CN109666611A - 一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，包括以下步骤：A、制备培养基；B、制备光合细菌；C、光合细菌分离；D、光合细菌的纯化，本发明的制备方法操作简单，制备的光合细菌纯度高，能够提高光合作用效果。

Description

一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法
技术领域
本发明涉及光合细菌制备技术领域，具体为一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法。
背景技术
光合细菌一类是能进行光合作用的细菌，是具有原始光能合成体系的原核生物的总称。它广泛存在于水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及潮湿的土壤中，能够以光作为能源，在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用，它表现出固氮、固碳、降解亚硝酸盐、脱氢、硫化物氧化等不同的生理功能，使其在自然界的碳、氮、硫循环中发挥着重要作用。
在水产养殖上，光合细菌在净化水质、预防疾病、提高养殖群体的免疫力、提高饲料利用率等诸多发面都发挥着越来越大的作用。然而，市面上光合细菌的售价大多在3-5元/升，生产成本仅为0.8-1元。因此，为了节省使用成本、提高公司养殖效益，工程中心计划从市售光合细菌、龙洋公司鱼虾养殖池中筛选光合细菌，以期形成自有的光合细菌品牌。
本发明的目的在于提供一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，包括以下步骤：
A、制备培养基，步骤如下：
a、富集用培养基制备：紫色非硫细菌富集培养基：酵母膏/蛋白胨1-2g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：50ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml，用0.1N的磷酸调节pH至7.0；
b、分离用培养基制备：紫色非硫细菌分离培养基：酵母膏/蛋白胨3-4g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：40ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml；另取九水硫代硫酸钠1g，加水10ml，于121℃蒸汽灭菌15min后加入培养基；之后用0.1N的磷酸调节pH至7.0；固体培养基需加琼脂1.5%-2.0%，半固体培养基加琼脂0.6-0.8%；
B、制备光合细菌；
C、光合细菌分离：当瓶中液体呈现红色时，取1ml液体进行梯度稀释，涂布固体培养基平皿，石蜡封闭培养皿，30℃、2000lx光照条件下培养7天，挑去其中呈红色的单菌落进行划线分离；
D、光合细菌的纯化：把以上分离到的不同形态的菌株，进行反复的纯化，直到在显微镜下观察菌体形态基本一致，纯化工作才结束，菌株做鉴定备用。
优选的，所述步骤B中光合细菌制备方法如下：
1）、取10g土壤或10ml污水放置于500ml三角瓶中，按照1:5的比例加入灭菌后的液体富集培养基500ml，搅拌均匀后，在液面上加一层灭菌的液体石蜡形成厌氧环境，同时外加橡皮塞，以阻断外界空气，或者将淤泥放入50ml带塞磨口瓶中，加满培养基，塞好塞子，隔绝空气，进行厌氧培养；
2）、在25-35℃温度下，用5000-10000lx的光照强度进行光照培养2-3周，生活在海水中的菌株生长较缓慢，需要培养1-3月，这时，光合细菌在玻璃壁上呈菌落状，布满全部，呈红色、深红色、橙色或绿色；
3）、然后，用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌，移植至约50ml的试剂瓶中，再加入上述培养液，继续培养；
4）、这样重复富集操作2-3次，用试剂瓶培养时，先装入泥状溶液，再把各种培养液装满瓶子，然后塞紧塞子，防止培养液溢出，保持厌氧条件，试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长时间培养液蒸发，在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良好的光合细菌悬浮液适当稀释，在厌氧条件下继续进行光照培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的制备方法操作简单，制备的光合细菌纯度高，能够提高光合作用效果；本发明采用的光合细菌制备方法，能够有效的防止光合细菌出现氧化现象。
附图说明
图1为本发明流程图；
图2为本发明中光合细菌在实验室效果图；
图3为本发明中光合细菌在养殖上应用效果图；
图4为本发明中光合细菌在养殖上应用效果图；
图5为本发明中中光合细菌在养殖上应用效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，包括以下步骤：
A、制备培养基，步骤如下：
a、富集用培养基制备：紫色非硫细菌富集培养基：酵母膏/蛋白胨1-2g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：50ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml，用0.1N的磷酸调节pH至7.0；
b、分离用培养基制备：紫色非硫细菌分离培养基：酵母膏/蛋白胨3-4g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：40ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml；另取九水硫代硫酸钠1g，加水10ml，于121℃蒸汽灭菌15min后加入培养基；之后用0.1N的磷酸调节pH至7.0；固体培养基需加琼脂1.5%-2.0%，半固体培养基加琼脂0.6-0.8%；
B、制备光合细菌；
C、光合细菌分离：当瓶中液体呈现红色时，取1ml液体进行梯度稀释，涂布固体培养基平皿，石蜡封闭培养皿，30℃、2000lx光照条件下培养7天，挑去其中呈红色的单菌落进行划线分离；
D、光合细菌的纯化：把以上分离到的不同形态的菌株，进行反复的纯化，直到在显微镜下观察菌体形态基本一致，纯化工作才结束，菌株做鉴定备用。
本发明中，步骤B中光合细菌制备方法如下：
1）、取10g土壤或10ml污水放置于500ml三角瓶中，按照1:5的比例加入灭菌后的液体富集培养基500ml，搅拌均匀后，在液面上加一层灭菌的液体石蜡形成厌氧环境，同时外加橡皮塞，以阻断外界空气，或者将淤泥放入50ml带塞磨口瓶中，加满培养基，塞好塞子，隔绝空气，进行厌氧培养；
2）、在25-35℃温度下，用5000-10000lx的光照强度进行光照培养2-3周，生活在海水中的菌株生长较缓慢，需要培养1-3月，这时，光合细菌在玻璃壁上呈菌落状，布满全部，呈红色、深红色、橙色或绿色；
3）、然后，用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌，移植至约50ml的试剂瓶中，再加入上述培养液，继续培养；
4）、这样重复富集操作2-3次，用试剂瓶培养时，先装入泥状溶液，再把各种培养液装满瓶子，然后塞紧塞子，防止培养液溢出，保持厌氧条件，试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长时间培养液蒸发，在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良好的光合细菌悬浮液适当稀释，在厌氧条件下继续进行光照培养。
图2为光合细菌在实验室效果图，经过多次试验发现，不管是9-405筛选的菌种，还是市售菌种得出的结论都是一致的：光合细菌具有降解水中氨氮的效果，但是需要添加一定量的光合细菌。
图3-图5为光合细菌在养殖上应用效果图，光合细菌的使用量与养殖水中亚硝态氮含量呈正相关。
试验方法：
a、根据养殖水中亚硝态氮含量0.719，推荐使用量为0.02kg/m³；
b、第二天（5月17日）测得水中亚硝态氮含量为0.506，建议再次使用光合细菌0.0125kg/立方米；
c、5月18日水中亚硝态氮含量降为0.18。
综上所述，本发明的制备方法操作简单，制备的光合细菌纯度高，能够提高光合作用效果；本发明采用的光合细菌制备方法，能够有效的防止光合细菌出现氧化现象。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、制备培养基，步骤如下：
a、富集用培养基制备：紫色非硫细菌富集培养基：酵母膏/蛋白胨1-2g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：50ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml，用0.1N的磷酸调节pH至7.0；
b、分离用培养基制备：紫色非硫细菌分离培养基：酵母膏/蛋白胨3-4g、氯化铵1g、氯化镁/硫酸镁0.2g、氯化钠2g、磷酸氢二钠0.5g、水948 ml，121℃灭菌20min；之后加入下列经过滤灭菌的溶液：40ml 10%的碳酸氢钠、乙醇或4%丙氨酸2ml；另取九水硫代硫酸钠1g，加水10ml，于121℃蒸汽灭菌15min后加入培养基；之后用0.1N的磷酸调节pH至7.0；固体培养基需加琼脂1.5%-2.0%，半固体培养基加琼脂0.6-0.8%；
B、制备光合细菌；
C、光合细菌分离：当瓶中液体呈现红色时，取1ml液体进行梯度稀释，涂布固体培养基平皿，石蜡封闭培养皿，30℃、2000lx光照条件下培养7天，挑去其中呈红色的单菌落进行划线分离；
D、光合细菌的纯化：把以上分离到的不同形态的菌株，进行反复的纯化，直到在显微镜下观察菌体形态基本一致，纯化工作才结束，菌株做鉴定备用。
2.根据权利要求1所述的一种水产养殖用光合细菌的制备及纯化方法，其特征在于：所述步骤B中光合细菌制备方法如下：
1）、取10g土壤或10ml污水放置于500ml三角瓶中，按照1:5的比例加入灭菌后的液体富集培养基500ml，搅拌均匀后，在液面上加一层灭菌的液体石蜡形成厌氧环境，同时外加橡皮塞，以阻断外界空气，或者将淤泥放入50ml带塞磨口瓶中，加满培养基，塞好塞子，隔绝空气，进行厌氧培养；
2）、在25-35℃温度下，用5000-10000lx的光照强度进行光照培养2-3周，生活在海水中的菌株生长较缓慢，需要培养1-3月，这时，光合细菌在玻璃壁上呈菌落状，布满全部，呈红色、深红色、橙色或绿色；
3）、然后，用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌，移植至约50ml的试剂瓶中，再加入上述培养液，继续培养；
4）、这样重复富集操作2-3次，用试剂瓶培养时，先装入泥状溶液，再把各种培养液装满瓶子，然后塞紧塞子，防止培养液溢出，保持厌氧条件，试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长时间培养液蒸发，在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良好的光合细菌悬浮液适当稀释，在厌氧条件下继续进行光照培养。
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