CN101455687A - 一株兼性厌氧海洋红细菌的活性提取物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，涉及一株兼性厌氧活性海洋红细菌、该菌株培养物的活性提取物及其制法，以及该提取物在抗菌药物方面的应用价值。一株从中国渤海分离获得的海洋菌株PSB－01，鉴定为海洋红细菌Rhodobium marinum，其乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相经硅胶薄层层析和反相高效液相分离，得到两个有效部分的油状物，对荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗性，具有作为抗菌药物的潜在用途。

Description

一株兼性厌氧海洋红细菌的活性提取物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及一株兼性厌氧海洋光合细菌，特别是该种海洋菌株培养物的活性提取物及其制法和该提取物在抗细菌药物方面的用途。

背景技术

海洋微生物来源的新药开发是二十一世纪世界范围的研究热点问题，以其新菌种来源、产生新结构活性物质、克服传统抗生素耐药性以及实现资源可持续等特点而为人们所普遍关注。目前已经从各类海洋微生物中分离到许多结构新颖的抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗肿瘤抗生素以及一些抗炎症和镇痛的活性物质、酶抑制剂等。海洋中存在一类兼性厌氧的微生物-光合细菌，这类微生物在自身代谢过程中能够分解低分子有机物，在地球化学循环中起着极为重要的作用。至今尚未见有报道从兼性海洋光合细菌类群中分离提取到具有药理活性的次生代谢产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光合细菌海洋菌株培养液的活性提取物。

本发明的另一个目的是提供了该活性提取物的分离方法。

本发明进一步的目的是提供了该活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。

本发明涉及的一株兼性厌氧海洋细菌PSB-01是从中国渤海海域的海洋底泥中分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为0.5％～5.0％；对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗性。依据《Bergy’s manual ofsystematical bacteriology》(vol.3.The Williams and wilkins Co.Baltimore.1984，28～29)，经鉴定为海洋红细菌Rhodobium marinum，已于2008年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏编号为：CGMCC No.2731。

海洋菌株PSB-01具有下述性质：菌株细胞呈短杆状，菌体大小为0.3μm～0.6μm×1.0μm～1.2μm，革兰氏染色为阴性，兼性厌氧，胞内含菌绿素a和类胡萝卜素。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.8～7.0。对有机碳源的利用情况如下：在(1)乙酸盐，(2)丙酮酸盐，(3)苹果酸盐等条件下生长良好。

海洋菌株PSB-01的16S rDNA序列(1249bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为EU910275。其全序列如下：

CGCGTGGGAATCTACCCAGTGGTACGGGATAACCCGAGGAAACTCGAGCTAATACCGTATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATTGCCATTGGATGAGCCCGCGTCGGATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGCAGAAGAAGCDTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATTGTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTCTGATACTGGCAATCTCGAGTCCGGAAGAGGTTGGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGCCAACTGGTCCGAGACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATGCTAGCCGTTGGTGGGTATACTCATCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATCCCGATCGCGGTTACCGGAGACGGTATCCTTCAGCTAGGCTGGATCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGAAAATCCCCAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGTCCTCTGCAACTCGGGGGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG

这种海洋菌株PSB-01可以利用常规的液体培养方式，可使培养基中含有用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适宜于PSB-01海洋菌株生长为准，并以选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。当然这些培养基的组分、氢离子的浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用的菌株种类及外部条件等进行适当的调节，并获得最好的效果。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋菌株PSB-01产生抗生素最佳：

液体培养基为：

              蛋白胨                2.5g；

              酵母膏                2.5g；

              人工海水(或陈海水)    1000ml；

              调节pH为6.8～7.0。

人工海水配方：

              NaCl                  25.0g；

              Na₂SO₄                4.0g；

              KCl                   0.7g；

              NaHCO₃                0.20g；

              KBr                   0.10g；

              H₃BO₃                 0.03g；

              NaF                   0.003g；

              1.0mol/L MgCl₂溶液    53mL；

              1.0mol/l CaCl₂溶液    10mL；

              0.1mol/L SrO₂溶液     0.90ml；

              蒸馏水1000ml，调节pH为6.8～7.0。

A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株PSB-01，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于28～30℃下恒温光照培养，采用白炽灯作光源，功率为15W～40W为宜，光源距离培养容器20厘米～30厘米，两侧安置。培养时间为7～10天；

B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株PSB-01菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；

C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得两份干固体。

D.提纯：将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，分别用体积比为二氯甲烷：甲醇＝2：1的混合溶剂洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。

本发明中从海洋菌株PSB-01中提取得到的活性提取物，通过抗菌模型筛选，采用琼脂稀释法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.2000.Approved standard：M2～A7，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性：乙酸乙酯相中制备出的活性组分抗荧光假单胞菌的MIC值为0.83μg/mL；抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.70μg/mL；抗表皮葡萄球菌的MIC值为0.97μg/mL；抗枯草芽孢杆菌的MIC值为0.68μg/mL；正丁醇相中制备出的活性组分抗荧光假单胞菌的MIC值为0.90μg/mL；抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.81μg/mL；抗表皮葡萄球菌的MIC值为1.38μg/mL；抗枯草芽孢杆菌的MIC值为0.83μg/mL。

利用本发明的活性提取物中的有效组分，可以用于制备抗菌的药物。

以下用实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1.液体培养基为：

                 蛋白胨                2.5g；

                 酵母膏                2.5g；

                 人工海水(或陈海水)    1000ml；

                 调节pH为6.8～7.0。

人工海水配方：

                 NaCl                  25.0g；

                 Na₂SO₄                4.0g；

                 KCl                   0.7g；

                 NaHCO₃                0.20g；

                 KBr                   0.10g；

                 H₃BO₃                 0.03g；

                 NaF                   0.003g；

                 1.0mol/L MgCl₂溶液    53mL；

                 1.0mol/l CaCl₂溶液    10mL；

                 0.1mol/L SrO₂溶液     0.90ml；

                 蒸馏水1000ml，调节pH为6.8～7.0。

A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株PSB-01，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于28～30℃下恒温光照培养，采用白炽灯作光源，功率为15W～40W为宜，光源距离培养容器20厘米～30厘米，两侧安置。培养时间为7～10天；

B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株PSB-01菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；

C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得两份干固体。

D.提纯：将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，分别用体积比为二氯甲烷：甲醇＝2：1的混合溶剂洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。

实施例2.液体培养基为：

            NaCl                           30.4g；

            酵母膏                         1.0g；

            丁二酸钠                       1.0g；

            KH₂PO₄                         0.5g；

            MgSO₄·7H₂O                    3.0g；

            NH₄Cl                          0.4g；

            CaCl₂·2H₂O                    0.05g；

            柠檬酸铁(0.1％)                5.0mL；

            SL～6                          1.0mL；

            无水乙醇                       0.5mL；

            调节pH为6.8±0.2。

其中SL～6为微量元素溶液，配方为：

            H₃BO₃                          0.3g；

            CoCl₂·6H₂O                    0.2g；

            ZnSO₄·7H₂O                    0.1g；

            MnCl₂·4H₂O                    0.03g；

            NaMoO₄·2H₂O                    0.03g；

            NiCl₂·6H₂O                     0.02g；

            CuCl₂·2H₂O                     0.01g；

            蒸馏水                          100mL；

            用HCl调节pH为3.4。

A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株PSB-01，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于28～30℃下恒温光照培养，采用白炽灯作光源，功率为15W～40W为宜，光源距离培养容器20厘米～30厘米，两侧安置。培养时间为7～10天；

B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株PSB-01菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；

C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得两份干固体。

D.提纯：将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，分别用体积比为二氯甲烷：甲醇＝2：1的混合溶剂洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。

实施例3.活性组分活性测定结果

采用琼脂稀释法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.2000.Approved standard：M2～A7，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性：乙酸乙酯相中制备出的活性组分抗荧光假单胞菌的MIC值为0.83μg/mL；抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.70μg/mL；抗表皮葡萄球菌的MIC值为0.97μg/mL；抗枯草芽孢杆菌的MIC值为0.68μg/mL；正丁醇相中制备出的活性组分抗荧光假单胞菌的MIC值为0.90μg/mL；抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.81μg/mL；抗表皮葡萄球菌的MIC值为1.38μg/mL；抗枯草芽孢杆菌的MIC值为0.83μg/mL。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>大连交通大学

<120>一株兼性厌氧海洋红细菌的活性提取物及其制法和用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1239

<212>DNA

<213>海洋菌株PSB-01的16S rDNA序列

<400>1

Claims (4)

1.一株兼性厌氧海洋红细菌PSB-01CGMCC No.2731培养液的活性提取物。

2.根据权利要求1所述的海洋菌株PSB-01培养液的活性提取物，其特征在于为乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗性。

3.根据权利要求2所述的海洋菌株PSB-01培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株PSB-01，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于28～30℃下恒温光照培养，采用白炽灯作光源，功率为15W～40W为宜，光源距离培养容器20厘米～30厘米，两侧安置。培养时间为7～10天；

B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株PSB-01菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；

所述种子培养和扩大培养中，液体培养基为：

蛋白胨                  2.5g；

酵母膏                  2.5g；

人工海水(或陈海水)      1000ml；

调节pH为6.8～7.0。

人工海水配方：

NaCl                   25.0g；

Na₂SO₄                 4.0g；

KCl                    0.7g；

NaHCO₃                 0.20g；

KBr                   0.10g；

H₃BO₃                 0.03g；

NaF                          0.003g；

1.0mol/L MgCl₂溶液           53mL；

1.0mol/l CaCl₂溶液           10mL；

0.1mol/L SrO₂溶液            0.90ml；

蒸馏水1000ml，调节pH为6.8～7.0。

C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得两份干固体。

D.提纯：将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，分别用体积比为二氯甲烷：甲醇＝2：1的混合溶剂洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。

4.权利要求1或2所述的海洋菌株PSB-01培养液的活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。