대한 이러한 상대적으로 낮은 부분압은 증기를 희석제로서 사용하여 달성되며, 이때 희석재는 지질 조성물의 10 내지 55 중량% 그리고 바람직하게는 지질 조성물의 약 15 중량%이다. 건조 가스와 같은 다른 희석제는 동등한 탄화수소 부분압을 달성하도록 사용될 수 있다.
상승부 배출구에서 분해된 증기의 온도는 약 510℃ 내지 621℃(950℉ 내지 1150℉)일 것이다. 그러나, 566℃(1050℉) 미만의 상승부 배출구 온도는 더 건조한 가스 및 더 많은 올레핀을 만든다. 반면에, 566℃(1050℉) 미만의 상승부 배출구 온도는 더 적은 에틸렌 및 프로필렌을 만든다. 따라서, FCC 공정을 바람직하게는 약 566℃ 내지 약 630℃ 온도에서, 바람직하게는 약 138 kPa 내지 약 240 kPa(20 내지 35 psia)에서 수행하는 것이 바람직하다. 공정에 대한 또 다른 조건은 지질 조성물에 대한 촉매의 비율이 약 5 내지 약 20으로 다양할 수 있고, 바람직하게는 약 10 내지 약 15일 수 있다.
제트 연료를 생산하는 방법의 일 실시예에서, 지질 조성물은 FCC 반응기의 리프트부 안으로 도입된다. 리프트부 내의 온도는 매우 뜨겁고 약 700℃(1292℉) 내지 약 760℃(1400℉)이며, 지질 조성물에 대한 촉매의 비율은 약 100 내지 약 150일 것이다. 지질 조성물을 리프트부 안으로 도입하는 것은 상당량의 프로필렌 및 에틸렌을 생산할 것이라고 예상된다.
생산된 가스 및 액체 탄화수소 생성물은 가스 크로마토그래피, HPLC 등에 의해 분석될 수 있다.
수소화탈산소화
지질 조성물 또는 본원에서 설명된 바와 같이 생산된 지질을 사용하여 제트 연료를 생산하는 방법의 또 다른 실시예에서, 지질 조성물 및 지질의 구조는 수소화탈산소화(HDO)로 지칭되는 공정에 의해 파괴된다.
HDO는 수소에 의해 산소를 제거하는 것을 의미하며, 즉 산소는 물질의 구조가 파괴되면서 제거된다. 올레핀의 이중 결합은 수소화되고, 임의의 황 및 질소 화합물은 제거된다. 황 제거는 수소화탈황화(HDS)로 불린다. 원료(지질 조성물 또는 지질)의 기처리 및 순도는 촉매의 사용 기간에 기여한다.
일반적으로 HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 원료(지질 조성물 또는 지질)와 혼합된 후 혼합물은 단일 상 또는 이중 상 공급 원료와 병류로 촉매층을 통과한다. HDO/MDS 단계 이후에, 생성물 분획은 분리되고 분리된 이성질화 반응기로 전달된다. 생물학적 시작 물질을 위한 이성질화 반응기는 현재의 반응기로서 문헌(FI 100 248)에서 설명된다.
탄화수소 공급물, 예를 들어 지질 조성물 또는 본원의 지질을 수소화하여 연료를 생산하는 공정은 지질 조성물 또는 지질을 수소 가스와 병류로 제 1 수소화 영역을 통과시킨 뒤, 탄화수소 용출액은 탄화수소 용출액에 관하여 향류로 제 2 수소화 영역에 수소 가스를 전달함으로써 제 2 수소화 영역에서 추가적으로 수소화되는 방식으로 수행될 수 있다. 예시적인 HDO 적용 및 C2-C5 올레핀을 생산하기 위한 지질 조성물을 분해에 유용한 촉매는 미국특허 제7,232,935호에 설명되며, 이 문헌의 전부는 참조로 본원에 포함된다.
일반적으로, 수소화탈산소화 단계에서, 지질 조성물 또는 본원의 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 분해되며, 산소, 질소, 인 및 황 화합물, 및 가스로서 경(light)탄화수소는 제거되고, 올레핀의 결합은 수소화된다. 공정의 두 번째 단계에서, 즉, 이성질화 단계에서, 이성질화는 탄화수소 쇄를 분지화하기 위해 수행되고, 이는 저온에서 파라핀의 성능을 향상시킨다.
제 1 단계에서, 즉 분해 공정 중 HDO 단계에서, 수소 가스 및 지질 조성물 또는 수소화될 본원의 지질은 병류 또는 향류 중 어느 하나로 HDO 촉매층 시스템으로 전달되며, 상기 촉매층 시스템은 하나 이상의 촉매층(들), 바람직하게는 1-3 촉매층을 포함한다. HDO 단계는 일반적으로 병류 방식으로 작동된다. 두개 이상의 촉매층을 포함하는 HDO 촉매층 시스템의 경우에, 하나 이상의 층은 향류 원리를 사용하여 작동될 수 있다.
HDO 단계에서, 압력은 20 내지 150 bar, 바람직하게는 50 내지 100 bar로 변화하고, 온도는 약 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃로 변화한다.
HDO 단계에서, 주기율표의 VII 및/또는 VIB족 금속을 함유하는 알려진 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이며, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 일반적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.
HDO 단계 이전에, 지질 조성물 또는 본원의 지질은 이중 결합의 부반응을 피하기 위해서 온화한 조건 하에서 예비수소화에 의해 선택적으로 처리될 수 있다. 이러한 예비수소화는 50℃ 내지 400℃의 온도, 1200 bar의 수소 압력, 바람직하게는 150℃ 내지 250℃의 온도, 10 내지 100 bar의 수소 압력 조건에서 예비수소화 촉매의 존재하에서 수행된다. 촉매는 주기율표의 VIII 및/또는 VIB족 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 예비수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이며, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.
수소를 함유하는 HDO 단계로부터의 가스 스트림은 냉각된 후, 일산화탄소 화합물, 이산화탄소 화합물, 질소 화합물, 인 화합물, 황 화합물, 가스형 경탄화수소 및 다른 불순물은 가스 스트림으로부터 제거된다. 압축후에, 정제된 수소 또는 재사용된 수소는 내향적인 가스 스트림을 만들기 위해 제 1 촉매층 및/또는 촉매층들 사이로 다시 돌려 보내진다. 물은 응결된 액체로부터 제거된다. 액체는 제 1 촉매층 또는 촉매층들 사이로 보내진다.
HDO 단계 후에, 생성물은 이성질화 단계를 겪는다. 탄화수소가 이성질화 촉매와 접촉되기 이전에 불순물이 가능하면 완벽히 제거되는 것은 공정에 있어서 상당히 중요하다. 이성질화 단계는 선택적인 스트립핑 단계를 포함하며, 이때 HDO 단계로부터의 반응 생성물은 수증기 또는 경탄화수소, 질소 또는 수소와 같은 적합한 가스로 스트립핑하여 정제될 수 있다. 선택적인 스트립핑 단계는 이성질화 촉매의 상류에 있는 유닛에서 향류 방식으로 수행되며, 이때 가스 및 액체는 서로 접촉되거나, 향류 원리를 활용하는 분리된 스트립핑 유닛 내의 실제 이성질화 반응기 이전에 서로 접촉된다.
스트립핑 단계 이후에, 수소 가스 및 수소화된 지질 조성물 또는 본워의 지질, 및 선택적으로 n-파라핀 혼합물은 하나 또는 몇몇의 촉매층(들)을 포함하는 반응성 이성질화 유닛으로 보내진다. 이성질화 단계의 촉매층들은 병류 또는 향류 중 어느 하나로 작동될 수 있다.
향류 원리가 이성질화 단계에서 적용된다는 것은 공정에서 중요하다. 이정질화 단계에서, 이는 선택적인 스트립핑 단계 또는 이성질화 반응 단계 또는 향류 방식의 앞의 두 단계가 수행됨으로써 이루어진다.
이성질화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 그릇 또는 분리된 압력 그릇에서 수행될 수 있다. 선택적인 예비수소화는 HDO 및 이성질화 단계와 같이 분리된 압력 그릇 또는 동일한 압력 그릇에서 수행될 수 있다.
이성질화 단계에서, 압력은 20 bar 내지 150 bar, 바람직하게는 20 bar 내지 100 bar, 200℃ 내지 500℃의 온도, 바람직하게는 300℃ 내지 400℃의 온도로 변화한다.
이성질화 단계에서, 당해 분야에서 달려진 이성질화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성질화 촉매는 분자체(molecular sieve) 및/또는 VII족 금속 및/또는 캐리어를 함유한다. 바람직하게는, 이성질화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리어라이트(ferrierite) 및 Pt, Pd 또는 N1 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 일반적인 이성질화 촉매에는 예를 들어, Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2가 있다.
생성물로서, 디젤 연료 또는 이의 성분으로서 유용한, 생물학적 유래의 고 품질 탄화수소 성분이 얻어지고, 상기 탄화수소 성분의 밀도, 세탄수 및 저온에서의 성능은 우수하다.
미생물 조작
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 특정 실시예에서, 지질 생산율을 향상시키거나 마이크로유기체에 의해 발생되는 성분의 특성 및 비율을 변형하거나, 다양한 공급원료 물질 상에서 데노보(de novo) 성장 특성을 향상시키거나 제공하기 위해 마이크로유기체를 유전적으로 변형하는 것이 바람직하다.
프로모터, cDNA, 및 3'UTR 뿐만 아니라 벡터의 다른 요소는 자생원(native source)으로부터 단리된 단편을 사용하는 클로닝 기술을 통해 말들어 질 수 있다(예, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press]; 및 미국특허 제4,683,202호 참조). 대안적으로, 벡터의 다른 요소는 공지된 방법을 사용하여 합성적으로 발생될 수 있다(예, 문헌[Gene. 1995 Oct. 16; 164(l):49-53] 참조). 미생물 조작 방법은 예를 들어, 미국특허 출원번호 제20090011480호로 당해 분야에 일반적으로 알려져 있으며, 모든 목적에 대해서 전체가 참조로 본원에 포함된다.
실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 실시예의 예이다. 하기 예는 실례의 목적만으로 제공되고, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한할 의도는 아니다. 사용된 숫자(예, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오차 및 편차는 물론 가능할 것이다.
본 발명의 실시는 따로 제시되지 않는 한 당해 분야에 통상의 기술자가 사용하는 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 종래 방법을 채용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 완전히 설명된다(예, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)]; 문헌[A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]; 문헌[Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; 문헌[Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]; 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]; 문헌[Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(l992)] 참조).
바이오매스는 낮은 강도의 - 미세조류 발효에 가하는 조도 -에 의해 증가된다 .
보트리오코쿠스는 자연적으로 합성되고 탄화수소 혼합물을 견디고 최대 85 중량%의 탄화수소를 생산하고, 많은 경우에서 주 탄화수소는 보트리오코켄스(botryococcenes)이다. 또한, 보트리오코쿠스는 절대 광영양생물로 알려져 있지만 글루코오스를 흡수하는 능력을 갖는 것으로 보인다(참조: "Biosynthesis of the triterpenoids, botryococcenes and tetramethylsqualene in the B race of Botryococcus braunii via the non-mevalonate pathway" Sato 등, 2003. Tetrahedron Letter 44:7035-7037).
보트리오코쿠스 배양은 25℃ 내지 35℃의, 10 내지 30%의 용존 산소량을 갖는 바이오리액터에서 BG11 배지(참조: Autotrophic cultivation of Botryococcus braunii for the production of hydrocarbons and exopolysaccharides in various media". Dayananda et al. 2007. Biomass and Bioenergy. 31 : 87-93) 상에서 성장된다. 보트리오코쿠스의 종속 영양 성장에 대한 광신호의 효과는 상이한 조건(어둠+글루코우스 결여, 어둠+글루코오스, 광+글루코오스 결여, 및 광+글루코오스)에서 배양의 세포 건조 중량과 비교하여 시험된다. 최적 광 강도(0.01 내지 300 μmol/m2s) 및 상이한 광 스펙트럼(360-700 nm)에서 시험될 뿐만 아니라 상이한 광 시간(9-16 시간)으로 시험된다. 낮은 조도의 광 및 글루코오스의 조합은 a) 성장 속도의 향상, b) 카로테노이드, 지질 및 보트리오코켄스와 같은 생성물의 증가를 가져온다.
이소프레노이드 경로의 광 조절
이소프렌, 모노테르펜 및 세스퀘테르펜은 일부 식물 및 미세조류 종에 의해합성되고 방출되지만 모든 종이 이런 능력을 갖지는 않는다. 이러한 휘발성, 비필수 이소프레노이드 화합물은 카로테노이드 및 탄화수소와 같은 상업적으로 크게 유용한 이소프레노이드와 동일한 생화학적 전구체를 공유한다. 두 개의 분리된 경로는 모든 이소프레노이드에서 공통되는 프레닐디포스페이트 전구체를 합성하기 위해 식물 세포에서 작동한다.
시토졸 및 미토콘드리아 전구체는 메발론산(MVA) 경로에 의해 생산되는 반면에, 최근 발견된 메틸에리트리톨포스페이트(MET) 경로가 색소체에 위치된다. 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)는 비-메발론산, MEP 경로에 의해 탄화수소를 생산한다(도 2).
광은 MEP 경로의 조절에 가장 중요한 환경 인자이다. 1-데옥시-d-크실룰로오스-5-포스페이트 환원이성질화효소(DXR)은 속도 제한 단계이고, DXR을 인코딩하는 유전자의 발현은 광에 의해 조절된다(참조: "Expression and molecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, the first committed enzyme of the 2-c-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway". Carretero-Paulet 등, Plant Physiology. 2002. 129: 1581-1591).
또 다른 예는 단세포 녹 조류인 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 카로테노이드 생합성 효소를 인코딩하는 유전자의 청색-광 활성이다. PDS, HDS, PSY 및 ZDS와 같은 카로테노이드 생합성 효소를 인코딩하는 유전자를 보여주는 마이크로어레이(Microarray) 및 정량 PCR 분석은 매우 낮은 조도의 백색광(0.01 μmol/m2s) 및 청색광에 의해 활성화된다. 청색광 수용자인 포토트로핀(phototropin)을 시사하는 추가적인 증거는 카르테노이드 생합성을 위해 청색-광 활성 유전자의 발현을 수반한다는 것이다(참조: Phototropin involvement in the expression of genes encoding chlorophyll and carotenoid biosynthesis enzymes and LHC apoproteins in Chlamydomonas reinhardtii". Im 등, The Plant Journal. 2006. 48:1-16).
일 예는 보트리오코쿠스로부터 탄화수소 생산의 증가이다. 다양한 광 강도(0.01-300 μmol/m2s) 및 상이한 광 스펙트럼(360-700 nm)은 보트리오코쿠스 배양에 가해졌고, 상이한 탄화수소 종의 양은 GC-MS에 의해 측정된다.
상이한 광 조건하에서 네오클로리스 올레아분단스( Neochloris oleabundans )의 성장
물질 및 방법
미세조류 및 배양 조건
네오클로리스 올레아분단스 균주 UTEX 1185를 텍사스 대학(Austin, TX USA)의 조류 배양 수집물로부터 얻었다. 25℃ 실온에서 2% 글루코오즈를 갖는 변형된 볼드(bold) 3N 배지 120 ml를 함유하는 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 미세조류의 최초 배양을 성장시키며, 상기 엘렌메이어 플라스크는 130 rpm의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 상에서 교대로 두 개의 40W 자연 태양광(392316, 필립스) 및 두 개의 40W 식물 및 아콰리움(392282, 필립스) 형광등 전구 하에 놓고, 알루미늄 호일로 느슨하게 감쌌다. 배양 배지(변형된 MB3N)는 탈이온수 1L 당 하기 성분을 함유했다: 0.75 g NaN03, 0.075 g K2HP04, 0.074 g MgS04 7H20, 0.025 g CaCl2 2H20, 0.176 g KH2P04, 0.025 g NaCl, 6 ml의 P-IV 금속 용액(1L의 탈이온수 중에 0.75 g Na2EDTA 2H20, 0.097g FeCl3 6H20, 0.04l g MnCl2 4H20, 0.005 g ZnCl2, 0.002g CoCl2 6H20, 0.004g Na2Mo04 2H20), 1 ml의 각각의 세 개의 비타민(pH 7.8 50 mM HEPES에 각각 용해된 O.l mM 비타민 B12, O.l mM의 비오틴, 6.5 mM의 티아민). 배지를 고압살균하기 이전에 20% KOH로 배지의 최종 pH를 7.5로 조종했다. 비타민 용액을 냉각된 고압살균된 배지에 첨가했다. 일단 최초 배양이 특정 융합점에 도달한 경우, Genesys 10 UV 분광 광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 680 nm 및 750 nm에서 광학 밀도(OD)로 이의 농도를 측정했다.
실험 과정 및 성장 측정
광의 세 개의 상이한 파장(백색, 청색 및 적색)을 시험했다. LED 광을 Super Bright LEDs, Inc.로부터 구입했다(백색: RL5-W3030, 청색: RL5-B2430, 적색: RL5-R1330). 각각의 광 파장에 대하여, 네 개의 상이한 조건을 중복해서 하기와 같이 세팅했다:
1-2. 변형된 MB3N + 글루코오스 결여 + 어둠
3-4. 변형된 MB3N + 글루코오스 결여 + 어둑한 광
5-6. 변형된 MB3N + 2% 글루코오스 + 어둠
7-8. 변형된 MB3N + 2% 글루코오스 + 어둑한 광.
120 ml 세포 배양의 최종 부피를 함유하는 총 여덟 개의 250 ml 엘렌메이어 플라스크를 각각의 조건에 대하여 750 nm에서(~1.1 x 106세포/ml) OD 0.1의 초기 세포 농도를 갖도록 제조했다. 광의 강도를 백색 광에 대하여 3-4 μmol/m2s 광자, 청색광에 대하여 2-3 μmol/m2s 광자, 및 적색 광에 대하여 1-2 μmol/m2s 광자로 세팅했다. 오비탈 쉐이커를 135 rpm으로 세팅했다. 2주 동안 실온에서 실험을 수행했다. 24시간마다 각각의 플라스크로부터 1 ml의 세포 배양을 수득해서 Thermo Fishcer Sciientific(Waltham, MA USA)로부터의 Genesys 10 UV 분광 광도계를 사용하여 680 nm 및 750 nm에서 OD를 측정함으로써 세포 농도를 측정했다. 시간에 따른 배양 광학 밀도의 대수를 그래프로 나타냄으로써 특정 성장 속도를 결정했다(도 3). 낮은 조도의 적색, 백색 또는 청색, 및 글루코오스의 조합은 대조군에 비해 향상된 성장 속도를 가져온다.
상이한 광 조건하에서 보트리오코쿠스 수데티커스( Botryococcus sudeticus )의 성장
물질 및 방법
균주 및 배지
보트리오코쿠스 수데티커스 균주 UTEX 2629를 텍사스 대학(Austin, TX USA)의 조류 배양 수집물로부터 얻었다. 25℃ 실온, 어둑한 광(4-5 μmol/m2s 광자)조건에서, 2% 글루코오스를 갖는 변형된 BG11 배지 120 ml를 함유하는, 130 rpm의 오비탈 쉐이커 상에 있는 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 보존 배양을 성장시켰다. 어둑한 조명은 두 개의 상이한 전구로 구성되며, 이는 40W의 자연 태양광(392316, 필립), 및 40W의 식물 및 아쿼리움 형광등 전구(392282 필립스)이다. 1L의 배양 배지(변형된 BG-11)는 1O mM HEPES (pH 7.8), 1.5 g NaN03, 0.04 g K2HPO4, 0.06 g MgS04 7H20, 0.036 g CaCl2 2H20, 0.006 g 시트르산 H20, 0.0138 g 구연산 철 암모늄, 0.001 g Na2EDTA 2H20, 0.02 g Na2C03, 2.86 mg H3B03, 1.81 mg MnCl2 4H20, 0.22 mg ZnS04 7H20, 0.39 mg Na2Mo04 2H20, 0.079 mg CuS04 5H20, 0.0494 mg Co(N03)2 6H20, 0.5 g 카세인 가수 분해물, 및 1 ml의 각각의 세 개의 비타민 (pH 7.8 50 mM HEPES에 각각 용해된 O.l mM 비타민 B12, O.l mM의 비오틴, 6.5 mM의 티아민)를 함유했다. 20% KOH로 배지의 최종 pH를 7.8로 조정했다.
실험 과정 및 성장 측정
광의 세 개의 상이한 파장(백색, 청색 및 적색)을 시험했다. LED 광을 Super Bright LEDs, Inc.로부터 구입했다(백색: RL5-W3030, 청색: RL5-B2430, 적색: RL5-R1330). 각각의 광 파장에 대하여, 네 개의 상이한 조건을 중복해서 하기와 같이 세팅했다:
1-2. 변형된 BG-11 + 글루코오스 결여 + 어둠
3-4. 변형된 BG-11 + 글루코오스 결여 + 어둑한 광
5-6. 변형된 BG-11 + 2% 글루코오스 + 어둠
7-8. 변형된 BG-11 + 2% 글루코오스 + 어둑한 광.
120 ml 세포 배양의 최종 부피를 함유하는 총 여덟 개의 250 ml 엘렌메이어 플라스크를 각각의 조건에 대하여 750 nm에서(~1.1 x 106세포/ml) OD 0.1의 초기 세포 농도를 갖도록 제조했다. 광의 강도를 백색 광에 대하여 3-4 μmol/m2s 광자, 청색광에 대하여 2-3 μmol/m2s 광자, 및 적색 광에 대하여 1-2 μmol/m2s 광자로 세팅했다. 오비탈 쉐이커를 135 rpm으로 세팅했다. 2주 동안 실온에서 실험을 수행했다. 24시간마다 각각의 플라스크로부터 1 ml의 세포 배양을 수득해서 Thermo Fishcer Sciientific(Waltham, MA USA)로부터의 Genesys 10 UV 분광 광도계를 사용하여 680 nm 및 750 nm에서 OD를 측정함으로써 세포 농도를 측정했다. 시간에 따른 배양 광학 밀도의 대수를 그래프로 나타냄으로써 특정 성장 속도를 결정했다(도 4). 낮은 조도의 적색, 백색 또는 청색, 및 글루코오스의 조합은 대조군에 비해 향상된 성장 속도를 가져온다.
보트리오코쿠스 브라우니 ( Botryococcus braunii ): 조절된 조도를 이용한 발효
물질 및 방법
균주 및 배지
보트리오코쿠스 브라우니 균주 UTEX 2441를 텍사스 대학(Austin, TX USA)의 조류 배양 수집물로부터 얻었다. 25℃ 실온, 어둑한 광(4-5 μmol/m2s 광자)조건에서, 2% 글루코오스를 갖는 변형된 BG11 배지 120 ml를 함유하는, 130 rpm의 오비탈 쉐이커 상에 있는 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 보존 배양을 성장시켰다. 어둑한 조명은 두 개의 상이한 전구로 구성되며, 이는 40W의 자연 태양광(392316, 필립), 및 40W의 식물 및 아쿼리움 형광등 전구(392282 필립스)이다. 1L의 배양 배지(변형된 BG-11)는 1O mM HEPES (pH 7.8), 1.5 g NaN03, 0.04 g K2HPO4, 0.06 g MgS04 7H20, 0.036 g CaCl2 2H20, 0.006 g 시트르산 H20, 0.0138 g 구연산 철 암모늄, 0.001 g Na2EDTA 2H20, 0.02 g Na2C03, 2.86 mg H3B03, 1.81 mg MnCl2 4H20, 0.22 mg ZnS04 7H20, 0.39 mg Na2Mo04 2H20, 0.079 mg CuS04 5H20, 0.0494 mg Co(N03)2 6H20, 0.5 g 카세인 가수 분해물, 및 1 ml의 각각의 세 개의 비타민 (pH 7.8 50 mM HEPES에 각각 용해된 O.l mM 비타민 B12, O.l mM의 비오틴, 6.5 mM의 티아민)를 함유했다. 20% KOH로 배지의 최종 pH를 7.8로 조정했다.
실험 과정 및 성장 측정
광의 세 개의 상이한 파장(백색, 청색 및 적색)을 시험했다. LED 광을 Super Bright LEDs, Inc.로부터 구입했다(백색: RL5-W3030, 청색: RL5-B2430, 적색: RL5-R1330). 각각의 광 파장에 대하여, 네 개의 상이한 조건을 중복해서 하기와 같이 세팅했다:
1-2. 변형된 BG-11 + 글루코오스 결여 + 어둠
3-4. 변형된 BG-11 + 글루코오스 결여 + 어둑한 광
5-6. 변형된 BG-11 + 2% 글루코오스 + 어둠
7-8. 변형된 BG-11 + 2% 글루코오스 + 어둑한 광.
120 ml 세포 배양의 최종 부피를 함유하는 총 여덟 개의 250 ml 엘렌메이어 플라스크를 각각의 조건에 대하여 750 nm에서(~1.1 x 106세포/ml) OD 0.1의 초기 세포 농도를 갖도록 제조했다. 광의 강도를 백색 광에 대하여 3-4 μmol/m2s 광자, 청색광에 대하여 2-3 μmol/m2s 광자, 및 적색 광에 대하여 1-2 μmol/m2s 광자로 세팅했다. 오비탈 쉐이커를 135 rpm으로 세팅했다. 2주 동안 실온에서 실험을 수행했다. 2일마다 각각의 플라스크로부터 5 ml의 세포 배양 각각을 얻어서 건조 세포 중량(DCW)으로 세포 성장을 측정했다. 시간에 대한 배양 DCW를 그래프로 도시함으로써 특정 성장 속도를 결정했다(도 5).
나일 레드(Nile red)를 사용하여 중성 지질의 형광 측정
1 ml의 조류 서스펜션에 아세톤(250 μg/ml) 중의 4 μl의 나일 레드 용액을 첨가했다. 실온에서 10분간 배양하는 동안 혼합물을 2회 와류 발생(vortex)시켰다. 배양 후에, 200 μl의 염색된 조류 샘플을 96 웰 플레이트 내의 웰 각각 안으로 옮겼다. 530 nm 방출을 차단하는 필터를 갖는 분자 장치 96 웰 플레이트 분광형광계 상에서 490 nm 여기 및 585 nm 방출 파장으로 형광을 측정했다. 조류 샘플의 상대적 형광 강도를 결정하기 위해서, 블랭크(blank)(배지 내에 나일 레드만 있음)를 형광 강도로부터 차감했다.
결과
적색 광 + 글루코오스는 어둠 속에서 종속 영양 배양(어둠 + 글루코오스)에 비해 UTEX 2441의 성장 속도를 35% 증가시켰다(도 5). 또한, 지질 수준도 대조군에 비해 적색 광 조건 하에서 52% 증가시켰다(도 6).
클라미도모나스 레인하드티 ( Chlamydomonas reinhardtii ): 조절된 조도를 이용한 발효
물질 방법
균주 및 배지
클라미도모나스 레인파드티 균주 UTEX 2243를 텍사스 대학(Austin, TX USA)의 조류 배양 수집물로부터 얻었다. 25℃ 실온, 어둑한 광(4-5 μmol/m2s 광자)조건에서, 120 ml TAP 배지를 함유하는, 130 rpm의 오비탈 쉐이커 상에 있는 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 보존 배양을 각각 성장시켰다. 어둑한 조명은 두 개의 상이한 전구(40W의 자연 태양광(392316, 필립), 및 40W의 식물 및 아쿼리움 형광등 전구(392282 필립스))로 구성된다. 1L의 배양 배지(TAP)는 2.42 g Tris, 25 ml의 TAP 식염수(15 g NH4Cl, 4 g MgS04 7H20, 2 g CaCl2 2H20), 0.375 ml 인산염 용액(100 ml 물 중에 28.8 g K2HP04, 14.4 g KH2P04), 1 ml 헌터의 미량 원소 용액(Hutner's trace elements solution)(1L의 미량 원소 용액은 50 g EDTA 디소듐 염, 22 g ZnS04 7H20, 11.4 g H3B04, 5.06 g MnCl2 4H20, 1.6l g CoCl2 6H20, 1.57 g CuS04 5H20, 1.10 (NH4)6Mo7024 4H20, 4.99g FeS04 7H20을 함유하고, KOH 또는 HCl 중 어느 하나를 사용하여 pH를 7.0으로 조절됨) 및 1 ml의 빙초산을 함유했다. 20% KOH로 배지의 최종 pH를 7.8로 조정했다.
실험 과정 및 성장 측정
LED 광을 Super Bright LEDs, Inc로 부터 구입했다(RL5-W3030). 네 개의 상이한 조건을 중복해서 하기와 같이 세팅했다:
1-2. TP (아세트산 결여) + 어둠
3-4. TP (아세트산 결여) + 어둑한 광
5-6. TAP (아세트산) + 어둠
7-8. TAP (아세트산) + 어둑한 광.
120 ml 세포 배양의 최종 부피를 함유하는 총 여덟 개의 250 ml 엘렌메이어 플라스크를 각각의 조건에 대하여 1.0 x 105 세포/ml의 초기 세포 농도를 갖도록 제조했다. 오비탈 쉐이커를 140 rpm으로 세팅했다. 실험을 1주간 실온에서 수행했다. 매일 마다 각각의 플라스크로부터 500 μl의 세포 배양을 얻어서 건조 세포 중량(DCW)으로 세포 성장을 측정했다. 세포를 세기 이전에 루골 용액(lugol solution)(1:20)을 사용하여 세포를 편모탈착상상태(deflagellates)로 만든다. 시간에 대한 세포 수를 그래프로 도시함으로써 특정 성장 속도를 결정했다. 낮은 조도의 백색 광 및 TAP의 조합은 대조군에 비해 향상된 성장 속도를 가져왔다(도 7).
낮은 조도의 광을 이용하는 미세조류의 배양
물질 및 방법
균주 및 배지
미세조류 균주(예, 클라미도모나스, 보트리오코쿠스, 네오클로리스, 남조식물, 녹조식물, 홍조식물, 클로라라크니오식물, 착편모조류, 유클레나식물, 부등편모조식물, 규조류 및/또는 상기 설명에서 설명된 것들)를 예를 들어, 텍사스 대학(Austin, TX USA)의 조류 배양 수집물로부터 얻었다. 25℃ 실온, 어둑한 광(4-5 μmol/m2s 광자)조건에서, 적절한 배지(예, 제조자의 설명서 참조)를 함유하는, 130 rpm의 오비탈 쉐이커 상에 있는 예를 들어, 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 보존 배양을 각각 성장시켰다. 적절한 탄소원, 예를 들어 글루코오스를 배양 배지에 사용했다. 어둑한 조명은 두 개의 상이한 전구, 예를 들어, 40W의 자연 태양광(392316, 필립), 및 40W의 식물 및 아쿼리움 형광등 전구(392282 필립스)로 구성된다. 특정 균주에 대한 적절한 pH로 배지의 최종 pH를 조정했다(예, 제조자의 설명서 참조).
실험 과정 및 성장 측정
세 개의 상이한 파장의 광(백색, 청색 및 적색)을 시험했다. LED 광을 예를 들어, Super Bright LEDs, Inc.로부터 구입했다(백색: RL5-W3030, 청색: RL5-B2430, 적색: RL5-R1330). 각각의 광 파장에 대하여, 네 개의 상이한 조건을 중복해서 하기와 같이 세팅했다:
1-2 탄소 결여 + 어둠
3-4 탄소 결여 + 어둑한 빛
5-6 탄소 + 어둠
7-8 탄소 + 어둑한 빛 .
120 ml 세포 배양의 최종 부피를 함유하는 총 여덟 개의 250 ml 엘렌메이어 플라스크를 각각의 조건에 대하여 예를 들어, 750 nm에서(~1.1 x 106세포/ml) OD 0.1의 초기 세포 농도를 갖도록 제조했다. 최적 광 강도(예를 들어, 0.01-300 μmol 광자/m2s) 및 상이한 광 스펙트럼(예를 들어, 360-700 nm) 뿐만 아니라 상이한 광 시간(예를 들어, 9-16 시간의 광)을 시험했다. 광의 강도를 예를 들어, 백색 광에 대하여 3-4 μmol/m2s 광자, 청색광에 대하여 2-3 μmol/m2s 광자, 및 적색 광에 대하여 1-2 μmol/m2s 광자로 세팅했다. 다양한 탄소원, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스를 다양한 농도, 예를 들어, 1%, 2% 또는 3%의 배양 배지의 농도에서 시험했다. 오비탈 쉐이커의 속도를 예를 들어, 150 rpm으로 세팅했다. 실험을 1주 미만, 1주, 2주, 3주 또는 그 이상의 주 동안 실온에서 수행했다. 각각의 세포 배양의 부분 표본을 하루 내지 이틀마다 각각의 플라스크로부터 수득하여 세포 성장을 예를 들어, 건조 세포 중량(DCW)으로 측정했다. 시간에 대한 배양 DCW를 그래프로 도시함으로써 특정 성장 속도를 결정했다.
관심 물질의 측정
배지 내의 관심 물질(탄화수소, 지질 등)의 양을 당해 분야에 알려진 표준 방식 예를 들어, 상기 설명된 바와 같이 GC-MS 또는 나일 레드를 사용하여 측정했다. 예를 들어, 1 ml의 조류 서스펜션에, 아세톤(250 μg/ml) 중의 4 μl의 나일 레드 용액을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 배양 도중에 편모탈착상상태(deflagellates)로 만들었다. 배양 후에, 100 내지 200 μl의 염색된 조류 샘플을 96-웰 플레이트 내의 개별적인 웰 안으로 옮겼다. 형광을 예를 들어 530 nm 방출을 차단하는 필터를 갖는 분자 장치 96 웰 플레이트 분광형광계 상에서 490 nm 여기 및 585 nm 방출 파장으로 측정했다. 조류 샘플의 상대적 형광 강도를 결정하기 위해서, 블랭크(blank)(배지 내에 나일 레드만 있음)를 형광 강도로부터 차감했다.
결과
탄소원과 함께 적색, 백색, 및/또는 청색 광의 사용은 대조군에 비해 미세조류 균주의 성장 속도를 증가시켰다. 실험 미세조류 균주(탄소원과 함께 적색, 백색, 및/또는 청색 광의 사용)에 의해 생산된 관심물질(예를 들어, 탄화수소 또는 지질)의 수준을 대조군에 비해 증가했다.
본 발명이 바람직한 실시예 및 다양한 대안적인 실시예를 참조로 하여 구체적으로 보여지고 설명되었지만, 형태 및 구체화에 다양한 변화는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
본원에서 인용된 모든 참조문헌, 공고된 특허문헌 및 특허 출원서는 모든 목적을 위해 이들의 전체가 참조로서 포함된다.

Claims (47)

  1. 미세조류(microalgae)가 성장하기에 충분한 시간의 기간 동안 종속 영양 성장 조건 하에서 미세조류를 배양하는 단계를 포함하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배(cultivating)하는 방법에 있어서,
    상기 종속 영양 성장 조건은 탄소원을 포함하는 배지를 포함하며, 그리고
    상기 종속 영양 성장 조건은 0.01 내지 4 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 백색광, 0.01 내지 3 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 청색광 및 0.01 내지 2 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 적색광으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광을 더 포함하는 것을 특징으로 하며,
    상기 미세조류는 광 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 보트리오코쿠스(Botryococcus) 균주이며, 탄소원은 글루코오스인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 보트리오코쿠스 수데티커스(Botryococcus sudeticus) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 보트리오코쿠스 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 UTEX 2629 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 UTEX 2441 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 네오클로리스 올레아분단스(Neochloris oleabundans) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 네오클로리스(Neochloris) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    미세조류는 UTEX 1185 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 클라미도모나스(Chlamydomonas) 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    미세조류는 UTEX 2243 균주인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 있어서,
    탄소원은 글루코오스인것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    탄소원은 고정 탄소원, 글루코오스, 프룩토오소, 수크로오스, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스, 람노오스, N-아세틸글루코사민, 글리세롤, 플로리도시드, 글루쿠론산, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로오스계 물질, 사탕수수, 사탕무, 락토오스, 유장(milk whey), 및 당밀로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 1 항에 있어서,
    광은 인조 광원에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서,
    광은 인조광인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
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  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제 1 항에 있어서,
    미세조류로부터 물질을 생산하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    물질은 다당류, 안료, 지질, 또는 탄화수소인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    물질은 탄화수소인 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서,
    물질을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  32. 제 28 항에 있어서,
    물질을 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  33. 제 28 항에 있어서,
    물질을 가공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서,
    물질을 가공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    물질을 가공하는 단계는 가공된 물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    가공된 물질은 연료, 바이오디젤, 제트 연료, 화장료, 약제, 계면활성제 및 재생 가능한 디젤로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  37. 제 1 항에 있어서,
    미세조류의 성장 속도는 미세조류가 성장하기에 충분한 시간의 기간 동안 제 2 종속 영양 성장 조건하에서 배양된 제 2 미세조류에 비해 더 높으며, 상기 제 2 종속 영양 성장 조건은 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하며, 그리고 상기 제 2 종속 영양 성장 조건은 낮은 조도의 광을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 종속 영양 성장할 수 있는 미세조류를 재배하는 방법.
  38. 탄소원 및 0.01 내지 4 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 백색광, 0.01 내지 3 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 청색광 및 0.01 내지 2 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 적색광으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광의 존재하에서, 복수의 미세조류 세포를 배치하는 단계를 포함하고, 상기 미세조류 세포는 광 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법.
  39. 물질을 생산할 수 있는 미세조류를 제공하는 단계;
    탄소원을 포함하는 배지 내에서 미세조류를 배양하는 단계;
    0.01 내지 4 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 백색광, 0.01 내지 3 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 청색광 및 0.01 내지 2 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 적색광으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광을 미세조류에게 가하는 단계; 및
    미세조류가 물질을 건조 세포 중량으로 10 중량% 이상 축적하도록 방치하는 단계를 포함하고
    상기 미세조류 세포는 광 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 물질을 제조하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    물질을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 물질을 제조하는 방법.
  41. 바이오리액터(bioreactor);
    바이오리액터 안에 위치되며 탄소원을 포함하는 배양 배지;
    배양 배지 내에 위치되며 종속 영양 성장에 적합한 미세조류;
    바이오리액터에 작용하도록 결합되며, 0.01 내지 4 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 백색광, 0.01 내지 3 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 청색광 및 0.01 내지 2 μmol 광자/m2s의 조도를 갖는 적색광으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광을 생산하는 광원을 포함하고
    상기 미세조류 세포는 광 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터 시스템.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 제 41 항에 있어서,
    광원으로부터의 광은 인조광을 포함하며, 상기 인조광은 발광소자(LED) 또는 형광등에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 바이오리액터 시스템.
  45. 제 44 항에 있어서,
    LED 또는 형광등을 구동하기에 충분한 전력 공급기를 더 포함하며, 상기 전력 공급기는 바이오리액터에 작동하도록 결합되고; 광 제어기는 전력 공급기에 작동하도록 결합되며, 상기 광 제어기는 LED 또는 형광등에 의해 방충되는 광의 강도 및 파장을 제어하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 바이오리액터 시스템.
  46. 삭제
  47. 제 44 항에 있어서,
    LED는 투명하고 보호되는 광 구조체 내에 실장되는 것을 특징으로 하는 바이오리액터 시스템.
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