BR112012005844B1 - Método para cultivar microalgas capazes de crescimento heterotrófico, método para fabricar um material, e sistema de biorreator - Google Patents

Método para cultivar microalgas capazes de crescimento heterotrófico, método para fabricar um material, e sistema de biorreator Download PDF

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Abstract

método para cultivar microalgas capazes de crescimento heterotrófico, método para fabricar um material, e sistema de biorreator são providos neste documento biorreatores e métodos para cultivar microalgas. o biorreator e os métodos incluem características e modificações para melhorar a eficiência do crescimento heterotrófico pela provisão de um sinal luminoso.

Description

MÉTODO PARA CULTIVAR MICROALGAS CAPAZES DE CRESCIMENTO HETEROTRÓFICO, MÉTODO PARA FABRICAR UM MATERIAL, E SISTEMA DE BIORREATOR
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório No. US 61/243.593, depositado em 18 de setembro de 2009 e Pedido Provisório No. US 61/359.726, depositado em 29 de junho de 2010, as divulgações inteiras dos quais são incorporadas pela referência em suas totalidades para todos os fins.
CAMPO
A invenção refere-se aos métodos, meios e sistemas de fermentação de micro-organismos, por exemplo, microalgas. A invenção pode ser usada em indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de alimentos, assim como para obter óleo e biocombustível de microalgas.
HISTÓRICO
Recentemente, foi dirigida atenção à aplicação de microalgas na produção de uma variedade de materiais incluindo lipídeos, hidrocarbonetos, óleo, polissacarídeos, pigmentos e biocombustíveis.
Um dos métodos convencionais para cultivar microalgas é cultivá-las heterotroficamente em um sistema fechado, sem luz. Técnicas foram desenvolvidas para a produção em grande escala de microalgas aquáticas em condições de crescimento heterotrófico, utilizando carbono orgânico em vez de luz como fonte de energia. Por exemplo, as Pat. Nos. US 3.142.135 e 3.882.635 descrevem processos para a produção heterotrófica de proteínas e pigmentos a partir de algas como o Chlorella, Spongiococcum, e Prototheca. Além disso, culturas de algas heterotróficas podem alcançar densidades muito maiores do que culturas fotoautotróficas.
Entretanto, o pedido de patente acima não pode ser
Petição 870180160141, de 07/12/2018, pág. 8/16
2/82 aplicado a todas as microalgas porque apenas um número limitado de cepas de microalgas pode crescer em condições heterotróficas. Tentativas para cultivar microalgas em condições heterotróficas frequentemente envolvem triagem de 5 cepas que possam crescer em condições heterotróficas, ou modificação genética de organismos para permitir o crescimento em tais condições.
As microalgas que contêm tanto um sistema de transporte adequado para o açúcar e que podem crescer 10 naturalmente em condições heterotróficas frequentemente mostram taxas de crescimento lentas ou baixa produção de matérias primas de interesse comercial, visto que elas evoluíram muitos anos para utilizar a luz solar como um sinal ambiental para controle de aspectos do metabolismo, assim 15 como a energia gerada através da fotossíntese.
A maioria dos organismos fotossintéticos, incluindo as microalgas, usa a luz como um sinal ambiental para otimizar-se para a sobrevivência e crescimento. Os sinais luminosos são percebidos por diferentes fotorreceptores 20 incluindo fotorreceptores do vermelho/vermelho distante (fitocromos) e fotorreceptores da luz azul (criptocromos e NPHs) . A luz serve como um sinal ambiental que regula processos fisiológicos e de desenvolvimento e provê a energia que alimenta a redução de carbono inorgânico. Entretanto, em 25 certas condições a luz também tem o potencial para ser tóxica. A fotoinibição ocorre quando o fluxo de fótons absorvido pelos cloroplastos é muito elevado (em condições de luz elevadas) ou quando o influxo de energia luminosa excede a capacidade de consumo (em condições mixotróficas onde uma 30 célula usa carbono reduzido como fonte de energia). Em condições mixotróficas, organismos fotossintéticos mostram fotoinibição em uma intensidade luminosa muito menor do que em condições autotróficas, visto que os elétrons absorvidos
3/82 através do aparelho fotossintético não podem ser usados eficientemente devido a um mecanismo de retroalimentação no ciclo de Calvin.
A energia luminosa absorvida pode resultar no acúmulo de moléculas de clorofila excitadas dentro do colchão de pigmento (pigment bed) e danos do fotossistema. Moléculas excitadas de clorofila que se acumulam no colchão de pigmento em consequência da excitação excessiva também podem estimular a produção de espécies reativas de oxigênio como superóxidos, radicais hidroxila e oxigênio singleto.
SUMÁRIO
Ê divulgado neste documento um método para cultivar microalgas capazes de crescimento heterotrófico, incluindo: incubar as microalgas em uma condição de crescimento heterotrófico por um período de tempo suficiente para permitir que as microalgas cresçam, em que a condição de crescimento heterotrófico inclui meios que incluem uma fonte de carbono, e em que a condição de crescimento heterotrófico inclui adicionalmente uma baixa irradiância de luz.
Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Botryococcus, a fonte de carbono é glicose, e a baixa irradiância da luz está entre 1-10 μπτοί fotons m s .
Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Botryococcus sudeticus. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Botryococcus. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa UTEX 2629. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Botryococcus braunii. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa UTEX 2441. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Neochloris oleabundans. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Neochloris. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa UTEX 1185. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa de Chlamydomonas reinhardtii. Em algumas realizações, a microalga é uma cepa
4/82 de Chlamydomonas. Em algumas realizações, a microalga é uma
cepa UTEX 2243. Em algumas realizações, as microalgas
compreendem um fotorreceptor.
Em algumas realizações, a fonte de carbono é
glicose. Em algumas realizações, a fonte de carbono é
selecionada do grupo que consiste em uma fonte de carbono
fixa, glicose, frutose, sacarose, galactose, xilose, manose, ramnose, N-acetilglicosamina, glicerol, floridosídeo, ácido glicurônico, amido de milho, material celulósico despolimerizado, cana de açúcar, beterraba sacarina, lactose, soro de leite e melaço.
Em algumas realizações, a luz é produzida por uma fonte de luz natural. Em algumas realizações, a luz é luz solar natural. Em algumas realizações, a luz compreende todo o espectro luminoso ou um comprimento de onda específico de luz. Em algumas realizações, a luz é produzida por uma fonte de luz artificial. Em algumas realizações, a luz é luz artificial. Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz está entre 0,01-1 pmol fotons m s . Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz está entre 1-10 pmol fótons m'2 s1-!. Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz está entre 10-100 pmol fótons m2 s’1. Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz está entre 100-300 pmol fótons m'2 s'1. Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz está entre 100-300 pmol fotons m s -1. Em algumas realizações, a intensidade da baixa irradiância de luz é 3-4 pmol/m2s’1 fótons, 2-3 pmol/m2s'1 fótons, 1-2 pmol/m2s’1 fótons ou 3-5 pmol/m2s1 fótons.
Em algumas realizações, o método inclui adicionalmente produzir um material a partir das microalgas. Em algumas realizações, o material é um polissacarídeo, um pigmento, um lipídeo ou um hidrocarboneto. Em algumas
5/82 realizações, o material é um hidrocarboneto.
Em algumas realizações, o método inclui adicionalmente recuperar o material. Em algumas realizações, o método inclui adicionalmente extrair o material.
Em algumas realizações, o método inclui adicionalmente processar o material. Em algumas realizações, o processamento do material produz um material processado. Em algumas realizações, o material processado é selecionado do grupo que consiste em um combustível, biodiesel, combustível 10 de jato, um cosmético, um agente farmacêutico, um tensoativo e um diesel renovável.
Em algumas realizações, a taxa de crescimento das microalgas nos métodos acima é maior do que a de uma segunda microalga incubada em uma segunda condição de crescimento 15 heterotrófico por um período de tempo suficiente para permitir que a microalga cresça, em que a segunda condição de crescimento heterotrófico inclui meios de crescimento que compreendem uma fonte de carbono, e em que a segunda condição de crescimento heterotrófico não inclui uma baixa irradiância 20 de luz.
Também descrito neste documento, é um método de cultivo de microalgas, incluindo a colocação de uma • pluralidade de células de microalgas na presença de uma fonte de carbono e de uma baixa irradiância de luz.
Também descrito neste documento é um método de fabricação de um material, incluindo: prover microalgas capazes de produzir o material; cultivar as microalgas em meios, em que os meios incluem uma fonte de carbono; aplicar uma baixa irradiância de luz às microalgas; e permitir que as 30 microalgas acumulem pelo menos 10% de seu peso celular seco como o material. Em algumas realizações, o método inclui adicionalmente recuperar o material.
Também é descritos neste documento um sistema de
6/82 biorreator, incluindo: um biorreator; meios de cultura incluindo uma fonte de carbono, em que os meios de cultura estão localizados dentro do biorreator; microalgas adaptadas para o crescimento heterotrófico, em que as microalgas estão 5 localizadas nos meios de cultura; e uma fonte de luz, em que a fonte de luz produz uma baixa irradiância de luz, e em que a fonte de luz está acoplada operativamente ao biorreator.
»>- Em algumas realizações, a luz da fonte de luz inclui todo o espectro luminoso ou um comprimento de onda 10 específico de luz. Em algumas realizações, a luz da fonte de luz inclui luz solar natural coletada por um coletor de energia solar operativamente acoplado ao biorreator, e em que a luz é transmitida para o interior do biorreator através de uma fibra óptica operativamente acoplada ao coletor solar e 15 ao biorreator. Em algumas realizações, a luz da fonte de luz inclui luz artificial, em que a luz artificial é produzida por um diodo emissor de luz (LED) ou uma luz fluorescente. Em algumas realizações, o sistema inclui adicionalmente uma fonte de alimentação suficiente para alimentar o LED ou luz 20 fluorescente, em que a fonte de alimentação está operativamente acoplada ao biorreator; e um controlador de luz operativamente acoplado à fonte de alimentação, em que o . controlador de luz é adaptado para controlar a intensidade e o comprimento de onda da luz emitida pelo LED ou luz 25 fluorescente. Em algumas realizações, a fibra óptica é montada em uma estrutura transparente e protetora para luz. Em algumas realizações, o LED é montado em uma estrutura transparente e protetora para luz.
BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS
Essas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão melhor compreendidas com relação à seguinte descrição e desenhos que a acompanham, onde:
7/82
A Figura 1 é uma realização de um biorreator.
A Figura 2 ilustra a via do isoprenoide/ carotenoide.
As Figuras 3A-C mostram o crescimento de UTEX 1185
em condições de luz branca, azul e vermelha. 0 eixo X é
mostrado em dias. Gli significa glicose.
As Figuras 4A-C mostram o crescimento de UTEX 2629
em condições de luz branca, azul e vermelha. 0 eixo X é
mostrado em dias. Gli significa glicose.
As Figuras 5A-C mostram o crescimento de UTEX 2441
em condições de luz branca, azul e vermelha. Gli significa
glicose.
A Figura 6 mostra a produção de lipídeos por UTEX 2441 em condições de luz vermelha. LG significa luz + glicose; EG significa escuro + glicose.
A Figura 7 mostra o crescimento de UTEX 2243 em condições de luz branca.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Termos utilizados nas reivindicações e relatório descritivo são definidos como estabelecido abaixo salvo especificação em contrário.
Axênica(o) significa uma cultura de um organismo que esteja livre de contaminação por outros organismos vivos.
Biodiesel é um éster alquílico de ácido graxo produzido biologicamente adequado para uso como combustível em um motor a diesel.
O termo biomassa refere-se ao material produzido pelo crescimento e/ou propagação de células. A biomassa pode conter células e/ou conteúdo intracelular, assim como material extracelular. O material extracelular inclui, entre outros, compostos secretados por uma célula.
Biorreator significa um compartimento ou compartimento parcial em que células são cultivadas,
8/82 opcionalmente em suspensão. A Figura 1 é um exemplo de um biorreator. Fotobiorreator refere-se a um recipiente, pelo menos parte do qual é pelo menos parcialmente transparente ou parcialmente aberta, permitindo assim que a luz passe, no qual uma ou mais células de microalgas são cultivadas. Os fotobiorreatores podem ser fechados, como no caso de um saco de polietileno ou frasco de Erlenmeyer, ou podem ser abertos para o ambiente, como no caso de um tanque ao ar livre.
Como usado neste documento, um catalisador refere-se a um agente, como uma molécula ou complexo macromolecular, capazes de facilitar ou promover uma reação química de um reagente para um produto sem se tornar uma parte do produto. Um catalisador aumenta assim a taxa de uma reação, após o que, o catalisador pode agir sobre outro reagente para formar o produto. Um catalisador geralmente reduz a energia de ativação global necessária para a reação, tal que ela prossiga mais rapidamente ou a uma temperatura inferior. Assim, o equilíbrio da reação pode ser atingido mais rapidamente. Exemplos de catalisadores incluem enzimas, que são catalisadores biológicos, calor, que é um catalisador não biológico, e catalisadores metálicos usados em processos de refino de óleo fóssil.
Material celulósico significa os produtos da digestão da celulose, incluindo glicose e xilose e opcionalmente compostos adicionais como dissacarídeos, oligossacarídeos, lignina, furfurais e outros compostos. Exemplos não limitantes de fontes de material celulósico incluem bagaços de cana-de-açúcar, polpa de beterraba sacarina, forragem de milho, lascas de madeira, serragem e switchgrass.
termo co-cultivo e suas variantes, como cocultivar, referem-se à presença de dois ou mais tipos de células no mesmo biorreator. Os dois ou mais tipos de células
9/82 podem ambos ser micro-organismos, como microalgas, ou podem ser uma célula de microalgas cultivada com um tipo de célula diferente. As condições de cultivo podem ser aquelas que promovem o crescimento e/ou a propagação de dois ou mais 5 tipos de células ou aqueles que facilitam o crescimento e/ou proliferação de um, ou um subconjunto, de duas ou mais células, enquanto mantém o crescimento celular para o restante.
termo cofator é usado neste documento para se 10 referir a qualquer molécula, com exceção do substrato, que seja necessária para uma enzima realizar sua atividade !
enzimática.
O termo cultivado e suas variantes, referem-se à promoção intencional de crescimento (aumentos no tamanho da célula, conteúdos celulares e/ou atividade celular) e/ou propagação (aumentos nos números de células através de mitose) de uma ou mais células pelo uso de condições previstas de cultivo. A combinação tanto de crescimento como de propagação pode ser denominada proliferação. Uma ou mais células podem ser aquelas de um micro-organismo, como microalgas. Exemplos de condições previstas incluem o uso de um meio definido (com características conhecidas, como pH, * força iônica e fonte de carbono), temperatura especificada, tensão de oxigênio, níveis de dióxido de carbono e 25 crescimento em um biorreator. O termo não se refere ao crescimento ou propagação de micro-organismos na natureza ou de outra forma sem a intervenção humana direta, como o crescimento natural de um organismo que, por fim, torna-se fossilizado para produzir petróleo bruto geológico.
Como usado neste documento, o termo citólise refere-se à lise de células em um ambiente hipotônico. A citólise é causada por osmose excessiva, ou movimento de água, para dentro de uma célula (hiper-hidratação). A célula
10/82 não pode suportar a pressão osmótica da água em seu interior, e então explode.
Como usado neste documento, os termos vetor de
expressão ou construção de expressão referem-se a uma
5 construção de ácido nucleico, gerada de modo recombinante ou
A- sintético, com uma série de elementos de ácido nucleico
especificados que permitam a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. 0 vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido 10 nucleico. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito operacionalmente ligado a um promotor.
Gene exógeno refere-se a um ácido nucleico transformado em uma célula. Uma célula transformada pode ser 15 referida como uma célula recombinante, em que gene(s) exógeno(s) adicional(is) pode/podem ser introduzido(s). O gene exógeno pode ser de uma espécie diferente (e, portanto, heterólogo), ou da mesma espécie (e, portanto, homólogo) em relação à célula a ser transformada. No caso de um gene 20 homólogo, ele ocupa uma localização diferente no genoma da célula em relação à cópia endógena do gene. O gene exógeno pode estar presente em mais de uma cópia na célula. 0 gene exógeno pode ser mantido em uma célula como uma inserção no genoma ou como uma molécula epissomal.
Provido exogenamente descreve uma molécula provida aos meios de cultura de uma cultura de células.
Fonte de carbono fixado significa molécula(s) de carbono que contenha/contenham carbono, por exemplo, orgânico, que está presente à temperatura e pressão ambientes sob a forma sólida ou líquida.
Homogenato significa biomassa que foi fisicamente rompida.
Como usado neste documento, hidrocarboneto
11/82 refere-se a: (a) uma molécula que contém apenas átomos de hidrogênio e carbono, em que os átomos de carbono estão covalentemente ligados para formar uma estrutura principal linear, ramificada, cíclica, ou parcialmente cíclica a que 5 estão ligados os átomos de hidrogênio; ou (b) uma molécula que contém apenas principalmente átomos de hidrogênio e carbono e que pode ser convertida para conter apenas átomos de hidrogênio e carbono por uma a quatro reações químicas. Exemplos não limitantes do último incluem hidrocarbonetos 10 contendo um átomo de oxigênio entre um carbono e um átomo de hidrogênio para formar uma molécula de álcool, assim como aldeídos que contêm um único átomo de oxigênio. Os métodos para a redução de álcoois em hidrocarbonetos que contêm apenas átomos de carbono e hidrogênio são bem conhecidos.
Outro exemplo de um hidrocarboneto é um és ter, em que um grupo orgânico substitui um átomo de hidrogênio (ou mais de um) em um ácido de oxigênio. A estrutura molecular de compostos de hidrocarbonetos varia do mais simples, na forma de metano (CH4) , que é um constituinte do gás natural, ao 20 muito pesado e muito complexo, como algumas moléculas como asfaltenos encontrados no petróleo bruto, petróleo e betume. Hidrocarbonetos podem estar na forma gasosa, líquida, ou sólida, ou qualquer combinação destas formas e podem ter uma ou mais ligações duplas ou triplas entre átomos de carbono 25 adjacentes na estrutura principal. Consequentemente, o termo inclui parafina, lipídeos, alcenos e alcanos lineares, ramificados, cíclicos ou parcialmente cíclicos. Os exemplos incluem o propano, butano, pentano, hexano, octano, trioleína e esqualeno.
O termo proporção hidrogênio:carbono refere-se à proporção de átomos de hidrogênio para átomos de carbono em uma molécula em uma base de átomo para átomo. A proporção pode ser usada para referir-se ao número de átomos de carbono
12/82 e hidrogênio em uma molécula de hidrocarboneto. Por exemplo, o hidrocarboneto com a maior proporção é o metano CH4 (4:1) .
Fração hidrofóbica refere-se à porção, ou fração, de um material que é mais solúvel em uma fase hidrofóbica em comparação a uma fase aquosa. Uma fração hidrofóbica é consideravelmente insolúvel em água e geralmente não polar.
Como usado neste documento, a expressão aumenta o rendimento lipídico refere-se a um aumento na produtividade de uma cultura microbiana, por exemplo, pelo aumento do peso seco de células por litro de cultura, aumentando a percentagem de células que constituem lipídeos, ou aumentando a quantidade total de lipídeos por litro de volume de cultura por unidade de tempo.
Um promotor induzível é aquele que medeia a transcrição de um gene operacionalmente ligado em resposta a um estímulo particular.
Como usado neste documento, a expressão em ligação operacional refere-se a uma ligação funcional entre duas sequências, como uma sequência de controle (tipicamente um promotor) e a sequência ligada. Um promotor está em ligação operacional com um gene exógeno se ele pode mediar a transcrição do gene.
O termo in situ significa no local ou em sua posição original. Por exemplo, uma cultura pode conter uma primeira microalga que secreta um catalisador e um segundo micro-organismo que secreta um substrato, em que o primeiro e o segundo tipo celular produzem os componentes necessários para que uma reação química particular ocorra in situ na cocultura sem exigir separação ou processamento adicional dos materiais.
Uma concentração limitante de um nutriente é uma concentração em uma cultura que limita a propagação de um organismo cultivado. Uma concentração não limitante de um
13/82 nutriente é uma concentração que ofereça suporte à propagação máxima durante um determinado período de cultivo. Assim, o número de células produzidas durante um determinado período de cultivo é inferior na presença de uma concentração 5 limitante de um nutriente do que quando o nutriente não é limitante. Um nutriente é dito como estando em excesso em um cultivo, quando o nutriente está presente em uma concentração maior do que aquela que oferece suporte à propagação maximal.
Como usado neste documento, uma lipase é uma enzima hidrossolúvel que catalisa a hidrólise de ligações de éster em substratos lipídicos insolúveis em água. As lipases catalisam a hidrólise de lipídeos em gliceróis e ácidos graxos.
Os lipídeos são uma classe de hidrocarbonetos que são solúveis em solventes apoiares (como éter e clorofórmio) e são relativamente ou totalmente insolúveis em água. Moléculas lipídicas têm essas propriedades porque elas consistem principalmente em longas caudas de hidrocarbonetos 20 que são de natureza hidrofóbica. Exemplos de lipídeos incluem ácidos graxos (saturados e insaturados); glicerídeos ou glicerolipídeos (como monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos ou gorduras neutras, e fosfoglicerídeos ou glicerofosfolipídeos); não glicerídeos (esfingolipídeos, lipídeos de esterol incluindo colesterol e hormônios esteroides, lipídios de prenol incluindo terpenoides, álcoois graxos, ceras e policetídeos); e derivados de lipídeos complexos (lipídeos ligados a açúcar, ou glicolipídeos e lipídeos ligados a proteínas). Gorduras são um subgrupo de 30 lipídeos chamados triacilglicerídeos.
O termo baixa irradiância de luz refere-se à irradiância de luz que pode ser aplicada a um microorganismo, enquanto evita a fotoinibição significativa em
14/82 condições heterotróficas e à irradiância de luz necessária para iniciar um metabolismo ativado por luz no microorganismo. Os metabolismos ativados por luz incluem, entre outros, um ciclo de vida, um ritmo circadiano, divisão celular, uma via biossintética e um sistema de transporte.
Como usado neste documento, o termo lisado refere-se a uma solução que contém o conteúdo de células lisadas.
Como usado neste documento, o termo lise refere à ruptura da membrana plasmática e, opcionalmente, da parede celular de um organismo biológico suficiente para liberar pelo menos algum conteúdo intracelular, frequentemente por mecanismos mecânicos, virais ou osmóticos que comprometem sua integridade.
Como usado neste documento, o termo lisando refere ao rompimento da membrana celular e, opcionalmente, da parede celular de um organismo biológico ou célula suficiente para liberar pelo menos algum conteúdo intracelular.
Microalgas significa organismos microbianos eucariotos que contêm um cloroplasto e, opcionalmente, que são capazes de realizar a fotossíntese, ou um organismo microbiano procarioto capaz de realizar a fotossíntese. Microalgas incluem organismos fotoautotróficos obrigatórios, que não podem metabolizar uma fonte de carbono fixado como energia, assim como heterotróficos, que somente podem viver fora de uma fonte de carbono fixado. Microalgas podem referir-se a organismos unicelulares que se separam das células-irmãs logo após a divisão celular, como Chlamydomonas, e podem também referir-se a micróbios como, por exemplo, Volvox, que é um micróbio fotossintetizador multicelular simples de dois distintos tipos celulares. Microalgas também pode se referir às células, como Chlorella e Dunaliella. Microalgas inclui também outros
15/82 organismos fotossintetizantes microbianos que exibem adesão célula-célula, como Agmenellum, Anabaena, e Pyrobotrys. Microalgas também incluem micro-organismos heterotróficos obrigatórios que perderam a capacidade de realizar a fotossíntese, como certas espécies de algas de dinoflagelados. Outros exemplos de microalgas são descritos abaixo.
Os termos micro-organismo e micróbio são usados de modo intercambiável neste documento para se referir a organismos unicelulares microscópicos, por exemplo, microalgas.
Como usado neste documento, o termo choque osmótico refere-se à ruptura de células em uma solução após uma súbita redução da pressão osmótica. O choque osmótico é às vezes induzido para a liberação de componentes celulares dessas células em uma solução.
Polissacarídeos (também chamados de glicanos) são carboidratos constituídos por monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas. A celulose é um exemplo de um polissacarídeo que constitui certas paredes celulares vegetais. A celulose pode ser despolimerizada por enzimas para produzir monossacarídeos como xilose e glicose, assim como dissacarídeos e oligossacarídeos maiores.
Porta, no contexto de um biorreator, refere-se a uma abertura no biorreator que permite o influxo ou efluxo de materiais, como gases, líquidos e células. Portas são geralmente conectadas à tubulação que partem do biorreator.
Um promotor é definido como um arranjo de sequências de controle de ácido nucleico que dirige a transcrição direta de um ácido nucleico. Como usado neste documento, um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias perto do sítio de início de transcrição, tais como, no caso de um promotor tipo polimerase II, um elemento
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TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos repressores ou intensificadores (enhancer) distais, que podem estar localizados tanto quanto a vários milhares de pares de bases do sítio de início de transcrição.
Como usado neste documento, o termo recombinante quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína exógena ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que caso contrário são anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de forma alguma. Pelo termo ácido nucleico recombinante, neste documento, entende-se ácido nucleico, originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação de ácido nucleico, por exemplo, usando polimerases e endonucleases, sob uma forma não normalmente encontrada na natureza. Dessa forma, a ligação operacional de diferentes sequência é conseguida. Assim, um ácido nucleico isolado, em uma forma linear, ou um vetor de expressão formado in vitro pela ligação de moléculas de DNA que não estão normalmente associadas, são ambos considerados recombinantes para efeitos desta invenção. Entende-se que uma vez que um ácido nucleico recombinante seja feito e reintroduzido em uma célula hospedeira ou organismo, ele se replicará de modo não recombinante, ou seja, usando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira em vez de manipulações in vitro; entretanto, esses ácidos nucleicos, uma vez produzidos de modo recombinante, embora subsequentemente replicados de modo não recombinante, adicionalmente são considerados recombinantes para efeitos da
17/82 invenção. Da mesma forma, uma proteína recombinante é uma proteína feita usando técnicas recombinantes, ou seja, através da expressão de um ácido nucleico recombinante, como descrito acima.
Como usado neste documento, o termo diesel renovável refere-se a alcanos (como C:10:0, C12:0, C:14:0, C16:0 e C18:0) produzidos através de hidrogenação e desoxigenação de lipídeos.
Como usado neste documento, o termo sonicação refere-se a um processo de rompimento de materiais biológicos, como uma célula, pelo uso de energia de ondas de som.
Espécies de furfural refere-se a 2furancarboxaldeído ou seu derivado que retenha as mesmas características estruturais básicas.
Como usado neste documento, forragem refere-se às folhas e talos secos de uma cultura que permanece após um grão ter sido colhido.
Águas residuais é resíduo aquoso que contém tipicamente água de lavagem, resíduos de lavanderia, fezes, urina e outros resíduos líquidos ou semilíquidos. Inclui algumas formas de resíduos urbanos, assim como esgoto secundariamente tratado.
Deve ser notado que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas singulares um(a) e o(a) incluem referências plurais a menos que o contexto determine claramente o contrário.
Micro-organismos
Qualquer espécie de organismo que produza lipídeo ou hidrocarboneto adequado pode ser usada, embora microorganismos que produzam naturalmente altos níveis de lipídeo ou hidrocarboneto adequado sejam preferidos. A produção de hidrocarbonetos por micro-organismos é revista por Metzger et
18/82 al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66:486-496 e A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998).
Considerações que afetam a seleção de microorganismos para uso na invenção incluem, além da produção de lipídeos ou hidrocarbonetos adequados para a produção de óleos, combustíveis e oleoquímicos, incluem: (1) elevado teor de lipídeos como percentagem de peso celular; (2) facilidade de crescimento; (3) facilidade de engenharia genética; e (4) facilidade de processamento de biomassa. Em realizações particulares, micro-organismos selvagens ou geneticamente engenheirados produzem células que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, ou pelo menos 70% ou mais de lipídeos. Organismos preferidos crescem de modo heterotrófico ou podem ser engenheirados para fazê-lo usando, por exemplo, métodos divulgados neste documento. A facilidade de transformação e a disponibilidade de marcadores selecionáveis e promotores, constitutivos e/ou induzíveis, que sejam funcionais no microorganismo afetam a facilidade da engenharia genética. Considerações sobre o processamento podem incluir, por exemplo, a disponibilidade de meios eficazes para lisar as células.
Em uma realização, micro-organismos incluem microorganismos naturais ou engenheirados que podem crescer em condição heterotróf ica e usar a luz como um sinal para controlar os processos celulares. Esses podem incluir alga, como Cyanophyta, Chlorophyta, Rhodophyta, Cryptophyta, Chlorarachniophyta, Haptophyta, Euglenophyta, Heterokontophyta e diatomáceas.
Algas
Em uma realização da presente invenção, o micro
19/82 organismo é uma microalga. Exemplos não limitantes de microalgas que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são descritos abaixo.
Mais especificamente, táxons de algas pertencentes à Cyanophyta, incluindo Cyanophyceae, são aqueles sendo Prokaryotae, têm a capacidade de fotossíntese tipo evolução de oxigênio e são classificados nas seguintes ordens e famílias. Chroococcales inclui Microcystaceae, Chroococcaceae, Entophysalidaceae, Chamaesiphoniaceae, Dermocarpellaceae, Xenococcaceae e Hydrococcaceae, Oscillatoriales inclui Borziaceae, Pseudanabaenaceae, Schizotrichaceae, Phormidiaceae, Oscillatoriaceae e Homoeotrichaceae, Nostocales inclui Scytonemataceae, Microchaetaceae, Rivulariaceae e Nostocaceae, e Stigonematales inclui Chlorogloeopsaceae, Capsosiraceae, Stigonemataceae, Fischerellaceae Borzinemataceae, Nostochopsaceae, e Mastigocladaceae.
Chlorophyta inclui Chlorophyceae, Prasinophyceae, Pedinophyceae, Trebouxiophyceae e Ulvophyceae. Mais especificamente, Chlorophyceae inclui Acetabularia, Acicularia, Actinochloris, Amphikrikos, Anadyomene, Ankistrodesmus, Ankyra, Aphanochaete, Ascochloris, Asterococcus, Asteromonas, Astrephomene, Atractomorpha, Axilococcus, Axilosphaera, Basichlamys, Basicladia, Binuclearia, Bipedinomonas, Blastophysa, Boergesenia, Boodlea, Borodinella, Borodinellopsis, Botryococcus, Brachiomonas, Bracteacoccus, Bulbochaete, Caespitella, Capsosiphon, Carteria, Centrosphaera, Chaetomorpha, Chaetonema, Chaetopeltis, Chaetophora, Chalmasia, Chamaetrichon, Characiochloris, Characiosiphon, Characium, Chlamydella, Chlamydobotrys, Chlamydocapsa, Chlamydomonas, Chlamydopodium, Chloranomala, Chlorochydridion, Chlorochytrium, Chlorocladus, Chlorocloster, Chlorococcopsis,
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Chlorococcum, Chlorogonium, Chloromonas, Chlorophysalis, Chlorosarcina, Chlorosarcinopsis, Chlorosphaera, Chlorosphaeropsis, Chlorotetraedron, Chlorothecium, Chodatella, Choricystis, Cladophora, Cladophoropsis, Cloniophora, Closteriopsis, Coccobotrys, Coelastrella, Coelastropsis, Coelastrum, Coenochloris, Coleochlamys, Coronastrum, Crucigenia, Crucigeniella, Ctenocladus, Cylindrocapsa, Cylindrocapsopsis, Cylindrocystis, Cymopolia, Cystococcus, Cystomonas, Dactylococcus, Dasycladus, Deasonia, Derbesia, Desmatractum, Desmodesmus, Desmotetra, Diacanthos, Dicellula, Dicloster, Dicranochaete, Dictyochloris, Dictyococcus, Dictyosphaeria, Dictyosphaerium, Didymocystis, Didymogenes, Dilabifilum, Dimorphococcus, Diplosphaera, Draparnaldia, Dunaliella, Dysmorphococcus, Echinocoleum, Elakatothrix, Enallax, Entocladia, Entransia, Eremosphaera, Ettlia, Eudorina, Fasciculochloris, Fernandinella, Follicularia, Fottea, Franceia, Friedmannia, Fritschiella, Fusola, Geminella, Gloeococcus, Gloeocystis, Gloeodendron, Gloeomonas, Gloeotila, Golenkinia, Gongrosira, Gonium,
Graesiella, Granulocystis, Gyorffiana, Haematococcus, Hazenia, Helicodictyon, Hemichloris, Heterochlamydomonas, Heteromastix, Heterotetracystis, Hormidiospora, Hormidium, Hormotila, Hormotilopsis, Hyalococcus, Hyalodiscus, Hyalogonium, Hyaloraphidium, Hydrodictyon, Hypnomonas, Ignatius, Interfilum, Kentrosphaera, Keratococcus, Kermatia, Kirchneriella, Koliella, Lagerheimia, Lautosphaeria, Leptosiropsis, Lobocystis, Lobomonas, Lola, Macrochloris, Marvania, Micractinium, Microdictyon, Microspora, Monoraphidium, Muriella, Mychonastes, Nanochlorum, Nautococcus, Neglectella, Neochloris, Neodesmus, Neomeris, Neospongiococcum, Nephrochlamys, Nephrocytium, Nephrodiella, Oedocladium, Oedogonium, Oocystella, Oocystis, Oonephris, Ourococcus, Pachycladella, Palmella, Palme1lococcus,
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Palmellopsis, Palmodictyon, Pandorina, Paradoxia,
Parietochloris, Pascherina, Paulschulzia, Pectodictyon,
Pediastrum, Pedinomonas, Pedinopera, Percursaria, Phacotus,
Phaeophila, Physocytium, Pilina, Planctonema, Planktosphaeria, Platydorina, Platymonas, Pleodorina, Pleurastrum, Pleurococcus, Ploeotila, Polyedriopsis, Polyphysa, Polytoma, Polytomella, Prasinocladus, Prasiococcus, Protoderma, Protosiphon, Pseudendocloniopsis, Pseudocharacium, Pseudochlorella, Pseudochlorococcum, Pseudococcomyxa, Pseudodictyosphaerium, Pseudodidymocystis, Pseudokirchneriella, Pseudopleurococcus, Pseudoschizomeris, Pseudoschroederia, Pseudostichococcus, Pseudotetracystis, Pseudotetradron, Pseudotrebouxia, Pteromonas, Pulchrasphaera, Pyramimonas, Pyrobotrys, Quadrigula, Radiofilum, Radiosphaera, Raphidocelis, Raphidonema, Raphidonemopsis, Rhizoclonium, Rhopalosolen, Saprochaete, Scenedesmus, Schizochlamys, Schizomeris, Schroederia, Schroederiella, Scotiellopsis, Siderocystopsis, Siphonocladus, Sirogonium, Sorastrum, Spermatozopsis, Sphaerella, Sphaerellocystis, Sphaerellopsis, Sphaerocystis, Sphaeroplea, Spirotaenia, Spongiochloris, Spongiococcum, Stephanoptera, Stephanosphaera, Stigeoclonium, Struvea, Tetmemorus, Tetrabaena, Tetracystis, Tetradesmus, Tetraedron, Tetrallantos, Tetraselmis, Tetraspora, Tetrastrum, Treubaria,
Triploceros, Trochiscia, Trochisciopsis, Ulva, Uronema, Valonia, Valoniopsis, Ventricaria, Viridiella, Vitreochlamys, Volvox, Volvulina, Westella, Willea, Wislouchiella, Zoochlorella, Zygnemopsis, Hyalotheca, Chlorella, Pseudopleurococcum e Rhopalocystis. Prasinophyceae inclui Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia. Pedinophyceae inclui Marsupiomonas, Pedinomonas, Resultor.
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Trebouxiophyceae inclui Apatococcus, Asterochloris, Auxenochlorella, Chlorella, Coccomyxa, Desmococcus, Dictyochloropsis, Elliptochloris, Jaagiella, Leptosira, Lobococcus, Makinoella, Microthamnion, Myrmecia, Nannochloris, Oocystis, Prasiola, Prasiolopsis, Prototheca, Stichococcus, Tetrachlorella, Trebouxia, Trichophilus, Watanabea e Myrmecia. Ulvophyceae inclui Acrochaete, Bryopsis, Cephaleuros, Chlorocystis, Enteromorpha, Gloeotilopsis, Halochlorococcum, Ostreobium, Pirula, Pithophora, Planophila, PseudendocIonium, Trentepohlia, Trichosarcina, Ulothrix, Bolbocoleon, Chaetosiphon, Eugomontia, Oltmannsiellopsis, Pringsheimiella, PseudodendrocIonium, Pseudulvella, Sporocladopsis, Urospora e
Wittrockiella.
Rhodophyta inclui Acrochaetium, Agardhiella, Antithamnion, Antithamnionella, Asterocytis, Audouinella, Balbiania, Bangia, Batrachospermum, Bonnemaisonia, Bostrychia, Callithamnion, Caloglossa, Ceramium, Champia, Chroodactylon, Chroothece, Compsopogon, Compsopogonopsis, Cumagloia, Cyanidium, Cystoclonium, Dasya, Digenia, Dixoniella, Erythrocladia, Erythrolobas, Erythrotrichia, Flintiella, Galdieria, Gelidium, Glaucosphaera, Goniotrichum, Gracilaria, Grateloupia, Griffithsia, Hildenbrandia,
Hymenocladiopsis, Hypnea, Laingia, Membranoptera,
Myriogramme, Nemalion, Nemnalionopsis, Neoagardhiella, Palmaria, Phyllophora, Polyneura, Polysiphonia, Porphyra, Porphyridium, Pseudochantransia, Pterocladia, Pugetia, Rhodella, Rhodochaete, Rhodochorton, Rhodosorus, Rhodospora, Rhodymenia, Seirospora, Selenastrum, Sirodotia, Solieria, Spermothamnion, Spyridia, Stylonema, Thorea, Trailiella e Tuomeya.
Cryptophyta inclui Cryptophycease. Mais especificamente, Campylomonas, Chilomonas, Chroomonas,
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Cryptochrysis, Cryptomonas, Goniomonas, Guillardia, Hanusia, Hemiselmis, Plagioselmis, Proteomonas, Pyrenomonas, Rhodomonas e Stroreatula.
Chlorarachniophyta inclui Chlorarachnion, Lotharella e Chattonella.
Haptophyta inclui Apistonema, Chrysochromulina, Coccolithophora, Corcontochrysis, Cricosphaera, Diacronema, Emiliana, Pavlova, Ruttnera, Cruciplacolithus, Prymnesium, Isochrysis, Calyptrosphaera, Chrysotila, Coccolithus, Dicrateria, Heterosigma, Hymenomonas, Imantonia, Gephyrocapsa, Ochrosphaera, Phaeocystis, Platychrysis, Pseudoisochrysis, Syracosphaera e Pleurochrysis.
Euglenophyta inclui stasia, Colacium, Cyclidiopsis, Distigma, Euglena, Eutreptia, Eutreptiella, Gyropaigne, Hyalophacus, Khawkinea Astasia, Lepocinclis, Menoidium, Parmidium, Phacus, Rhabdomonas, Rhabdospira, Tetruetreptia e Trachelomonas.
Heterokontophyta inclui Bacillariophyceae, Phaeophyceae, Pelagophyceae, Xanthophyceae, Eustigmatophyceae, Syanurophyceae, Phaeothamniophyceae e Raphidophyceae. Mais especificamente, Bacillariophyceae inclui Achnanthes, Amphora, Chaetoceros, Bacillaria, Nitzschia, Navicula e Pinnularia. Phaeophyceae inclui Ascoseira, Asterocladon, Bodanella, Desmarestia, Dictyocha, Dictyota, Ectocarpus, Halopteris, Heribaudiella, Pleurocladia, Porterinema, Pylaiella, Sorocarpus, Spermatochnus, Sphacelaria e Waerniella. Pelagophyceae inclui Aureococcus, Aureoumbra, Pelagococcus, Pelagomonas, Pulvinaria e Sarcinochrysis. Xanthophyceae inclui Chloramoebales, Rhizochloridales, Mischococcales, Tribonematales e Vaucheriales. Eustigmatophyceae inclui Chloridella, Ellipsoidion, Eustigmatos, Monodopsis, Monodus, Nannochloropsis, Polyedriella, Pseudocharaciopsis,
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Pseudostaurastrum e Vischeria. Syanurophyceae inclui Allomonas, Synura e Tessellaria. Phaeothamniophyceae inclui Phaeobotrys e Phaeothamnion. Raphidophyceae inclui Olisthodiscus, Vacuolaria e Fibrocapsa.
Diatomáceas incluem Bolidophyceae,
Coscinodiscophyceae, Dinophyceae e alveolados. Bolidophyceae inclui Bolidomonas, Chrysophyceae, Giraudyopsis,
Glossomastix, Chromophyton, Chrysamoeba, Chrysochaete, Chrysodidymus, Chrysolepidomonas, Chrysosaccus,
Chrysosphaera, Chrysoxys, Cyclonexis, Dinobryon, Epichrysis, Epipyxis, Hibberdia, Lagynion, Lepochromulina, Monas, Monochrysis, Paraphysomonas, Phaeoplaca, Phaeoschizochlamys, Picophagus, Pleurochrysis, Stichogloea e Uroglena.
Coscinodiscophyceae inclui Bacteriastrum, Bellerochea, Biddulphia, Brockmanniella, Corethron, Coscinodiscus,
Eucampia, Extuboce1lulus, Guinardia, Helicotheca, Leptocylindrus, Leyanella, Lithodesmium, Melosira,
Minidiscus, Odontella, Planktoniella, Porosira, Proboscia, Rhizosolenia, Stellarima, Thalassionema, Bicosoecid, Symbiomonas, Actinocyclus, Amphora, Arcocellulus, Detonula, Diatoma, Ditylum, Fragilariophyceae, Asterionellopsis, Delphineis, Grammatophora, Nanofrustulum, Synedra e
Tabularia. Dinophyceae inclui Adenoides, Alexandrium, Amphidinium, Ceratium, Ceratocorys, Coolia, Crypthecodinium, Exuviaella, Gambierdiscus, Gonyaulax, Gymnodinium, Gyrodinium, Heterocapsa, Katodinium, Lingulodinium, Pfiesteria, Polarella, Protoceratium, Pyrocystis, Scrippsiella, Symbiodinium, Thecadinium, Thoracosphaera e Zooxanthella. Os alveolados incluem Cystodinium, Glenodinium, Oxyrrhis, Peridinium, Prorocentrum e Woloszynskia.
Métodos de Cultivo de Micro-organismos e Biorreatores
Micro-organismos são geralmente cultivados tanto
25/82 para fins de realização de manipulações genéticas como para subsequente produção de hidrocarbonetos (por exemplo, lipídeos, ácidos graxos, aldeídos, álcoois e alcanos). O antigo tipo de cultura é geralmente conduzido em pequena escala e, inicialmente, pelo menos, em condições em que o micro-organismo de partida possa crescer. Cultura para fins de produção de hidrocarbonetos é geralmente conduzida em grande escala. Preferivelmente uma fonte de carbono fixado (por exemplo, uma matéria-prima) está presente. A cultura também pode ser exposta à luz algum tempo ou todo o tempo.
Biorreator
As microalgas podem ser cultivadas em meios líquidos. A cultura pode estar contida em um biorreator. As microalgas podem também ser cultivadas em fotobiorreatores que contêm uma fonte de carbono fixado e permitem que a luz atinja as células. A exposição de células de microalgas à luz, mesmo na presença de uma fonte de carbono fixado que as células transportam e utilizam, pode acelerar o crescimento em comparação ao cultivo de células no escuro. Os parâmetros de condição de cultivo podem ser manipulados para otimizar a produção de hidrocarbonetos totais, a combinação de espécies de hidrocarbonetos produzidos e/ou a produção de uma espécie de hidrocarboneto.
A Figura 1 é uma realização de um biorreator da invenção. Em um aspecto, um biorreator é um fotobiorreator. Em um aspecto, um sistema de biorreator pode ser utilizado para cultivar microalgas. O sistema de biorreator pode incluir um recipiente e um conjunto de irradiação, onde o conjunto de irradiação está operativamente acoplado ao recipiente.
Em um aspecto, um biorreator é um tanque de fermentação utilizado para processos de fermentação industrial.
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Em algumas realizações, um biorreator inclui tanques de vidro, metal ou plástico, equipados com, por exemplo, medidores e ajustes para controlar a aeração, taxa de agitação, temperatura, pH e outros parâmetros de interesse. Geralmente, os medidores e ajustes estão operativamente acopladas ao biorreator.
Em um aspecto, um biorreator pode ser pequeno o suficiente para aplicações de topo de bancada (5-10 L ou menos) ou de até 120.000 L ou maior em capacidade para aplicações industriais em larga escala.
Em algumas realizações, o sistema de biorreator pode incluir uma estrutura de difusão da luz ou uma pluralidade de estruturas de difusão da luz. Em algumas realizações, uma ou mais das estruturas de difusão da luz da pluralidade de estruturas de difusão da luz estão localizadas ao longo da superfície interna do biorreator. Em algumas realizações, a estrutura de difusão da luz está operativamente acoplada ao biorreator.
O sistema de biorreator pode incluir uma ou mais fibras ópticas e/ou uma pluralidade de fontes de luz e/ou uma fonte de luz. Em algumas realizações, uma ou mais fibras ópticas são montadas em estruturas de iluminação protetoras e opticamente transparentes. Em algumas realizações, a fibra óptica está operativamente acoplada ao biorreator. Em algumas realizações, a fonte de luz está operativamente acoplada ao biorreator.
Em algumas realizações, o sistema de biorreator pode incluir uma estrutura de iluminação operativamente acoplada a um biorreator. Em determinadas realizações neste documento, uma estrutura de iluminação pode ter qualquer formato ou forma já que direciona o sinal luminoso para o interior de um biorreator. O sistema de biorreator também pode incluir pelo menos uma fibra óptica que se estende desde
27/82 uma primeira extremidade de pelo menos uma das uma ou mais fibras ópticas até uma porção de um coletor de energia solar. Em algumas realizações, o coletor de energia solar está operativamente acoplado ao biorreator. A fibra óptica pode 5 ser adaptada para acoplar opticamente o coletor de energia solar ao biorreator. A fibra óptica pode ser opticamente acoplada (direta ou indiretamente) ao coletor de energia solar.
Em algumas realizações, o sistema de biorreator 10 inclui uma pluralidades de fontes de luz operativamente acopladas ao biorreator. A pluralidade de fontes de luz pode incluir múltiplos LEDs. A pluralidade de fontes de luz que compreende múltiplos LEDs pode ser operável para fornecer todo o espectro ou um comprimento de onda específico de luz 15 artificial para um biorreator.
Em uma realização, um LED é montado em estruturas de iluminação protetoras e opticamente transparentes. Em uma realização, o LED é um arranjo de LEDs.
Em algumas realizações, as microalgas podem ser 20 cultivadas e mantidas em biorreatores fechados feitos de diferentes tipos de material transparente ou semitransparente. Tal material pode incluir compartimentos de Plexiglass™, compartimentos de vidro, sacos feitos de substâncias como o polietileno, tubos transparentes ou 25 semitransparentes e outros materiais. As microalgas podem ser cultivadas e mantidas em biorreatores abertos como tanques tipo raceway ponds, tanques de ajuste e outros recipientes não fechados.
O teor de gás de um biorreator para cultivar micro30 organismos como microalgas pode ser manipulado. Parte do volume de um biorreator pode conter gás ao invés de líquido. As entradas de gás podem ser usadas para bombear gases para dentro do biorreator. Qualquer gás pode ser bombeado para
28/82 dentro de um biorreator, incluindo ar, misturas de ar/02, gases nobres, como argônio e outros. A taxa de entrada de gás em um biorreator também pode ser manipulada. Aumentando o fluxo de gás para um biorreator aumenta a turbidez de uma cultura de microalgas. A colocação de portas que transportam gases para dentro de um biorreator pode também afetar a turbidez de uma cultura em uma determinada taxa de fluxo de gás. Misturas ar/02 podem ser moduladas para gerar quantidades ideais de 02 para crescimento máximo por um organismo particular. Microalgas crescem significativamente mais rápido à luz sob, por exemplo, 3% de O2/97% de ar do que em 100% de ar. Três por cento de O2/97% de ar é aproximadamente 100 vezes mais 02 do que o encontrado no ar. Por exemplo, misturas de ar:O2 de cerca de 99,75% de ar:0,25% de O2, cerca de 99,5% de ar: 0,5% de O2, cerca de 99,0% de ar: 1,00% de O2, cerca de 98,05 de ar: 2,0% de O2, cerca de 97,0% de ar: 3,0% de 02, cerca de 96,0% de ar: 4,0% de O22 e cerca de 95,00% de ar: 5,0% de O2 podem ser infundidas em um biorreator ou biorreator.
Culturas de microalgas também podem ser submetidas a mistura usando dispositivos como pás e turbinas giratórias, para balançar uma cultura, barras de agitação, infusão de gás pressurizado e outros instrumentos.
Os biorreatores podem ter portas que permitam a entrada de gases, sólidos, semissólidos e líquidos na câmara que contém as microalgas. As portas estão geralmente ligadas à tubulação ou outros meios de transporte de substâncias. Portas de gás, por exemplo, transportam gases para dentro da cultura. O bombeamento de gases para dentro de um biorreator pode servir tanto para alimentar células com O2 e outros gases como para arejar a cultura e, portanto, gerar turbidez. A quantidade de turbidez de uma cultura varia conforme o número e a posição de portas de gás são alterados. Por
29/82 exemplo, portas de gás podem ser colocadas ao longo da parte inferior de um saco de polietileno cilíndrico. As microalgas crescem mais rapidamente quando o 02 é adicionado ao ar e borbulhado para dentro de um biorreator.
Os biorreatores, preferivelmente têm uma ou mais portas que permitem a entrada de meios. Não é necessário que apenas uma substância entre ou saia de uma porta. Por exemplo, uma porta pode ser usada para fluir meios de cultura para o biorreator e, então, mais tarde pode ser usada para 10 amostragem, entrada de gás, saída de gás ou outros fins. Em alguns casos, um biorreator é preenchido com meios de cultura no início de uma cultura e meios de crescimento não mais são infundidos depois que a cultura é inoculada. Em outras palavras, a biomassa de microalgas é cultivada em um meio 15 aquoso por um período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentam de número; entretanto, quantidades de meio de cultura aquoso não são fluidas através do biorreator durante todo o período de tempo. Assim, em algumas realizações, o meio de cultura aquoso não flui através do 20 biorreator após a inoculação.
Em outros casos, os meios de cultura podem fluir pelo biorreator durante todo o período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentar de número. Em algumas realizações, os meios são infundidos no biorreator 25 após a inoculação, mas antes as células atingem uma densidade desejada. Em outras palavras, um regime de fluxo turbulento de entrada de gás e entrada de meios não é mantido para reprodução de microalgas, até que se um aumento desejado do número das ditas microalgas tenha sido alcançado.
0 Os biorreatores, preferivelmente têm uma ou mais portas que permitem a entrada de gás. 0 gás pode servir tanto para prover nutrientes, como O2, como para prover turbulência nos meios de cultura. A turbulência pode ser alcançada
30/82 colocando-se uma porta de entrada de gás abaixo do nível dos meios de cultura aquosos, para que o gás que entra no biorreator borbulhe na superfície da cultura. Uma ou mais portas de saída de gás permitem que o gás escape, evitando assim acúmulo de pressão no biorreator. Preferivelmente, uma porta de saída de gás leva a uma válvula unidirecional que impede que microrganismos contaminantes entrem no biorreator. Em alguns casos, as células são cultivadas em um biorreator por um período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentam de número, entretanto, um regime de fluxo turbulento com redemoinhos turbulentos predominantemente por todos os meios de cultura, causado pela entrada de gás não é mantido por todo o período de tempo. Em outros casos, um regime de fluxo turbulento com redemoinhos turbulentos predominantemente por todos os meios de cultura, causado por entrada de gás pode ser mantido por todo o período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentam de número. Em alguns casos, um intervalo predeterminado de proporções entre a escala do biorreator e a escala de redemoinhos não é mantido durante o período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentam de número. Em outros casos esse intervalo pode ser mantido.
Biorreatores, preferivelmente, possuem pelo menos uma porta que pode ser utilizada para amostragem da cultura. Preferivelmente, uma porta de amostragem pode ser usada repetidamente sem alterar o comprometimento da natureza axênica da cultura. Uma porta de amostragem pode ser configurada com uma válvula ou outro dispositivo que permita que o fluxo da amostra seja interrompido e iniciado. Em alternativa, uma porta de amostragem pode permitir amostragem contínua. Biorreatores, preferivelmente, possuem pelo menos uma porta que permita a inoculação de uma cultura. Essa porta também pode ser usada para outros fins, como entrada de meios
31/82 ou gás.
Em uma realização, um biorreator com um sistema de irradiação pode ser usado para produzir hidrocarbonetos a partir de Botryococcus. Botriococenos são triterpenos de isoprenoides não ramificados que possuem a fórmula CnH2n-io· Uma pista A produz alcadienos e alcatrienos (derivados de ácidos graxos) , em que n é um número ímpar de 23 a 31. A pista B produz botriococenos, em que n está no intervalo de 30 a 40. Estes podem ser biocombustíveis de escolha para o hidrocraqueamento para hidrocarbonetos tipo gasolina.
Meios
Meios de cultura de microalgas tipicamente contêm componentes como uma fonte de nitrogênio fixado, elementos traço, opcionalmente um tampão para manutenção de pH, e fosfato. Outros componentes podem incluir uma fonte de carbono fixado, como acetato ou glicose e sais, como cloreto de sódio, particularmente para microalgas marinhas. Exemplos de elementos traço incluem zinco, boro, cobalto, cobre, manganês e molibdênio, por exemplo, nas respectivas formas de ZnCl2, H3BO3, CoC12.6H20, CuC12.2H2O, MnCl2.4H2O e (NH4) 6Mo7024. 4H2O.
Para os organismos capazes de crescer em uma fonte de carbono fixado, a fonte de carbono fixado pode ser, por exemplo, glicose, frutose, sacarose, galactose, xilose, manose, ramnose, N-acetilglicosamina, glicerol, floridosídeo òú ácido glicurônico. Uma ou mais fontes de carbono podem ser fornecidas em uma concentração inferior a 50 μΜ, pelo menos cerca de 50 μΜ, pelo menos cerca de 100 μΜ, pelo menos cerca de 500 μΜ, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca e 5 0 mM, pelo menos cerca de 500 mM e mais de 500 mM de uma ou mais fontes de carbono fixado providas de modo exógeno. Uma ou mais fontes de carbono podem ser fornecidas em menos de 1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%,
32/82
14%, 15%, 16% , 17% , 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%,
26%, 27%, 28% , 29% , 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39%, 40% , 41% , 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,
50%, 51%, 52% , 53% , 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,
62%, 63%, 64% , 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%,
74%, 75%, 76% , 77% , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,
86%, 87%, 88% , 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99%, OU 100% dos meios. Uma ou mais fontes de carbono
também podem ser fornecidas em uma porcentagem dos meios entre as porcentagens acima mencionadas, por exemplo, 2,5% ou 3,7% dos meios.
Alguns micro-organismos naturalmente crescem ou podem ser engenheirados para crescer em uma fonte de carbono fixado que seja uma fonte de heterogênea de compostos, como resíduo urbano, esgoto tratado secundariamente, água residual e outras fontes de carbono fixado e outros nutrientes, como sulfatos, fosfatos e nitratos. 0 componente de esgoto serve como uma fonte de nutrientes na produção de hidrocarbonetos, e a cultura provê uma fonte barata de hidrocarbonetos.
Outros parâmetros de cultura também podem ser manipulados, como o pH dos meios de cultura, a identidade e concentração de elementos traço e outros constituintes dos meios.
Os micro-organismos úteis de acordo com os métodos da presente invenção são encontrados em vários locais e ambientes em todo o mundo. Como consequência de seu isolamento de outras espécies e de sua divergência evolucionária resultante, o meio de crescimento particular para o crescimento ideal e a geração de constituintes lipídicos e/ou de hidrocarbonetos pode variar. Em alguns casos, determinadas cepas de micro-organismos podem ser incapazes de crescer em um meio de crescimento particular por causa da presença de algum componente inibitório ou ausência
33/82 de algum requisito nutricional essencial exigido pela cepa particular de micro-organismo.
Meios de crescimento sólido e líquido estão em geral disponíveis a partir de uma ampla variedade de fontes, e instruções para a preparação de meios particulares que são adequados para uma ampla variedade de cepas de microorganismos podem ser encontradas, por exemplo, on-line em um site mantido pela Universidade do Texas em Austin para sua coleção de cultura de algas (UTEX).
As condições de processo podem ser ajustadas para aumentar o rendimento de lipídeos adequados para um uso particular e/ou para reduzir o custo de produção. Por exemplo, em determinadas realizações, um micróbio (por exemplo, microalgas) é cultivado na presença de uma concentração limitante de um ou mais nutrientes, como, por exemplo, carbono e/ou nitrogênio, fósforo, ou enxofre, enquanto é provido um excesso de energia de carbono fixado, como glicose. A limitação de nitrogênio tende a aumentar o rendimento de lipídeos microbianos sobre o rendimento de lipídeos microbianos em uma cultura em que o nitrogênio é provido em excesso. Em realizações particulares, o aumento do rendimento de lipídeos é de pelo menos cerca de: 10%, 2 0%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, ou 500%. Os micróbios podem ser cultivados na presença de uma quantidade limitante de um nutriente por uma parte do período total de cultivo ou por todo o período. Em realizações particulares, a concentração de nutrientes está em um ciclo entre uma concentração limitante e uma concentração não limitante pelo menos duas vezes durante o período de cultivo total.
Crescimento Heterotrófico e Luz
Os micro-organismos podem ser cultivados em condições de crescimento heterotrófico, em que uma fonte de carbono fixado provê energia para o crescimento e acúmulo de
34/82 lípídeos.
Métodos padrões para o crescimento heterotróficos e propagação de microalgas são conhecidos (veja, por exemplo, Miao and Wu, J Biotechnology, 2004, 11:85-93 e Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
Para a produção de hidrocarbonetos, células, incluindo células recombinantes da invenção descritas neste documento, podem ser cultivadas ou fermentadas em grandes quantidades. O cultivo pode ser em grandes volumes líquidos, como em culturas em suspensão como um exemplo. Outros exemplos incluem começar com uma pequena cultura de células que se expande em uma grande biomassa em combinação com crescimento celular e propagação, assim como com a produção de hidrocarbonetos. Biorreatores ou fermentadores de aço podem ser usados para acomodar volumes grandes de cultura. Um biorreator pode incluir um fermentador. Um fermentador similar ao utilizado na produção de cerveja e/ou vinho pode ser adequado, visto serem fermentadores extremamente grandes usados na produção de etanol.
Fontes de nutrientes apropriadas para a cultura em um fermentador são providas. Estas incluem matérias-primas como uma ou mais das seguintes: uma fonte de carbono fixado, como glicose, amido de milho, material celulósico despolimerizado, sacarose, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, lactose, soro de leite, ou melaço; uma fonte de gordura, como gorduras ou óleos vegetais; uma fonte de nitrogênio, como proteínas, farinha de soja, água de maceração de milho, amônia (pura ou em forma de sal), nitrato ou sal de nitrato, ou nitrogênio molecular; e uma fonte de fósforo, como sais de fosfato. Adicionalmente, um fermentador permite o controle de condições de cultura, como temperatura, pH, tensão de oxigênio e níveis de dióxido de carbono. Opcionalmente, os componentes gasosos, como oxigênio ou
35/82 nitrogênio, podem ser borbulhados em uma cultura líquida. Outras fontes de amido (glicose) como trigo, batata, arroz e sorgo. Outras fontes de carbono incluem correntes de processo, como glicerol de grau técnico, licor negro, ácidos orgânicos, como acetato, e melaço. Fontes de carbono também podem ser providas como uma mistura, como uma mistura de sacarose e polpa de beterraba sacarina despolimerizada.
Um fermentador pode ser usado para permitir que células submetam-se às várias fases de seu ciclo de crescimento. Por exemplo, um inóculo de células produtoras de hidrocarbonetos pode ser introduzido em um meio seguido por um período de latência (fase lag) antes das células começarem a crescer. Após o período de latência, a taxa de crescimento aumenta constantemente e entra na fase log, ou exponencial. A fase exponencial, por sua vez é seguida por uma desaceleração do crescimento devido à redução de nutrientes e/ou aumentos de substâncias tóxicas. Após esta desaceleração, o crescimento pára e as células entram em uma fase estacionária ou estado estacionário, dependendo do ambiente particular provido para as células.
A produção de hidrocarbonetos por células divulgadas neste documento pode ocorrer durante a fase log ou posteriormente, incluindo a fase estacionária em que os nutrientes são providos, ou adicionalmente estão disponíveis, para permitir a continuação da produção de hidrocarbonetos na ausência de divisão celular.
Preferivelmente, os micro-organismos cultivados usando condições descritas neste documento e conhecidas na técnica compreendem pelo menos cerca de 20% em peso de lipídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 40% em peso, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% em peso, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% em peso.
Em um método alternativo de crescimento
36/82 heterotrófico de acordo com a presente invenção, microorganismos podem ser cultivados usando biomassa celulósica despolimerizada como matéria-prima. A biomassa celulósica (por exemplo, forragem, tal como forragem de milho) é barata e facilmente disponível; entretanto, as tentativas de usar este material como matéria-prima para leveduras falharam. Em particular, tal matéria-prima foi considerada inibitória para o crescimento de leveduras e as leveduras não podem usar os açúcares de 5 carbonos produzidos a partir de materiais celulósicos (por exemplo, xilose de hemicelulose). Em contraste, as microalgas podem crescer em material celulósico processado. Consequentemente, a invenção provê um método para cultivar microalgas na presença de um material celulósico e/ou um açúcar de 5 carbonos.
Materiais celulósicos adequados incluem resíduos de herbáceas e culturas energéticas lenhosas, assim como culturas agrícolas, ou seja, as partes de plantas, principalmente talos e folhas, não removidas dos campos com o principal produto alimentar ou fibra. Os exemplos incluem resíduos agrícolas, como bagaço de cana, cascas de arroz, fibra de milho (incluindo talos, folhas, cascas e sabugo), palha de trigo, palha de arroz, polpa de beterraba sacarina, polpa de citrinos, cascas de citrinos; resíduos florestais, como desbastes de madeira de lei e de coníferas, e resíduos de madeira de lei e de coníferas de operações de madeira; resíduos de madeira como resíduos de serralheria (aparas de madeira, serradura) e resíduos de fábrica de celulose; resíduos urbanos como frações de papel de resíduos sólidos urbanos, resíduos urbanos de madeira e resíduos verdes urbanos, como aparas de relva municipal; e resíduos de construção em madeira. Celulósicos adicionais incluem culturas celulósicas dedicadas como switchgrass, madeira de álamo híbrido e miscanthus, cana de fibra e sorgo de fibra.
37/82
Os açúcares de cinco carbonos que são produzidos partir desses materiais incluem a xilose.
Adicionalmente outro método alternativo de crescimento heterotrófico de acordo com a presente invenção, que por sua vez pode opcionalmente ser usada em combinação com os métodos descritos acima, a sacarose, produzida, por exemplo, a partir da cana-de-açúcar ou beterraba sacarina, é usada como matéria-prima.
O crescimento heterotrófico pode incluir o uso tanto de luz como de fonte (s) de carbono fixado para que as células cresçam e produzam hidrocarbonetos. O crescimento heterotrófico pode ser conduzido em um fotobiorreator.
Os biorreatores podem ser expostos a uma ou mais fontes de luz para prover às microalgas um sinal luminoso. Um sinal luminoso pode ser provido através de luz direcionada a uma superfície do biorreator por uma fonte de luz. Preferivelmente, a fonte de luz provê uma intensidade que é suficiente para que as células cresçam, mas não tão intensa como para causar dano oxidativo ou causar uma resposta fotoinibitória. Em alguns casos, uma fonte de luz tem um intervalo de comprimento de onda que imita ou aproximadamente imita o intervalo do sol. Em outros casos, é usado um intervalo de comprimento de onda diferente. Os biorreatores podem ser colocados ao ar livre ou em uma estufa ou outra instalação que permita que a luz do sol atinja a superfície. Em algumas realizações, as fotointensidades para espécies do gênero Botryococcus estão entre 25 e 500 pmE m 2 s 1 (veja, por exemplo, Photosynth Res. 2005 June; 84(1-3) : 21-7) .
número de fótons que atinge uma cultura de células de microalgas pode ser manipulado, assim como outros parâmetros como o espectro de comprimento de onda e proporção de horas de escuro:luz por dia. As microalgas podem também ser cultivadas em luz natural, assim como combinações
38/82 simultâneas e/ou alternadas de luz natural e luz artificial. Por exemplo, as microalgas podem ser cultivadas sob luz natural durante as horas do dia e sob luz artificial durante as horas da noite.
Em um aspecto da invenção, um micro-organismo é exposto a cerca de 0,1% a cerca de 1% da irradiância luminosa necessária para a fotossíntese, preferivelmente cerca de 0,3% a cerca de 0,8% da irradiância luminosa necessária para a fotossíntese pelo organismo. A irradiância luminosa típica pode estar entre 0,1 - 3 00 . pmol de fótons m'2 s’1 incluindo
menos que 0, 1, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0 ,5, 0,6 , 0,7, 0,8, 0,9,
1,2,3 , 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51 a 99 , 100, 101 a 149 , 150, 151, a 199, 200,
201 a 249, 250, ou maios que 250 .pmol de fótons m'2 s’1. A irradiância luminosa pode ser cerca de 0,01-1 pmol de fótons m’2 s’1, preferivelmente entre 1-10 pmol de fótons m 2 s 1, ou entre 10-100 pmol de fótons m'2 s’1, ou entre 100-300 pmol de fótons m’2 s'1, ou entre 100-300 pmol de fótons m’2 s’1. Também estão incluídos irradiâncias luminosas entre as irradiâncias luminosas mencionadas acima, por exemplo, 1,1, 2,1, 2,5 ou
3,5 pmol de fotons ms .
Em um aspecto, os diferentes espectros luminosos (por exemplo, 360-700 nm) podem ser usados. Os espectros luminosos podem ser de menos de 300, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou 750 nm ou mais. Também estão incluídos os espectros luminosos entre os espectros luminosos mencionados acima, por exemplo, 360 ou 440 nm.
Em uma realização, a irradiação pode ser aplicada de forma contínua. Em outra realização, a irradiação pode ser aplicada em um padrão cíclico com um período de iluminação apropriado, incluindo entre outros 12h de luz:12h de escuro
39/82 ou 16h de luz: 8h de escuro. Os padrões de luz podem incluir menos do que 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 h de luz e/ou menos do que 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 horas (h) de escuro. Também estão incluídos os padrões de luz entre os padrões de luz mencionados acima, por exemplo, 7,5 h de luz ou 7,5 h de escuro.
Em uma realização, a irradiação pode ser a luz solar natural coletada por um coletor solar e transmitida para o interior de um biorreator através de uma fibra óptica.
Em outra realização, a luz artificial, como luz fluorescente ou de diodos emissores de luz (LEDs) pode ser usada como fonte de luz. Em outra realização, luz solar natural e a luz artificial podem ser usadas juntas.
Em uma realização, a irradiação é um espectro de luz completo.
Em outra realização, a irradiação é um comprimento de onda específico de luz ou um intervalo de espectro luminoso transmitido através de um filtro específico.
Métodos para Recuperar Lipídeos e Hidrocarbonetos
Os hidrocarbonetos (por exemplo, lipídeos, ácidos graxos, aldeídos, álcoois e alcanos) produzidos pelas células da invenção podem ser colhidos, ou caso contrário coletados, por qualquer meio conveniente. Por exemplo, os hidrocarbonetos secretados das células podem ser centrifugados para separar os hidrocarbonetos em uma fração hidrofóbica dos contaminantes em uma fração aquosa e, opcionalmente, de quaisquer materiais sólidos, como um precipitado, após a centrifugação. O material que contém a célula ou frações celulares pode ser tratado com proteases para degradar proteínas contaminantes antes ou após a centrifugação. Em alguns casos, as proteínas contaminantes
40/82 estão associadas, possivelmente covalentemente, a hidrocarbonetos ou precursores de hidrocarbonetos que formam hidrocarbonetos após a remoção da proteína. Em outros casos, as moléculas de hidrocarbonetos estão em uma preparação que 5 também contém proteínas. As proteases podem ser adicionadas às preparações de hidrocarbonetos que contenham proteínas, para degradar proteínas (por exemplo, a protease de Streptomyces griseus pode ser usada (número de catálogo da Sigma Aldrich P5147). Após a digestão, os hidrocarbonetos são 10 preferivelmente purificados das proteínas residuais, fragmentos peptídicos e aminoácidos. Esta purificação pode ser feita, por exemplo, pelos métodos listados acima como centrifugação e filtração.
Os hidrocarbonetos extracelulares também podem ser 15 extraídos in vivo a partir de células vivas de microalgas que são então devolvidas para um biorreator por exposição das células, em um ambiente de outro modo estéril, a um solvente de extração não tóxico, seguida pela separação das células vivas e da fração hidrofóbica de solvente de extração e de 20 hidrocarbonetos, em que as células vivas separadas são então devolvidas a um recipiente de cultura, como um fotobiorreator ou fermentador de aço inoxidável (veja, Biotechnol Bioeng. 2004 Dec. 5; 88(5): 593-600 e Biotechnol Bioeng. 2004 Mar. 5; 85(5):475-81).
Os hidrocarbonetos também podem ser isolados por extração de célula total. As células são primeiro rompidas e, em seguida, os hidrocarbonetos intracelulares e associados à membrana celular/parede celular, assim como hidrocarbonetos extracelulares podem ser coletados da massa celular total, 30 tal como pelo uso de centrifugação como descrito acima.
Vários métodos estão disponíveis para a separação de hidrocarbonetos e lipídeos dos lisados celulares produzidos pelos métodos acima. Por exemplo, os
41/82 hidrocarbonetos podem ser extraídos com um solvente hidrofóbico como o hexano (veja, Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11: 717). Os hidrocarbonetos podem também ser extraídos usando liquefação (veja, por exemplo, Sawayama et al.1999, Biomass and Bioenergy 17: 33-39 e Inoue et al.1993, Biomass Bioenergy 6(4): 269-274); liquefação de petróleo (veja, por exemplo, Minowa et al., 1995, Fuel 74(12): 1735-1738); e extração com CO2 supercrítico (veja, por exemplo, Mendes et al. 2003, Inorgânica Chimica Acta 356:328-334).
Miao e Wu descrevem um protocolo da recuperação de lipídeo de microalgas de uma cultura em que as células foram coletadas por centrifugação, lavadas com água destilada e secas por liof ilização. O pó de células resultante foi pulverizado em um mortor e então extraído com n-hexano. Miao e Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846.
Lisando Células
Os lipídeos intracelulares e os hidrocarbonetos produzidos em micro-organismos são, em algumas realizações, extraídos após a lise das células do micro-organismo. Uma vez extraídos, os lipídeos e/ou hidrocarbonetos podem ser adicionalmente refinados para produzir, por exemplo, óleos, combustíveis ou oleoquímicos.
Após a conclusão do cultivo, os micro-organismos podem ser separados do caldo de fermentação. Opcionalmente, a separação é efetuada por centrifugação para gerar uma pasta concentrada. A centrifugação não remove quantidades significativas de água intracelular dos micro-organismos e não é uma etapa de secagem. A biomassa pode em seguida ser lavada com uma solução de lavagem (por exemplo, água Dl) para se livrar do caldo de fermentação e detritos. Opcionalmente, a biomassa microbiana lavada pode também ser seca (seca em forno, liofilizada, etc.) antes do rompimento das células. Em
42/82 alternativa, as células podem ser lisadas sem separação de parte ou de todo o caldo de fermentação quando a fermentação está concluída. Por exemplo, as células podem estar em uma proporção menor que 1:1 v:v células para líquido extracelular quando as células são lisadas.
Micro-organismos contendo um lipídeo e/ou hidrocarbonetos podem ser lisados para produzir um lisado. Como detalhado neste documento, a etapa de lise de um microorganismo (também referida como lise celular) pode ser alcançada por qualquer meio conveniente, incluindo lise induzida por calor, adição de uma base, adição de um ácido, usando enzimas como proteases e enzimas de degradação polissacarídica, como amilases, usando o ultrassom, lise mecânica, usando choque osmótico, infecção por um vírus lítico, e/ou expressão de um ou mais genes líticos. A lise é executada para liberar moléculas intracelulares que foram produzidas pelos micro-organismos. Cada um destes métodos para lisar um micro-organismo pode ser usado como um método único ou em combinação, simultânea ou sequencialmente.
A extensão do rompimento celular pode ser observado por análise microscópica. Usando um ou mais dos métodos descritos neste documento, tipicamente observa-se mais do que 70% de ruptura celular. Preferivelmente, a ruptura celular é de mais de 80%, mais preferivelmente de mais de 90% e mais preferido, cerca de 100%.
Em realizações particulares, o micro-organismo é lisado após o crescimento, por exemplo, para aumentar a exposição de lipídeos e/ou hidrocarbonetos celulares à extração ou processamento subsequente. 0 sincronismo da expressão da lipase (por exemplo, através de um promotor induzível) ou lise celular pode ser ajustado para aperfeiçoar o rendimento de lipídeos e/ou hidrocarbonetos. Abaixo estão descritas uma série de técnicas de lise. Estas técnicas podem
43/82 ser usadas individualmente ou em combinação.
Lise Induzida por Calor
Em uma realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende o aquecimento de uma suspensão celular contendo o micro-organismo. Nesta realização, o caldo de fermentação contendo os microorganismos (ou uma suspensão de micro-organismos isolados do caldo de fermentação) é aquecido até que os micro-organismos, ou seja, as paredes celulares e membranas dos microorganismos se degradem ou sofram ruptura. Tipicamente, as temperaturas aplicadas são de pelo menos 50°C. Temperaturas mais elevadas, tais como, pelo menos 30°C, pelo menos 60°C, pelo menos 70°C, pelo menos 80°C, pelo menos, 90°C, menos 100°C, pelo menos, 110°C, pelo menos 120°C, pelo menos 130°C ou maiores são usadas para lise celular mais eficiente.
A lise de células por tratamento térmico pode ser realizada através da fervura do micro-organismo. Em alternativa, um tratamento térmico (sem fervura) pode ser realizado em uma autoclave. O lisado tratado por calor pode ser resfriado para tratamento adicional.
O rompimento celular pode também ser realizado por tratamento com vapor, ou seja, através da adição de vapor pressurizado. O tratamento por vapor de microalgas para o rompimento celular é descrito, por exemplo, em Pat. No. US 6.750.048 .
Lise Usando uma Base
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende a adição de uma base a uma suspensão celular contendo o micro-organismo.
A base deve ser suficientemente forte para hidrolisar pelo menos uma parte dos compostos proteicos dos microrganismos utilizados. As bases que são úteis para solubilizar proteínas são conhecidas na técnica da Química.
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As bases exemplares que são úteis nos métodos da presente invenção incluem, entre outras, hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos de lítio, sódio, potássio, cálcio e suas misturas. Uma base preferida é KOH. O tratamento com base de microalgas para o rompimento celular é descrito, por exemplo, em Pat. No. US 6.750.048.
Lise Ácida
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende a adição de um ácido a uma suspensão celular contendo o micro-organismo. A lise ácida pode ser afetada usando um ácido com uma concentração de 10-500 mN ou preferivelmente 40-160 nM. A lise ácida é preferivelmente realizada acima da temperatura ambiente (por exemplo, a 40-160 e preferivelmente a uma temperatura de 50-130. Para temperaturas moderadas (por exemplo, da temperatura ambiente a 100°C e particularmente, da temperatura ambiente a 65, o tratamento com ácido pode ser utilmente combinados com sonicação ou outros métodos de rompimento celular.
Lisando Células Usando Enzimas
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende lisar o micro-organismo usando uma enzima. As enzimas preferidas para lisar um micro-organismo são proteases e enzimas que degradam polissacarídeos, como a hemicelulase (por exemplo, hemicelulase de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.; #H2125), a pectinase (por exemplo, pectinase de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.; #P2401), Mannaway 4.0 L (Novozymes), celulase (por exemplo, celulose de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.; #C9422) e driselase (por exemplo, driselase de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.; #D9515.
Celulases
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Em uma realização preferida da presente invenção, uma celulase para lisar um micro-organismo é uma enzima que degrada polissacarídeos, opcionalmente de Chlorella ou de um vírus de Chlorella.
Proteases
Proteases como a protease de Streptomyces griseus, quimiotripsina, proteinase K, proteases listadas em Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Y et al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Número 1, janeiro de 2000, pp. 29-32(4) e outras proteases podem ser usadas para lisar os micro-organismos. Outras proteases que podem ser usadas incluem a Alcalase 2.4 FG (Novozymes) e Flavourzyme 100 L (Novozymes).
Combinações
Qualquer combinação de uma protease e de uma enzima que degrade polissacarídeo também pode ser usada, incluindo qualquer combinação das proteases e enzimas que degradam polissacarídeos anteriores.
Lisando Células Usando Ultrassom
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo é realizada usando ultrassom, ou seja, sonicação. Assim, as células também podem ser lisadas com som de alta frequência. O som pode ser produzido eletronicamente e transportado através de uma ponta metálica para uma suspensão celular adequadamente concentrada. Esta sonicação (ou ultrassonicação) rompe a integridade celular com base na criação de cavidades na suspensão celular.
Lise Mecânica
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo é realizada por lise mecânica. As células podem ser lisadas mecanicamente e, opcionalmente, homogeneizadas para facilitar a coleta de
46/82 hidrocarbonetos (por exemplo, lipídeos). Por exemplo, um desregulador de pressão pode ser usado para bombear uma pasta fluida contendo células através de uma válvula de orifício restrito. Alta pressão (até 1500 bar) é aplicada, seguida por 5 uma expansão instantânea através de um bocal de saída. O , . rompimento celular é realizado por três mecanismos diferentes: impacto na válvula, alto cisalhamento líquido no * -- orifício e queda de pressão repentina após a descarga, causando uma explosão da célula. 0 método libera moléculas 10 intracelulares.
Em alternativa, um moinho de bolas pode ser usado.
Em um moinho de bolas, as células são agitadas em suspensão com pequenas partículas abrasivas, como microesferas. As células são rompidas devido à força de cisalhamento, moagem 15 entre microesferas e colisões com as microesferas. As microesferas rompem as células para liberar o conteúdo celular. As células também podem ser rompidas por forças de cisalhamento, como com o uso de liquidificação (como com um liquidificador Waring ou de alta velocidade como exemplos), a 20 prensa francesa, ou mesmo centrifugação no caso de paredes celulares fracas, para romper células.
Lisando Células por Choque Osmótico (Citólise) Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo é realizada pela 25 aplicação de um choque osmótico.
Infecção por um Vírus Lítico
Em uma realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende a infecção do micro-organismo com um vírus lítico. Uma grande variedade de 30 vírus são conhecidos por lisar micro-organismos adequados para uso na presente invenção, e a seleção e a uso de um vírus lítico particular para um micro-organismo particular está dentro do nível de habilidade na técnica.
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Por exemplo, o vírus de Chlorella em Paramecium bursaria (PBCV-1) é o protótipo de um grupo (família Phycodnaviridae, gênero Chlorovirus) de vírus grandes, icosaédricos, formadores de placa, de DNA dupla fita que se replicam em e lisam, certas algas verdes unicelulares, eucarióticas semelhantes à Chlorella. Consequentemente, quaisquer microalgas suscetíveis podem ser lisadas pela infecção da cultura com um vírus de Chlorella adequado. Veja, por exemplo, Adv. Virus Res. 2006; 66:293-336; Virology, 1999 Apr. 25; 257 (1):15-23,- Virology, 2004 Jan. 5; 318(1): 214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000; (44):161-2,- J. Virol.2006 March; 80(5): 2437-44; e Annu. Rev. Microbiol. 1999; 53:44794 .
Autólise (Expressão de um Gene Litico)
Em outra realização preferida da presente invenção, a etapa de lise de um micro-organismo compreende a autólise. Nesta realização, um micro-organismo de acordo com a invenção é geneticamente engenheirado para produzir uma proteína lítica que irá lisar o micro-organismo. Este gene lítico pode ser expresso usando um promotor induzível para que as células possam primeiro ser cultivadas a uma densidade desejável em um fermentador, seguidas por indução do promotor para expressar o gene lítico para lisar as células. Em uma realização, o gene lítico codifica uma enzima que degrada polissacarídeos.
Em certas outras realizações, o gene lítico é um gene de um vírus lítico. Assim, por exemplo, um gene lítico de um vírus de Chlorella pode ser expresso em uma célula de algas do gênero Chlorella, como C. protothecoides.
Os métodos de expressão adequada são descritos neste documento com relação à expressão de um gene de lipase. A expressão de genes líticos é feita preferivelmente utilizando um promotor induzível, como um promotor ativo em
48/82 microalgas que seja induzido por um estímulo, como a presença de uma pequena molécula, luz, calor e outros estímulos. Por exemplo, veja Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); e virology 230, 361-368 (1997).
Extração de Lipídeos e Hidrocarbonetos
Os lipídeos e hidrocarbonetos gerados pelos microorganismos da presente invenção podem ser recuperados por extração com um solvente orgânico. Em alguns casos, o solvente orgânico preferido é o hexano. Tipicamente, o solvente orgânico é adicionado diretamente ao lisado sem separação prévia dos componentes do lisado. Em uma realização, o lisado gerado por um ou mais dos métodos descritos acima entre em contato com um solvente orgânico por um período de tempo suficiente para permitir que os componentes lipídicos e/ou de hidrocarbonetos formem uma solução com o solvente orgânico. Em alguns casos, a solução pode em seguida ser adicionalmente refinada para recuperar componentes de hidrocarbonetos ou lipídicos desejados específicos. Os métodos de extração com hexano são bem conhecidos na técnica.
Métodos para Processar Lipídeos e Hidrocarbonetos Modificação Enzimãtica
Os hidrocarbonetos (por exemplo, lipídeos, ácidos graxos, aldeídos, álcoois e alcanos) produzidos pelas células como descrito neste documento podem ser modificadas pelo uso de uma ou mais enzimas, incluindo uma lipase. Quando os hidrocarbonetos estão no ambiente extracelular das células, uma ou mais enzimas podem ser adicionadas a esse ambiente em condições em que a enzima modifica o hidrocarboneto ou conclui sua síntese a partir de um precursor de hidrocarbonetos. Em alternativa, os hidrocarbonetos podem ser parcialmente, ou completamente, isolados do material celular
49/82 antes da adição de um ou mais catalisadores, como enzimas. Esses catalisadores são adicionados de forma exógena, e sua atividade ocorre fora da célula ou in vitro.
Modificação Catalítica Térmica e Outras
Hidrocarbonetos produzidos por células in vivo, ou enzimaticamente modificados in vitro, como descrito neste documento, podem ser opcionalmente tratados adicionalmente por meios convencionais. O processamento pode incluir o craqueamento para reduzir o tamanho e, assim, aumentar a proporção hidrogênio:carbono, de moléculas de hidrocarbonetos. Métodos de craqueamento térmico e catalítico são rotineiramente usados no processamento de óleo de triglicerídeos e hidrocarbonetos. Os métodos catalíticos envolvem o uso de um catalisador, como um catalisador ácido sólido. O catalisador pode ser sílica-alumina ou um zeólito, o que resulta na ruptura heterolítica, ou assimétrica, de uma ligação carbono-carbono para resultar em um carbocation e um ânion hidreto. Estes reativos intermediários, em seguida, passam por rearranjo ou transferência de hidreto com outro hidrocarboneto. As reações podem, assim, regenerar os intermediários para resultar em um mecanismo de autopropagação de cadeia. Os hidrocarbonetos também podem ser processados para reduzir, opcionalmente a zero, o número de ligações carbono-carbono duplas, ou triplas neles. Os hidrocarbonetos também podem ser processados para remover ou eliminar uma estrutura de anel ou cíclica neles. Os hidrocarbonetos também podem ser processados para aumentar a proporção hidrogênio:carbono. Isso pode incluir a adição de hidrogênio (hidrogenação) e/ou o craqueamento de hidrocarbonetos em hidrocarbonetos menores.
Os métodos térmicos envolvem o uso de temperatura e pressão elevadas para reduzir o tamanho de hidrocarbonetos. Podem ser usadas a uma temperatura elevada de cerca de 800 C
50/82 e pressão de cerca de 700 kPa. Estas condições geram luz, um termo que ás vezes é usado para referir-se a moléculas de hidrocarbonetos ricas em hidrogênio (como distinguido do fluxo de fótons), enquanto também geram, por condensação, moléculas de hidrocarbonetos mais pesadas que são relativamente desprovidas de hidrogênio. A metodologia provê ruptura homolítica, ou simétrica, ruptura e produz alcenos, que podem ser opcionalmente saturados enzimaticamente como descrito acima.
Os métodos catalíticos e térmicos são padrões em usinas para processamento de hidrocarbonetos e refino de petróleo. Assim, os hidrocarbonetos produzidos por células, como descrito neste documento, podem ser coletados e processados ou refinados através de meios convencionais. Veja, Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)) para um relatório sobre hidrocraqueamento de hidrocarbonetos produzidos por microalgas. Em realizações alternativas, a fração é tratada com outro catalisador, como um composto orgânico, calor e/ou um composto inorgânico. Para processamento de lipídeos em biodiesel, um processo de transesterificação é usado como descrito na Secção IV neste documento.
Os hidrocarbonetos produzidos através da presente invenção são úteis em uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, a produção de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS), um tensoativo aniônico usado em quase todos os tipos de detergentes e preparações para limpeza, utiliza hidrocarbonetos geralmente compreendendo uma cadeia de 10-14 átomos de carbono. Veja, por exemplo, Pat, Nos. US 6.946.430, 5.506.201, 6.692.730, 6.268.517, 6.020.509, 6.140.302, 5.080.848 e 5.567.359. Os tensoativos, como o LAS, podem ser usados na fabricação de composições de cuidados pessoais e detergentes, como aquelas descritas nas
51/82
Pat. Nos. US 5.942.479, 6.086.903, 5.833.999, 6.468.955 e
6.407.044.
Métodos para Produzir Combustíveis Adequados para Uso em Veículos a Diesel e Motores a jato
Crescente interesse é direcionado ao uso de componentes de hidrocarbonetos de origem biológica em combustíveis, como biodiesel, diesel renovável e combustível de jato, visto que estão disponíveis materiais de partida biológicos renováveis que podem substituir materiais de 10 partida derivados de combustíveis fósseis, e a sua utilização é desejável. Há uma necessidade de métodos para produzir componentes de hidrocarbonetos provenientes de materiais biológicos. A presente invenção atende a essa necessidade pela provisão de métodos para produzir biodiesel, diesel 15 renovável e combustível de jato usando os lipídeos gerados pelos métodos descritos neste documento como um material biológico para produzir biodiesel, diesel renovável e combustível de jato.
Os combustíveis de diesel tradicionais são 20 destilados de petróleo ricos em hidrocarbonetos parafínicos.
Eles têm intervalos de ebulição tão amplos como de 370 a 780 F, que são adequados para a combustão em um motor de ignição por compressão, como um veículo de motor a diesel. A Sociedade Americana de Testes e Materiais (ASTM) estabelece o 25 grau de diesel de acordo com o intervalo de ebulição, com intervalos admissíveis de outras propriedades de combustível, como o índice de cetano, ponto nuvem, ponto de fulgor, viscosidade, ponto de anilina, teor de enxofre, teor de água, teor de cinzas, corrosão em lâmina de cobre e resíduo de 30 carbono. Tecnicamente, qualquer material destilado de hidrocarbonetos derivado de biomassa ou de outra maneira que atenda à especificação apropriada da ASTM pode ser definido como combustível tipo diesel (ASTM D975), combustível de jato
52/82 (ASTM D1655), ou como biodiesel (ASTM D6751).
Após a extração, os componentes lipidicos e/ou de hidrocarbonetos recuperados a partir da biomassa microbiana descrita neste documento podem ser submetidos a tratamento químico para fabricar um combustível para uso em veículos a diesel e motores a jato.
Biodiesel
Biodiesel é um líquido que varia de cor - entre dourado e marrom escuro - dependendo da matéria-prima de produção. É praticamente imiscível com a água, tem um alto ponto de ebulição e baixa pressão de vapor. Biodiesel referese a um combustível processado equivalente ao diesel para uso em veículos de motor a diesel. O biodiesel é biodegradável e não tóxico. Um benefício adicional do biodiesel sobre o combustível tipo diesel convencional é o menor desgaste do motor.
Tipicamente, o biodiesel compreende ésteres de alquila C14-C18. Vários processos convertem biomassa ou um lipídeo produzido e isolado como descrito neste documento em combustíveis tipo diesel. Um método preferido para produzir biodiesel é por transesterificação de um lipídeo como descrito neste documento. Um éster alquílico preferido para uso como biodiesel é um éster metílico ou éster etílico.
biodiesel produzido por um método descrito neste documento pode ser usado sozinho ou misturado com o combustível diesel convencional em qualquer concentração na maior parte dos veículos de motor a diesel modernos. Quando misturado com o combustível diesel convencional (diesel de petróleo), o biodiesel pode estar presente de cerca de 0,1% a cerca de 99,9%. Grande parte do mundo usa um sistema conhecido como o fator B para indicar a quantidade de biodiesel em qualquer mistura de combustível. Por exemplo, o combustível contendo 20% de biodiesel é rotulado B20. O
53/82 biodiesel puro é referido como B100.
O biodiesel pode também ser usado como combustível para aquecimento em caldeiras domésticas e comerciais. As caldeiras de óleo existentes podem conter peças de borracha e 5 podem exigir a conversão para funcionarem com biodiesel. 0 processo de conversão geralmente é relativamente simples, envolvendo a troca de peças de borracha por peças sintéticas devido ao biodiesel ser um forte solvente. Devido ao seu forte poder solvente, a queima do biodiesel aumentará a 10 eficiência das caldeiras.
O biodiesel pode ser usado como um aditivo em formulações de diesel para aumentar a lubricidade do combustível Diesel de Enxofre Ultrabaixo (ULSD) puro, o que é vantajoso porque praticamente não tem teor de enxofre.
O biodiesel é um solvente melhor do que o petrodiesel e pode ser usado para quebrar depósitos de resíduos nas linhas de combustível de veículos que anteriormente funcionavam com petrodiesel.
Produção de Biodiesel
O biodiesel pode ser produzido por transesterificação de triglicerídeos contidos em biomassa rica em óleo. Assim, em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para produzir biodiesel. Em uma realização preferida, o método para produzir biodiesel compreende as 25 etapas de (a) cultivar um micro-organismo contendo lipídeos usando métodos divulgados neste documento, (b) lisar um micro-organismo contendo lipídeos para produzir um lisado, (c) isolar os lipídeos do micro-organismo lisado e (d) transesterificar a composição lipídica, por meio da qual o 30 biodiesel é produzido.
Métodos para.o cultivo de um micro-organismo, lise de um micro-organismo para produzir um lisado, tratamento do lisado em um meio que compreenda um solvente orgânico para
54/82 formar uma mistura heterogênea e separar o lisado tratado em uma composição lipídica foram descritos acima e também podem ser usados no método de produção de biodiesel.
As composições lipídicas podem ser submetidas à transesterificação para produzir ésteres de ácidos graxos de cadeia longa úteis como biodiesel. As reações de transesterificação preferidas são esboçadas a seguir e incluem transesterificação catalisada por base e transesterificação usando lipases recombinantes.
Em um processo de transesterificação catalisada por base, os triacilglicerídeos reagem com um álcool, como metanol ou etanol, na presença de um catalisador alcalino, tipicamente hidróxido de potássio. Esta reação forma ésteres metílicos ou etílicos e glicerina (glicerol) como um subproduto.
Processo Químico Geral
Óleos animais e vegetais são tipicamente feitos de triglicerídeos que são ésteres de ácidos graxos livres com o álcool tri-hídrico, glicerol. Na transesterificação, o glicerol em um triacilglicerídeo (TAG) é substituído com um álcool de cadeia curta como metanol ou etanol.
Usando Lipases Recombinantes
A transesterificação também foi realizada experimentalmente, utilizando uma enzima, como uma lipase em vez de uma base. A transesterificação catalisada por lipase pode ser efetuada, por exemplo, a uma temperatura entre a temperatura ambiente e 8 0°C e um razão molar do TAG para o álcool inferior superior a 1:1, preferivelmente cerca de 3:1.
As lipases adequadas para uso na transesterificação são encontrada, por exemplo, nas Pat. Nos. US 4.798.793, 4.940.845, 5.156.963, 5.342.768, 5.776.741 e W089/01032.
Um desafio para usar uma lipase para a produção de ésteres de ácidos graxos adequados para biodiesel é o de que
55/82 o preço da lipase é muito maior do que o preço do hidróxido de sódio (NaOH) usado pelo processo de base forte. Este desafio foi abordado usando uma lipase imobilizada, que pode ser reciclada. Entretanto, a atividade da lipase imobilizada 5 deve ser mantida após ser reciclado por um número mínimo de ciclos para permitir que um processo baseado em lipase compita com o processo de base forte em termos de custo de produção. As lipases imobilizadas estão sujeitas à envenenamento pelos álcoois inferiores tipicamente usados na 10 transesterificação. A Pat. No. US 6.398.707 (expedida em 4 de junho de 2002 para Wu et al.) descreve métodos para intensificar a atividade de lipases imobilizadas e regenerar lipases imobilizadas que possuem atividade reduzida.
Em realizações particulares, uma lipase 15 recombinante é expressa nos mesmos micro-organismos que produzem o lipídeo sobre o qual a lipase atua. O DNA que codifica a lipase e o marcador selecionável é preferivelmente cDNA com otimização de códon. Métodos para recodificar genes para a expressão em microalgas são descritos na Pat. No. US. 20 7.135.290.
Normas
A norma internacional comum para biodiesel é EN 14214. ASTM D6751 é a norma para biodiesel mais comum referenciada nos Estados Unidos e no Canadá. A Alemanha usa 25 DIN EN 14214 e o Reino Unido requer conformidade com BS EN 14214.
Testes industriais básicos para determinar se os produtos estão em conformidade com essas normas tipicamente incluem cromatografia gasosa, HPLC e outros. O biodiesel que 30 atende às normas de qualidade de biodiesel é muito não tóxico, com uma classificação de toxicidade (LD50) superior a 50 mL/kg.
Diesel Renovável
56/82 diesel renovável compreende alcanos, como C16:0 e C18:0 e assim, são distinguíveis do biodiesel. O diesel renovável de alta qualidade está em conformidade com a norma ASTM D975.
Os lipídeos produzidos pelos métodos da presente invenção podem servir como matéria-prima para produzir diesel renovável. Assim, em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para produzir diesel renovável. O diesel renovável pode ser produzido pelo menos por três processos: 10 processamento hidrotérmico (hidrotratamento);
hidroprocessamento; e liquefação indireta. Estes processos produzem destilados não éster. Durante esses processos, os triacilglicerídeos produzidos e isolados como descrito neste documento, são convertidos em alcanos.
Em uma realização preferida, o método para produzir diesel renovável compreende (a) cultivar um micro-organismo contendo lipídeos usando métodos divulgados neste documento, (b) lisar o micro-organismo para produzir um lisado, (c) isolar os lipídeos do micro-organismo lisado e (d) desoxigenar e hidrotratar os lipídeos para produzir um alcano, por meio do que o diesel renovável é produzido. Lipídeos adequados para a fabricação de diesel renovável podem ser obtidos através da extração de biomassa microbiana, usando um solvente orgânico como o hexano, ou através de 25 outros métodos, como aqueles descritos na Pat. No. US 5.928.696.
Em alguns métodos, o lipídeo microbiano é primeiro craqueado com hidrotratamento para reduzir o comprimento da cadeia de carbono e saturar as ligações duplas, 30 respectivamente. 0 material é em seguida isomerizado, também com hidrotratamento. A fração nafta pode em seguida ser removida através de destilação, seguida por destilação adicional para vaporizar e destilar os componentes desejados
57/82 no combustível diesel para atender a uma norma D975, enquanto deixa os componentes que são mais pesados do que o desejado para atender a norma D 975. Os métodos de hidrotratamento, hidrocraqueamento, desoxigenação e isomerização de modificação química de óleos, incluindo óleos de triglicerídeos, são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, os pedidos de patente europeia EP1741768 (Al), EP1741767 (Al) , EP1682466 (Al) , EP1640437 (Al) , EP1681337 (Al), EP1795576 (Al), e as Pat. Nos. US 7.238.277, 6.630.066; 6.596.155, 6.977.322, 7.041.866, 6.217.746, 5.885.440, 6.881.873.
Hidrotratamento
Em uma realização preferida do método para produzir diesel renovável, o tratamento dos lipídeos para produzir um alcano é realizado por hidrotratamento da composição lipídica. No processamento hidrotérmico, tipicamente, a biomassa reage em água a uma temperatura e pressão elevadas para formar óleos e sólidos residuais. As temperaturas de conversão são tipicamente 300 a 660 F, com pressão suficiente para manter a água principalmente como um líquido, de 100 a 170 atmosferas padrões (atm) . Os tempos de reação são da ordem de 15 a 30 minutos. Após a reação ser concluída, a parte orgânica é separada da água. Assim, é produzido um destilado adequado para diesel.
Hidroprocessamento
Um diesel renovável, referido como diesel verde, pode ser produzido a partir de ácidos graxos por tecnologia tradicional de hidroprocessamento. Os óleos contendo triglicerídeos podem ser hidroprocessados como co-suprimentos com petróleo ou como um suprimento dedicado. O produto é um combustível diesel que está em conformidade com a especificação ASTM D975. Assim, em outra realização preferida do método para produzir diesel renovável, o tratamento da
58/82 composição lipídica para produzir um alcano é realizado por hidroprocessamento da composição lipídica.
Em alguns métodos para fazer diesel renovável, a primeira etapa do tratamento de um triglicerídeo é o hidroprocessamento para saturar ligações duplas, seguido por desoxigenação em temperatura elevada na presença de hidrogênio e de um catalisador. Em alguns métodos, a hidrogenação e a desoxigenação ocorrem na mesma reação. Em outros métodos, a desoxigenação ocorre antes da hidrogenação. A isomerização é então opcionalmente realizada, também na presença de hidrogênio e de um catalisador. Componentes de nafta são preferivelmente removidos através de destilação. Para exemplos, veja, Pat. Nos. US 5.475.160 (hidrogenação de triglicerídeos), 5.091.116 (desoxigenação, hidrogenação e remoção de gás), 6.391.815 (hidrogenação) e 5.888.947 (isomerização).
Refinarias de petróleo usam hidroprocessamento para remover impurezas, pelo tratamento de suprimentos com hidrogênio. As temperaturas de conversão de hidroprocessamento são tipicamente 300 a 700 F. As pressões são tipicamente 40 a 100 atm. Os tempos de reação são tipicamente da ordem de 10 a 60 minutos.
Catalisadores sólidos são empregados para aumentar determinadas taxas de reação, melhorar a seletividade para determinados produtos e aperfeiçoar o consumo de hidrogênio.
hidrotratamento e o hidroprocessamento, por fim, conduzem a uma redução no peso molecular dos suprimentos. No caso de óleos contendo triglicerídeos, a molécula de triglicerídeos é reduzida a quatro moléculas de hidrocarbonetos em condições de hidroprocessamento: uma molécula de propano e três moléculas de hidrocarbonetos mais pesadas, tipicamente no intervalo de C8 a C18.
Liquefação Indireta
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Um diesel de enxofre ultrabaixo tradicional pode ser produzido a partir de qualquer forma de biomassa por um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, a biomassa é convertida em um gás de síntese, uma mistura gasosa rica em hidrogênio e monóxido de carbono. Em seguida, o gás de síntese é cataliticamente convertido em líquidos. Tipicamente, a produção de líquidos é realizada usando a síntese de Fischer-Tropsch (FT) . Esta tecnologia aplica-se a carvão, gás natural e óleos pesados. Assim, adicionalmente em outra realização preferida do método para produzir diesel renovável, o tratamento da composição lipídica para produzir um alcano é realizado por liquefação indireta da composição lipídica.
Combustível de Jato combustível de aeronave é claro a cor de palha. O combustível mais comum é um combustível baseado em óleo de parafina/sem chumbo classificada como Aeronave A-l, que é produzido por um conjunto de especificações internacionalmente padronizadas. O combustível de aeronave é uma mistura de um grande número de diferentes hidrocarbonetos, possivelmente tanto quanto mil ou mais. O intervalo de seus tamanhos (pesos moleculares ou números de carbono) é restrito pelos requisitos do produto, por exemplo, ponto de congelamento ou ponto de fumo. Combustível de aeronave tipo querosene (incluindo Jato A e Jato A-l) tem uma distribuição de número de carbono entre cerca de 8 e 16 números de carbono. Combustível de aeronave tipo nafta ou de ampla porcentagem (wide-cut) (incluindo Jato B) tipicamente tem uma distribuição de números de carbono entre cerca de 5 e 15 carbonos.
Ambas Aeronaves (Jato A e Jato B) podem conter vários aditivos. Aditivos úteis incluem, entre outros, antioxidantes, agentes antiestáticos, inibidores de corrosão
60/82 e agentes inibidores de congelamento em sistema de combustível (FSII). Os antioxidantes previnem gomagem e geralmente, baseiam-se em fenóis alquilados, por exemplo, AO30, AO-31, ou AO-37. Os agentes antiestáticos dissipam a eletricidade estática e previnem faíscas. Stadis 450 com ácido dinonilnaftilsulfônico (DINNSA) como princípio ativo é um exemplo. Os inibidores de corrosão, por exemplo, DCI-4A são usados para combustíveis civis e militares e DCI-6A é usado para combustíveis militares. Agentes FSII, incluem, por exemplo, Di-EGME.
Uma solução é a mistura de combustíveis de algas com o combustível de jato existente. A presente invenção provê essa solução. Os lipídeos produzidos pelos métodos da presente invenção podem servir como matéria-prima para produzir combustível de jato. Assim, em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para produzir combustível de jato. Deste modo, dois métodos para produzir combustível de jato a partir de lipídeos produzidos pelos métodos da presente invenção são fornecidos: craqueamento catalítico fluido (CCF); e hidrodesoxigenação (HDO).
Craqueamento Catalítico Fluido
O Craqueamento Catalítico Fluido (CCF) é um método que é usado para produzir olefinas, especialmente propileno a partir de frações brutas pesadas. Há relatos na literatura de que óleos vegetais como óleo de canola poderíam ser processados usando CCF para dar uma corrente de hidrocarbonetos útil como um combustível de gasolina.
Os lipídeos produzidos pelo método da presente invenção podem ser convertidos em olefinas. 0 processo envolve o fluxo de lipídeos produzidos através de uma zona de CCF e a coleta de uma corrente de produto composto por olefinas, que é útil como um combustível de jato. Os lipídeos produzidos entram em contato com um catalisador de
61/82 craqueamento em condições de craqueamento para prover uma corrente de produto compreendendo olefinas e hidrocarbonetos úteis como combustíveis de jato.
Em uma realização preferida, o método para produzir combustível de jato compreende (a) cultivar um microorganismo contendo lipídeos usando métodos divulgados neste documento, (b) lisar o micro-organismo contendo lipídeos para produzir um lisado, (c) isolar os lipídeos do lisado e (d) tratar a composição lipídica, por meio da qual o combustível de jato é produzido.
Em uma realização preferida do método para produzir um combustível de jato, a composição lipídica pode fluir através de uma zona de craqueamento catalítica fluida, que, em uma realização, pode compreender entrar por em contato a composição lipídica com um catalisador de craqueamento em condições de craqueamento para prover uma corrente de produto compreendendo olefinas C2-C5.
Em determinadas realizações desse método, pode ser desejável remover quaisquer contaminantes que possam estar presentes na composição lipídica. Assim, antes de fluir a composição de lipídica através de uma zona de craqueamento catalítica fluida, a composição lipídica é pré-tratada. O pré-tratamento pode envolver por em contato a composição lipídica com uma resina de troca iônica. A resina de troca iônica é uma resina de troca iônica ácida, como Amberlyst™15 e pode ser usada como um leito em um reator através do qual flui a composição lipídica, em fluxo ascendente ou em fluxo descendente. Outros pré-tratamentos podem incluir lavagens ácidas suaves, pondo em contato a composição lipídica com um ácido, como ácido sulfúrico, acético, nítrico, ou clorídrico. O contato é feito com uma solução ácida diluída geralmente à temperatura ambiente e pressão atmosférica.
62/82
A composição lipídica, opcionalmente pré-tratada, flui para uma zona de CCF onde os componentes de hidrocarbonetos são craqueados em olefinas. O craqueamento catalítico é alcançado pondo em contato a composição lipídica em uma zona de reação com um catalisador composto por material particulado finamente dividido. A reação é craqueamento catalítico, em oposição ao hidrocraqueamento, e é realizada na ausência de hidrogênio adicionado ou do consumo de hidrogênio. Conforme a reação de craqueamento prossegue, quantidades consideráveis de coque são depositadas no catalisador. 0 catalisador é regenerado a altas temperaturas pela queima de coque no catalisador em uma zona de regeneração. 0 catalisador contendo coque, referido neste documento como catalisador com formação de coque, é continuamente transportado da zona de reação para a zona de regeneração para ser regenerado e substituído por catalisador regenerado essencialmente sem coque da zona de regeneração. A fluidização das partículas de catalisador por várias correntes gasosas, permite o transporte de catalisador entre a zona de reação e zona de regeneração. Métodos para craqueamento de hidrocarbonetos, como aqueles da composição lipídica descrita neste documento, em uma corrente fluidizada do catalisador, transportando o catalisador entre as zonas de reação e regeneração, e o coque de combustão no regenerador são bem conhecidos pelos técnicos no assunto de processos de CCF. Exemplos de aplicações de CCF e catalisadores úteis para o craqueamento da composição lipídica para produzir olefinas C2-C5 são descritos nas Pat. Nos. US 6.538.169, 7.288.685, que são incorporados em sua totalidade pela referência.
Em uma realização, o craqueamento da composição lipídica da presente invenção, ocorre na seção do riser ou, em alternativa, a seção de elevação, da zona de CCF. A composição lipídica é introduzida no riser por um bocal,
63/82 resultando na vaporização rápida da composição lipídica. Antes de entrar em contato com o catalisador, a composição lipídica ordinariamente terá uma temperatura de cerca de 149 C a cerca de 316 C (300 F a 600 F). O catalisador flui de uma recipiente de mistura para o riser onde entra em contato com a composição lipídica por um tempo de cerca de 2 segundos ou menos.
Os vapores do catalisador misturado e da composição lipídica reagida são em seguida descarregados do topo do riser através de uma saída e separados em uma corrente de vapor de produto craqueado incluindo olefinas e uma coleção de partículas de catalisador cobertas com quantidades consideráveis de coque e geralmente referidas como catalisador com formação de coque. Em um esforço para minimizar o tempo de contato da composição lipídica e do catalisador, o que pode promover a conversão adicional de produtos desejados em outros produtos indesejáveis, qualquer disposição de separadores como um arranjo de braço espiral pode ser usada para remover o catalisador com formação de coque da corrente de produto rapidamente. O separador, por exemplo, separador de braço espiral, está localizado em uma parte superior de uma câmara com uma zona de extração situada na parte inferior da câmara. 0 catalisador separado pelo arranjo de braço espiral desce para a zona de extração. A corrente de vapor de produto craqueado compreendendo hidrocarbonetos craqueados incluindo olefinas leves e alguns catalisadores sai da câmara através de um conduto que comunica com ciclones. Os ciclones removem as partículas de catalisador remanescentes da corrente de vapor de produto para reduzir as concentrações de partículas para níveis muito baixos. A corrente de vapor de produto, em seguida, sai do topo do recipiente de separação. O catalisador separado pelos ciclones retorna para o recipiente de separação e, em
64/82 seguida, para a zona de extração. A zona de extração remove os hidrocarbonetos adsorvidos à superfície do catalisador por contato de contra-corrente com o vapor.
A baixa pressão parcial de hidrocarbonetos opera para favorecer a produção de olefinas leves. Consequentemente, a pressão do riser é fixada em cerca de 172 a 241 kPa (25 a 35 psia) com uma pressão parcial de hidrocarbonetos de cerca de 35 a 172 kPa (5 a 25 psia) , com uma pressão parcial de hidrocarbonetos preferida de cerca de 69 a 138 kPa (10 a 20 psia) . Esta pressão parcial relativamente baixa de hidrocarbonetos é conseguida usando vapor como um diluente na medida em que o diluente é 10 a 55% em peso da composição lipídica e preferivelmente cerca de 15% em peso da composição lipídica. Outros diluentes, como gás seco podem ser usados para alcançar pressões parciais de hidrocarbonetos equivalentes.
A temperatura da corrente craqueada na saída do riser será cerca de 510 C a 621 C (950 F a 1150 F) . Entretanto, temperaturas de saída do riser acima de 566 C (1050 F) fazem mais gás seco e mais olefinas. Enquanto que temperaturas de saída do riser abaixo de 566 C (1050 F) fazem menos etileno e propileno. Consequentemente, é preferível executar o processo de CCF a uma temperatura preferida de cerca de 566 C a cerca de 630 C, pressão preferida de cerca de 138 kPa a cerca de 240 kPa (20 a 35 psia). Outra condição para o processo é a razão de catalisador sobre composição de lipídica que pode variar de cerca de 5 a cerca de 20 e, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 15.
Em uma realização do método para produzir um combustível de jato, a composição lipídica é introduzida na seção de elevação de um reator de CCF. A temperatura na seção de elevação será muito quente e variará de cerca de 700 C (1292 F) a cerca de 760 C (1400 F) com uma razão de
65/82 catalisador sobre composição lipídica de cerca de 100 a cerca de 150. Prevê-se que a introdução da composição lipídica na seção de elevação produzirá quantidades consideráveis de propileno e etileno.
Os produtos de hidrocarbonetos gasosos e líquidos produzidos podem ser analisados por cromatografia gasosa, HPLC, etc.
Hidrodesoxigenação
Em outra realização do método para produzir um combustível de jato usando a composição lipídica ou os lipídios produzidos como descrito neste documento, a estrutura da composição lipídica ou os lipídeos são quebrados por um processo referido como hidrodesoxigenação (HDO).
HDO, significa a remoção de oxigênio por meio de hidrogênio, isto é, o oxigênio é removido ao mesmo tempo em que a estrutura do material é quebrada. As ligações duplas olefínicas são hidrogenadas e quaisquer compostos de enxofre e de nitrogênio são removidos. A remoção de enxofre é chamada de hidrodessulfurização (HDS). O pré-tratamento e a pureza das matérias-primas (composição lipídica ou os lipídeos) contribuem para a vida útil do catalisador.
Geralmente na etapa de HDO/HDS, o hidrogênio é misturado com a matéria-prima (composição lipídica ou os lipídeos) e, em seguida, a mistura passa através de um leito catalisador como um fluxo de co-corrente, como uma matériaprima de única fase ou de duas fases. Após a etapa HDO/MDS, a fração de produto é separada e passa para um reator de isomerização separado. Um reator de isomerização para material de partida biológico é descrito na literatura (FI 100 248) como um reator de co-corrente.
O processo para produzir um combustível por hidrogenação de um suprimento de hidrocarbonetos, por exemplo, a composição lipídica ou os lipídeos neste
66/82 documento, também pode ser realizado passando a composição lipídica ou os lipídeos como um fluxo de co-corrente com gás hidrogênio através de uma primeira zona de hidrogenação e, posteriormente, o efluente de hidrocarbonetos é hidrogenado adicionalmente em uma segunda zona de hidrogenação, passando gás hidrogênio para a segunda zona de hidrogenação como um fluxo de contra-corrente em relação ao efluente de hidrocarbonetos. Exemplos de aplicações de HDO e catalisadores úteis para o craqueamento da composição lipídica para produzir olefinas C2-C5 são descritos na Pat. No. US 7.232.935, que é incorporada em sua totalidade pela referência.
Tipicamente, na etapa de hidrodesoxigenação, a estrutura do componente biológico, como a composição lipídica ou os lipídeos neste documento, é decomposta, compostos de oxigênio, nitrogênio, fósforo e enxofre, e hidrocarbonetos leves como o gás são removidos, e as ligações olefínicas são hidrogenadas. Na segunda etapa do processo, isto é, na assim chamada etapa de isomerização, a isomerização é executada para ramificar a cadeia de hidrocarboneto e melhorar o desempenho da parafina a baixas temperaturas.
Na primeira etapa, ou seja, etapa de HDO do processo de craqueamento, o gás hidrogênio e a composição lipídica ou os lipídeos neste documento, que estão para ser hidrogenados passam para um sistema de leito catalisador de HDO como fluxos de co-corrente ou de contracorrente, o dito sistema de leito catalisador compreendendo um ou mais leitos catalisadores, preferivelmente 1-3 leitos catalisadores. A etapa de HDO é tipicamente operada de forma co-corrente. No caso de um sistema de leito catalisador de HDO compreendendo dois ou mais leitos catalisadores, uma ou mais dos leitos pode ser operado usando o princípio de fluxo contra-corrente.
Na etapa de HDO, a pressão varia entre 20 e 150
67/82 bar, preferivelmente entre 50 e 100 bar, e a temperatura varia entre 200 e 500 C, preferivelmente no intervalo de 300400 C.
Na etapa de HDO, conhecidos catalisadores de hidrogenação contendo metais do Grupo VII e/ou VIB do Sistema Periódico podem ser usados. Preferivelmente, os catalisadores de hidrogenação são catalisadores de Pd, Pt, Ni, NiMo ou CoMO suportados, o suporte sendo alumina e/ou silica. Tipicamente, catalisadores de NiMo/Al203 e CoMo/A1203 são usados.
Antes da etapa de HDO, a composição lipídica ou os lipídeos neste documento podem opcionalmente ser tratados por pré-hidrogenação em condições mais brandas, evitando assim reações laterais das ligações duplas. Tal pré-hidrogenação é efetuada na presença de um catalisador de pré-hidrogenação a temperaturas de 50 400 C e em pressões de hidrogênio de 1 200 bar, preferivelmente a uma temperatura entre 150 e 250 Cea uma pressão de hidrogênio entre 10 e 100 bar. O catalisador pode conter metais do Grupo VIII e/ou VIB do Sistema Periódico. Preferivelmente, o catalisador de pré-hidrogenação é um catalisador de Pd, Pt, Ni, NiMo ou CoMO suportado, o suporte sendo alumina e/ou silica.
Uma corrente gasosa da etapa de HDO contendo hidrogênio é resfriada e, em seguida, monóxido de carbono, dióxido de carbono, compostos de nitrogênio, fósforo e enxofre, hidrocarbonetos gasosos leves e outras impurezas são removidos dela. Após compressão, o hidrogênio purificado ou hidrogênio reciclado retorna para o primeiro leito catalisador e/ou entre os leitos catalisadores para compensar a corrente de gás retirada. A água é removida do líquido condensado. 0 líquido passa para o primeiro leito catalisador ou entre os leitos catalisadores.
Após a etapa de HDO, o produto é submetido a uma etapa de isomerização. É importante para o processo que as
68/82 impurezas sejam removidas tão completamente quanto possível antes dos hidrocarbonetos entrarem em contato com o catalisador de isomerização. A etapa de isomerização compreende uma etapa de extração opcional, em que o produto de reação da etapa de HDO pode ser purificado por extração com vapor d'água ou de um gás adequado como hidrocarbonetos leves, nitrogênio ou hidrogênio. A etapa de extração opcional é efetuada de modo contra-corrente em uma unidade a montante do catalisador de isomerização, em que o gás e o líquido entram em contato entre si, ou antes do reator de isomerização real em uma unidade de extração separada que utiliza o princípio de contra-corrente.
Após a etapa de extração, o gás hidrogênio e a composição lipídica hidrogenada ou os lipídeos neste documento e, opcionalmente, uma mistura de n-parafina, passam para uma unidade de isomerização reativa que compreende um ou vários leitos catalisadores. Os leitos catalisadores da etapa
de isomerização podem operar de modo de co-corrente ou
contra-corrente.
É importante para o processo que o princípio de
fluxo de contra-corrente seja aplicado na etapa de
isomerização. Na etapa de isomerização, isso é feito pela execução da etapa opcional de extração ou da etapa de reação de isomerização ou ambas de modo de contra-corrente.
A etapa de isomerização e a etapa de HDO podem ser efetuadas no mesmo vaso de pressão ou em vasos de pressão separados. A pré-hidrogenação opcional pode ser efetuada em um vaso de pressão separado ou no mesmo vaso de pressão como as etapas de HDO e de isomerização.
Na etapa de isomerização, a pressão varia no intervalo de 20 150 bar, preferivelmente no intervalo de 20 100 bar, a temperatura estando entre 200 e 500 C, preferivelmente entre 300 e 400 C.
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Na etapa de isomerização, os catalisadores de isomerização conhecidos na técnica podem ser usados. Catalisadores de isomerização adequados contêm peneira molecular e/ou um metal do Grupo VII e/ou um veículo. Preferivelmente, o catalisador de isomerização contém SAPO-11 ou SAPO41 ou ZSM-22 ou ZSM-23 ou ferrierita e Pt, Pd ou NI e A12O3 ou SiO2. Típicos catalisadores de isomerização são, por exemplo, Pt/SAPO-ll/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 e Pt/SAPO-ll/SÍO2.
Como o produto, um componente de hidrocarbonetos de alta qualidade de origem biológica, útil como um combustível tipo diesel ou seu componente, é obtido, a densidade, índice de cetano e o desempenho em baixa temperada do dito componente de hidrocarbonetos sendo excelente.
Engenharia de Micróbios
Como mencionado acima, em determinadas realizações da presente invenção é desejável modificar geneticamente um micro-organismo para intensificar a produção de lipídios, modificar as propriedades ou as proporções de componentes gerados pelo micro-organismo, ou melhorar ou prover características de crescimento de novo em uma variedade de materiais de matérias-primas.
Promotores, cDNAs e 3'UTRs, assim como outros elementos dos vetores, podem ser gerados através de técnicas de clonagem que usam fragmentos isolados de fontes nativas (veja, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al.(3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press; e Pat. No. US 4.683.202). Em alternativa, os elementos podem ser gerados sinteticamente usando métodos conhecidos (veja, por exemplo, Gene. 1995 Oct. 16; 164(1) : 49-53) . Métodos de engenharia microbiana são em geral conhecidos na técnica, por exemplo, a Pat. No. US 20090011480, incorporada neste documento pela referência em sua totalidade, para todas os
70/82 fins .
EXEMPLOS
Abaixo estão exemplos de realizações específicas para a execução da presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer maneira. Esforços foram feitos para garantir precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro e desvio experimental, evidentemente, são permitidos.
A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, os métodos convencionais de química de proteínas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993) ; A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adição atual); Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc. ); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Editção (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3a Ed. (Plenum Press) Vols A e B (1992) .
Exemplo 1: Aumento de biomassa por aplicação de iluminação de baixa intensidade à fermentação de microalgas.
Botryococcus naturalmente sintetiza e tolera misturas de hidrocarbonetos e produz tanto quanto 85% de hidrocarbonetos em peso e em muitos casos o hidrocarboneto principal é botriococeno. Ele também é conhecido por ser um fotoautotrofo obrigatório, mas parece ter a habilidade de absorver glicose (Referência: Biosynthesis of the triterpenoids, botryococcenes and tetramethylsqualene in the
71/82
B race of Botryococcus braunii via the non-mevalonate pathway Sato et al. 2003. Tetrahedron Letter 44: 7035-7037).
A cultura de Botryococcus é cultivada em meios BG11 (Referência: Autotrophic cultivation of Botryococcus braunii for the production of hydrocarbons and exopolysaccharides in various media. Dayananda et al. 2007. Biomass and Bioenergy. 31: 87-93) a 25-35 DC em urn biorreator com 10-30% de oxigênio dissolvido. Os efeitos do sinal luminoso sobre o crescimento heterotrófico de Botryococcus são testados, comparando-se o peso seco celular das culturas de diferentes condições (escuro + sem glicose, escuro + glicose, luz + sem glicose e luz + glicose). A intensidade de luz ideal (0,01-300 pmols de fótons m'2 s-1) e o espectro luminoso diferente (360-700 nm) , assim como diferentes períodos luminosos (9-16 h) são testados. A combinação de baixa irradiância de luz e glicose resulta em a) maior taxa de crescimento, b) aumento de produtos, como carotenoides, lipídeos e botriococenos.
Exemplo 2: Regulação de luz da via de isoprenoides.
O isopreno, monoterpenos e sesquiterpenes são sintetizados e emitidos por algumas espécies de plantas e microalgas, mas nem todas as espécies têm essa capacidade. Estes compostos isoprenoides voláteis, não essenciais compartilham os mesmos precursores bioquímicos dos isoprenoides maiores comercialmente úteis como carotenoides e hidrocarbonetos. Duas vias separadas operam em células vegetais para sintetizar precursores de prenil difosfato comuns a todos os isoprenoides.
Precursores citosólicos e mitocondriais são produzidos pela via do mevalonato (MVA) enquanto que a via do metileritritol fosfato (MEP) recentemente descoberta situa-se nos plastídeos. Botryococcus braunii produz hidrocarbonetos pela via do MEP, não mevalônica (Figura 2).
A luz é o fator ambiental mais importante para a
72/82 regulação da via do MEP. A 1-desóxi-d-xilulose 5-fosfato redutoisomerase (DXR) é a etapa de taxa limitante, e a expressão do gene que codifica DXR é regulada por luz (Referência: Expression and molecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, the first committed enzyme of the 2-cmethyl-d-erythritol 4-phosphate pathway. Carretero-Paulet et al. Plant Physiology. 2002. 129: 1581-1591).
Outro exemplo é a ativação por luz azul de genes que codificam enzimas da biossíntese de carotenoides em Chlamydomonas reinhardtii, uma alga verde unicelular. Experimentos de microarranjos e de PCR quantitativo mostraram que os genes que codificam enzimas da biossíntese de carotenoides como PDS, HDS, PSY e ZDS são ativados por irradiância muito baixa da luz branca (0,01 pmol de fótons m 2 s'1) e luz azul. Outra evidência sugeriu que a fototropina, um receptor de luz azul, está envolvida na expressão de genes ativados por luz azul para a biossíntese de carotenoides (Referência: Phototropin involvement in the expression of genes encoding chlorophyll and carotenoid biosynthesis enzymes and LHC apoproteins in Chlamydomonas reinhardtii. Im et al. The Plant Journal. 2006. 48: 1-16).
Um exemplo é o aumento da produção de hidrocarbonetos de Botryococcus. Várias intensidades de luz (0,01-300 pmols de fótons m‘2 s'1) e espectro de luz diferente (360-700 nm) são aplicados a uma cultura de Botryococcus, e a quantidade de espécies diferentes de hidrocarbonetos é medida por CG-EM.
Exemplo 3. Crescimento de Neochloris oleabundans em diferentes condições luminosas
Materiais e Métodos
Microalgas e condição de cultivo
A cepa UTEX 1185 de Neochloris oleabundans foi
73/82 obtido a partir da coleção de cultura de algas da Universidade do Texas (Austin, TX, EUA) . A cultura inicial das microalgas foi cultivada em frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 120 mL de meio 3 N bold modificado com 2% de glicose a 25°C de temperatura ambiente com uma folha de alumínio cobrindo frouxamente o frasco em um agitador orbital a 130 rpm sob a alternação de dois bulbos de luz fluorescente de aquário e plantas de 40W (392282, Philips) e dois de luz solar natural de 4 0W (3 92316, Philips) . O meio de cultura (MB3N modificado) continha os seguintes componentes por 1 L de água deionizada: 0,75 g de NaNO3, 0,075 g de K2HPO4, 0,074 g de MgSO4 7H2O, 0,025 g de CaCl2 2H2O, g 0,176 g de KH2PO4 0,025 g de NaCl, 6 mL de solução de P-metal IV (0,75 g de Na2EDTA 2H2O, 0,097 g de FeCl3 6H2O, 0,041 g de MnCl2 4H2O, 0,005 g de ZnCl2, 0,002 g de CoCl2 6H2O, 0,004 g de Na2Mo04 2H2O em 1L de água dl), 1 mL de cada três vitaminas (0,1 mM de vitamina B12, 0,1 mM de biotina, 6,5 mM de tiamina dissolvida separadamente em 50 mM de HEPES pH 7,8) . 0 pH final do meio foi ajustado para 7,5 com 2 0% de KOH antes da autoclavação do meio. As soluções de vitamina foram adicionadas para resfriar o meio autoclavado. Uma vez que a cultura inicial tenha alcançado certa confluência, sua concentração foi medida usando a densidade óptica (DO) em 680nm e 750nm usando o espectrofotômetro Genesys 10 UV (Thermo Scientific).
Procedimento experimental e medição do crescimento Três diferentes comprimentos de onda de luz (branco, azul e vermelho) foram testados. As luzes de LED foram adquiridas na Super Bright LEDs, Inc. (branca: RL5W3030, azul: RL5-B2430, vermelho: RL5-R1330). Para cada comprimento de onda de luz, quatro diferentes condições foram estabelecidas em duplicata da seguinte forma:
1-2. MB3N modificado + sem glicose + escuro
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3-4. MB3N modificado + sem glicose + meia-luz
5-6. MB3N modificado + 2% de glicose + escuro
7-8. MB3N modificado + 2% de glicose + meia-luz
Um total de oito frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo um volume final de cultura de células de 120 mL foram preparados com uma concentração de células inicial de DO 0,1 em 750 nm (~l,lx 10Gcélulas/mL) para cada condição. A intensidade de luz foi fixada em 3-4 pmol/m2s'1 fótons para branco, 2-3 pmol/m2s‘1 fótons para azul e 1-2 pmol/m2s'1 fótons para vermelho. A velocidade do agitador orbital foi fixada em 135 rpm. O experimento foi realizado à temperatura ambiente por duas semanas. Um mililitro da cultura de células foi obtido de cada frasco a cada 24 h para avaliar as concentrações de células medindo a DO em 68 0 nm e 750 nm usando o espectrofotômetro Genesys 10 UV da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) . A taxa de crescimento específico foi determinada pela plotagem do logaritmo da densidade óptica da cultura contra o tempo (Figura 3) . A combinação de uma baixa irradiância da luz vermelha, branca ou azul e glicose resultou em uma taxa de crescimento maior em comparação aos controles.
Exemplo 4. Crescimento de Botryococcus sudeticus em diferentes condições luminosas
Materiais e Métodos
Cepas e meios
A cepa UTEX 2629 de Botryococcus sudeticus foi obtido a partir da coleção de cultura de algas da Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). A cultura-estoque foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 120 mL de meio BG11 modificado com 2% de glicose a 25°C de temperatura ambiente com meia-luz (fótons de 4-5 pmol/m2s'1) em um agitador orbital a 13 0 rpm. A iluminação a meia-luz é composta por dois bulbos diferentes, bulbos de luz
75/82 fluorescente de planta e aquário de 40W (392282 da Philips) e luz solar natural de 4 0W (3 92316 da Philips) . Um litro de meio de cultura (BG-11 modificado) continha: 10 mM de HEPES (pH 7,8), 1,5 g de NaNO3, 0,04 g de K2HPO4, 0,06 g de MgSO4
7H20, 0,036 g de CaCl2 2H2O, 0,006 g de ácido cítrico H2O, 0,0138 g de citrato férrico de amônio, 0,001 g de Na2EDTA 2H2O, 0,02 g de Na2CO3, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2
4H2O, 0,22 mg de ZnSO4 7H2O, 0,39 mg de Na2Mo04 2H2O, 0,079 mg de CuSO4 5H2O, 0,04 94 mg de Co(N03) 2 6H2O, 0,5 g de hidrolisado de caseína e 1 mL de cada uma das três vitaminas (0,1 mM de vitamina B12, 0,1 mM de biotina, 6,5 mM de tiamina dissolvida separadamente em 50 mM de HEPES pH 7,8) . O pH final do meio foi ajustado para 7,8 com 20% de KOH.
Procedimento experimental e medição do crescimento
Três diferentes comprimentos de onda de luz (branco, azul e vermelho) foram testados. As luzes de LED foram adquiridas na Super Bright LEDs, Inc. (branca: RL5W3030, azul: RL5-B2430, vermelho: RL5-R1330). Para cada comprimento de onda de luz, quatro diferentes condições foram estabelecidas em duplicata da seguinte forma:
1-2 . BG-11 modificado + sem glicose + escuro
3-4 . BG-11 modificado + sem glicose + meia-luz
5-6 . BG-11 modificado + 2% de glicose + escuro
7-8 . BG-11 modificado + 2% de glicose + meia-luz
Um total de oito frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo um volume final de cultura de células de 120 mL foram preparados com uma concentração de células inicial de DO 0,1 em 750 nm (~l,lx 106células/mL) para cada condição. A intensidade de luz foi fixada em 3-4 pmol/m2s’1 fótons para branco, 2-3 pmol/m2s'1 fótons para azul e 1-2 pmol/m2s1 fótons para vermelho. A velocidade do agitador orbital foi fixada em 135 rpm. O experimento foi realizado à temperatura ambiente por duas semanas. Um mililitro de culturas de células foi
76/82 obtido de cada frasco todo dia para avaliar as concentrações de células medindo a DO em 680 nm e 750 nm usando o espectrofotômetro Genesys 10 UV da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) . A taxa de crescimento específico foi determinada pela plotagem do logaritmo da densidade óptica da cultura contra o tempo (Figura 4). A combinação de uma baixa irradiância da luz vermelha, branca ou azul e glicose resultou em uma taxa de crescimento maior em comparação aos controles.
Exemplo 5: Botryococcus brauniií Fermentação com iluminação controlada
Materiais e Métodos
Cepas e meios
A cepa UTEX 2441 de Botryococcus braunii foi obtida a partir da coleção de cultura de algas da Universidade do Texas (Austin, TX, EUA) . A cultura-estoque foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 120 mL de meio BG11 modificado com 2% de glicose a 25°C de temperatura ambiente com meia-luz (fótons de 4-5 pmol/m2s'1) em um agitador orbital a 13 0 rpm. A iluminação a meia-luz foi composta por dois bulbos diferentes, bulbos de luz fluorescente de planta e aquário de 40W (392282 da Philips) e luz solar natural de 40W (392316 da Philips) . Um litro de meio de cultura (BG-11 modificado) continha: 10 mM de HEPES (pH 7,8) , 1,5 g de NaNO3, 0,04 g de K2HPO4, 0,06 g de MgSO4 7H2O, 0,036 g de CaCl2 2H2O, 0,006 g de ácido cítrico H2O, 0,0138 g de citrato férrico de amônio, 0,001 g de Na2EDTA 2H2O, 0,02 g de Na2CO3, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2 4H2O, 0,22 mg de ZnSO4 7H2O, 0,39 mg de Na2Mo04 2H2O, 0,079 mg de CuSO4 5H2O, 0,04 94 mg de Co(N03) 2 6H2O, 0,5 g de hidrolisado de caseína e 1 mL de cada uma das três vitaminas (0,1 mM de vitamina B12, 0,1 mM de biotina, 6,5 mM de tiamina dissolvida separadamente em 50 mM de HEPES pH 7,8). O pH final do meio foi ajustado para 7,8
77/82 com 20% de KOH.
Procedimento experimental e medição do crescimento
Três diferentes comprimentos de onda de luzes (branco, azul e vermelho) foram testados. As luzes de LED foram adquiridas na Super Bright LEDs, Inc. (branca: RL5W3030, azul: RL5-B2430, vermelho: RL5-R1330). Para cada comprimento de onda de luz, quatro diferente condições foram
estabelecidas em duplicata da seguinte forma:
1-2 BG-11 modificado + sem glicose + escuro
3-4 BG-11 modificado + sem glicose + meia-luz
5-6 BG-11 modificado + 2% de glicose + escuro
7-8 BG-11 modificado + 2% de glicose + meia-luz
Um total de oito frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo um volume final de cultura de células de 120 mL foram preparados com uma concentração de células inicial de DO 0,1 em 750 nm (~l,lx 106células/mL) para cada condição. A intensidade de luz foi fixada em 3-4 pmol/m2s'1 fótons para branco, 2-3 pmol/m2s'1 fótons para azul e 1-2 pmol/n^s'1 fótons para vermelho. A velocidade do agitador orbital foi fixada em 150 rpm. 0 experimento foi realizado à temperatura ambiente por duas semanas. Cinco mililitros de cada cultura de células foram obtidos de cada frasco a cada dois dias para avaliar o crescimento celular pelo peso seco das células (PSC). A taxa de crescimento específico foi determinada pela plotagem do logaritmo do PSC da cultura contra o tempo (Figura 5).
Medição de fluorescência de lipídeos neutros usando Vermelho do Nilo
Em 1 mL de suspensão de algas, 4 uL de solução de Vermelho do Nilo em acetona (250 ug/mL) foram adicionados. A mistura foi agitada em vórtex 2 vezes durante uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, 200 uL de amostras de algas coradas foram transferidos para poços individuais em uma placa de 96 poços. A fluorescência foi
78/82 medida em um espectrofluorômetro para placa de 96 poços da Molecular Devices com um comprimento de onda de excitação de 490 nm e de emissão de 585 nm com filtro de corte de emissão em 530. A fim de determinar a intensidade de fluorescência relativa das amostras de algas, o branco (Vermelho do Nilo
sozinho no meio) foi subtraído da intensidade de
fluorescência.
Resultados
Luz vermelha + glicose aumentou a taxa de
crescimento de UTEX 2441 em 3 5% em comparação com a cultura
heterotrófica no escuro (Escuro + gli) (Figura 5). Os níveis de lipídeos também tiveram um aumento de 52% em condições de luz vermelha em comparação aos controles (Figura 6).
Exemplo 6: Chlamydomonas reinhardtiit Fermentação com iluminação controlada
Materiais e Métodos
Cepas e meios
A cepa UTEX 2243 de Chlamydomonas reinhardtii foi obtida a partir da coleção de cultura de algas da Universidade do Texas (Austin, TX, EUA) . A culturas-estoque foram cultivadas separadamente em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 120 mL de meio TAP a 25°C de temperatura ambiente com meia-luz (fótons de 4-5 pmol/m2s U em um agitador orbital a 13 0 rpm. A iluminação a meia-luz foi composta por dois bulbos diferentes (bulbos de luz fluorescente de planta e aquário de 40W (392282 da Philips) e luz solar natural de 40W (392316 da Philips)). Um litro de meio de cultura (TAP) continha: 2,42 g de Tris, 25 mL de solução de sais de TAP (15 g de NH4C1, 4 g de MgSO4 7H2O, 2g de CaCl2 2H2O) , 0,375 mL de solução de fosfato (28,8 g de K2HPO4, 14,4g KH2PO4 em 100 mL de água) , 1 mL de solução de elementos-traço de Hutner (1 L de solução de metal traço contém 50 g de sal dissódico de EDTA, 22 g de ZnSO4 7H2O, 11,4 g de H3BO4, 5,06 g de MnCl2
79/82
4H2O, 1,61 g de CoCl2 6H2O, 1,57 g de CuSO4 5H2O, 1,10 (NH4)6Mo7024 4H2O, 4,99 g de FeSO4 7H2O com pH 7,0 usando KOH ou HC1) e 1 mL de ácido acético glacial. 0 pH final do meio é 7,0 ajustado com ácido acético glacial. Meio mínimo de Tris (TP) foi feito com todos os componentes listados acima, com exceção do ácido acético. 0 pH do meio foi ajustado a 7,0 com HC1.
Procedimento experimental e medição do crescimento
As luzes de LED foram adquiridas na Super Bright LEDs, Inc. (RL5-W3030). Quatro diferentes condições foram estabelecidas em duplicata da seguinte forma:
1-2. TP (sem ácido acético) + escuro
3-4. TP (sem ácido acético) + meia-luz
5-6. TAP (sem ácido acético) + meia-luz
7-8. TAP (sem ácido acético) + meia-luz
Um total de oito frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo um volume final de cultura de células de 120 mL foram preparados com uma concentração de células inicial de 1,0 x 105células/mL para cada condição. A intensidade da luz foi fixada em 3-5 pmol/m2s'1 fótons. A velocidade do agitador orbital foi fixada em 140 rpm. 0 experimento foi realizado à temperatura ambiente por uma semana. Quinhentos microlitros de cultura celular foram obtidos de cada frasco todos os dias para avaliar o crescimento celular pela contagem do número de células. As células foram desflageladas com solução de lugol (1:20) antes da contagem. A taxa de crescimento específico foi determinada pela plotagem do número de células contra o tempo. A combinação de uma baixa irradiância de luz branca e TAP resultou em uma taxa de crescimento maior em comparação aos controles (Figura 7).
Exemplo 7: Cultivo de microalgas com uma baixa irradiância de luz
Materiais e Métodos
80/82
Cepas e meios
As cepas de microalgas (por exemplo, Chlamydomonas, Botryococcus, Neochloris, Cyanophyta, Chlorophyta, Rhodophyta, Cryptophyta, Chlorarachniophyta, Haptophyta, Euglenophyta, Heterokontophyta, diatomáceas e/ou aquelas descritas na descrição acima) são obtidas a partir, por exemplo, da coleção de cultura de algas da Universidade do Texas (Austin, TX, EUA) . A cultura-estoque é cultivada, por exemplo, em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo o meio apropriado (veja, por exemplo, as instruções do fabricante) a cerca de 25°C de temperatura ambiente com meia-luz (por exemplo, 4-5 pmol/m2s1 fótons) em um agitador orbital em cerca de 130 rpm. Uma fonte de carbono apropriada é usada nos meios de cultura, por exemplo, glicose. A iluminação a meialuz pode ser composta por dois bulbos diferentes, por exemplo, bulbos de luz fluorescente de planta e aquário de 40W (392282 da Philips) e luz solar natural de 40W (392316 da Philips). O pH final do meio é ajustado como apropriado para a cepa particular. Veja, por exemplo, as instruções do fabricante.
Procedimento experimental e medição do crescimento
Três diferentes comprimentos de onda de luz (branco, azul e vermelho) são testados. As luzes de LED são adquiridas, por exemplo, na Super Bright LEDs, Inc. (branca: RL5-W3030, azul: RL5-B2430, vermelho: RL5-R1330). Para cada comprimento de onda de luz, quatro diferentes condições são estabelecidas em duplicata da seguinte forma:
1-2 sem carbono + escuro
3-4 sem carbono + meia-luz
5-6 carbono + escuro
7-8 carbono + meia-luz
Um total de oito frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo um volume final de cultura de células de 120 mL são
81/82 preparados com uma concentração de células inicial de, por exemplo, DO 0,1 em 750 nm (-1,1 x 106células/mL) para cada condição. A intensidade de luz ideal (por exemplo, 0,01-300 pmols de fótons m'2 s'1) e diferentes espectros luminosos (por exemplo, 360-700 nm) , assim como diferentes períodos luminosos (por exemplo, 9-16 h) são testados. A intensidade de luz é fixada, por exemplo, em 3-4 pmol/m2s'1 fótons para branco, 2-3 pmol/m2s'1 fótons para azul e 1-2 pmol/m2s‘1 fótons para vermelho. Várias fontes de carbono em várias concentrações são testadas, por exemplo, glicose, sacarose, frutose em uma concentração de, por exemplo, 1%, 2%, ou 3% dos meios de cultura. A velocidade do agitador orbital é fixada, por exemplo, em 150 rpm. O experimento é efetuado à temperatura ambiente por menos de uma, uma, duas, três, ou mais semanas. Uma alíquota de cada cultura de células é obtida de cada frasco a cada um a dois dias para avaliar o crescimento celular, por exemplo, pelo peso seco das células (PSC) . A taxa de crescimento específico é determinada pela plotagem do PSC da cultura contra o tempo.
Medição de material de interesse
A quantidade de material de interesse (hidrocarbonetos, lipídeos, etc.) nos meios é medida usando meios padrões conhecidos na técnica, por exemplo, CG-EM ou Vermelho do Nilo como descrito acima. Por exemplo, em 1 mL de suspensão de algas, 4 uL de solução de Vermelho do Nilo em acetona (250 ug/mL) são adicionados. A mistura é agitada em vórtex durante a incubação à temperatura ambiente. Após a incubação, 100-200 uL de amostras de algas coradas são transferidos para poços individuais em uma placa de 96 poços. A fluorescência é medida, por exemplo, em um espectrofluorômetro para placa de 96 poços da Molecular Devices com um comprimento de onda de excitação de 4 90 nm e de emissão de 585 nm com filtro de corte de emissão em 530. A
82/82 fim de determinar a intensidade de fluorescência relativa das amostras de algas, o branco (Vermelho do Nilo sozinho no meio) é subtraído da intensidade de fluorescência.
Resultados
A luz vermelha, branca e/ou luz azul em combinação com uma fonte de carbono aumenta a taxa de crescimento da cepa de microalgas em comparação aos controles. Os níveis do material de interesse (por exemplo, hidrocarbonetos ou lipídeos) produzidos pelo cepa experimental de microalgas (luz vermelha, branca e/ou azul em combinação com uma fonte de carbono) tiveram aumento em comparação com os controles.
Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a uma realização preferida e várias realizações alternativas, será compreendido por técnicos no assunto relevante que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção.
Todas as referências, patentes expedidas e pedidos de patente citados dentro do corpo do presente relatório descritivo ficam incorporados pela referência em sua totalidade, para todos os fins.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. MÉTODO PARA CULTIVAR MICROALGAS CAPAZES DE CRESCIMENTO HETEROTRÓFICO, caracterizado por compreender:
    incubar as microalgas em uma condição de crescimento heterotrófico por um período de tempo suficiente para permitir que as microalgas cresçam, em que a condição de crescimento heterotrófico compreende meios que compreendem uma fonte de carbono fixado, e em que a condição de crescimento heterotrófico compreende adicionalmente uma irradiância de luz branca 0,01-4 qmol de fótons/m2s, luz azul 0,01-3 qmol de fótons/m2s, e luz vermelha 0,01-2 qmol de fótons/m2s, em que a microalga é uma cepa de Botryococcus, cepa de Neochloris, ou cepa de Chlamydomonas.
    2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa de Botryococcus sudeticus. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa UTEX 2629. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa de Botryococcus braunii. 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa UTEX 2441. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa de Neochloris oleobundans. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa UTEX 1185. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a microalga é uma cepa UTEX 2243. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que as microalgas compreendem um
    fotorreceptor.
    Petição 870190080467, de 19/08/2019, pág. 5/10
  2. 2/4
    10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a fonte de carbono é glicose.
    11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a fonte de carbono é selecionada do grupo que consiste em uma fonte de carbono fixado, glicose, frutose, sacarose, galactose, xilose, manose, ramnose, Nacetilglicosamina, glicerol, floridosídeo, ácido glicurônico, amido de milho, material celulósico despolimerizado, cana de açúcar, beterraba sacarina, lactose, soro de leite e melaço.
    12. MÉTODO de acordo com reivindicação 1 caracterizado em que a luz é produzida por uma fonte de luz natural.
    13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a luz é luz solar natural.
    14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a luz compreende todo o espectro luminoso ou um comprimento de onda específico de luz.
    15. MÉTODO de acordo com reivindicação 1 caracterizado em que a luz é produzida por uma fonte de luz artificial.
    16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a luz é luz artificial.
    17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a produção de um material a partir das microalgas.
    18. MÉTODO de acordo com a reivindicação caracterizado em que o material é um polissacarídeo, um pigmento, um lipídeo, ou um hidrocarboneto.
    19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado em que o material é um hidrocarboneto.
    20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender adicionalmente a recuperação do material.
    Petição 870190080467, de 19/08/2019, pág. 6/10
  3. 3/4
    21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender adicionalmente a extração do material.
    22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender adicionalmente o processamento do material.
    23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender adicionalmente o processamento do material.
    24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado em que o processamento do material produz um material processado. 25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado em que o material processado é selecionado do
    grupo que consiste em um combustível, biodiesel, combustível de jato, um cosmético, um agente farmacêutico, um tensoativo e um diesel renovável.
    26. MÉTODO PARA FABRICAR UM MATERIAL, caracterizado por compreender:
    prover microalgas capazes de produzir o material;
    cultivar sob uma condição de crescimento heterotrófico as microalgas em meios, em que os meios compreendem uma fonte de carbono fixado;
    aplicar uma irradiância de luz branca 0,01-4 pmol de fótons/m2s, luz azul 0,01-3 pmol de fótons/m2s, e luz vermelha 0,01-2 pmol de fótons/m2s às microalgas; e permitir que as microalgas acumulem pelo menos 10% do seu peso seco de células como o material, em que o material é um polissacarídeo, um pigmento, um lipídeo, ou um hidrocarboneto e a microalga é uma cepa de Botryococcus, cepa de Neochloris, ou cepa de Chlamydomonas.
    27. SISTEMA DE BIORREATOR, caracterizado por compreender:
    Petição 870190080467, de 19/08/2019, pág. 7/10
  4. 4/4 um biorreator;
    meios de cultura que compreendem uma fonte de carbono fixado, em que os meios de cultura estão localizados dentro do biorreator;
  5. 5 microalgas adaptadas para crescimento heterotrófico, em que as microalgas estão localizadas nos meios de cultura; e uma fonte de luz, em que a fonte de luz produz uma irradiância de luz branca 0,01-4 qmol de fótons/m2s, luz azul
  6. 10 0,01-3 qmol de fótons/m2s, e luz vermelha 0,01-2 qmol de fótons/m2s, e em que a fonte de luz está operativamente acoplada ao biorreator, em que a microalga é uma cepa de Botryococcus, cepa de Neochloris, ou cepa de Chlamydomonas.
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