CN102994408B - 一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌，具体的说是一种降解卡拉胶的新菌及其发酵的方法和应用，其命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacter hainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564。本发明还对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降解卡拉胶能力的酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌，特别是一种卡拉胶降解菌及其发酵方法与应用。
背景技术
卡拉胶是从某些的红藻中提取酸性的线性多聚糖，属于亲水性的线性硫酸化半乳糖家族。它们主要由交替的3-连接的β-D-吡喃半乳糖（G-单元）和4-连接的α-D-吡喃半乳糖（D-单元）或4-连接的3，6-内醚-α-D-吡喃半乳糖（DA-单元），形成重复的二糖单元组成。
卡拉胶因具有优良的热可逆凝胶化、抗蛋白凝结、亲水无毒等性能而广泛应用于食品工业中。卡拉胶还用于医药行业，如作为微生物培养基、缓释胶囊/片剂、药膏基、鱼肝油乳化剂等。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，分子量较小，溶解性较好，同时因糖链上的活性基团充分暴露出来，使其活性较卡拉胶显著提高，拓宽了医药上的应用领域。研究发现卡拉胶寡糖具有特殊的医药疗效，它对许多重要病毒病原（如疱疹病毒、粘液病毒、HPV等）具有广谱抑制活性，有许多证据表明卡拉胶寡糖能够在抗HIV上提供保护。卡拉胶寡糖还对免疫系统具有持续性作用，能有效的抗胃蛋白酶活、抗溃疡、抗凝血、抗栓物质。
目前降解卡拉胶的方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶解法以其降解过程容易控制，反应条件温和，对环境没有污染等优点而倍受青睐。虽然目前已在很多种微生物中发现卡拉胶酶，但由于酶活不高，产酶量小等缺点，不能满足对卡拉胶寡糖日益增长的需求，因此寻找具有能分泌降解卡拉胶能力酶的菌种是十分需要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能分泌卡拉胶降解酶的新菌种，并提供该新菌种的分离培养方法和降解卡拉胶生成寡糖的方法。（以下部分与权利要求一致）
本发明所述的卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株（CGMCC NO.5564）分离自海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤中，经一系列形态学、生理生化、16S rRNA、脂肪酸组分分析、醌型分析表明它属于土地杆菌属，但又区别于土地杆菌属中的其它种，定名为卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q。该菌分类位置比较独立，申请人已针对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降解卡拉胶能力的酶。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564。
所述卡拉胶降解菌菌株的生物化学特征为：
菌落形态特征为：
在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1.0mm；
菌体形态特征为：
细胞杆状，0.3~0.5μm×1.3~2.0μm，单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；
主要生理生化特征：
在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶；好氧；可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长。
脂肪酸组分特征：
主要脂肪酸及比例为iso-C15:0(40.4%),iso-C15∶0 2-OH and/orC16:1ω7c(18.9%)and iso-C17:0 3-OH(18.4%)。
醌型特征：
主要优势醌为甲基萘醌K7（MK-7），含量大约为92.9％。
DNA G+C mol%含量特征：
DNA G+C mol%含量为42.7%。
遗传学特征：
所述卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株的16SrRNA全基因序列。菌株16S rRNA全基因序列（1391bp）(Genbank登录号为：JQ083404)为：
1 gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggtgcgtaacgcg
61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc ccggagaaat ccggattaacaccgcataaa
121 atcacagtac cgcatggtat aatgatcaaa tatttatagg ataaagatgggcatgcgtgt
181 cattagctag ttggagaggt aacggctcac caaggcgacg atgactaggggatctgagag
241 gatgaccccc cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggaggcagcagtaag
301 gaatattggt caatggaggg aactctgaac cagccatgcc gcgtgcaggaagactgccct
361 atgggttgta aactgctttt gtatgggaat aaaccctggt atgtataccaggctgaatgt
421 accataagaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatacggaggatcca
481 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggc ggcctgttaagtcaggggtg
541 aaagacggtg gctcaaccat cgcagtgcct ttgatactga taggcttgaatatagttgag
601 gtaggcggaa tgtgacaagt agcggtgaaa tgcatagata tgtcacagaacaccgattgc
661 gaaggcagct tactaaacta atattgacgc tgaggctcga aagcgtggggatcaaacagg
721 attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgataac tcgatgttagcgatatacag
781 ttagcgtcca agcgaaagcg ttaagttatc cacctgggga gtacgcccgcaagggtgaaa
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1141 tacgtccggg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggccgctacccagcgatg
1201 ggatgccaat ctcaaaaagc cgatcacagt tcggatcggg gtctgcaactcgaccccgtg
1261 aagttggatt cgctagtaat cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgttcccgggcct
1321 tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagt tgggggtgcc taaagtccgtaaccgcaagg 1381 atcggcctag g
根据《Bergey’s Manual of Deteminative Bacteriology(Ninth Edition)》（John G.Holt et al.1994）和MIDI公司Sherlock全自动细菌鉴定系统脂肪酸成份分析以及形态和生理生化特征，本发明菌株与土地杆菌属有相似性，用Phylip软件包对其16S rRNA序列进行系统学分析，并用邻接法（Neigbor-Joining）构建系统树表明本菌株与土地杆菌属属于同一类群，关系最紧密。16S rRNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Pedobacter terricolaDS-40T (EF446146)的相似性为95.2%。
卡拉胶降解菌的发酵方法
1）将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25-35摄氏度培养72-96小时；
2）将固体培养基种子接1-3环于种子培养基的试管中，于25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-72小时。
3）按体积比为1/50~1.5/5将种子培养基接入发酵培养基中，25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-96小时。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，余量为水，pH 6.0-8.0。
所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，余量为水，氯化钠：0-20，pH6.0-8.0。
所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
所述卡拉胶降解菌13-Q可用于发酵生产具有降解卡拉胶能力的酶。
本发明的优点：
本发明所述的卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-QCGMCC NO.5564的优点：
1.在此之前没有报道过土地杆菌属中能生产卡拉胶降解酶的细菌，该发明为首次发现土地杆菌属中该菌还可以进一步遗传选育或改良得到更优良的工业生产用菌；对目前卡拉胶降解酶日益增加的需求，本发明为之找到了一条新的生产途径。
2.具有生产降解卡拉胶能力的酶的用途，该菌能稳定的产生含量较高的卡拉胶降解酶。
3.可应用该菌发酵得到的卡拉胶降解酶制备与其它细菌不同聚合度的卡拉胶寡糖。
附图说明
图1.脂肪酸组分及比例图；
图2.醌型分析结果图；
图3.卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC NO.5564酶解卡拉胶聚糖得到的高效液相色谱图。
图4.卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC NO.5564酶解卡拉胶聚糖得到的质谱图。
卡拉胶降解菌，命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacterhainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCC，地址:中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564。
表1.卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC NO.5564的16S rRNA序列。
具体实施方式
实施例1
卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q的分离和纯化。
1、菌株的分离：
（1）采集样品
采集海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤后，取10g，加无菌水90ml，制成土壤悬浮液。
（2）菌株分离
取菌液1ml，用无菌水依次稀释10-3-10-6倍，于卡拉胶固体培养基上划线，卡拉胶固体培养基配方（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，pH 6.0-8.0，余量为水。
（3）菌株的纯化
按照微生物纯种分离的常规方法，将上述培养基于30℃放置3-5天。挑取多个单菌落，接种到新的卡拉胶固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落。再在液体培养基中进行发酵检验，结果得到一株卡拉胶酶产量较高的菌株。
所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，pH6.0-8.0，用水不足1000ml。
所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
实施例2
卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株的分离的鉴定。
（1）卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株的菌体及菌落形态特征：
卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株为杆状，0.3~0.5μm×1.3~2.0μm，单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1.0mm。
（2）卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株的生理生化特征：
好氧，可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶（C8）反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长。
（3）脂肪酸组分特征：
主要脂肪酸及比例为iso-C15:0(40.4％),iso-C15∶0 2-OH and/orC16∶1ω7c(18.9％)and iso-C17:0 3-OH(18.4％)（图.1）。
醌型特征：
主要优势醌为甲基萘醌K7（MK-7），含量大约为92.9％(图.2)。
DNA G+C mol％含量特征：
DNA G+C mol％含量为42.7％。
遗传学特征：
16S rRNA碱基序列（表.1）；菌株16S rRNA全基因序列共1391bp(Genbank登录号为：JQ083404)。
表1：
1 gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggtgcgtaacgcg
61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc ccggagaaat ccggattaacaccgcataaa
121 atcacagtac cgcatggtat aatgatcaaa tatttatagg ataaagatgggcatgcgtgt
181 cattagctag ttggagaggt aacggctcac caaggcgacg atgactaggggatctgagag
241 gatgaccccc cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggaggcagcagtaag
301 gaatattggt caatggaggg aactctgaac cagccatgcc gcgtgcaggaagactgccct
361 atgggttgta aactgctttt gtatgggaat aaaccctggt atgtataccaggctgaatgt
421 accataagaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatacggaggatcca
481 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggc ggcctgttaagtcaggggtg
541 aaagacggtg gctcaaccat cgcagtgcct ttgatactga taggcttgaatatagttgag
601 gtaggcggaa tgtgacaagt agcggtgaaa tgcatagata tgtcacagaacaccgattgc
661 gaaggcagct tactaaacta atattgacgc tgaggctcga aagcgtggggatcaaacagg
721 attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgataac tcgatgttagcgatatacag
781 ttagcgtcca agcgaaagcg ttaagttatc cacctgggga gtacgcccgcaagggtgaaa
841 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggagca tgtggtttaattcgatgata
901 cgcgaggaac cttacccggg cttgaaagtt actgcattac tcagagatgagtaagacctt
961 cgggacagga aactaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgaggtgttgggtt
1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccctatgtt tagttgccag catttaaggtggggactcta
1081 aacagactgc ctgcgcaagc agagaggaag gatgggacga cgtcaagtcatcatggccct
1141 tacgtccggg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggccgctacccagcgatg
1201 ggatgccaat ctcaaaaagc cgatcacagt tcggatcggg gtctgcaactcgaccccgtg
1261 aagttggatt cgctagtaat cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgttcccgggcct
1321 tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagt tgggggtgcc taaagtccgtaaccgcaagg 1381 atcggcctag g
实施例3
种卡拉胶降解菌(（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC：5564的发酵工艺：
1）将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25摄氏度培养4天；
2）将固体培养基种子接1-3环于种子培养基中，于25摄氏度下以150rpm转速培养48小时。
3）按体积比为1/50~1.5/5将种子培养基接入1升发酵培养基中，25摄氏度下以150转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，余量为水，pH 6.0-8.0。
所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，蒸馏水1000ml，氯化钠：0-20，余量为水，pH6.0-8.0。
所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
实施例4
一种卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC：5564的发酵工艺：
1）将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上，在30摄氏度培养4天；
2）将固体培养基种子接于种子培养基的试管中，于30摄氏度下以180rpm转速培养48小时。
3）按体积比为1/5~1.5/5将种子培养基接入5升发酵培养基中，30摄氏度下以180转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，用水补足1000ml，pH6.0-8.0。
所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
实施例5
一种卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC：5564的发酵工艺：
1）将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上，在35摄氏度培养4天；
2）将固体培养基种子接1-3环于种子培养基的试管中，于35摄氏度下以210rpm转速培养48小时。
3）按体积比为1/5~1.5/5将种子培养基接入1升发酵培养基中，35摄氏度下以210转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，用水补足1000ml，pH6.0-8.0。
所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO4·7H2O：0.01-0.05；MgSO4·7H2O：0.2-1.0；CaCl2：0.1-0.5；KH2PO4：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
实施例6
按照常规方法进行卡拉胶酶的制备，制备过程参考文献《Statisticaloptimization of medium components for К-carrageenase production byPseudomonas elongata》，Yasmin Khambhaty等人。
卡拉胶降解菌（Pedobacter hainangensis sp.13-Q）在实施例1的基础上制备卡拉胶酶的方法。
1）将培养3-4天的发酵液在4℃条件下10000g离心25分钟以去除菌体，留上清液备用。
2）上清液经60%饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30分钟，收集沉淀，用一定量的PBS缓冲液（0.02-0.05M，pH 7.0-8.0）重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，得粗酶液。
实施例7
利用卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCCNO.5564制备卡拉胶寡糖。
将实施例6中得到的粗酶液加入卡拉胶底物中，使1000ml体系中卡拉胶底物质量为5-20g、粗酶液2-10ml、余量为水，于30-40℃，pH 7.0-8.0条件下酶解反应3-9小时，将反应器置于沸水10-15分钟终止反应。制得的卡拉胶寡糖溶液粗产品去除蛋白质后（Sevage法），经真空旋蒸仪蒸发除去水分，烘干，得到卡拉胶寡糖产物。
所述卡拉胶降解菌发酵产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖的特征：
寡糖产物经过高效液相色谱（图.3）和电喷雾离子质谱（图.4）分析说明聚合度在2-8之间。
利用卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株CGMCC NO.5564制备卡拉胶寡糖高效液相色谱和电喷雾离子质谱分析
用实施例7中得到的卡拉胶寡糖配制0.1-0.5%的溶液经0.45μm滤膜过滤，经高效液相色谱和电喷雾离子质谱分析，卡拉胶寡糖聚合度为2-8。
Claims (4)
1.一种卡拉胶降解菌，其特征在于：命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacter hainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564，所述降解菌的16S rRNA的全基因碱基序列共1391bp，Genbank登录号为：JQ083404。
2.一种权利要求1所述卡拉胶降解菌的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由以下发酵方法获得：
1)将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25-35摄氏度培养72-96小时；
2)将固体培养基种子接于种子培养基的试管中，接种1-3环，于25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-72小时；
3)按体积比为1/50-1.5/5将种子培养基接入发酵培养基中，25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-96小时，获取发酵物。
3.按照权利2所述卡拉胶降解菌的发酵产物，其特征在于：
所述卡拉胶固体培养基：琼脂粉：7-15g/L，蛋白胨：3-8g/L，酵母浸出粉0.5-5g/L，卡拉胶：1-10g/L，氯化钠：0-20g/L，FeSO4·7H2O：0.01-0.05g/L；MgSO4·7H2O：0.2-1.0g/L；CaCl2：0.1-0.5g/L；KH2PO4：0.5-4g/L，pH 6.0-8.0，余量为水；
所述种子培养基：酵母浸膏：0.5-5g/L，蛋白胨：2-10g/L，卡拉胶：1-10g/L，氯化钠：0-20g/L，pH6.0-8.0，余量为水；
所述发酵培养基：卡拉胶0.2-1g/L，蛋白胨2-8g/L，酵母浸出粉：0.5-5g/L，FeSO4·7H2O：0.01-0.05g/L；MgSO4·7H2O：0.2-1.0g/L；CaCl2：0.1-0.5g/L；KH2PO4：0.5-4g/L，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。
4.一种权利要求2所述的卡拉胶降解菌的发酵产物在生产卡拉胶寡糖中的应用，其特征在于：
利用卡拉胶降解菌的发酵产物中产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖，也可称之为卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp.)13-Q用于生产卡拉胶寡糖；
1)收集发酵粗酶液：将按照权利要求3得的发酵物，经10000g离心10分钟去除菌体，上清液经60％饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30分钟，收集沉淀，用0.02-0.05M，pH7.0-8.0的PBS缓冲液重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，得粗酶液；
酶解底物：于反应器中进行反应，将粗酶液加入卡拉胶底物中，使1000ml体系中卡拉胶底物质量为5-20g、粗酶液2-10ml、余量为水，于30-40℃，pH 7.0-8.0条件下酶解反应3-9小时，将反应器置于沸水10-15分钟终止反应；得的卡拉胶寡糖溶液粗产品；
2)分离产物：所得的卡拉胶寡糖溶液粗产品，经过Sevage法除去酶蛋白质后，于真空旋转蒸发仪中去除水分，或经喷雾干燥或冷冻干燥去除水分，得到卡拉胶寡糖产物。
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