CN103740610B - 链球菌auh-jld109及其在柚皮素生物合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的应用，属于微生物及其应用技术领域。链球菌AUH-JLD109，保藏号为CGMCC No.8033。其应用包括下述步骤：（1）混菌种子液的培养；（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明采用链球菌AUH-JLD109使柚皮苷进行转化，转化性能稳定，大大提高了柚皮素的转化率，且方法简单，原料易得，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用。
背景技术
柚皮素（Naringenin）是二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗高血糖、抗氧化、解痉孪和利胆等多种生理或药理功能。早在上世纪90年代人们就曾认识到柚皮素具有抗癌功效，如Guengerich等于1990年报道柚皮素而非柚皮苷能抑制黄曲霉毒素B1诱导的致癌作用(Carcinogenesis，1990，, 11:2275-2279)；Chen等于2003年发现，较低浓度的柚皮素（40微摩尔/升）即可引起白血病细胞系HL-60细胞发生凋亡，且表现出明显的量效关系和时间依赖性；与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素（即柚皮苷）在相同浓度下甚至更高浓度（80微摩尔/升）下仍不表现明显的细胞凋亡作用，而用柚苷酶处理柚皮苷后又产生明显细胞凋亡作用，这一研究结果再次证明柚皮素而非柚皮苷的抗癌活性（Biochemical Pharmacology，2003，66:1139-1150）。此外，RAZA等用柚皮素预处理雄性小鼠21天后发现，柚皮素可显著减弱局部性脑损伤小鼠模型中的氧化应激以及受NF-KB调节的炎症进程（Neuroscience，2013，230:157-171）。Ortiz-Andrade等发现柚皮素具有体内外抗高血糖活性（Diabetes, Obesity and Metabolism，2008，10:1097-1104）。我国学者廖霞等曾报道柚皮素对凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用，且该抑制作用随浓度的增加而增大 (时珍国医药，2010，21（11）:2909-2910)。
柚皮素为天然产物，但因在天然植物中含量较低，直接从植物中提取分离柚皮素的收率也较低。如陈雪峰等采用传统有机溶剂法从桃叶中提取柚皮素， 通过试验确定柚皮素最佳提取条件为: 乙醇和甲醇混合溶剂（浓度比为甲醇:乙醇=7:3），温度为50℃，时间为5小时，料液比为1:45(克/毫升)，然而在该最佳提取条件下柚皮素的收率仅为5.25%（食品科技，2009，34(5):209-212）。与柚皮素相比，柚皮苷（即与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素）则在柑橘属植物中分布广泛且含量较高。目前柚皮素的工业生产多以柚皮苷为底物，采用酸水解或柚苷酶水解这两种生产方式。刘亚萍（光谱实验室，2008，25(6):1292-1294）提供了酸水解柚皮苷来制备柚皮素的方法，然而，这种方法需多次结晶才能获得纯度较高的柚皮素。专利CN 102453011 A通过酸水解的方法虽获得的柚皮素的纯度较高，但是涉及到的有机溶剂种类多且步骤繁琐，不适合现代化生产绿色环保的要求。2003年Hwang等通过基因工程手段首次以酪氨酸为底物生物合成柚皮素，所设计的3套质粒系统中以第3套的得率最高，所制得的柚皮素约为400微克/升（Applied Microbiology Biotechnology，2003，69(5): 2699-2706)。此后，Leonard于2008年利用重组大肠杆菌以苯丙氨酸为底物，添加外源丙二酸盐诱导，并通过脂肪酸抑制宿主本身丙二酰辅酶A的旁路流失得到186毫克/升的柚皮素（Molecular Pharmaceutics，2008，5(2):257-265)。利用基因工程菌生物合成柚皮素的方法虽简便，但产量低，不适宜规模化生产。此外，酶水解柚皮苷获得柚皮素是目前柚皮素制备的另一主要途径。郑美瑜等（中国食品学报，2010，10(4):141-146）研究证实成品柚苷酶对柚皮苷单体的酶解条件为:酶解液中底物质量浓度为25克/毫升，酶含量为1酶单位/毫升，酶解时间为1.0-1.5小时，此条件下柚皮苷单体可被完全降解。酶法制备柚皮素具有反应条件温和、副产物少、产物纯度高等优点，但成品柚皮苷酶价格昂贵，也同样不适合大规模工业化生产，因此目前急需找到一种廉价高效的生物酶源来代替成品柚皮苷酶制备柚皮素。
柚苷酶广泛存在于植物、酵母、真菌及细菌中，近年来虽然国内外也从曲霉属、青霉属中筛选到高产柚苷酶真菌菌株，但是由于真菌发酵生产柚苷酶存在一些问题如（1）发酵周期长、需氧量大、发酵液粘稠，后期处理困难；（2）几乎所有菌株都受到葡萄糖的调节作用；（3）多数产柚苷酶真菌为多核细胞且易形成菌丝体，给菌种的选育造成困难，发酵过程中难以建立稳定的发酵系统。这一系列问题致使目前柚苷酶的价格较高。细菌生长迅速且遗传性能稳定，利用细菌发酵生产柚皮素因操作容易越来越受到人们关注。然而，目前国内外仅分离报道两株能产柚苷酶（能同时将结构中的鼠李糖和葡萄糖水解掉的酶）活性的细菌菌株，且两株菌产柚苷酶活性均较低。其中一株为Puri等2010年从土壤中分离到的葡萄球菌属菌株Staphylococcus xylosus MAK2（酶活性为8.45酶单位/毫升；Applied Biochemistry Biotechnology，2010，162:181-191），另一株为Pavithra Mukund 等从土壤中分离到的芽孢杆菌属菌株Bacillus methylotrophicus (酶活性为12.05酶单位/毫升；Preparative Biochemistry and Biotechnology,doi:10.1080/10826068.2013.797910)。相比之下，已报道的多为产a-L-鼠李糖苷酶（即只能将鼠李糖水解掉的酶）的细菌菌株，如拟杆菌属(Bacteroidessp.)、梭杆菌属(Fusobacteriumsp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.) 和梭菌属(Clostridium sp.)等。
发明内容
本发明提供一种链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109，保藏号为CGMCC No.8033。
本发明还提供在链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，采用链球菌AUH-JLD109使柚皮苷进行转化，转化性能稳定，大大提高了柚皮素的转化率，且方法简单，原料易得，成本低。
本发明采取的技术方案为：
一种链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109，保藏号为CGMCC No.8033。
链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用。
其应用包括下述步骤：
（1）混菌种子液的培养
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液接种于LB液体培养基或混菌发酵培养基中培养，得到混菌种子液；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏号为CGMCC No.8031；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液转接到LB培养基或混菌发酵培养基中，加入柚皮苷粗品母液进行共培养；所述混菌发酵培养基的重量组成为：1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸盐0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸铁，余量为水；磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物，磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为2:1；
（3）代谢产物的分离纯化。
优选的，步骤（1）中链球菌AUH-JLD109的种子液通过下述方法培养：将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养18-24小时作为种子液。
优选的，步骤（1）中大肠埃希氏菌AUH-D2-1的种子液通过下述方法培养：将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续18-24小时作为种子液。
优选的，步骤（1）中将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于LB液体培养基中，培养18-24小时。
优选的，步骤（2）混菌种子液按10-15%接种，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的终浓度为5.5-6.5毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2-3天。
优选的，步骤（2）中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为110-160毫摩尔/升。
优选的，步骤（2）中采用混菌发酵培养基进行共培养。
进一步优选的，步骤（3）中分离纯化为：等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离，得到代谢产物柚皮素。
链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109是从健康人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性兼性厌氧细菌菌株，该菌株能将中药化橘红乙醇水溶液提取物的柚皮苷粗品高效转化为柚皮素。推测是柚皮苷粗品在链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109（为方便书写，在这里将链球菌Streptococcus sp. AUH-JLD109简称菌株AUH-JLD109，以下均使用该转化菌株的简称形式）产生的柚苷酶作用下首先被水解掉一个鼠李糖生成普鲁宁，然后再水解掉一个葡萄糖生成柚皮素，有关柚皮素微生物生物合成途径如下所示：
本发明中的链球菌（Streptococcus sp. ）AUH-JLD109菌株（简称AUH-JLD109）已于2013年8月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.8033。中国微生物菌种保藏管理委员会地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
链球菌（Streptococcus sp. ）AUH-JLD109的分类学特征为：
菌落为圆形，直径2-4 毫米，白色，表面光滑湿润；菌落中部有凸起，边缘整齐。在BHI液体培养基中菌体为球形或卵圆形，成对或是短链排列；该菌株革兰氏染色呈阳性；在血平板培养时不产生溶血环。
由于菌株AUH-JLD109为兼性厌氧细菌菌株，对营养要求较高，经试验发现其在LB培养基中不能生长，在LB培养基中添加0.1%的维生素K1后仍不能生长；菌株AUH-JLD109在BHI培养基中虽然能正常生长，但是其水解底物柚皮苷的最大浓度仅为1.6毫摩尔/升，因此为提高其水解活性，考虑采用菌株AUH-JLD109与其它菌株混合培养的方式。
经过反复筛选发现从人体肠道分离得到一优势需氧菌株，将此菌株命名为AUH-D2-1。当菌株AUH-JLD109与菌株AUH-D2-1混合培养后能极显著提高水解柚皮苷的能力，通过混菌培养可将柚皮苷水解最大浓度从原来单菌时的1.6毫摩尔/升提高到至混菌时的6.0毫摩尔/升，且平均水解率高达99.7%。以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）为引物对该菌株16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交华大基因进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该菌株的16S rDNA序列与大肠埃希氏菌的相似性高达99%，将该菌株初步鉴定为埃希氏大肠杆菌，即Escherichia coli AUH-D2-1。
本发明中的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1菌株（简称AUH-D2-1）已于2013年8月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.8031。中国微生物菌种保藏管理委员会地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的分类学特征为：
菌落为不规则圆形，边缘有裂痕，培养48小时后菌落直径6-8 毫米，中间为乳白色凸起，周围为淡黄色，表面光滑湿润。在LB液体培养基中菌体呈短杆状；该菌株革兰氏染色呈阴性。
一、链球菌AUH-JLD109分离培养、纯化培养、菌种鉴定与保藏
1、链球菌AUH-JLD109分离培养包括下述步骤：
（1）人粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入2毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养链球菌Streptococcus sp. AUH-JLD109
①单一菌落式分离培养
用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10-1，10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，再分别将100微升浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性鉴定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入终浓度为0.1毫摩尔/升柚皮苷粗品，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物柚皮苷10微升，共同培养48小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物柚皮苷功能的单菌落。
2、菌株AUH-JLD109的纯化培养、菌种鉴定与保藏
（1）单菌落的纯化培养
将筛选出的单一功能微生物菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液200微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70℃的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）为引物对16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交华大基因进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该细菌菌株的16S rDNA序列与Claire Poyart等于2002年分离到的链球菌属菌株StreptococcuspasteurianusCIP107122 (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002(52):1247-1255)的相似性为100%，因此，将该功能微生物菌株初步鉴定为链球菌属菌株。此外，Macdonald 等于曾于1984年报道了两株产β-D-葡萄糖苷酶的链球菌Streptococcus faecium VGH-1 和Streptococcus sp.FRP-17，但由于发表年代久远，当时并未对菌株的16S rDNA进行测序（Applied and Environmental Microbiology, 1984，350-355）。由于本发明中的链球菌AUH-JLD109同样也产生葡萄糖苷酶，因而将菌株AUH-JLD109的生理生化特性与上述三株链球菌属菌株分别进行对比分析。经生理生化试验发现，菌株AUH-JLD109在糖的利用、产吲哚能力以及溶血特性上与上述三株链球菌存在明显不同（见表1），因此将菌株AUH-JLD109鉴定为链球菌属中的新种，即Streptococcus sp. AUH-JLD109。
表1链球菌属菌株生理生化特性比较
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“N”表示无数据。
二、菌株AUH-D2-1的分离培养
菌株AUH-D2-1的分离培养包括下述步骤：
（1）人粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入2毫升新鲜LB液体培养基中， 37℃恒温培养箱中培养24小时，作为筛选肠道优势需氧菌的微生物菌群；
（2）菌株AUH-D2-1分离培养
用新鲜LB液体培养基将事先在恒温培养箱中培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10-1，10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，再分别将100微升浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的LB固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的LB固体培养基置于37℃恒温培养箱中培养48小时后，分别从LB固体培养基上挑取单菌落进行随机编号。
（3）单菌落的纯化培养
将筛选出的单一微生物菌落在LB固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到2毫升LB液体培养基中，培养24小时取菌液200微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，再将其保藏在-70℃的超低温冰箱中，对低温保藏的微生物菌株定期进行复壮培养和活性测定。
三、柚皮苷粗品的制备和鉴定
柚皮苷粗品通过以下方法分离制备：
（1）柚皮苷粗品的提取方法
从药店购买中药化橘红（产地：中国广州），将化橘红用粉碎机粉粹至粉末状。称取粉碎后的化橘红粉10克加到250毫升三角瓶中，同时加入50毫升的70%的乙醇水溶液（固液比为1:5）50℃浸提 1小时，化橘红中的大部分黄酮苷即被提取到乙醇水溶液中了，提取效果可用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）进行检测（见图1中B）。HPLC检测条件为：色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（4.6毫米×250毫米）；流动相为乙腈和水，具体为A液为10%乙腈水溶液加入0.1%乙酸，B液为90%乙腈水溶液同时加入0.1%乙酸；检测方法为：A:B (0~9分钟：80:20；9~14分钟：40:60；14~19分钟：80:20)（v/v）流速为1毫升/分钟，检测波长为283纳米。
将上述溶解在乙醇水溶液中的粗提物用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中蒸干所得即为柚皮苷粗品。
（2）柚皮苷粗品的鉴定方法
将柚皮苷粗品加入与提取液等体积的甲醇中，过0.45微米的滤膜后与柚皮苷标准品进行HPLC检测，粗提液中的主要的物质峰的保留时间与标准品的保留时间一致，为进一步确定粗提液中主要物质峰的归属，对化橘红的乙醇水溶液提取物的主要的物质峰进行了最大紫外吸收的检测，结果发现其分别在283纳米和327纳米处有最大紫外吸收（见图2），这与文献中报道的柚皮苷的紫外图谱正好相吻合。由此可以确定柚皮苷粗品中的主要物质峰为柚皮苷。
四、混合菌株水解底物柚皮苷的发酵培养基的优化
经过试验发现混菌种子液能够在LB培养基中稳定传代并保持活性，在此基础上为进一步降低生物合成的成本，对混菌种子液的发酵培养基进行优化。
采用正交实验设计对混菌种子液培养基主要成分进行优化。由单因素实验（见表2）可知可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸盐、硫酸铁对混菌种子液的水解活性有较大影响，依据L9(34)正交表对这四个因素进行正交试验，正交试验结果与分析见表3，正交试验结果的方差分析见表4。由表3可以看出，磷酸盐不同配比对混菌种子液水解底物柚皮苷水解率影响较大，其次为蛋白胨和可溶性淀粉，最后为硫酸铁。各因素影响程度的主次顺序为C>B>A>D，选定的最优组合为A3B3C2D2。
表2 混合菌株发酵培养基正交试验因素及水平表
表3 正交试验结果与分析
表4 正交试验结果的方差分析
F0.05（2, 9）=19.38 F0.01（2, 9）= 99.39 **（F>F0.01） *（F>F0.05）
由表4可以看出，因素C对混菌的水解活性有极显著的影响，因素A和B均有显著影响，而因素D影响则不显著。
综合上述结果，优化后培养基配方为：1.2%可溶性淀粉、1.5%蛋白胨、0.5%磷酸盐总量（磷酸氢二钾：磷酸二氢钾=2:1）和0.005%的硫酸铁。经计算，配制1L混合菌株的发酵培养基的成本约为2.8元(可溶性淀粉500克需10元人民币；蛋白胨250克需40元人民币；磷酸氢二钾500克需12元人民币；磷酸二氢钾500克需14元人民币；硫酸铁500克需5元人民币)，与LB培养基（LB培养基250克需85元人民币）相比成本可降低3倍左右。优化后的培养基中混合菌株转化底物柚皮苷的最大底物浓度为6.0毫摩尔/升，转化率为99.8%，柚皮素产率为95.5%。
有益效果：
本发明采用链球菌AUH-JLD109使柚皮苷进行转化，转化性能稳定，大大提高了柚皮素的转化率，且方法简单，原料易得，成本低，解决了柚皮素难于工业化的难题。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1 为应用例中柚皮苷标准品（A）、化橘红乙醇水溶液提取物（B）、柚皮素标准品（C）、化橘红乙醇水溶液提取物水解后的产物（D）的高效液相色谱图；
图2 为本发明应用例1中化橘红乙醇水溶液提取物的以及提取物代谢产物的紫外吸收图谱；
图3为本发明应用例1中菌株AUH-JLD109对底物柚皮苷的水解动态；
图4为本发明应用例1中混合菌对底物柚皮苷的水解动态；
图5 为本发明应用例1中菌株AUH-JLD109对不同浓度底物柚皮苷水解能力比较；
图6 为本发明应用例1中混合菌对不同浓度底物柚皮苷水解能力比较。
具体实施方式
以下实施例中，链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109，保藏号为CGMCC No.8033；大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏号为CGMCC No.8031。
应用例1
本实施例中，步骤（1）和步骤（2）中混菌发酵培养基的重量组成为：1.0%可溶性淀粉，2.0%蛋白胨，磷酸盐0.5%和0.005%的硫酸铁，余量为水。磷酸盐中磷酸氢二钾：磷酸二氢钾重量比为2:1。
（1）混菌种子液的培养
将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养18小时作为种子液。
将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续18小时作为种子液。
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于混菌发酵培养基中，培养24小时，得到混菌种子液；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液按10%接种量转接到混菌发酵培养基中培养，加入柚皮苷粗品母液，使柚皮苷的终浓度为5.5毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为150毫摩尔/升。
（3）代谢产物的分离纯化。
用等体积的乙酸乙酯将步骤（2）的培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离，用干净三角瓶收集代谢产物峰，蒸干后即为代谢产物柚皮素。
（4）对代谢产物进行鉴定：
将收集的代谢产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其紫外吸收图谱和保留时间。结果表明，该代谢产物峰在288纳米和328纳米处有最大紫外吸收（见图2），这与文献中报道的柚皮素的紫外吸收图谱相吻合；另外，该代谢产物峰与柚皮素标准品柚皮素的保留时间完全一致。因此，根据产物的HPLC图谱和紫外吸收图谱可将该代谢产物鉴定为柚皮素。
（5）菌株AUH-JLD109及混菌生长特性的比较
为了解菌株AUH-JLD109单独培养与混合培养在生长特性上有无差异，分别测定了菌株AUH-JLD109单菌及混菌培养的生长曲线及pH。由于转化时所用接种量为10%，因此，研究菌株生长特性时的接种量也采用10%接种量。具体方法如下：
将事先培养好的菌株AUH-JLD109的种子液（培养方法同上）按10%接种量接种到盛有2毫升BHI培养基的试管中于恒温培养箱中培养，观察不到延滞期，菌体立即进入指数增长期。发酵液的pH为5.0，菌液的OD值为2.18。同样地，按10%接种量将事先培养好的混合菌株的种子液（培养方法同上）接种到盛有2毫升LB培养基的试管中于恒温培养箱中培养，接种后菌体同样立即进入指数增长期。发酵液的pH为6.5-7.5，菌液的OD值为2.46。经光学显微镜观察发现，与埃希氏大肠杆菌AUH-D2-1菌株混菌培养液中，菌株AUH-JLD109数量略少于菌株AUH-D2-1，但经10次转接培养后，发现菌株AUH-JLD109数量并未减少，且对底物柚皮苷转化稳定，这表明混菌培养时埃希氏大肠杆菌AUH-D2-1对菌株AUH-JLD109的生长无抑制作用。
（6）菌株AUH-JLD109及混合菌株对底物柚皮苷粗品的水解动态
为了解菌株AUH-JLD109及混合菌株水解底物柚皮苷的速度，以便确定最佳转化时间，对菌株AUH-JLD109水解底物柚皮苷粗品的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的菌株AUH-JLD109的种子液（培养方法同上）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的柚皮苷粗品0.5 毫升，恒温培养箱中培养0小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图3），由图3可知， 4小时后柚皮苷即可全部被水解为柚皮素，平均水解率为98.0%。
将事先培养好的混合菌株的种子液（培养方法同上）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的柚皮苷粗品0.5 毫升，恒温培养箱中培养0小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图4），由图4可知，4小时后柚皮苷即可被水解为柚皮素，平均水解率为98.2%。
（7）菌株AUH-JLD109及混合菌株对不同浓度底物柚皮苷粗品最大水解能力测定
将菌株AUH-JLD109分别与不同浓度的柚皮苷粗品共同培养3天，然后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况。结果表明，菌株AUH-JLD109对浓度分别为0.8毫摩尔/升、1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升的柚皮苷粗品的转化能力相似，平均水解率（水解率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）分别为92.3%、93.1%和93.2%，柚皮素的最大产率为86.25%（产率=（产物浓度/加入的底物浓度）×100%）；当所加入的底物浓度为2.0毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD109对底物柚皮苷粗品转化能力急剧下降，平均水解率仅为13.7%（见图5）。
将混合菌株种子液分别与不同浓度的柚皮苷粗品共同培养3天，然后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液1000微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况。结果表明，混菌对浓度分别为5.6毫摩尔/升、6.0毫摩尔/升的柚皮苷粗品的转化能力相似，平均水解率（水解率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）分别为99.6%、99.7%，柚皮素的最大产率为94%（产率=（产物浓度/加入的底物浓度×100%）；当所加入的底物浓度为6.4毫摩尔/升时，混合菌株株对底物柚皮苷粗品转化能力有所下降，平均水解率为97.1%；当继续加大柚皮苷浓度至6.8毫摩尔/升时，混合菌株株对底物柚皮苷粗品水解能力明显下降，平均水解率为86.3%（见图6）。
应用例2
（1）混菌种子液的培养
将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养24小时作为种子液。
将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续24小时作为种子液。
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于混菌发酵培养基中，培养18小时，得到混菌种子液；混菌发酵培养基的重量组成为：1.2%可溶性淀粉，1.0%蛋白胨，磷酸盐0.7%和0.002%的硫酸铁，余量为水。磷酸盐中磷酸氢二钾：磷酸二氢钾重量比为2:1；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液按15%接种量转接到LB液体培养基中培养，加入柚皮苷粗品母液，使柚皮苷的终浓度为6.5毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天；柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为120毫摩尔/升。
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将步骤（2）的培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离，用干净三角瓶收集代谢产物峰，蒸干后即为代谢产物柚皮素。
应用例3
（1）混菌种子液的培养
将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按18%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养20小时作为种子液。
将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按12%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续20小时作为种子液。
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于LB液体培养基中，培养20小时，得到混菌种子液；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液按13%接种量转接到混菌发酵培养基中培养，加入柚皮苷粗品母液，使柚皮苷的终浓度为6.0毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为110毫摩尔/升；混菌发酵培养基的重量组成为：1.2%可溶性淀粉，1.0%蛋白胨，磷酸盐0.7%和0.002%的硫酸铁，余量为水。磷酸盐中磷酸氢二钾：磷酸二氢钾重量比为2:1；
（3）代谢产物的分离纯化。
用等体积的乙酸乙酯将步骤（2）的培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离，用干净三角瓶收集代谢产物峰，蒸干后即为代谢产物柚皮素。
应用例4
本实施例中，步骤（1）和步骤（2）中混菌发酵培养基的重量组成为：1.5%可溶性淀粉，1.5%蛋白胨，磷酸盐0.3%和0.008%的硫酸铁，余量为水。磷酸盐中磷酸氢二钾：磷酸二氢钾重量比为2:1；
（1）混菌种子液的培养
将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养20小时作为种子液。
将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续20小时作为种子液。
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于混菌发酵培养基中，培养20小时，得到混菌种子液；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液按13%接种量转接到混菌发酵培养基中培养，加入柚皮苷粗品母液，使柚皮苷的终浓度为6.0毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为160毫摩尔/升
（3）代谢产物的分离纯化。
用等体积的乙酸乙酯将步骤（2）的培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离，用干净三角瓶收集代谢产物峰，蒸干后即为代谢产物柚皮素。
Claims (10)
1.一种链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109，保藏号为CGMCC No.8033。
2.根据权利要求1所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用。
3.根据权利要求2所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）混菌种子液的培养
将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液接种于LB液体培养基或混菌发酵培养基中培养，得到混菌种子液；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏号为CGMCC No.8031；
（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤（1）得到的混菌种子液转接到LB培养基或混菌发酵培养基中，加入柚皮苷粗品母液进行共培养；其中，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的终浓度最大为6.5毫摩尔/升；
（3）代谢产物的分离纯化；
所述混菌发酵培养基的重量组成为：1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸盐0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸铁，余量为水；磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物，磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为2:1。
4.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（1）中链球菌AUH-JLD109的种子液通过下述方法培养：将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养18-24小时作为种子液。
5.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（1）中大肠埃希氏菌AUH-D2-1的种子液通过下述方法培养：将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中， 37℃恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续18-24小时作为种子液。
6.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（1）中将链球菌（Streptococcus sp.）AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1的种子液各以10%的接种量接种于LB液体培养基中，培养18-24小时。
7.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）混菌种子液按10-15%接种，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的终浓度为5.5-6.5毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2-3天。
8.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为110-160毫摩尔/升。
9.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中采用混菌发酵培养基进行共培养。
10.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤（3）中分离纯化为：等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离，得到代谢产物柚皮素。
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