CN113214995A - 伪菱形藻快速扩大培养及筛查鉴别其产毒成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种伪菱形藻快速扩大培养及筛查鉴别其产毒成分的方法，包括下列步骤：（1）伪菱形藻细胞初级培养；（2）伪菱形藻细胞连续扩大培养。本发明首先解决了伪菱形藻快速扩大培养问题，并建立了对其产毒组分进行有效筛查鉴定方法，通过优化伪菱形藻细胞培养条件，在短时间内进行大规模培养，满足了研究贝类中失忆性贝类毒素调控机制的实验需要。经不断调整优化前处理及色谱质谱条件，通过收集高浓度藻细胞，能够有效分离多种产毒组分，对具有相同分子量及离子碎片的DA及其多种异构体进行定性定量分析，这对贝类中失忆性贝类毒素的溯源及保障水产品质量安全具有重要意义。

Description

伪菱形藻快速扩大培养及筛查鉴别其产毒成分的方法
技术领域
本发明涉及一种复杂基质中贝类毒素的筛查与确证数据库以及质谱确证方法，属于生物技术领域。
背景技术
伪菱形藻属是一类广泛分布于世界各国沿海的浮游硅藻类群，它们是失忆性贝类毒素的重要生物来源。许多海洋动物比如海狮、海鸟、海獭和鲸鱼以及人类通过食用鱼类、软体动物和磷虾等食物链传递蓄积失忆性贝类毒素，是引起人类和多数海洋生物失忆性中毒的主要原因。失忆性贝类毒素是具有神经毒性的非蛋白氨基酸类物质，其主要成分为软骨藻酸(domoic acid，DA)，国际社会以DA为主要限定目标。近年来在日本、美国、新西兰、法国、澳大利亚、马来西亚等多个国家和地区不断爆发由DA引发的中毒事件，DA备受关注。
以往研究发现伪菱形藻在我国沿海广泛分布，并常常在春季和夏季达到较高细胞丰度，甚至引发藻华，2017年我国学者第一次报道了中国产DA毒素伪菱形藻。贝类通过滤食极易蓄积大量DA，且DA具有毒性强、残留高且代谢慢等显著特性，经食物链放大作用后严重威胁消费者健康。因缺乏对DA代谢轮廓的清晰认知，导致无法准确评价其安全风险并制定科学的限量标准，亟需对贝类中DA调控机制开展系统研究，解析贝类中DA风险形成过程，对保障食品安全和贝类产业健康发展具有重要意义。
研究贝类中DA的调控机制主要以产毒藻暴露的方式进行，需投喂大量产毒藻细胞，以供室内贝类暴露实验需要，使贝类中蓄积高浓度的藻毒素，以研究贝类自身产生的免疫调控应答分子机制。但目前对产毒伪菱形藻的培养，多以在培养箱中进行小规模培养，无法满足暴露实验所需求的大量藻细胞，亟需建立在短时间内进行快速扩大培养的方法以满足研究需要。
此外，伪菱形藻单细胞产毒量仅在飞克级别，产毒量极低，但又可能同时产生DA及其多种异构体，目前的检测方法如酶联免疫法、高效液相色谱法等均无法准确区分DA及其多种异构体，存在容易产生假阳性、基质干扰等缺点。而近年来逐渐发展起来的高效液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）由于灵敏度高、快速高效等优点，逐渐成为常用的检测方法，但多以DA总量来计算。由于DA毒性相对其它几种同分异构体要高，可能造成过高评估藻细胞毒性，这极大地影响了对现有贝类产品中DA及其多种异构体危害的源头解析，严重威胁着贝类产业的健康可持续发展。
《中国台湾海峡隆氏拟菱形藻的物种信息和毒性特征》、《中国东南海域拟菱形藻属的新记录种和产毒种》、《中国沿海尖刺拟菱形藻的种下分类学研究》、《中国沿海新报道的三种产毒拟菱形藻》等文献资料简单报道了该藻属的细胞培养及毒素测定方法，主要技术路线是通过在细胞培养板中建立单克隆株系，待其存活繁殖达到一定细胞数量之后，转移到盛有培养基的100 mL锥形瓶中进行培养，对毒素总量进行大体分析，其存在的缺点是藻细胞仅限于实验室培养箱小体积培养，培养规模小且藻细胞数量远远无法满足贝类暴露研究实验所需。此外，完全没有对藻细胞毒素不同组分进行有效分离及定性定量分析。更加凸显出建立快速扩大培养及筛查鉴别其不同产毒成分方法的重要性及紧迫性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种能够在短时间内快速扩大培养伪菱形藻细胞的方法，并建立高效的藻细胞毒素提取步骤，在充分优化仪器色谱质谱条件的前提下，将DA及其多种异构体进行有效分离，对具有相同分子量及离子碎片的同分异构体进行准确定性定量。
本发明提供的伪菱形藻快速扩大培养方法，主要包括下列步骤：
（1）伪菱形藻细胞初级培养
采用玻璃纤维滤膜过滤自然海水，经高温高压灭菌，温度冷却至室温后，添加L1培养基各工作液，放于光照培养箱中接入伪菱形藻细胞，设置培养箱一定的温度、光照强度和光暗比，进行伪菱形藻细胞初级培养。
具体的，培养过程如下：
（1）设置培养箱参数为光照强度10000LX，光周期14 h：10 h及温度20 ℃；
（2）用孔径0.45 µm玻璃纤维滤膜过滤新鲜的自然海水（盐度为30 ‰），将过滤后的海水置于1 L和5 L锥形瓶中；
（3）用透气封口膜系住三角瓶瓶口，并放置于灭菌锅中，121 ℃条件下高温高压灭菌20 min；
（4）灭菌结束后，待三角瓶温度冷却至室温，在超净工作台中添加L1培养基各工作液；
（5）将三角瓶放于光照培养箱中，在1 L三角瓶中接入伪菱形藻细胞，连续曝气；
（6）每隔2天采集1 mL藻液，加入100 μL鲁格试剂进行固定，血球计数板法进行计数；
（7）待1 L三角瓶中藻种达到接种密度5×104 cells/mL，转移至5 L三角瓶内进行培养观察，连续曝气；
（8）每天对5 L三角瓶内藻细胞进行计数，连续采集15天，进行生长曲线的绘制，确定快速对数生长期。
（2）伪菱形藻细胞连续扩大培养
待培养箱三角瓶内藻细胞达到一定浓度，转移至经消毒的纯净水桶进行连续扩大培养，采用自然光加白炽灯的光照方式，定时器控制白炽灯光周期，循环收集藻细胞并添加新配制的培养液，短时间内实现获得大量伪菱形藻细胞。
具体的，培养过程如下：
（1）自然海水处理方法同上所述；
（2）加入5 mL10 %次氯酸钠消毒液及1 L高温灭菌后的自然海水（次氯酸钠有效含量0.05 %）至18.9 L纯净水桶中，混匀后对每个纯净水桶进行消毒，并用高温灭菌后的海水冲洗3遍；
（3）加入8~10 L新配制的L1培养基，按照接种伪菱形藻细胞1×104cell/mL密度加入初级培养的藻液，连续曝气，瓶口用透气灭菌封口膜封口；
（4）设置培养室空调温度为20 ℃，自然光照，每个18.9 L纯净水桶增加1个18W圆形白炽灯光，定时器控制白炽灯光周期14 h:10 h；
（5）在首次接种扩大培养后第3~4天收集藻液（藻液颜色明显加深呈暗褐色），取一半体积藻液，加入相同体积新配制的L1培养基；
（6）首次收集藻液后，每隔2天可再次收集藻液，注意防止污染，可不断循环收集添加，短时间内实现快速扩大培养。
伪菱形藻细胞在实验室培养箱条件下长时间培养，容易造成藻细胞退化，自身形态结构发生变形，严重影响其生长速度及单细胞产毒量，无法长时间保藏藻种及进行持续的科学研究实验。本发明在反复研究实践中发现，接种藻细胞初始浓度及光照是影响其能否快速扩大培养的关键影响因子。扩大培养时，接种藻细胞初始浓度过高所需初级培养藻细胞数量大、培养箱数量多，对实验室硬件要求较高，接种藻细胞初始浓度过底，容易导致培养时间过长，甚至可能藻细胞无法正常生长。室内单独使用自然光，受天气影响较大，无法有效控制藻细胞繁殖速度，而白炽灯光为可见光，在实验室可控，但光谱波长范围有限，采用自然光加白炽灯的光照方式相对于前两者不仅实验室可控而且补充了其他自然光谱，可以达到最佳培养效果。
另外，本发明还提供一种伪菱形藻细胞毒素提取方法，主要技术路线是：
取一定体积的快速对数生长期的藻细胞，将藻细胞过滤至玻璃纤维素膜，滤膜放入离心管，加入一定体积的甲醇水溶液，经超声破碎后，高速离心，过膜至进样小瓶待测。
具体步骤为：
（1）根据藻细胞生长曲线，确定藻细胞快速对数生长期，血球计数板法进行计数，藻细胞密度约为5×104 cell/mL；
（2）取50 mL对数生长期的藻液，经玻璃过滤器收集藻细胞至0.22 μm GF/F玻璃纤维素膜上，滤膜放入10 mL离心管底部；
（3）加入8 mL 50 %甲醇水溶液，均质5 min，（如藻细胞冷冻过夜，测样前待恢复室温后可以先超声5~10 min），充分洗脱藻细胞至甲醇水溶液；
（4）冰浴超声破碎3~5 min（650 w，50 %功率），取100 μL破碎藻液进行10X镜下显微镜检确认藻细胞破碎完全，不同样品之间采用超纯水清洗超声破碎探头，防止交叉污染；
（5）4500 rpm离心5 min上述破碎后的藻液，取1 mL上清液过0.22 μm水相MCM滤膜至进样小瓶，待测。
本发明还提供一种DA及其多种异构体定性定量分析确证的方法，采用高效液相色谱-质谱（LC-MS/MS）联用技术测定藻细胞中DA及其多种异构体含量。质谱采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测模式（MRM），通过针泵进样，正离子模式下进行母离子和子离子的扫描，以确定最佳多级反应监测离子对，优化电喷雾电压、碰撞能量、解簇电压等。采用C18色谱柱，或性能相当者，梯度洗脱。标准溶液经乙腈溶液溶解并定容至适当体积，配制成适当的标准系列工作液，外标法定量。
（1）液相色谱条件：色谱柱为菲罗门Luna C18(2)-HST (C18 100 mm×2 mm×2.6μm)，柱温30 ℃，样品室温度为20 ℃，进样体积10 µL，梯度洗脱，流动相A为水(含0.1 % 甲酸)， B 为乙腈(含0.1 %甲酸)，梯度洗脱条件: 0~1 min，5% B，1~20 min，5~20% B，20~22min， 20~5% B，22~25 min，5% B，流速：0.3 mL/min。
（2）质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，喷雾电压3500 V，射频电压142 V，碰撞气1.5 mTorr，雾化气25 Arb，辅助气15 Arb，蒸发气温度为250 ℃，离子传输管温度为300 ℃，驻留时间为250 ms。欧盟 EC/657/2002中规定LC-MS/MS检测污染物定性时必须达到4个确证点( Identification point, IP)，低分辨质谱每个母离子IP为1.0，子离子IP为1.5。本发明采用正离子扫描，以5 μL/min针泵流动注射方式，设定扫描范围(100~500 Da)，通过全扫描的方式确定DA及其多种异构体分子离子峰m/z 312.0；以其分子离子峰m/z 312.0为母离子进行二级子碎片离子解析，以丰度最高的m/z 266.0 作为基峰定量离子，以m/z 248.0、161.0两个碎片离子作为辅助定性离子。本方法采用1个母离子，3个子离子，IP达到5.5，满足欧盟的要求，从而实现对5种DA及其异构体同时准确定量和定性确证，图4~6为DA及其多种异构体标准溶液色谱及质谱图，保留时间依次为Iso-E、Iso-D、Iso-A、DA、epi-DA，能够将标准溶液中各组分进行有效分离，且峰形对称、灵敏度高和保留时间稳定。
采用上述伪菱形藻细胞毒素提取步骤及LC-MS/MS液相色谱质谱条件，对培养的伪菱形藻细胞进行产毒组分鉴定分析，共发现Iso-D、Iso-A、DA、epi-DA等4种产毒组分，未检出Iso-E，图7~9为伪菱形藻细胞中DA及其多种异构体色谱及质谱图。
本发明的有益效果：
本发明首先解决了伪菱形藻快速扩大培养问题，并建立了对其产毒组分进行有效筛查鉴定方法。通过优化伪菱形藻细胞培养条件，在短时间内进行大规模培养，满足了研究贝类中失忆性贝类毒素调控机制的实验需要。经不断调整优化前处理及色谱质谱条件，通过收集高浓度藻细胞，能够有效分离多种产毒组分，对具有相同分子量及离子碎片的DA及其多种异构体进行定性定量分析，这对贝类中失忆性贝类毒素的溯源及保障水产品质量安全具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是软骨藻酸的化学结构。
图2 伪菱形藻细胞初级培养生长曲线。
图3是纯净水桶中快速扩大培养的伪菱形藻液。
图4是软骨藻酸及其多种异构体标准溶液色谱图。
图5是软骨藻酸及其多种异构体标准溶液局部放大色谱图。
图6是软骨藻酸及其多种异构体标准溶液质谱图。
图7是伪菱形藻细胞中软骨藻酸及其多种异构体色谱图。
图8是伪菱形藻细胞中软骨藻酸及其多种异构体的局部放大色谱图。
图9是伪菱形藻细胞中软骨藻酸及其多种异构体质谱图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种伪菱形藻快速扩大培养的方法。
1、本实施例选用的仪器和试材
三重四极杆质谱联用仪（Thermo TSQ Endura），配有电喷雾离子源（ESI）及超高效液相色谱系统（美国ThermoFisher公司，Dionex UltiMate 3000）；E300H 超声波清洗器（德国Elmasonic公司）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司）；Neofuge 1600台式高速离心机（上海力申科学仪器有限公司）；–80 ℃超低温保存箱（Haier公司）；XW-80A旋涡混合器（上海医大仪器厂）。
DA及4种异构体混合标液（DA、Iso-A、Iso-D、Iso-E、epi-DA）购自于加拿大国家海洋研究中心，DA结构式见图1。实验用水为超纯水( 18.2 MΩ. cm)，甲醇、乙腈（色谱纯，Merk公司）、甲酸（色谱纯，上海安谱）。
2、伪菱形藻细胞快速扩大培养步骤
对来源于我国南海的一株产毒伪菱形藻进行短时间内连续不断扩大培养。
（一）伪菱形藻细胞初级培养
（1）设置培养箱参数为光照强度10000LX、光周期14 h:10 h及温度20 ℃；
（2）用孔径0.45 µm玻璃纤维滤膜过滤新鲜的自然海水（盐度为30 ‰），将过滤后的海水置于1 L和5 L锥形瓶中；
（3）用透气封口膜系住三角瓶瓶口，并放置于灭菌锅中，121 ℃条件下高温高压灭菌20 min；
（4）灭菌结束后，待三角瓶温度冷却至室温，在超净工作台中添加L1培养基各工作液；
（5）将三角瓶放于光照培养箱中，在1 L三角瓶中接入伪菱形藻细胞，连续曝气；
（6）每隔2天采集1 mL藻液，加入100 μL鲁格试剂进行固定，血球计数板法进行计数；
（7）待1 L三角瓶中藻种达到接种密度5×104cells/mL，转移至5 L三角瓶内进行培养观察，连续曝气，接种密度为1×104 cells/mL；
（8）每天对5 L三角瓶内藻细胞进行计数，连续采集15天，进行生长曲线的绘制，确定快速对数生长期，第5天可达到5×104 cells/mL（见图2）。
（二）伪菱形藻细胞连续扩大培养
（1）自然海水处理方法同上所述；
（2）加入5 mL10 %次氯酸钠消毒液及1 L高温灭菌后的自然海水（次氯酸钠有效含量0.05 %）至18.9 L纯净水桶中，混匀后对每个纯净水桶进行消毒，并用高温灭菌后的海水冲洗3遍；
（3）加入8~10 L新配制的L1培养基，按照接种伪菱形藻细胞1×104 cell/mL密度加入一定体积的初级培养的藻液，连续曝气，瓶口用透气灭菌封口膜封口，可同时培养若干个纯净水桶藻液；
（4）设置培养室空调温度为20 ℃，窗台自然光照，每个18.9 L纯净水桶增加1个18W圆形白炽灯光，定时器控制白炽灯光周期14 h:10 h；
（5）在首次接种扩大培养后，每天记录藻细胞浓度，并记录藻细胞总量，第3~4天收集藻液（藻液颜色明显加深呈暗褐色），取一半体积藻液，加入相同体积新配制的L1培养基；
（6）首次收集藻液后，每隔2天可再次收集藻液，注意防止污染，可不断循环收集添加，短时间内实现快速扩大培养（图3）。
按照血球计数板法，扩大培养后每天藻细胞的总数量如下：
扩大培养的天数和扩大培养后藻细胞总数量（个，以15L计）分别为：
0天（初始接种）：1.5×108 cell。
1天：2.1×108 cell。
2天：3.4×108 cell。
3天：7.0×108 cell。
4天（收集藻细胞）：1.6×109cell。
数据表明，采用上述连续扩大培养条件，可以在短期内快速获取大量藻细胞，能够满足贝类暴露实验需要。
本实施例2
本实施例提供一种伪菱形藻筛查鉴别其产毒成分的方法，包括下列步骤：
（一）伪菱形藻细胞毒素提取
（1）根据藻细胞生长曲线，确定藻细胞快速对数生长期，血球计数板法进行计数，藻细胞密度约为5×104 cell/mL；
（2）取50 mL对数生长期的藻液，经玻璃过滤器收集藻细胞至0.22 μm GF/F玻璃纤维素膜上，滤膜放入10 mL离心管底部；
（3）加入8 mL 50 %甲醇水溶液，均质5 min，（如藻细胞冷冻过夜，测样前待恢复室温后可以先超声5~10 min），充分洗脱藻细胞至甲醇水溶液；
（4）冰浴超声破碎3~5 min（650 w，50 %功率），取100 μL破碎藻液进行10X镜下显微镜检确认藻细胞破碎完全，不同样品之间采用超纯水清洗超声破碎探头，防止交叉污染；
（5）4500 rpm离心5 min上述破碎后的藻液，取1 mL上清液过0.22 μm水相MCM滤膜至进样小瓶，待测。
（二）DA及其多种异构体定性定量分析确证
（1）液相色谱条件：色谱柱为菲罗门Luna C18(2)-HST (C18 100 mm×2 mm×2.6μm)，柱温30 ℃，样品室温度为20 ℃，进样体积10 µL，梯度洗脱，流动相A为水(含0.1 % 甲酸)， B 为乙腈(含0.1 %甲酸)，梯度洗脱条件: 0~1 min，5% B，1~20 min，5~20% B，20~22min， 20~5% B，22~25 min，5% B，流速：0.3 mL/min。
（2）质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，喷雾电压3500 V，射频电压142 V，碰撞气1.5 mTorr，雾化气25 Arb，辅助气15 Arb，蒸发气温度为250 ℃，离子传输管温度为300 ℃，驻留时间为250 ms。欧盟 EC/657/2002中规定LC-MS/MS检测污染物定性时必须达到4个确证点( Identification point, IP)，低分辨质谱每个母离子IP为1.0，子离子IP为1.5。本发明采用正离子扫描，以5 μL/min针泵流动注射方式，设定扫描范围(100~500 Da)，通过全扫描的方式确定DA及其多种异构体分子离子峰m/z 312.0；以其分子离子峰m/z 312.0为母离子进行二级子碎片离子解析，以丰度最高的m/z 266.0 作为基峰定量离子，以m/z 248.0、161.0两个碎片离子作为辅助定性离子。本方法采用1个母离子，3个子离子，IP达到5.5，满足欧盟的要求，从而实现对5种DA及其异构体同时准确定量和定性确证，图4~6为DA及其多种异构体标准溶液色谱及质谱图，保留时间依次为Iso-E、Iso-D、Iso-A、DA、epi-DA，能够将标准溶液中各组分进行有效分离，且峰形对称、灵敏度高和保留时间稳定。
采用上述伪菱形藻细胞毒素提取步骤及LC-MS/MS液相色谱质谱条件，对培养的伪菱形藻细胞进行产毒组分鉴定分析，共发现Iso-D、Iso-A、DA、epi-DA等4种产毒组分，未检出Iso-E，图7~9为伪菱形藻细胞中DA及其多种异构体色谱及质谱图。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.伪菱形藻快速扩大培养方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）伪菱形藻细胞初级培养
采用玻璃纤维滤膜过滤自然海水，经高温高压灭菌，温度冷却至室温后，添加L1培养基各工作液，放于光照培养箱中接入伪菱形藻细胞，设置培养箱的温度、光照强度和光暗比，进行伪菱形藻细胞初级培养；
（2）伪菱形藻细胞连续扩大培养
待培养箱三角瓶内藻细胞达到一定浓度，转移至经消毒的纯净水桶进行连续扩大培养，采用自然光加白炽灯的光照方式，定时器控制白炽灯光周期，循环收集藻细胞并添加新配制的培养液，短时间内实现获得大量伪菱形藻细胞。
2.根据权利要求1所述的伪菱形藻快速扩大培养方法，其特征在于，步骤（1）伪菱形藻细胞初级培养的具体培养过程如下：
①设置培养箱参数为光照强度10000LX，光周期14 h：10 h及温度20 ℃；
②用孔径0.45 µm玻璃纤维滤膜过滤新鲜的自然海水（盐度为30 ‰），将过滤后的海水置于1 L和5 L锥形瓶中；
③用透气封口膜系住三角瓶瓶口，并放置于灭菌锅中，121 ℃条件下高温高压灭菌20min；
④灭菌结束后，待三角瓶温度冷却至室温，在超净工作台中添加L1培养基各工作液；
⑤将三角瓶放于光照培养箱中，在1 L三角瓶中接入伪菱形藻细胞，连续曝气；
⑥每隔2天采集1 mL藻液，加入100 μL鲁格试剂进行固定，血球计数板法进行计数；
⑦待1 L三角瓶中藻种达到接种密度5×104 cells/mL，转移至5 L三角瓶内进行培养观察，连续曝气；
⑧每天对5 L三角瓶内藻细胞进行计数，连续采集15天，进行生长曲线的绘制，确定快速对数生长期。
3.根据权利要求1所述的伪菱形藻快速扩大培养方法，其特征在于，步骤（2）伪菱形藻细胞连续扩大培养的具体步骤为：
①自然海水处理：用孔径0.45 µm玻璃纤维滤膜过滤新鲜的自然海水（盐度为30 ‰），经高温高压灭菌，温度冷却至室温；
②将5 mL的10 %次氯酸钠消毒液及1 L高温灭菌后的自然海水（次氯酸钠有效含量0.05 %）至18.9 L纯净水桶中，混匀后对每个纯净水桶进行消毒，并用高温灭菌后的海水冲洗3遍；
③加入8~10 L配制的L1培养基，按照接种伪菱形藻细胞1×104cell/mL密度加入步骤（1）中进入对数生长期的初级培养的藻液，连续曝气，瓶口用透气灭菌封口膜封口；
④设置培养室空调温度为20 ℃，自然光照，每个18.9 L纯净水桶增加1个18W圆形白炽灯光，定时器控制白炽灯光周期14 h:10 h；
⑤在首次接种扩大培养后第3~4天收集藻液，取一半体积藻液，加入相同体积新配制的L1培养基；
⑥首次收集藻液后，每隔2天可再次收集藻液，注意防止污染，取一半体积藻液，加入相同体积新配制的L1培养基，可不断循环收集添加，短时间内实现快速扩大培养。
4.伪菱形藻细胞毒素提取方法，其特征在于，包括下列步骤：
①根据藻细胞生长曲线，确定藻细胞快速对数生长期，血球计数板法进行计数，藻细胞密度约为5×104cell/mL；
②取50 mL对数生长期的藻液，经玻璃过滤器收集藻细胞至0.22 μm GF/F玻璃纤维素膜上，滤膜放入10 mL离心管底部；
③加入8 mL 50 %甲醇水溶液，均质5 min，（如藻细胞冷冻过夜，测样前待恢复室温后可以先超声5~10 min），充分洗脱藻细胞至甲醇水溶液；
④冰浴超声破碎3~5 min（650 w，50 %功率），取100 μL破碎藻液进行10X镜下显微镜检确认藻细胞破碎完全，不同样品之间采用超纯水清洗超声破碎探头，防止交叉污染；
⑤4500 rpm离心5 min上述破碎后的藻液，取1 mL上清液过0.22 μm水相MCM滤膜至进样小瓶，待测。
5.伪菱形藻筛查鉴别其产毒成分的方法，其特征在于，包括下列步骤：
（一）毒素提取
按照权利要求4所述的方法进行；
（二）液相色谱质谱检测
（1）液相色谱条件：色谱柱为菲罗门Luna C18(2)-HST (C18 100 mm×2 mm×2.6 μm)，柱温30 ℃，样品室温度为20 ℃，进样体积10 µL，梯度洗脱，流动相A为水(含0.1 % 甲酸),B 为乙腈(含0.1 %甲酸)，
梯度洗脱条件: 0~1 min，5% B，1~20 min，5~20% B，20~22 min， 20~5% B，22~25 min，5% B，流速：0.3 mL/min。
（2）质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，喷雾电压3500 V，射频电压142 V，碰撞气1.5 mTorr，雾化气25 Arb，辅助气15 Arb，蒸发气温度为250 ℃，离子传输管温度为300 ℃，驻留时间为250 ms；
采用正离子扫描，以5 μL/min针泵流动注射方式，设定扫描范围(100~500 Da)，通过全扫描的方式确定DA及其四种异构体分子离子峰m/z 312.0；以其分子离子峰m/z 312.0为母离子进行二级子碎片离子解析，以丰度最高的m/z 266.0 作为基峰定量离子，以m/z248.0、161.0两个碎片离子作为辅助定性离子；
采用1个母离子，3个子离子，IP达到5.5，从而实现对5种DA及其异构体同时准确定量和定性确证。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6698134B1 (en) * 1998-11-16 2004-03-02 Succeed Hi-Tech Industrialization Scale-Up Assemblies Co., Ltd. Method of cultivating fresh spirulina at home and device thereof
CN101481655A (zh) * 2008-01-11 2009-07-15 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种充气培养单细胞藻类的方法
US20120171733A1 (en) * 2009-09-18 2012-07-05 Phycoil Biotechnology International, Inc. Microalgae fermentation using controlled illumination
CN106950327A (zh) * 2017-03-13 2017-07-14 中国水产科学研究院黄海水产研究所 复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法
CN109374809A (zh) * 2018-11-22 2019-02-22 浙江省海洋水产研究所 一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6698134B1 (en) * 1998-11-16 2004-03-02 Succeed Hi-Tech Industrialization Scale-Up Assemblies Co., Ltd. Method of cultivating fresh spirulina at home and device thereof
CN101481655A (zh) * 2008-01-11 2009-07-15 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种充气培养单细胞藻类的方法
US20120171733A1 (en) * 2009-09-18 2012-07-05 Phycoil Biotechnology International, Inc. Microalgae fermentation using controlled illumination
CN106950327A (zh) * 2017-03-13 2017-07-14 中国水产科学研究院黄海水产研究所 复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法
CN109374809A (zh) * 2018-11-22 2019-02-22 浙江省海洋水产研究所 一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIYAN WU等: "Liquid chromatography quadrupole linear ion trap mass spectrometry for multiclass screening and identification of lipophilic marine biotoxins in bivalve mollusks", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
HUAN CHANG DONG等: "Occurrence of Pseudo-nitzschia species and associated domoic acid production along the Guangdong coast, South China Sea", 《HARMFUL ALGAE》 *
朱学宝等: "《中国鱼池生态学研究》", 31 December 1995 *
赵艳珍等: "《海参高效养殖关键技术》", 31 May 2015 *
郑关超等: "典型贝类对一株拟菱形藻所产多莫酸毒素的蓄积差异性研究", 《中国渔业质量与标准》 *
黄春秀等: "福氏拟菱形藻(Pseudo-nitzschia fukuyoi)—中国产毒拟菱形藻的新记录", 《海洋与湖沼》 *

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