CN102168034B - 一种海洋链霉菌以及利用该菌制备替达霉素a和b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋链霉菌以及利用该菌制备替达霉素A和B的方法。该菌为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666，于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4359。本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666能够产生细菌RNA聚合酶抑制剂替达霉素A和替达霉素B，这是首次从海洋放线菌中发酵提取分离得到替达霉素A和替达霉素B，为先导化合物提供了更多的源泉。
Description
技术领域：
本发明涉及一种海洋链霉菌，具体涉及一种海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666，另外本发明还涉及一种利用该菌株制备替达霉素A和B的方法。
背景技术：
替达霉素A(Tirandamycin A)和替达霉素B(Tirandamycin B)是利迪链菌素类似化合物，其结构式如式(I)所示，这类Tetramic acid(2，4-吡咯啉啶二酮)抗生素具有广泛的生物活性，如抗革兰阳性细菌、抑制白血病淋巴细胞的末端转脱氧核苷酸酰酶、抑制细菌RNA聚合酶、抑制小鼠肝线粒体氧化磷酸化和HIV蛋白酶等生物活性(Reusser F.Infect Immun，1970，2(1)：77；Reusser F.Infect Immun，1970，2(1)：82；Reusser F.Antimicrob Agents Chemother，1976，10(4)：618.)。Tuske等用X射线衍射法阐明了利迪链菌素与RNA聚合酶复合物的晶体三维结构和作用位点，发现了其发挥抑制作用的方式和机制，这种作用方式有别于临床治疗肺结核疾病药物利福平作用于细菌RNA聚合酶(Tuske S，et al.Cell，2005，122(26)：541)。提示此类抗生素具有潜在的药物开发价值。近年来这些方面的研究受到越来越多的重视。
式(I)
Tirandamycin A：R＝H
Tirandamycin B：R＝OH
发明内容：
本发明的第一个目的是提供了一种新的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666，该菌于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No. 4359。
本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666是从我国南海北部水深35米的海底沉积物中分离获得，该海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666菌的分类学特征如下：该菌菌落质地致密，菌落与固体培养基结合较紧，不容易被挑起。在AM2固体培养基上培养气生菌丝少，基质菌丝呈黄褐色；在高氏一号固体培养基培养产生大量气生菌丝；在AM2固体培养基和高氏一号培养基上培养均产生紫红色可溶性色素；在M-ISP4固体培养基上生长良好，不产生紫红色可溶性色素，基质菌丝呈黄褐色和气生菌丝白色，产生灰色分生孢子。利用常规方法提取该菌的16S rDNA，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，Blast分析表明，该海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的16S rDNA与链霉菌S.variabilis NBRC 12825T和S.aureofaciens IMET 43577T菌株的16S rDNA序列相似性较高，分别为97.9％和97.7％，表明该菌属于链霉菌属中的一个种。将该菌命名为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666，该菌于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCCNo.4359。
本发明的第二个目的是提供从本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物中制备替达霉素A和替达霉素B的方法。
所述的替达霉素A优选通过以下方法制备：
a)制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物，离心得到发酵液和菌丝体；
b)发酵液用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏A；菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏B，浸膏A和浸膏B合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为96％-94％洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20％～100％梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为80％洗脱的馏分，该馏分再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10∶0～8∶2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为94％洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素A。
所述的替达霉素B优选通过以下方法制备：
a)制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物，离心得发酵液和菌丝体；
b)菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏C；发酵液用乙酸乙酯或者丁酮萃取，减压浓缩得浸膏D，浸膏C和浸膏D合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体 积比10∶0～5∶5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比8∶2洗脱的馏分，再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比8∶2洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20％～100％梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为20％～30％洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素B。
所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物优选通过以下方法制备的：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养40～60小时制得种子液，将种子液按照体积比1∶9的比例接入发酵培养基中，28℃，200rpm，培养120～168小时，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物，所述发酵培养基和种子培养基都为AM2发酵培养基，按质量分数100％计：大豆粉1％，蛋白胨0.2％，葡萄糖2％，淀粉0.5％，酵母膏0.2％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，碳酸钙0.2％，粗海盐3％，余量为水。
所述的减压蒸馏浓缩优选都是在-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏浓缩。
所述的替达霉素A优选通过以下方法制备：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养40～60小时制得种子液，将种子液按照体积比1∶9的比例接入发酵培养基中，28℃，200rpm，培养120～168小时，获得海洋链霉菌(Streptomycessp.)SCSIO 1666的发酵培养物，所述种子培养基为AM2发酵培养基，按质量分数100％计：大豆粉1％，蛋白胨0.2％，葡萄糖2％，淀粉0.5％，酵母膏0.2％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，碳酸钙0.2％，粗海盐3％，余量为水，所述的发酵培养基，按质量分数100％计：大豆粉1％，蛋白胨0.2％，葡萄糖2％，淀粉0.5％，酵母膏0.2％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，碳酸钙0.2％，粗海盐3％，大孔树脂2％，余量为水，将发酵培养物离心弃去发酵液得到菌丝体和大孔树脂，菌丝体和大孔树脂通过水漂洗分离，大孔树脂用无水乙醇萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏E，菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得到浸膏F，浸膏E和F合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为96％-94％洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20％～100％梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为80％洗脱的馏分，该馏分再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10∶0～8∶2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为94％洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素A。
本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666能够产生细菌RNA聚合酶抑制剂替达霉素A和替达霉素B，这是首次从海洋放线菌中发酵提取分离得到替达霉素A和替达霉素B，为先导化合物提供了更多的源泉。
本发明提供的最佳成份和配比的种子培养基和发酵培养基，利用该培养基，按照本发明 的培养条件和分离纯化工艺，可以得到最高产量的替达霉素A和替达霉素B，从而可以大规模的制备替达霉素A和替达霉素B。
本发明的链霉菌Streptomyces sp.1666于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4359。
附图说明：
图1是替达霉素A的ESI-MS；
图2是替达霉素B的ESI-MS；
图3是替达霉素B随发酵时间的变化曲线；
图4是海洋链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666在AM2发酵培养基发酵生产替达霉素的HPLC图谱；
图5是海洋链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666在AM2发酵培养基+2％大孔树脂发酵生产替达霉素的HPLC图谱。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步的说明，而不是对本发明的限制。
实施例一
海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的分离：
海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666是从我国南海北部水深35米的海底沉积物中分离获得，该海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666菌的分类学特征如下：该菌菌落质地致密，菌落与固体培养基结合较紧，不容易被挑起。在AM2固体培养基上培养气生菌丝少，基质菌丝呈黄褐色；在高氏一号固体培养基培养产生大量气生菌丝；在AM2固体培养基和高氏一号培养基上培养均产生紫红色可溶性色素；在M-ISP4固体培养基上生长良好，不产生紫红色可溶性色素，基质菌丝呈黄褐色和气生菌丝白色，产生灰色分生孢子。其16S rDNA序列，如SEQ ID NO：1所示，Blast分析表明，该海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的16SrDNA与链霉菌S.variabilis NBRC 12825T和S.aureofaciens IMET 43577T菌株的16S rDNA序列相似性较高，分别为97.9％和97.7％，因此属于链霉菌属中的一个种。将该菌命名为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666，该菌于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4359。
所使用的培养基配方如下：
高氏一号培养基：淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠 0.5g，硫酸亚铁0.01g，粗海盐30.0g，水1000mL，pH 7.2-7.4，琼脂粉18.0g
M-ISP4培养基：淀粉10.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁1.0g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠1.0g，蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，碳酸钙2.0g，粗海盐30.0g，微量元素溶液[每升含七水硫酸亚铁、四水氯化锰和七水硫酸锌各0.1克(pH 7.2)]1.0ml，水1000mL，pH 7.2-7.4，琼脂粉18.0g
AM2培养基：大豆粉10.0g，蛋白胨2.0g，葡萄糖20.0g，淀粉5.0g，酵母膏2.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，碳酸钙2.0g，粗海盐30.0g，水1000mL，pH 7.2-7.4，琼脂粉18.0g琼脂粉18.0g
实施例二
替达霉素A的制备：
1、种子培养：
(1)AM2种子培养基配制：大豆粉16g，蛋白胨3.2g，葡萄糖32g，淀粉8g，酵母膏3.2g，K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O 0.8g，碳酸钙3.2g，粗海盐48g，加自来水1600mL，调节pH7.0～7.4，分装32个250mL三角瓶，每瓶装50mL，115℃保温30分钟灭菌；
(2)种子培养：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养50小时制得种子液1600mL。
2、发酵培养：
(1)发酵培养基的配置
AM2培养基+2％大孔树脂配制：大豆粉72g，蛋白胨14.4g，葡萄糖144g，淀粉36g，酵母膏14.4g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 3.6g，碳酸钙14.4g，粗海盐216g，大孔树脂144g，加自来水7200mL，调节pH 7.0～7.4，分装16个2000mL三角瓶，每瓶装450mL，115℃保温30分钟灭菌；
(2)发酵培养：
每瓶50mL种子液接入装有450mL无菌AM2培养基+2％大孔树脂的2000mL三角瓶中，28℃，200rpm，培养168小时，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物。
3、代谢产物的分析
取AM2培养基+2％大孔树脂发酵的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物50mL，3500rpm离心10分钟，发酵液弃去，大孔树脂和菌丝体用无水乙醇萃取三次，萃取液于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩后，用1mL甲醇溶解，12000rpm离心10分钟，离心两次，取上清液10μL于HPLC上分析。
4、替达霉素A的分离纯化
将AM2培养基+2％大孔树脂发酵的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物，3500rpm离心十分钟，发酵液弃去，菌丝体和大孔树脂通过水漂洗分离开，菌丝体用丙酮萃取，大孔树脂用无水乙醇萃取，分别于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩后，合并浸膏获得总浸膏3.25g，用100～200目正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC-UV追踪分析，发现替达霉素A在氯仿-甲醇体积分数为96％～94％洗脱的馏分中，收集该馏分；该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水从体积分数20％～100％梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC追踪分析，显示替达霉素A在甲醇-水体积分数为80％洗脱的馏分中；浓缩该馏分，再用正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇从体积比10∶0～8∶2梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC-UV追踪分析，显示替达霉素A在氯仿-甲醇体积分数为94％洗脱的馏分中，收集该馏分，减压蒸干，即得到纯品(5.6mg)，经鉴定为替达霉素A，其ESI-MS见于图1，碳谱和氢谱数据见于表1。
表1替达霉素A和B的碳谱和氢谱数据
实施例三
替达霉素B的制备：
1、种子培养：
(1)AM2种子培养基配制：大豆粉16g，蛋白胨3.2g，葡萄糖32g，淀粉8g，酵母膏3.2g，K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O 0.8g，碳酸钙3.2g，粗海盐48g，加自来水1600mL，调节pH7.0～7.4，分装32个250mL三角瓶，每瓶装50mL，115℃保温30分钟灭菌；
(2)种子培养：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养50小时制得种子液1600mL。
2、发酵培养
(1)发酵培养基的配置：
AM2发酵培养基配制：大豆粉72g，蛋白胨14.4g，葡萄糖144g，淀粉36g，酵母膏14.4g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 3.6g，碳酸钙14.4g，粗海盐216g，加自来水7200mL，调节pH 7.0～7.4，分装16个2000mL三角瓶，每瓶装450mL，115℃保温30分钟灭菌；
(2)发酵培养：
每瓶50mL种子液接入装有450mL无菌AM2发酵培养基的2000mL三角瓶中，28℃，200rpm，培养168小时，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物。
3、代谢产物的分析
取AM2发酵培养基发酵的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物50mL，用两倍体积的丁酮萃取三次，萃取液于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩后，用1mL甲醇溶解，12000rpm离心10分钟，离心两次，取上清液10μL于HPLC分析。
4、替达霉素B的纯化
AM2培养基发酵的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666的发酵培养物，3500rpm离心十分钟，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，所加溶剂的量是发酵液的2倍体积，菌丝体用丙酮萃取，分别于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩合并获得总浸膏2.62g，分别用100～200目正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC追踪分析，显示替达霉素B在氯仿-甲醇体积比为8∶2的馏分中；浓缩该馏分，再经300～400目正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇从体积比10∶0～5∶5梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC追踪分析，显示替达霉素B在氯仿-甲醇体积比8∶2洗脱的馏分；蒸干该馏分后经反相硅胶柱层析，用甲醇-水从体积分数20％～100％梯度洗脱，枯草芽孢杆菌抑菌实验结果结合HPLC追踪分析，显示替达霉素B在甲醇-水体积分数为20％～30％洗脱的馏分中，减压蒸干即得到纯品(8.3mg)，经鉴定为替达霉素B，其ESI-MS见于图2，碳谱和氢谱数据见于表1。
实施例四
发酵时间分析：
1、种子培养：
(1)AM2种子培养基配制：大豆粉1.0g，蛋白胨0.2g，葡萄糖2g，淀粉0.5g，酵母膏0.2g，K2HPO40.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，碳酸钙0.2g，粗海盐3g，加自来水至100mL，分装2个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
(2)种子培养：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养50小时制得种子液100mL。
2、发酵培养
(1)发酵培养基的配置：
AM2发酵培养基配制：大豆粉6.0g，蛋白胨1.2g，葡萄糖12g，淀粉3.0g，酵母膏1.2g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，碳酸钙1.2g，粗海盐18g，加自来水500mL，调节pH 7.0～7.4，分装12个250mL三角瓶，每瓶装50mL，115℃保温30分钟灭菌；
(2)发酵培养：
将5mL种子液接入一瓶装有50mL无菌AM2发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，200rpm。
3、代谢产物的分析
分别取AM2发酵培养基发酵24、72、120、168、216、264小时的培养液50mL，用两倍体积的丁酮萃取三次，萃取液于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩后，用1mL甲醇溶解，12000rpm离心10分钟，离心两次，取上清液10μL于HPLC分析替达霉素A和B的含量，替达霉素B的含量随发酵时间的变化如图3所示，从图3可以看出替达霉素B的产量在发酵时间为120～168小时产量最高，同理经过测试分析，替达霉素A的产量也是在发酵时间为120～168小时产量最高。
实施例五
1、种子培养：
(1)AM2种子培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
(2)种子培养：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养50小时制得种子液150mL；
2、发酵培养：
(1)发酵培养基的配置：
①AM2发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
②AM2-1发酵培养基配制：大豆粉0.45g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
③AM2-2发酵培养基配制：大豆粉2.25g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
④AM2-3发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑤AM2-4发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，1％大孔树脂，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑥AM2-5发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，2％大孔树脂，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑦AM2-6发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，3％大孔树脂，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑧AM2-7发酵培养基配制：大豆粉1.5g，蛋白胨0.3g，葡萄糖3g，淀粉0.75g，酵母膏0.3g，K2HPO40.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，碳酸钙0.3g，3％粗海盐，4％大孔树脂，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑨JNP1发酵培养基配制：淀粉0.75g，鱼粉0.3g，海藻糖0.3g，几丁质0.3g，3％粗海盐，加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
⑩JNP2发酵培养基配制：淀粉1.5g，酵母膏0.6g，蛋白胨0.3g，3％粗海盐；加自来水至150mL，分装3个250mL三角瓶，每瓶装50mL，pH 7.0～7.4，115℃保温30分钟灭菌；
(2)发酵培养：
在分别装有50mL上述10种培养基的150mL三角瓶中，加入5mL种子液，28℃，200rpm，培养168小时；
3、代谢产物的分析
分别取上述发酵培养基发酵168小时的培养液50mL，用两倍体积的丁酮萃取三次(其中AM2-4、AM2-5、AM2-6、AM2-7发酵培养基发酵168小时的产物，3500rmp离心10分钟，发酵液弃去，大孔树脂和菌丝体用无水乙醇萃取三次)，萃取液于-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏，浓缩后，用1mL甲醇溶解，12000rmp离心10分钟，离心两次，取上清液10μL于HPLC分析。
经HPLC测试分析表明，AM2发酵培养基的发酵产物中的替达霉素B产量最高，见于图4。AM2-5发酵培养基的发酵产物中的替达霉素A产量最高，见于图5。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>一种海洋链霉菌以及利用该菌制备替达霉素A和B的方法
<160>1
<210>1
<211>1482
<212>DNA
<213>海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1666
<400>1
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC 60
GATGAACCTC TTTCGGGAGG GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG 120
CCCTGCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATATGA CCATCGGGGG 180
CATCCCTGGT GGTGGAAAGC TCCGGCGGTG CAGGATGAGC CCGCGGCCTA TCAGCTTGTT 240
GGTGGGGTGA TGGCCTACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA 300
CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA 360
ATGGGCGAAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC 420
CTCTTTCAGC AGGGAAGAAG CGAAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCGC CGGCTAACTA 480
CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGC GCGAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA 540
AGAGCTCGTA GGCGGCTTGT CGCGTCGGTT GTGAAAGCCC GGGGCTTAAC CCCGGGTCTG 600
CAGTCGATAC GGGCAGGCTA GAGTTCGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG 660
AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG CCGATACTGA 720
CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT 780
AAACGTTGGG CACTAGGTGT GGGCGACATT CCACGTCGTC CGTGCCGCAG CTAACGCATT 840
AAGTGCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC 900
CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT TACCAAGGCT 960
TGACATACAC CGGAAAGCAT CAGAGATGGT GCCCCCCTTG TGGTCGGTGT ACAGGTGGTG 1020
CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC 1080
CCTGTCCTGT GTTGCCAGCG GGTCATGCCG GGGACTCACA GGAGACCGCC GGGGTCAACT 1140
CGGAGGAAGG TGGGGACGAC GTCAAGTCAT CATGCCCCTT ATGTCTTGGG CTGCACACGT 1200
GCTACAATGG CCGGTACAAT GAGCTGCGAT ACCGCGAGGT GGAGCGAATC TCAAAAAGCC 1260
GGTCTCAGTT CGGATTGGGG TCTGCAACTC GACCCCATGA AGTCGGAGTC GCTAGTAATC 1320
GCAGATCAGC ATTGCTGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACGT 1380
CACGAAAGTC GGTAACACCC GAAGCCGGTG GCCCAACCTT TGGGAGGGAG CCGTCGAAGG 1440
TGGGACTGGC GATTGGGACG AAGTCGTAAC AAGGTAACCG TA 1482
Claims (3)
1.海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666，其保藏编号为：CGMCC No.4359。
2.一种制备替达霉素A和替达霉素B的方法，其特征在于，
所述的替达霉素A是通过以下任一种方法制备的：
方法1：
a)制备权利要求1所述的海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666的发酵培养物，离心得到发酵液和菌丝体；
b)发酵液用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏A；菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏B，浸膏A和浸膏B合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～5：5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为96%-94%洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20%～100%梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为80%洗脱的馏分，该馏分再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～8：2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为94%洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素A；
方法2：
将权利要求1所述的海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃,200rpm,培养40～60小时制得种子液，将种子液按照体积比1：9的比例接入发酵培养基中，28℃，200rpm，培养120～168小时，获得海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666的发酵培养物，所述种子培养基为AM2发酵培养基，按质量分数100%计：大豆粉1%，蛋白胨0.2%，葡萄糖2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O0.05%，碳酸钙0.2%，粗海盐3%，余量为水，所述的发酵培养基，按质量分数100%计：大豆粉1%，蛋白胨0.2%，葡萄糖2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O0.05%，碳酸钙0.2%，粗海盐3%，大孔树脂2%，余量为水，将发酵培养物离心弃去发酵液得到菌丝体和大孔树脂，菌丝体和大孔树脂通过水漂洗分离，大孔树脂用无水乙醇萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏E，菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得到浸膏F，浸膏E和F合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～5：5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为96%-94%洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20%～100%梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为80%洗脱的馏分，该馏分再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～8：2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积分数为94%洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素A；
所述的替达霉素B是通过以下方法制备的：
a)制备权利要求1所述的海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666的发酵培养物，离心得发酵液和菌丝体；
b)菌丝体用丙酮萃取，减压蒸馏浓缩得浸膏C；发酵液用乙酸乙酯或者丁酮萃取，减压浓缩得浸膏D，浸膏C和浸膏D合并，经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～5：5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比8：2洗脱的馏分，再经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10：0～5：5梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比8：2洗脱的馏分，该馏分再用反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂从体积分数20%～100%梯度洗脱，收集甲醇-水体积分数为20%～30%洗脱的馏分，纯化即得到纯品替达霉素B；
所述的制备替达霉素A的方法1中的步骤a）和制备替达霉素B的方法中的步骤a）中的海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666的发酵培养物是通过以下方法制备的：将海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666接入种子培养基中，28℃,200rpm,培养40～60小时制得种子液，将种子液按照体积比1：9的比例接入发酵培养基中，28℃，200rpm，培养120～168小时，获得海洋链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 1666的发酵培养物，所述发酵培养基和种子培养基都为AM2发酵培养基，按质量分数100%计：大豆粉1%，蛋白胨0.2%，葡萄糖2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，碳酸钙0.2%，粗海盐3%，余量为水。
3.根据权利要求2所述的制备替达霉素A和替达霉素B的方法，其特征在于，所述的减压蒸馏浓缩都是在-0.05～-0.15MPa，40℃减压蒸馏浓缩。
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