CN101481655A - 一种充气培养单细胞藻类的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单细胞藻类的培养，具体地说是一种充气培养单细胞藻类的方法，在温度18－35℃和自然光照条件下，于装满沙滤自然海水的培养瓶中进行单细胞藻的充气培养，充气量为4－8L/min，用充气泵或鼓风机充入空气，空气先经2－3个空气过滤器进行过滤，然后通过气排分散到透明塑料培养瓶中进行用于贝类育苗饵料单细胞藻类的一级或二级大规模生产培养。本发明的操作方便、藻类生长稳定快速、无污染。

Description

一种充气培养单细胞藻类的方法

技术领域

本发明涉及藻类的培养，具体地说是一种充气培养单细胞藻类的方法。

背景技术

单细胞藻类是贝类育苗幼体培育过程中的主要饵料，是决定贝类育苗的关键因素之一。但是在贝类育苗中常常出现饵料供不足、不及时以及生产池饵料污染严重，藻种又不能及时供应等情况，从而造成饵料生长高峰期和幼体需求不协调的现象。生产上采用的单细胞藻培养方法一般包括一下几个环节：保种，一级培养，二级培养，三级培养(大池培养)。传统的一级和二级培养通常在泡沫薄膜袋、50L塑料桶和小型水泥池培养，培养速度慢，并且很容易污染。一般认为，充气培养能使藻细胞和培养环境充分接触，从而增加藻细胞的生长速度，但因为充气容易使培养环境受到污染，也同时加大了管理的难度，因此也具有一定风险性，有些生产单位采取传统的充气培养法，因为管理不善、操作不规范等原因往往引起藻种全部污染，导致贝类幼体饵料严重短缺，甚至使育苗失败。

发明内容

根据多年积累的经验，申请人对二级培养的方法进行了改进，经过几年的生产实验验证，本发明的目的在于提供一种具有操作方便、藻类生长稳定快速、无污染的充气培养单细胞藻类方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为；

一种充气培养单细胞藻类的方法，在温度18-35℃和自然光照(光照范围为3500-33000lux)条件，于装满沙滤自然海水的培养瓶中进行单细胞藻的充气培养，充气量为4-8L/min，

所述培养瓶为透明塑料瓶，培养瓶瓶口上塞有用于密封的橡胶塞，在橡胶塞上钻有两个直径为0.8-1cm的小孔，每个小孔插入一段8-10cm长、粗细与小孔孔径一致的玻璃管；其中一个小孔插入一段8-10cm长、粗细与小孔孔径一致的玻璃管；玻璃管用于通风，其上面塞有消毒处理的脱脂棉以防止灰尘污染；另一个小孔内穿套有充气管，其于培养瓶瓶体内的一端与散气石相连，瓶体外的一端通过气排经2-3个空气过滤器与充气泵或鼓风机相连；

用充气泵或鼓风机充入空气，空气先经空气过滤器过滤，然后通过气排分散到培养瓶中进行用于贝类育苗饵料单细胞藻类的一级或二级大规模生产培养。

所述单细胞藻类为贝类育苗中的常用种类，其可为硅藻(新月菱形藻，三角褐指藻)、金藻(等鞭金藻3011，3012和叉鞭金藻)和/或扁藻(青岛大扁藻)，本发明可用于它们的高密度、大规模培养。

本发明对培养基进行了优化，可于每升沙滤、消毒的自然海水中添加有1ml培养母液，

所述优化后的母液营养盐基础配方为Na₂NO₃ 120g，KH₂PO₄ 4g；将营养盐溶于1000ml蒸馏水中，配置成母液备用，使用时每升培养液加1ml母液；

当单细胞藻类为硅藻时，母液营养盐基础配方中还添加有Na₂SiO₃ 5g，FeC₅H₅O₇ 2.5g；

当单细胞藻类为扁藻时，母液营养盐基础配方中还添加有FeC₅H₅O₇0.5g；

当单细胞藻类为金藻时，母液营养盐基础配方中还添加有维生素B₁100mg，维生素B₁₂ 0.5mg。

所述培养瓶为市面上常用的18.9L的透明塑料纯净水瓶；在进行单细胞藻的充气培养前，于培养瓶中加满过滤海水，再加入次氯酸或次氯酸钠消毒液消毒，使培养瓶中有效氯含量达到40～80×10⁶。

本发明具有如下优点：

1)生长快。本发明方法能显著提高单细胞藻类的生长速率，用该方法培养的新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻的特定生长率分别是对照组的1.4，1.8，1.4和1.7倍；相对生长率分别是对照组的3.4，10.3，5.0和7.2倍；绝对生长率分别是对照最的3.3，9.8，4.9和6.8倍。

2)密度大。本发明能大幅度提高藻液的培养浓度，新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻的最大培养密度分别为2957，1700，2355和350万cell/ml，远远大于常规培养方法的培养密度。

3)持续时间长。本发明能延长藻细胞的生长期，新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻藻细胞密度高峰期分别推迟3天，3天，0天和6天，维持较高密度的时间分别达到14，14，17和17天。

4)省时省力。传统的方法要求每天至少早、中和晚上有求摇瓶3次。而本发明的方法仅需定期检查藻细胞的生长情况，不需要摇瓶。

5)节省空间。和传统采用水泥池、25L的聚乙烯桶等二级培养方法相比，本发明方法具有占地面积小，灵活方便等优点。

6)节约成本。本发明方法采用18.9L透明矿泉水瓶作为培养容器，其造价比同等规格的玻璃器皿价格低，且操作方便，重复利用性强。

附图说明

图1为本发明充气培养单细胞藻系统工艺框图；

→代表海水流向，

代表空气流向；

图2为本发明充气培养装置结构示意图；图中，1为充气泵，2为空气过滤器，3为主管道，4为总阀门，5为流量控制阀门，6为气排，7为脱脂棉，8为玻璃管，9为橡胶塞，10为培养瓶，11为充气软管，12为充气石；

图3为培养期间的温度和光照条件变化情况图；

图4不同处理4种饵料单胞藻的生长曲线；

图5用充气培养的二级藻种进行大池生产效果。

具体实施方式

实施例

采用本发明的方法与常规方法(对照组)分别进行培养。

(一)实验方法

1.1 实验材料

实验于2007年3月1日—5月30日在红岛蛤原良种发展有限公司进行。选用实验用小新月菱形藻Nitzschia closterium(以下简称硅藻)，等鞭金藻3011 Isochrysis galbana Parke(以下简称3011)，等鞭金藻3012(以下简称3012)和亚心型扁藻Platymonas subcordiformis(以下简称扁藻)为实验对象。

1.2 充气和培养装置

用小型充气泵或鼓风机充气，充气管先通过3个空气过滤器，然后通过气排分散到培养瓶(如图1和2示)。采用18.9L的透明塑料纯净水瓶作为一级或二级培养瓶，培养瓶用相应型号的橡胶塞密封，在每个橡胶塞上钻两个直径为0.8-1cm的孔，其中一个小孔插入一段10cm长，粗细与孔径一致的玻璃管，用于通风，上面加少许消毒处理的脱脂棉以防止灰尘污染。另一个小孔穿充气管，进行充气培养。

1.3 培养方法

培养瓶、充气设备和其他培养工具先用稀盐酸戏刷，再经海水冲洗2-3次备用。培养瓶加满过滤海水，加入100ml次氯酸消毒液，使有效氯含量达到40～80×10⁶，充气混匀，使多余的水溢出刚好消毒培养瓶表面，用消毒的橡胶塞塞紧。消毒12-18h后，第二天清晨向培养瓶中加入等浓度的Na₂S₂O₃中和，经淀粉碘化钾试剂滴定为无色后，可以加入营养盐。

营养盐配方：基础配方为Na₂NO₃ 120g，KH₂PO₄ 4g；硅藻培养增加Na₂SiO₃ 5g，FeC₅H₅O₇ 2.5g，扁藻培养增加FeC₅H₅O₇0.5g，金藻培养增加维生素B₁ 100mg，维生素B₁₂ 0.5mg。上述营养盐溶于1000ml蒸馏水中，配置成母液备用，使用时每升培养液加1ml母液。

接种：选择藻液颜色正常，镜检藻细胞形状规则、分裂正常、无污染，处于指数生长期的藻种，按照1:5-10的比例(接种藻液和过滤、消毒海水的体积比例)一次性接种，使培养液体积占培养瓶体积的4/5。

在自然温度和光照下培养，每天上午10:00时和下午15:30测定温度和光照，培养期间的变化情况见图3，温度和光照为每天两次测量的平均值，变化范围为18.6-33.8℃，平均25.8℃；光照范围为3785-32500lux，平均17062lux。培养用水与育苗用水相同，是经过沙滤的自然海水。充气量为4-8L/min。

常规的传统方法(对照组)采用的培养装置和条件与上述本发明方法相同，只是不充气(即不向培养瓶充入空气)，每天摇瓶3-5次；

本发明的方法和传统的方法培养几种饵料单胞藻的生长曲线如图4所示。可以看出几种饵料微藻在两种培养模式下生长速度差异显著。

硅藻的生长曲线如图4A所示。硅藻在生长速率在第5天开始出现差异(F＝11.860，P＝0.014<0.05)，不同培养模式的特点生长率(SGR)、相对生长率(RGR)和绝对生长率(AGR)分别为56.63，51.50、16.0，12.1和16.97，13.13(表1)。8天后出现显著差异(F＝592.206，P＝0.000<0.01)，传统摇瓶法的培养密度(对照组，下同)为635万cell/ml，而采用本发明的方法(实验组，下同)的藻细胞密度为1670万cell/ml，是对照组的2.63倍，SGR，RGR和AGR分别是对照组的1.33，2.76和2.67倍。对照组在第11天达到最大值，藻细胞密度为930万cell/ml，然后开始下降，而实验组藻细胞仍在指数增长期，到第14天达到最大值2957万cell/ml，RGR和AGR都达到最大值，此时对照组已经达到终止期，藻细胞密度已经有所下降。

金藻3011的生长曲线如图4B所示。培养第2天实验组和对照组藻细胞就出现显著差异(P<0.05)，第5天以后差异均为极显著(P<0.01)。对照组藻密度在第11天时达到最大值为262万cell/ml，实验组藻细胞密度推迟3天，在第14天达到最大值为1700万cell/ml，此时SGR，RGR和AGR分别为对照组的1.8，10.8和9.8倍。可见，增长效果非常明显。

实验组和对照组金藻3012的生长曲线(图4C)与3011略有不同。在培养5天内两个处理组差异不显著(F＝0.027，P＝0.875>0.05)，培养8天后出现极显著差异(P<0.01)。对照组和实验组藻细胞数量都是在第11天时达到最大值，分别为575和2355万cell/ml，以后对照组出现明显的下降，而实验组基本保持不变，实验结束时藻细胞密度为2275万cell/ml，SGR，RGR和AGR分别为对照组的1.6，7.9和7.0倍。

实验组和对照组扁藻的生长曲线如图4D所示。培养到第5天后两者开始显著差异(P<0.01)，对照组在第11天藻细胞数量达到最大值为70万cell/ml，实验组高峰期推迟6天，在第17天时达到最大值为350万cell/ml，此时SGR，RGR和AGR分别为对照组的1.7，7.2和6.8倍。

用充气培养的一、二级藻种进行大池生产效果如图4所示。采用一次性接种的方法，接种6桶(18.9L，藻细胞密度为3000万cell/ml)到事先处理好的6m³的消毒海水中，初始密度为55万cell/ml；3011和3012接种4桶(藻细胞密度为1500万cell/ml左右)，初始浓度分别为18和21万cell/ml。几种藻类生产效果如图5所示，硅藻的细胞数量在4天时达到175万cell/ml，接近生产投喂的饵料浓度，第7天达到最大值470万cell/ml，最佳投喂时间为第5-10天，藻细胞密度超过300万cell/ml。两种金藻的生长相对缓慢，但也在第6天左右达到较适宜的投喂密度200万cell/ml，最佳投喂时间为第6-11天，持续时间6天。

表1 用两种方法培养的4种饵料单胞藻生长情况的比较

综上所述，本发明能大幅度提高4种饵料单胞藻的生长速度。实验组(本发明方法)与对照组(不充气)在细胞数目、特定生长率(SGR)、相对生长率(RGR)和绝对生长率(AGR)等方面均有显著差异。在充气条件下，新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻的最大培养密度分别为2957，1700，2355和350万cell/ml，分别是对照组最大培养密度的3.2，6.5，4.1和5倍；SGR、RGR和AGR分别是对照组(相同培养时间)的1.4、3.4、3.3，1.8、10.3、9.8，1.4、5.0、4.9和1.7、7.2、6.8倍。二级充气培养的藻液可以直接扩种到大池进行生产培养，能显著提高生产培养效率，用这种方法培养的上述饵料藻类用于栉孔扇贝的春季人工育苗取得了较好的效果。

Claims (7)

1.一种充气培养单细胞藻类的方法，其特征在于：

在温度18-35℃和自然光照条件下，于装满沙滤自然海水的培养瓶中进行单细胞藻的充气培养，充气量为4-8L/min，

所述培养瓶为透明塑料瓶，培养瓶瓶口上塞有用于密封的橡胶塞，在橡胶塞上钻有两个直径为0.8-1cm的小孔，其中一个小孔插入一段8-10cm长、粗细与小孔孔径一致的玻璃管；玻璃管用于通风，其上面塞有消毒处理的脱脂棉以防止灰尘污染；另一个小孔内穿套有充气管，其于培养瓶瓶体内的一端与散气石相连，瓶体外的一端通过气排经2-3个空气过滤器与充气泵或鼓风机相连；

用充气泵或鼓风机充入空气，空气先经2-3个空气过滤器进行过滤，然后通过气排分散到透明塑料培养瓶中进行用于贝类育苗饵料单细胞藻类的一级或二级大规模生产培养。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单细胞藻类为贝类育苗中的常用种类，其可为硅藻、金藻和/或扁藻。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述每升沙滤、消毒的自然海水中含有1ml经过优化处理的培养母液，

所述母液营养盐基础配方为Na₂NO₃ 120g，KH₂PO₄ 4g；将营养盐溶于1000ml蒸馏水中，配置成母液备用，使用时每升培养液加1ml母液。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：当单细胞藻类为硅藻时，母液营养盐基础配方中还添加有Na₂SiO₃ 5g，FeC₅H₅O₇ 2.5g；

当单细胞藻类为金藻时，母液营养盐基础配方中还添加有维生素B₁100mg，维生素B₁₂ 0.5mg。

当单细胞藻类为扁藻时，母液营养盐基础配方中还添加有FeC₅H₅O₇0.5g；

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养瓶为市面上常用的18.9L的透明塑料纯净水瓶。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在进行单细胞藻的充气培养前，于培养瓶中加满过滤海水，再加入次氯酸或次氯酸钠消毒液消毒，使培养瓶中有效氯含量达到40～80×10⁶。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述光照范围为3500-33000lux。

Images