CN113832082A - 一种快速分离纯化光合细菌的方法 - Google Patents

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张鑫志
肖骊锟
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Abstract

本发明公开了一种快速分离纯化光合细菌的方法，具体为：将从自然界采集的样品用无菌水稀释、混匀后取少量划线接种于分离培养基上，之后于黑暗环境以及有氧条件下培养至出现单菌落；将单菌落接种于液体培养基中密封培养一段时间后根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，当培养基呈现黄、橙、红或粉色时表明获得光合细菌；否则再次进行分离纯化过程至获得光合细菌。本发明能够在很短的时间内获得光合细菌，与常规的光合细菌分离纯化方法相比极大的缩短了分离时间；另外整个分离过程无需借助厌氧设备、设施，投入小；在充分保证分离结果的准确性的基础上，整个分离过程不涉及复杂的操作步骤，具备较高的稳定性和可重复性。

Description

一种快速分离纯化光合细菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物分离纯化技术领域，特别是涉及一种快速分离纯化光合细菌的方法。
背景技术：
光合细菌是一类能利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。自然环境下，光合细菌广泛分布于土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等环境中，可通过厌氧富集方式获得具有光合细菌的混合菌液。现有的光合细菌纯化方法，如半固体试管法、Hungate滚管法、双层平板法等，存在操作方法相对复杂、实验重复性差、耗时长等缺陷；而通过厌氧设备培养厌氧菌，投入成本相对较大且光合细菌生长缓慢，尤其是在厌氧平板上的生长更加缓慢，通过厌氧技术分离光合细菌耗时过长，极大的限制了光合细菌的分离纯化效率。
发明内容：
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种快速分离纯化光合细菌的方法，可快速、准确地获得光合细菌。
本发明提供的光合细菌的快速分离纯化方法具体包括如下步骤：
1)从自然界采集样品；
2)将样品用无菌水稀释、混匀后取少量划线接种于分离培养基上；
3)将分离培养基置于黑暗环境中，在有氧条件下培养至出现单菌落；
4)挑取单菌落接种于液体培养基中密封培养一段时间；
5)根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，当培养基呈现黄、橙、红或粉色时表明获得光合细菌；否则重复所述步骤1)～步骤5)的分离纯化过程，直至获得光合细菌。
进一步地，当通过所述步骤5)获得光合细菌后，继续执行步骤6)：从所述步骤5)获得的光合细菌的液体培养基中取菌样于平板上反复划线培养，直至获得光合细菌纯菌株。
进一步地，所述步骤3)中的黑暗有氧培养温度为25～35℃，培养时间为1～3天；所述步骤4)的培养条件为：温度25～35℃，光照强度2000～5000Lx，培养时间3～7天。
进一步地，所述步骤2)中的分离培养基的组分配比为：NaHCO3 1～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、琼脂粉15～25g、海水1000mL；所述步骤4)中的液体培养基的组分配比为：NaHCO3 1～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、海水1000mL。
进一步地，所述步骤6)中用于划线培养的平板的组分配比为：NaHCO3 1～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、琼脂粉15～25g、海水1000mL；相应的培养条件为：黑暗有氧培养，培养温度为25～35℃。
进一步地，所述步骤2)中的划线接种方法采用四区划线法。
本发明的有益效果在于：
1)分离效率高：能够在很短的时间内获得光合细菌，与常规的光合细菌分离纯化方法相比极大的缩短了分离时间；
2)分离成本极低：整个分离过程无需借助厌氧设备、设施，投入小；
3)简单可控、易于操作：在充分保证分离结果的准确性的基础上，整个分离过程不涉及复杂的操作步骤，具备较高的稳定性和可重复性。
附图说明：
图1实施例1获得的沙氏外硫红螺菌的活细胞扫描光谱。
图2实施例2获得的嗜硫小红卵菌的活细胞扫描光谱。
图3本发明获得的沙氏外硫红螺菌和嗜硫小红卵菌的生长情况测定结果。
图4本发明获得的沙氏外硫红螺菌和嗜硫小红卵菌的COD降解能力测定结果。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明技术方案做进一步详细说明。
实施例1
1)从自然界采集样品。样品为采自天津海河沿岸的沼泽污泥。
2)将样品用无菌水稀释、混匀后取少量划线接种于分离培养基上。划线接种采用四区划线法：用灼烧后的接种环蘸取菌悬液，在平板内划3～5条平行线形成第一区划线，灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区划线，采用与第二区划线相同的操作完成第三区和第四区的划线，第三区划线不与第一区划线接触，第四区划线不与第一区、第二区划线接触。所用的分离培养基的组分配比为：NaHCO3 1g、氯化铵1g、K2HPO4 0.1g、酵母粉0.05g、琼脂粉15g、海水1000mL，灭菌后倒平板备用。
3)将分离培养基置于黑暗有氧条件下25℃培养至出现单菌落，本步骤的培养时间为2天。
4)将事先准备好的液体培养基充满培养容器，用接种环或牙签从分离培养基中挑取单菌落后接种于液体培养基中(每个反应容器对应一个单菌落)，接种后密封培养3天；培养温度为25℃，光照强度为5000Lx。所用的液体培养基的组分配比为：NaHCO3 1g、氯化铵2g、K2HPO4 0.6g、酵母粉0.15g、海水1000mL，灭菌后备用。
5)根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，本实施例选取的40个单菌落所对应的培养容器(液体培养基)中有9个呈现橙色或红色，表明获得光合细菌。
6)分别从呈现橙色或红色的液体培养基中少量培养液(菌样)以三区或四区划线方式划线接种于平板上，培养条件及培养基组分配比与步骤3)相同，培养至出现单菌落(2～3天)；挑取单菌落，以相同的方式重复进行划线分离培养2～3次，获得光合细菌纯菌株。
经16s rDNA测序鉴定，步骤6)获得的2株纯菌株分别为沙氏外硫红螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。
实施例2
1)从自然界采集样品。样品为采自天津海河沿岸的土壤样品。
2)将样品用无菌水稀释后取少量以划线接种于分离培养基上。划线接种采用与实施例1完全相同的四区划线法。分离培养基的组分配比为：NaHCO3 1.15g、氯化铵2g、K2HPO40.6g、酵母粉0.12g、琼脂粉20g、海水1000mL，灭菌后倒平板备用。
3)将分离培养基置于黑暗有氧条件下30℃培养至出现单菌落，本步骤的培养时间为2天。
4)将单菌落接种于液体培养基中培养，接种及培养方法与实施例1步骤4)相同。培养温度为35℃，光照强度为2000Lx，培养时间为7天。液体培养基的组分配比为：NaHCO31.15g、氯化铵2g、K2HPO4 0.6g、酵母粉0.12g、海水1000mL，灭菌后备用。
5)根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，本实施例选取的25个单菌落所对应的培养容器(液体培养基)中有2个呈现橙色或红色，表明获得光合细菌。
6)采用与实施例1步骤6)相同的方法对橙色或红色的液体培养基中的菌样做进一步分离纯化，获得光合细菌纯菌株。
经16s rDNA测序鉴定，步骤6)获得的1株纯菌株为嗜硫小红卵菌(Rhodovulumsulfidophilum)。
实施例3
1)从自然界采集样品。样品为采自天津海河浅层水体的水样。
2)将水样用无菌水稀释后取少量以划线接种于分离培养基上。划线接种采用与实施例1完全相同的四区划线法。分离培养基的组分配比为：NaHCO3 1.25g、氯化铵3g、K2HPO41g、酵母粉0.2g、琼脂粉25g、海水1000mL，灭菌后倒平板备用。
3)将分离培养基置于黑暗有氧条件下35℃培养至出现单菌落，本步骤的培养时间为2天。
4)将单菌落接种于液体培养基中培养，接种及培养方法与实施例1步骤4)相同。培养温度为35℃，光照强度为2000Lx，培养时间为7天。液体培养基的组分配比为：NaHCO31.25g、氯化铵3g、K2HPO4 1g、酵母粉0.2g、海水1000mL，灭菌后备用。
5)根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，本实施例选取的18个单菌落所对应的培养容器(液体培养基)中有3个呈现橙色或红色，表明获得光合细菌。
6)采用与实施例1步骤6)相同的方法对橙色或红色的液体培养基中的菌样做进一步分离纯化，获得光合细菌纯菌株。
经16s rDNA测序鉴定，步骤6)获得的1株纯菌株为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
实施例4
分别取实施例1获得的沙氏外硫红螺菌和实施例2获得的嗜硫小红卵菌进行活细胞扫描光谱测定。结果如图1、2所示。图1中沙氏外硫红螺菌的活细胞扫描光谱在862nm和799nm处的吸收峰为该光合菌的细菌叶绿素a的吸收峰；图2中嗜硫小红卵菌的活细胞扫描光谱在378、590、804和856nm处的吸收峰均为该菌的细菌叶绿素a的吸收峰。
实施例5
对实施例1获得的沙氏外硫红螺菌和实施例2获得的嗜硫小红卵菌进行生长及COD降解能力测定。测定所采用的对照1和对照2分别为通过常规厌氧分离方式(分离及培养过程均在厌氧箱内完成)获得的沙氏外硫红螺菌和嗜硫小红卵菌。生长情况根据菌在培养5天后在660nm处的OD值测定结果绘制。化学需氧量(COD)降解率的测定方法为：根据《水和废水监测分析方法(第四版)》中的重铬酸钾法测定。光合菌的生长情况测定结果如图3所示，由本发明方法获得的沙氏外硫红螺菌和嗜硫小红卵菌与各自的对照相比，OD值几乎没有差别；COD降解能力的测定结果(图4)也表明本发明获得的光合菌与常规方法分离得到的光合菌在降解能力上无明显差异。

Claims (5)

1.一种快速分离纯化光合细菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从自然界采集样品；
2)将样品用无菌水稀释、混匀后取少量划线接种于分离培养基上；
3)将分离培养基置于黑暗环境中，在有氧条件下培养至出现单菌落；
4)挑取单菌落接种于液体培养基中密封培养一段时间；
5)根据液体培养基的颜色判定是否获得光合细菌，当培养基呈现红、橙、黄、紫或粉色时表明获得光合细菌；否则重复所述步骤1)～步骤4)的分离纯化过程，直至获得光合细菌。
2.根据权利要求1所述的快速分离纯化光合细菌的方法，其特征在于：当通过所述步骤5)获得光合细菌后，继续执行步骤6)：从所述步骤5)获得的光合细菌的液体培养基中取菌样于平板上反复划线培养，直至获得光合细菌纯菌株。
3.根据权利要求1或2所述的快速分离纯化光合细菌的方法，其特征在于：所述步骤3)中的培养温度为25～35℃，培养时间为1～3天；所述步骤4)的培养条件为：温度25～35℃，光照强度2000～5000Lx，培养时间3～7天。
4.根据权利要求3所述的快速分离纯化光合细菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中的分离培养基的组分配比为：NaHCO31～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、琼脂粉15～25g、海水1000mL；所述步骤4)中的液体培养基的组分配比为：NaHCO31～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、海水1000mL。
5.根据权利要求4所述的快速分离纯化光合细菌的方法，其特征在于：所述步骤6)中用于划线培养的平板的组分配比为：NaHCO31～1.25g、氯化铵1～3g、K2HPO4 0.1～1g、酵母粉0.05～0.2g、琼脂粉15～25g、海水1000mL；相应的培养条件为：黑暗有氧培养，培养温度为25～35℃。
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